способ повышения эффективности противоопухолевых агентов

Формула изобретения

1. Способ повышения эффективности противоопухолевого средства, включающий стадии введения субъекту, нуждающемуся в лечении,

а) химиотерапевтически активного количества противоопухолевого соединения платины и

б) эритропоэтина или эритропоэтинподобного вещества.

2. Способ по п.1, где соединение платины представляет собой малонатное соединение платины.

3. Способ по п.2, где малонатное соединение платины выбрано из группы, состоящей из цисплатина и карбоплатина.

4. Способ по п.3, где соединением платины является цисплатин.

5. Способ по п.3, где соединением платины является карбоплатин.

6. Способ по п.4, где цисплатин вводят в дозах от 25 до 300 мг/м².

7. Способ по п.6, где цисплатин вводят в дозах от 50 до 100 мг/м² .

8. Способ по п.1, где эритропоэтин или эритропоэтинподобное вещество вводят до введения соединения платины.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Это изобретение относится к области лечения злокачественных опухолей. В частности, это изобретение относится к повышению эффективности химиотерапевтических средств для лечения солидных опухолей посредством улучшения гематокрита во время химиотерапии.

Предпосылки изобретения

Противоопухолевые агенты

В то время как в лечении злокачественных опухолей достигнуты значительные успехи, солидные опухоли по прежнему трудно поддаются лечению. Следовательно, у многих пациентов развиваются развернутые злокачественные опухоли, лечение которых общепринятыми способами, как правило, неэффективно. В результате, новые типы противораковых лекарственных средств исследуются на предмет противоракового действия. В последние годы значительный интерес вызывают координационные соединения платины (Rosenberg et al., 1969, Nature, 222:385-386). В структурном плане они представляют собой комплексы, образованные центральным атомом платины, окруженным в различном порядке атомами хлора и аминогруппами как в цис-, так и в трансположении. Множественная химиотерапия агентами на основе платины стала первоочередной послеоперационной терапией пациентов с развернутым раком яичников (American Cancer Society, 1995, Facts and Figures). Цисплатин (цис-диаминодихлорплатина) и карбоплатин (1,1-циклобутандикарбоксилдиаминоплатина (II)) - примеры цитотоксических координационных соединений платины, которые применимы для лечения разнообразных злокачественных новообразований. Другие соединения платины, известные способностью проявлять цитотоксический эффект в отношении злокачественных клеток, представляют собой комплексы 1,4- и 1,2-диаминоциклогексанплатины (IV) (патент США №5434256).

Хотя соединения платины применимы для борьбы со злокачественными новообразованиями, развитие резистентности опухолей против курса лечения ограничивает их применимость. Многие из специфических противоопухолевых механизмов действия платины не до конца понятны. В отсутствие подробной информации о механизме цитотоксичности платины было трудно преодолеть проблему опухолевой резистентности к цисплатину и повысить таким образом эффективность платины и других противоопухолевых средств.

В состав солидных опухолей входят как хорошо оксигенированные, так и гипоксические клетки. Гипоксия обычно возникает в клетках, находящихся дальше всего от кровяного русла. Такие клетки медленно пролиферируют, но при этом относительно устойчивы к противораковым лекарственным средствам. Примером служат данные, указывающие на то, что цитотоксические эффекты цисплатина сталкиваются с большей резистентностью в гипоксических опухолевых клетках, чем в оксигенированных (Herman et al., 1988, Cancer Research, 48:2342-2347; Melvic et al., 1988, Radiat. Res., 114:489-499; Grau et al., 1988, Radiother. Oncol., 13:301-309). Таким образом, один из механизмов, посредством которого опухоли проявляют резистентность к противораковым средствам, может быть связан с их относительно гипоксическим состоянием.

