способ изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных

Формула изобретения

Способ изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных, включающий выращивание вакцинного штамма ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью не ниже 7,0 lg МЛД₅₀/см³ в перевиваемой культуре клеток и смешивании его с защитными компонентами, отличающийся тем, что суспензию вакцинного штамма вируса бешенства смешивают со стабилизирующей средой, полученную техническую жидкость в объеме 3,0-5,0 см³ наносят на приманку (пористый брикет), замораживают и лиофилизируют в течение 24-30 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов для оральной иммунизации животных.

Имеется способ изготовления вакцины против бешенства для орального применения (W.Winkler et al., Vaccination of foxes against rabies using ingested bait. - J. Wildlife Disease, 1978, 11, 3, р.382-388), заключающийся во введении в приманку (коммерческий бисквит) суспензии вируса бешенства штамм ERA, выращенный в клетках ВНК-21, и дальнейшем замораживании приманки с вирусом при минус 70°С. Замороженные приманки покрывали жидкой смесью (49% парафина, 49% говяжьего жира и 2% сардинного масла).

Недостаток этого способа в том, что он позволяет получить приманки, хранящиеся и применяющиеся только при низких отрицательных температурах.

Известен также способ изготовления вакцины (K.F.Lawson, R. Hertler, K. M.Carlton, J.B.Campbell and A.J.Rhodes. Safety and Immunogenicity of ERA Strain of Rabies virus Propagated in BHK-21 Cell Line. - Can. J. Vet. Res. 1989, 53, p.438-444) для оральной иммунизации плотоядных против бешенства, состоящий в том, что суспензию штамма ERA вируса бешенства, размноженного в ВНК-21/С 13 клетках, вносят в пористую полиуретановую губку размером 31/31/38 мм, замораживают при минус 70°С, покрывают смесью жира/воска и применяют как при низких отрицательных, так и низких положительных температурах.

Недостаток этого способа состоит в том, что для сохранения устойчивости вакцины применяются дорогостоящие коммерческий стабилизатор и 10% суспензия яичного желтка, а также низкие отрицательные температуры минус 20°С хранения. При применении вакцины в осенне-зимний и весенне-зимний периоды она изменяет агрегатное состояние при суточных колебаниях температуры, что инактивирует ее биологическую активность и тем самым снижает иммуногенность.

Известен способ получения вирусвакцины (Патент РФ 2157700, 10.20.2000) против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных, при котором выращенную в перевиваемой культуре клеток почки сайги суспензию вируса бешенства, штамм ТС-80, смешанную со стабилизирующими компонентами в соотношении 1:1:2, подвергают сублимационному высушиванию в течение 48-72 часов, размалывают в шаровой мельнице и заполняют полученной массой полые брикеты-приманки.

Недостатки этого метода состоят в многостадийности (высушивание, измельчение, заполнение приманок), длительности и трудоемкости процесса, а также высокой себестоимости.

Целью настоящего изобретения является способ изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных, при котором высушивание вакцины происходит в приманке. Указанная цель достигается тем, что суспензию вакцинного штамма ТС-80 вируса бешенства, выращенную в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с защитными добавками, полученный полуфабрикат наносят на приманку (пористый брикет), замораживают и высушивают сублимацией в течение 24-30 часов.

Положительный эффект получают при смешивании суспензии вируса с растворами пептона с лактозой и раствором пектина, замораживании при минус 40°С последующим сублимационном высушивании.

Таблица Технологическая схема изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных
№ п/п		Технологический этап		Предлагаемый способ		Прототип
1.		Получение вирусного сырья		Штамм ТС-80, выращенный в культуре клеток ПС		Штамм ТС-80, выращенный в культуре клеток ПС
2.		Приготовление стабилизаторов		40% пептон + 8% лактоза, 4% пектин		40% пептон+8% лактоза, 4% пектин
3.		Приготовление технической жидкости (ТЖ)		Вирусное сырье + пептонлактозный стабилизатор + пектин 14+5+1 соответственно		Вирусное сырье+пептонлактозный стабилизатор+пектин 1+1+2 соответственно
4.		Изготовление приманок		Пористые брикеты из муки		Печеные брикеты из рыбно-мясного фарша и муки
5.		Фасовка вакцины		Нанесение ТЖ на пористые брикеты		Разлив ТЖ во флаконы или кассеты
6.		Замораживание		Замораживание		Замораживание
Продолжение таблицы
1.	Лиофилизация		Лиофилизация брикетов-приманок одновременно и совместно в течение 24-30 часов		Лиофилизация ТЖ в течение 72-74 часов
8.			нет		Сбор сухого продукта в герметичную тару
9.			нет		Измельчение сухой вакцины до однородного порошка
10.			нет		Заполнение полых приманок сухой вакциной
11.	Контроль		Вакцина готова к применению (7 этапов)		Вакцина готова к применению (10 этапов)