Эффективность соединений платины ограничивается некоторыми часто наблюдаемыми побочными эффектами, такими как ото- и нефротоксичность. Распространенным побочным эффектом терапии платиной также является анемия. Анемия особенно обычна при терапии цисплатином, и пациентам часто требуются гемотрансфузии. Хотя у анемии вследствие применения цисплатина может быть много причин, в этих случаях обнаруживается пониженный уровень эритропоэтина, и поэтому важным представляется дефицит эритропоэтина. Имеется сообщение о том, что рекомбинантный человеческий эритропоэтин, вводимый во время терапии цисплатином и других видов химиотерапии оказывается эффективным в борьбе с анемией, сопровождающей эти виды терапии (Abels 1992, Seminars in Oncology, 19:29-35).

Регуляторы эритропоэза

Предположение о существовании гормона, регулирующего эритропоэз, продукцию красных кровяных клеток, возникло в начале двадцатого века. С тех пор продолжало увеличиваться количество данных, говорящих в пользу наличия гуморальной регуляции эритропоэза. Это привело к получению чистого эритропоэтина (ЕРО), определению его аминокислотной последовательности и, в конечном счете, к клонированию гена человеческого ЕРО (Jacobs et al., 1985, Nature, 313:806-810, Lin, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7580-7584; Lin, патент США, №4403008). Очистка рекомбинантного ЕРО описана в патенте США №4667016, выданном Lai et al.

ЕРО представляет собой гормон, принципиально важный для регуляции содержания красных кровяных клеток в циркуляции. Природный ЕРО продуцируется печенью во внутриутробном развитии и главным образом почками у взрослых. Продукция рекомбинантного эритропоэтина генноинженерными методами включает экспрессию белкового продукта клетками, трансформированными геном, кодирующим эритропоэтин. Как многие секреторные белки и белки клеточной поверхности, ЕРО гликозилирован. Гликозилирование обычно осуществляется по двум типам: O-связанные олигосахариды присоединены через остатки серина или треонина, тогда как N-связанные олигосахариды - через остатки аспарагина. Эритропоэтин, полученный из человеческой мочи, содержит три N-связанных и одну O-связанную олигосахаридную цепь, которые составляют около 40% от общей молекулярной массы гликопротеина. Описаны разные изоформы эритропоэтина, соответствующие разным уровням гликозилирования (Elliott et al., 1995, EP 640619 A1).

Эритропоэтин оказывает свое действие посредством связывания с эритропоэтиновым рецептором. Активация рецептора ЕРО приводит к некоторым биологическим эффектам, включая стимуляцию пролиферации, стимуляцию дифференцировки и ингибирование апоптоза (Liboi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1990, 11351). Рецептор ЕРО может быть также активирован такими агонистами, как мутанты, аналоги и пептиды ЕРО и антитела против него. Помимо ЕРО, были идентифицированы другие соединения с эритропоэтин-подобной активностью. Например, сообщалось об идентифицированной в почечно-клеточной карциноме молекуле, которая оказывала ЕРО-подобный эффект на эритропоэз, но иммунологически отличалась от него (Sytkowski et al., 1979). Другие стимуляторы эритропоэза представляют собой водорастворимые соли переходных металлов (Brugnara et al., патент США №5369014).

В то время как терапия платиной стала более приемлемой в отношении развернутых солидных опухолей, клинические взаимосвязи между гематокритом, содержанием гемоглобина и противоопухолевым действием химиотерапевтических средств не были оценены с целью выяснения, увеличивают ли повышающие гематокрит средства чувствительность опухолей к противораковым средствам. С учетом роста использования необычных противораковых средств продолжает существовать необходимость повышения их противоопухолевого ответа.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу повышения эффективности противоопухолевых средств. Способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении противоопухолевого средства в условиях повышенного гематокрита.

Итак, объектом настоящего изобретения является способ лечения солидных опухолей посредством введения комбинации противоопухолевого средства и средства, повышающего гематокрит. В предпочтительном осуществлении средство, повышающее гематокрит, вводят до введения противоопухолевого средства.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения солидных опухолей введением противоопухолевого соединения платины и эритропоэтина или эритропоэтин-подобного соединения.

Еще одним объектом настоящего исследования является способ лечения опухолей яичника введением комбинации цисплатина и эритропоэтина.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 проиллюстрировано влияние введения цисплатина, эритропоэтина и обоих препаратов на рост опухоли яичника как функция времени.

На фигуре 2 проиллюстрировано влияние введения цисплатина, эритропоэтина и обоих препаратов на процентное изменение гематокрита как функция времени.

Подробное описание изобретения

Под термином "малонатное(ые) координационное(ые) соединение(я) платины", используемым здесь в контексте данного описания и формулы изобретения, подразумеваются цис- и транс-изомеры платины (II) и платины (IV), содержащие бидентатный малонатный лиганд, который может быть замещенным и незамещенным. Платина (II) образует координационные соединения, имеющие плоское расположение в пространстве, тогда как платина (IV) образует координационные соединения, имеющие октаэдрическое расположение в пространстве. Эти соединения описаны в выданных Cleary et al. патентах США №4140707 и 4657927, которые включены сюда в качестве ссылок.

Термины "противоопухолевое средство" и "противораковое средство", используемые взаимозаменяемо и в контексте данного описания и формулы изобретения, означают соединение или композицию, эффективные для ингибирования, замедления или остановки роста раковых клеток, или которые оказывают цитотоксический эффект в отношении злокачественных клеток. Под термином "химиотерапевтически эффективное количество" противоопухолевого средства в контексте данного описания и формулы изобретения подразумевается вводимое субъекту количество, достаточное, чтобы вызвать ингибирование, замедление или остановку роста злокачественных клеток, или достаточное для обеспечения цитотоксического эффекта в отношении злокачественных клеток.

Под термином "противоопухолевый эффект" или "противоопухолевая активность" в контексте данного описания и формулы изобретения подразумевается ингибирование, замедление или остановка роста злокачественных клеток, или оказание цитотоксического эффекта. Примером измеримого противоопухолевого эффекта служит уменьшение размеров опухоли.

Под термином "эритропоэтин" или "ЕРО" в контексте данного описания и формулы изобретения подразумевается эритропоэтин, целый или часть, полученный или выделенный посредством химического выделения и методов очистки; и эритропоэтин любого типа, включая человеческий, полученный с использованием методов рекомбинантной ДНК. Этот термин также включает эритропоэтин, продуцированный клетками субъекта в результате трансфекции экзогенным генетическим материалом, включающим ген, кодирующий ЕРО, или в результате имплантации данному субъекту трансфицированных первичных или вторичных клеток, содержащих экзогенный генетический материал, включая ген, кодирующий ЕРО. Методы продукции и доставки продукта трансфицированных клеток раскрыты в патенте США №5733761, методика из которого включена сюда в качестве ссылки.