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

1,4±0,1 дм³ вируссодержащего материала, штамм ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью 7,2±0,15 lg МЛД₅₀/см³, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с 0,5 дм³ стабилизирующей среды, содержащей 40±2% пептона и 8±0,4% лактозы, и с 0,1 дм³ 4±0,1% раствора пектина в соотношении 14:5:1 (вирусная суспензия стабилизатор пектин соответственно). Полученный полуфабрикат наносят на пористый брикет-приманку (изготовленный из муки) размером 5,5/3,5/1,5 см, массой 10-12 г с помощью дозатора “Контур”, нанося последовательно 2, а затем 3 см³ материала. Брикеты-приманки замораживают при минус 40°С и высушивают в аппарате для сублимационного высушивания в течение 24-30 часов. Готовые брикеты-приманки оценивают на контаминацию грибной и бактериальной микрофлорой, безвредность, инфекционную активность и иммуногенность. Вакцина была стерильной, безвредной, с инфекционной активностью 6,5±0,3 lg МЛД₅₀/приманку. Для определения иммуногенности вакцину, ароматизированную рыбьим жиром, скармливали 5-месячным щенкам из расчета одна приманка (одна доза) на голову двукратно с интервалом 12 суток. В сыворотках крови вакцинированных щенков титры вируснейтрализующих антител составили от 1:8 до 1:32 через 30 суток после вакцинации, что свидетельствует об иммуногенности вакцины. Вакцина сохраняла иммуногенные свойства не менее 5 суток при температуре окружающей среды до 20°С и при хранении в течение 6 месяцев при температуре 6-8°С.

Пример 2.

14±0,2 дм³ вируссодержащего материала, штамм ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью 7,3±0,10 lg МЛД₅₀/см³, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с 5±0,1 дм³ защитной среды, содержащей 40±2% пептона и 8±0,4% лактозы и с 1±0,1 дм³ 4±0,5% пектина, сохраняя соотношение, указанное в примере 1.

Полученный полуфабрикат наносят на пористый брикет-приманку по 4,0 см ³ размером 5,9/3,8/1,8 см, массой 12-14 г с помощью дозатора “Контур”. Брикеты замораживают при минус 40°С и высушивают в аппарате для сублимационной сушки в течение 24-30 часов. Готовые брикеты-приманки оценивают по контаминации грибной и бактериальной микрофлорой, безвредности, инфекционной активности и иммуногенности. Вакцина была стерильной, безвредной, с инфекционной активностью 6,4±0,2 lg МЛД₅₀/приманку. Для использования в полевых условиях брикет-приманку ароматизировали рыбьим жиром и покрывали пищевой пленкой. Готовые приманки из расчета одна доза на голову раскладывали двукратно с интервалом 14 суток в феврале-марте вблизи лисьих нор. Через 3 месяца после вакцинации лис выборочно отстреливали и определяли титры вируснейтрализующих антител в пробах сывороток крови. У 6 из 10 отстреленных животных были обнаружены вируснейтрализующие антитела в титрах от 1:8 до 1:32, что доказывает иммуногенность испытанной вакцины. Вакцина сохраняла иммуногенные свойства не менее 5 суток при температуре окружающей среды до 20°С и при хранении в течение 6 месяцев при температуре 6-8°С.

Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ включает меньшее число этапов изготовления вакцины, более экономичен и производителен, менее трудоемок и позволяет получить иммунологически эффективную вирусвакцину против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных. Колебания температуры окружающей среды от положительных до отрицательных значений не оказывают влияния на иммуногенные характеристики вакцины.