Под термином "эритропоэтин-подобная" молекула или вещество в контексте данного описания и формулы изобретения подразумевается любая молекула, полученная посредством химического выделения и методов очистки или посредством рекомбинантных методов, которая обладает способностью активировать рецептор эритропоэтина или иным способом имитировать такое действие эритропоэтина, как стимуляция эритропоэза. Таким образом, под это определение подпадают фрагмент нативного или рекомбинантного ЕРО, который по длине может быть короче целой молекулы ЕРО и способен при этом активировать рецептор ЕРО; молекула слияния, включающая как свою часть аминокислотные последовательности, в норме присутствующие в интактной молекуле ЕРО; аналог, подобный описанному в выданном Okasinski патенте США №5888722, включенном сюда в качестве ссылки, аминокислотная последовательность которого сходна, но не идентична с природным ЕРО, и который обладает биологической активностью в отношении стимуляции эритропоэза; производные ЕРО, в которых структура ЕРО модифицирована посредством добавления (или удаления) одного или более заместителя или химической группы; изоформы ЕРО, которые представляют собой различные состояния гликозилирования ЕРО, например, описанное Strickland в патенте США №5856298, включенном сюда в качестве ссылки; полученные рекомбинантными методами изоформы ЕРО, содержащие дополнительные сайты гликозилирования или перегруппированные сайты гликозилирования, как описано в выданном Elliott et al. Европейском патенте (ЕР 0640619 В1), включенном сюда в качестве ссылки; пептиды, подобные описанным в выданном Wrighton et al. патенте США №5773569 и выданном Wilson et al. патенте США №5835382, включенными сюда в качестве ссылки, которые связываются с рецептором ЕРО и активируют его или иначе выступают в качестве агонистов ЕРО; мутантные секреторные белки ЕРО, подобные описанному в выданном Sytkowski et al. патенте США №5614184, включенном сюда в качестве ссылки, которые обладают измененной биологической активностью. Под это определение также подпадают антитела-агонисты или их фрагменты, подобные описанным в выданном Elliott et al. патенте США №5885574, включенном сюда в качестве ссылки, которые активируют рецептор эритропоэтина или другим способом имитируют действие ЕРО. Общей чертой всех эритропоэтин-подобных веществ является их способность имитировать один или больше эффектов ЕРО.

Под термином «терапевтически эффективное» количество средства для повышения гематокрита подразумевается количество натурально выделенного или произведенного рекомбинантными методами ЕРО или ЕРО-подобного вещества, достаточного для увеличения продукции красных кровяных клеток и осуществляемого таким образом повышения гематокрита по сравнению с нормальным уровнем. Например, количество в пределах от 15 до 1500 единиц на кг массы тела, предпочтительно 50-300 единиц/кг, описано как терапевтически эффективное в патенте США №5013718, описание которого включено сюда в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к способу усиления эффекта определенных противоопухолевых средств посредством повышения гематокрита. Способ по настоящему изобретению включает стадии введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, комбинации противоопухолевого средства и средства, повышающего гематокрит.

Способы, описанные в настоящем изобретении, применимы для лечения злокачественных опухолей млекопитающих, включая злокачественные опухоли человека, и, особенно, солидных опухолей, которые чувствительны к лечению соединениями платины. Неограничивающими примерами таких опухолей служат аденокарциномы, меланомы, лимфомы, саркомы, а также опухоли легких, молочной железы, яичников, головы и/или шеи, простаты, шейки матки, эндометрия, толстой и прямой кишки, желудка, печени, фаллопиевых труб, пищевода, тонкого кишечника, поджелудочной железы, почек, надпочечников, влагалища, вульвы, головного мозга и яичек.

Согласно способу, описанному в настоящем изобретении, одно или больше противоопухолевых средств вводят в сочетании со средством, повышающим гематокрит. Противоопухолевое средство и средство для повышения гематокрита могут вводиться одновременно или последовательно. Предпочтительно вводить средство для повышения гематокрита до введения противоопухолевого средства. Примером противоопухолевого средства служит соединение, содержащее платину, как например, любое координационное соединение платины. Координационные соединения платины по настоящему изобретению включают соединения платины (II) и платины (IV), но не ограничиваются ими.

Двумя примерами соединений платины, оказывающих цитотоксический эффект на злокачественные клетки, являются цисплатин и карбоплатин. Эти два соединения принадлежат к группе соединений, известных как "малонаты", благодаря присутствию в их структуре связи (ООС)₂-С. Цисплатин представляет собой желтовато-белый порошок и содержит хлоридные группы и группы аммиака в горизонтальной проекции. Карбоплатин представляет собой не совсем белый кристаллический порошок. Как и цисплатин, карбоплатин используется для лечения разнообразных злокачественных опухолей человека, включая мелкоклеточный рак легких, плоскоклеточные карциномы и рак яичек (см. U.S.Pharmacists, September, 1989, pages 62-63). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, предполагается, что координационные соединения платины проявляют противоопухолевую активность, нарушая синтез ДНК образованием сшивок между комплементарными цепями ДНК. Предпочтительным вариантом используемого соединения платины является цисплатин.

Противоопухолевое средство вводят пациенту в фармацевтически приемлемом носителе общепринятыми путями введения, подходящими для конкретного вида химиотерапии. Например, противоопухолевое средство может быть введено внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно или инфузионно, для обеспечения его доставки в кровяное русло в эффективной форме. Кроме того, противоопухолевые средства можно назначать в виде липосомных препаратов, как описано в патенте США №5620703, включенном сюда в качестве ссылки. Эффективные дозы противоопухолевых средств по настоящему изобретению представляют собой дозы, обеспечивающие противоопухолевый эффект. Эти дозы известны квалифицированным специалистам или же могут быть установлены эмпирическим путем. К примеру, руководящие принципы дозировки для многих видов химиотерапии в общем виде изложены в Physician's desk Reference. Обычно дозировка соединений платины колеблется от примерно 1 до примерно 200 мг/кг/доза. Эти соединения могут назначаться путем однократной инфузии или многократных инфузий в течение нескольких дней, например, 3-5 дней. При необходимости цикл можно повторить. Предпочтительно их вводят одноразовой внутривенной инъекцией на 1 день лечения, Дозировка цисплатина обычно находится в пределах 25-300 мг/м². Более предпочтительный интервал составляет 50-100 мг/м². Для достижения достаточной гидратации организма перед и после инфузии цисплатина вводят изотонический солевой раствор.

Средства для повышения гематокрита по настоящему изобретению представляют собой любые средства, способные повысить число красных кровяных клеток у субъекта, получающего это средство. Например, применимые в рамках способа по настоящему изобретению средства для повышения гематокрита включают, не ограничиваясь, эритропоэтин и эритропоэтин-подобные соединения. Средства для повышения гематокрита могут быть введены общепринятыми способами, включая внутривенный, внутрибрюшинный или подкожный путь и другие пути, в дозах, известных специалистам в этой области, как применимые для повышения гематокрита. ЕРО можно назначать в многократных дозах, учитывая, что его период полужизни в плазме составляет около 5 часов. В качестве альтернативы, для доставки ЕРО к клеткам субъекта могут также использоваться методы трансфекции. Для индикации эффективности действия ЕРО можно отслеживать уровень гематокрита. Сходные пути введения могут использоваться для ЕРО-подобных веществ. В предпочтительном варианте назначают 50-100 единиц/кг массы тела три раза в неделю, внутривенно или подкожно.

Эффективность лечения можно определить путем оценки состояния опухолей. Пальпируемые опухоли можно измерять общепринятыми методами. Для измерения и оценки размеров опухоли можно также.использовать методы визуализации, такие как компьютерная томография, магнитно-резонансное сканирование, ультразвуковое исследование и подобные им. В качестве альтернативы для обеспечения оценки опухоли можно количественно определять специфические опухолевые маркеры, такие как PSA для рака простаты, СА-125 для рака яичников, СА-15-3 для рака молочной железы, не ограничиваясь ими. Для оценки ответа на лечение можно использовать стандартные критерии. Например, можно следовать критериям, изложенным в WHO handbook of Reporting Results of Cancer Treatment, WHO Offset Publication, 1979. Таким образом, опухоли можно классифицировать как восприимчивые к терапии опухоли, частично восприимчивые опухоли и невосприимчивые. Циклы лечения цисплатином и ЕРО могут продолжаться, пока не будет достигнут приемлемый ответ на лечение или пока не возникнут недопустимые токсические эффекты.

ПРИМЕР 1

Это осуществление изобретения демонстрирует эффект повышения чувствительности к цисплатину человеческих клеток, внедренных в организм мышей SCID, который возник в результате применения ЕРО перед лечением, подъема и поддержания уровня гематокрита вследствие применения ЕРО. Для иллюстрации этого осуществления были проведены эксперименты с иммунодефицитными мышами SCID, несущими рак яичников человека. Эти мыши признаны специалистами в данной области подходящими модельными животными для демонстрации противоопухолевой активности потенциальных химиотерапевтических агентов.

Использовали восемьдесят мышей СВ 17-SCID/SCID (Taconic Labs). Животных содержали в стерильных условиях при контроле освещения. Части опухолей от пациентов с рецидивирующей папиллярной серозной аденокарциномой яичников стадии IIIC, 3 степени были имплантированы и распространились в мышах SCID с использованием хорошо известных специалистам в данной области процедур. В кратком изложении, ксенотрансплантаты выращивали и пересеивали по крайней мере пять раз перед имплантацией опухоли в организм экспериментальных животных. Части опухолевого ксенотрансплантата человека размером 2-3 мм имплантировали в жировое тело гонады (GFP) методом наложения шва по Sakakibara et al. (1996, Can. J. Sci. Amer., 2:291-300), который включен сюда в качестве ссылки. Опухолевые ксенотрансплантаты в GFP вырастали в большие внутрибрюшинные массы, выявляемые при пальпации живота. Впоследствии каждую мышь подвергали лапаротомии посредством срединного разреза от грудины до гребней подвздошных костей. Окружающие опухоль налипания разрушали и поднимали опухоль из полости брюшины, не повреждая ножку GFP. Размеры опухоли оценивали в трех измерениях с помощью кронциркуля-верньера. Затем опухоль возвращали в ее первоначальное внутрибрюшинное положение, после чего закрывали брюшную полость одним слоем. Через три дня после операции начинали применять протоколы лечения. Выбранные случайным образом мыши составили четыре группы лечения. Первый день внутрибрюшинных инъекций цисплатина или фосфатно-солевого буфера (PBS) был обозначен как нулевой день. Животные группы I (контрольные) получали 100 мкл PBS три раза в неделю подкожно от дня -15 до дня +6 и 300 мкл PBS внутрибрюшинно в день 0. Мыши группы II (группа ЕРО) получали ЕРО подкожно в дозе 20 единиц в 100 мкл PBS три раза в неделю от дня -15 до дня +6 и 300 мкл PBS внутрибрюшинно в день 0. Мыши группы III (группа цисплатина) получали цисплатин внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг в 300 мкл PBS в день 0 и 100 мкл PBS три раза в неделю подкожно от дня -15 до дня +6. Мыши группы IV (ЕРО + цисплатин) получали подкожные инъекции ЕРО, как мыши II группы, от дня -15 до дня +6 и внутрибрюшинно инъекции цисплатина, как мыши III группы, в день 0. Мышей наблюдали до дня 8.

Автоматически определяли гематокрит для образцов крови, взятых в дни -15, -7, 0, +7 из хвоста отобранных случайно трех мышей из каждой группы. В день 7 мышей фиксировали, и проводили их вскрытие. Опухоли отделяли и их размеры оценивали в трех измерениях с помощью кронциркуля-верньера. Объем опухоли рассчитывали следующим образом.

(ширина) × (длина) × (глубина) = объем опухоли

Прирост опухоли в процентах вычисляли по следующей формуле:

[(объем опухоли при вскрытии/изначальный объем опухоли)-1] × 100 = прирост опухоли в процентах

Размер опухолей при изначальной лапаротомии составлял приблизительно 2 см × 1,5 см × 1 см в трех измерениях и был одинаковым в каждой группе лечения. Значимое различие в приросте опухоли наблюдалось между группой животных, получавших цисплатин, и группой, не получавшей его. Различие (Р=0,07), указывающее на повышение эффекта цисплатина при приеме ЕРО, наблюдалось между размерами опухолей мышей, получавших только цисплатин, и мышей, получавших цисплатин плюс ЕРО. Между контрольной группой и группой, получавшей только ЕРО, различий не наблюдалось.

В другой иллюстрации этого осуществления цисплатин назначали дважды в течение лечения. Части ксенотрансплантата рака яичников человека размером 2 мм имплантировали сорока экспериментальным мышам шестинедельного возраста. Животных случайным образом разделили на группы лечения через три дня после имплантации. Животные группы I (контрольные) получали 100 мкл PBS три раза в неделю подкожно от дня -15 до дня +13 и 300 мкл PBS внутрибрюшинно в дни 0 и 7. Мыши группы II (группа ЕРО) получали ЕРО подкожно в дозе 20 единиц в 100 мкл PBS три раза в неделю от дня -15 до дня +13 и 300 мкл PBS внутрибрюшинно в дни 0 и 7. Мыши группы III (группа цисплатина) получали цисплатин внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг в 300 мкл PBS в дни 0 и 1, а также 100 мкл PBS три раза в неделю подкожно от дня -15 до дня +13. Мыши группы IV (группа ЕРО + цисплатин) получали подкожные инъекции ЕРО, как мыши II группы, от дня -15 до дня +13 и внутрибрюшинно инъекции цисплатина, как мыши III группы, в дни 0 и 7. Мышей наблюдали до дня +15.

Гематокрит определяли автоматически, как описано выше, в дни -15, -7, 0, +7 и +14. Был составлен график зависимости изменения гематокрита относительно его изначального значения от времени. Серийные оценки размеров опухолевых узелков проводили в двух измерениях с помощью кронциркуля-верньера, начиная с нулевого дня. К нулевому дню опухоли в каждой группе животных увеличились в размерах примерно до 4 мм × 5 мм. Объем опухолей, соответствующий дням 0, +1, +3, +5, +7, +9, +11, +13 и +15, вычисляли согласно формуле.

(длина) × (ширина) ²/2 = объем опухоли

Прирост опухоли в процентах вычисляли для каждого из дней, когда проводили измерения, по сравнению с днем 0, строили график зависимости прироста от времени. Статистический анализ включал Т-критерий Стьюдента, который применяли к общему приросту опухоли в эксперименте с большими опухолями GFP. Кривые прироста, соответствующие меньшей группе с подкожными опухолями, и кривые, представляющие собой изменения гематокрита в зависимости от времени, подвергали дисперсионному анализу. Статистически значимыми признавали значения Р ниже 0,05.

Когда цисплатин назначался два раза в неделю, наблюдалось значимое различие (р<0,05) между группой, получавшей ЕРО + цисплатин, и группой, получавшей цисплатин (фигура 1). Кривые прироста опухоли, построенные для мышей, несущих подкожные опухолевые узелки, демонстрировали значимо большую регрессию опухоли в группе, получавшей ЕРО + цисплатин, по сравнению с группой, получавшей цисплатин. Снова не наблюдалось различий между контрольными животными и группой, получавшей только ЕРО.

Еженедельные уровни гематокрита и его процентное изменение в зависимости от времени для мышей, несущих маленькие подкожные опухоли, представлены в таблице 1 и на фигуре 2, соответственно. Сходным был гематокрит у мышей, несущих большие опухоли GFP (данные не показаны). Введение ЕРО приводило к 25-35% повышению гематокрита по сравнению с его изначальным уровнем (на 2^ой неделе), и это значимо отличалось от контроля (р<0,01). Цисплатин без ЕРО приводил к 20% снижению гематокрита. Несущие опухоль мыши из контрольной группы характеризовались 2% снижением гематокрита в течение времени (фигура 2).

Таблица 1
Время	Значения гематокрита
	КОНТРОЛЬ	ЕРО	ЦИСПЛАТИН	ЕРО + ЦИСПЛАТИН
Неделя -2	39,5±0,1	39,5±0,2	39,8±0,2	39,6±0,2
Неделя -1	39,7±0,3	44,9±0,2	39,8±0,2	45,1±0,3
Неделя 0	39,8±0,3	48,9±0,3	39,8±0,3	48,9±0,2
Неделя +1	40,8±0,2	49,3±0,3	40,7±0,1	52,7±0,3
Неделя +2	38,6±0,3	53,6±0,4	33,1±0,3	50,9±0,3

Эти данные показывают, что опухолевая регрессия при использовании ЕРО и цисплатина является значимо большей по сравнению с таковой у мышей, которых лечили только цисплатином. Мыши в группе, получавшей ЕРО и цисплатин, характеризовались подъемом гематокрита на 25-35% по сравнению с мышами группы цисплатина.

ПРИМЕР 2

Это осуществление изобретения показывает, что повышение гематокрита уменьшает смертность, связанную с токсичностью противоопухолевых средств. Для иллюстрации этого осуществления оценивали жизненное состояние мышей из примера 1, получавших разные варианты лечения. Оценку жизненному состоянию давали в дни 0, +7 и +14, используя пять объективных критериев заболеваемости и смертности экспериментальных мышей. Эти критерии были следующими: (1) взъерошенная шерсть; (2) слабость/летаргия; (3) 20% потеря веса по сравнению со средним весом мышей контрольной группы; (4) сгорбленная осанка, подобная кифозу; (5) смерть. Число баллов, равное 0, соответствовало нормальному здоровью, а число баллов, равное 5+, означало смерть.

Жизненное состояние, вычисленное для всех мышей в день 0, показало, что мыши во всех группах лечения обладали нормальным здоровьем (число баллов всех мышей = 0). Как показано в таблице 2, в день +7 были замечены признаки заболевания мышей от приема цисплатина (таблица 2). Все мыши из контрольной группы и из группы ЕРО сохранили жизненное состояние на уровне 0 баллов. Из 10 мышей группы цисплатина все имели взъерошенную шерсть, все проявляли признаки слабости/летаргии, а 6 мышей характеризовались 20% потерей веса по сравнению с контрольными мышами на день +7. Все мыши в группе, получавшей ЕРО + цисплатин, имели взъерошенную шерсть, а 7 из них проявляли признаки слабости/летаргии. В день +14 жизненное состояние мышей в группе цисплатина ухудшилось, включая 4 смертельных исхода и сгорбленную осанку у 3 мышей. Только 1 смертельный исход наблюдался в группе, получавшей ЕРО + цисплатин, и кроме того, у одной мыши развилась сгорбленная осанка (таблица 2).

Таблица 2
№МЫШИ	КОНТРОЛЬ	ЕРО	ЦИСПЛАТИН	ЕРО + ЦИСПЛАТИН
1	0	0	+++++	++
2	0	0	+++	+++
3	0	0	++++	+++
4	0	0	+++++	++
5	0	0	+++++	+++
6	0	0	+++	++++
7	0	0	++++	++
8	0	0	+++	++
9	0	0	++++	+++++
10	0	0	+++++	+++
Сумма	0	0	43+	29+

Таким образом, среди животных, которых лечили цисплатином, наблюдалось больше заболеваемости по сравнению с мышами, которых лечили ЕРО + цисплатином. Более того, мыши, получавшие ЕРО, сохраняли лучшее жизненное состояние и характеризовались меньшей заболеваемостью, связанной с получением цисплатина. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, выдвигается гипотеза, что повышенный противоопухолевый эффект, наблюдаемый в группе, получавшей ЕРО + цисплатин, был обусловлен увеличением гематокрита, скорее чем приемлемым рабочим состоянием.

Следует понимать, что поскольку изобретение описано здесь подробно, примеры служат исключительно иллюстративным целям. Подразумевается, что другие модификации осуществления настоящего изобретения, очевидные для специалистов в этой области, находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения.