композиция с антиоксидантными свойствами и способ лечения болезней млекопитающих

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для антиоксидантной защиты клеток, тканей и организма в целом от гиперпродукции свободных радикалов при остром воспалении, химических, термических и радиационных поражениях, содержащая пероксиредоксин Prx VI, отличающаяся тем, что содержит дополнительно дигидролипоевую кислоту и фармацевтически приемлемые добавки, причем содержит пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту в эффективном количестве, а соотношение между пероксиредоксином Prx VI и дигидролипоевой кислотой находится в интервале (ww) от 1:1 до 50:1.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный пероксиредоксин Prx VI является рекомбинантным человеческим пероксиредоксином Prx VI.

3. Способ повышения антиоксидантной защиты млекопитающих, характеризующийся тем, что доставку фармацевтической композиции по любому из пп.1 или 2 осуществляют в межклеточное пространство ткани, органа или всего организма млекопитающего.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что доставку в межклеточное пространство ткани, органа или организма в целом, осуществляют посредством пассивной или активной диффузии при аппликации или распылении, посредством парентрального или эндолюмбального введения путем инъекции, посредством парентрального введения, путем инфузии, ингаляции, дренажа, посредством сублингвального, вагинального, или ректального введения, посредством капель в нос или глаза.

5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что доставку осуществляют одновременно с применением иного терапевтического агента.

6. Способ по п.6, характеризующийся тем, что указанный терапевтический агент является интерфероном.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу и фармацевтической композиции, предназначенным для профилактики и/или лечения патологий, которые частично или полностью вызваны нарушением баланса между окислительными и антиоксидантными процессами в клетках и организмах млекопитающих.

Предшествующий уровень техники

Известен широкий спектр заболеваний, для лечения которых антиоксидантные препараты подтвердили свою эффективность (Babish J.G. et al. PCT Appl. WO 0230419, 2002). К таким заболеваниям относятся: а) болезни легких, б) болезни печени, в) болезни почек, г) болезни кишечного тракта, д) болезни иммунной системы, е) болезни нервной системы, ж) болезни глаз, з) воспалительные процессы, и) болезни сердца, к) вирусные инфекции, например СПИД и другие.

В настоящее время открыт новый класс природных антиоксидантов, хорошо растворимых в воде, обладающих широким спектром антиоксидантной активности и исследованных в экспериментах in vitro. К такому классу относятся тиол-специфические антиоксиданты или пероксиредоксины, которые способны нейтрализовать как органические, так и неорганические соединения в широком диапазоне их концентрации (Chae H.Z. et al., 1994; McGonigle S. et al., 1998). Из экспериментов in vitro известно, что многие из пероксиредоксинов участвуют в процессе пролиферации клеток (Prosperi M.T. et al., 1993; Pesenko I.V. et al., 1998; Novoselov S.V. et al., 1999).

Известны публикации, в которых изучалась роль пероксиредоксинов в клетках при дисфункциях вызванных: артеросклерозом (Butterfield L.H., 1999), раком (Chung Y.M. et al., 2001; Kinnula V.L. et al., 2002), нервными заболеваниями (Kirn S.H. et al., 2001), болезнями легких (Das K.C. et al., 2001; Kim H.S. et al., 2002), болезнями почек (Fujii Т., 2001) болезнями кожи (Lee S.C. et al., 2000), ионизирующей радиацией (Park S.H. et al., 2000).

На основании гомологии аминокислотных последовательностей и иммунологического сродства все известные к настоящему времени пероксиредоксины млекопитающих могут быть классифицированы в следующие группы: Prx I-Prx IV, Prx V и Prx VI. Гомология белков, относящихся к одной и той же группе, составляет более 90%. Пероксиредоксины Prx I-Prx V принадлежат к группе 2-Cys тиол-специфических антиоксидантов. Группа Prx VI, самая малочисленная, представлена 1-Cys пероксиредоксинами, сильно отличается от других групп и имеет только 20-40% общих аминокислотных последовательностей с пероксиредоксинами других групп.

Семейство пероксиредоксинов отличается высокой консервативностью, и его представители обнаружены в геномах практически всех живых организмов от бактерий до человека. Согласно данным иммуногистохимических исследований, полученных с помощью световой микроскопии и in situ гибридизации, пероксиредоксин Prx VI обнаруживается практически во всех тканях животного. Однако его максимальная концентрация выявлена преимущественно в тканях, непосредственно контактирующих с атмосферой, а именно: в обонятельном эпителии, трахее, бронхах легких, эпидермисе кожи и волосяных фоликулах (Novoselov S.V et al., 1999). Иммуногистохимические исследования с помощью электронной микроскопии показали, что Prx VI является единственным идентифицированным к настоящему времени секреторным пероксиредоксином. Он синтезируется в специализированных клетках (бокаловидные клетки респираторного эпителия и опорные клетки обонятельного эпителия) и секретируется в слизь, покрывающей клетки этих эпителиальных тканей. Прямыми биохимическими и иммунологическими исследованиями на крысе было показано, что в трахее, бронхах легких и обонятельном эпителии вклад 28-кДа Prx VI в нейтрализацию активных форм кислорода составляет 70-80%. Аналогичные результаты были получены для трахеи и бронхов человека. Например, в составе слизи эпителия трахеи концентрация Prx VI составляет не менее 15 мкг/мг белка.

Известен способ лечения, основанный на повышении уровня пероксиредоксина в клетке с помощью генной терапии. Для этой цели используют вектор, созданный генно-инженерным способом, с помощью которого трансформируют клетки животных. В состав вектора введен ген, кодирующий последовательность пероксиредоксина, выделенного из гельминтов (Chandrashekar R. et al., US Patent 6352836, 2002). Одновременно с применением вектора авторы предлагают дополнительно использовать белок в качестве средства для стимуляции иммунной системы животных. Следует отметить, что применение генотерапии для лечения млекопитающих не получило быстрого развития из-за дороговизны и выявления большого числа побочных эффектов.

Известны исследования по выделению натурального пероксиредоксина (Prx VI) из обонятельных органов крыс и последующего применения выделенного препарата для воздействия на химический ожог органов дыхания крыс (Novoselov V.I. et al., 2000).

Недостатком способа выделения препарата из обонятельных органов является невозможность его применения при получении натурального пероксиредоксина человека в препаративных количествах.

Известен способ для лечения вирусных заболеваний, в том числе СПИДа (HIV-1), в котором в качестве основного компонента лекарственного средства используют натуральные и рекомбинантные пероксиредоксины, имеющие протеазную активность (Walker B.D., Lynn R.G. PCT appl. WO 02077294, 2002). Авторы обнаружили противовирусные свойства пероксиредоксинов по защите клеточных мембран от проникновения вирусов в клетку при введении разовой дозы от 100 до 1000 мг пероксиредоксина в зависимости от веса пациента.

Задачей настоящего изобретения является расширение спектра эффективных фармакологических композиций и повышение их эффективности для лечения и предотвращения болезней, связанных с гиперпродукцией свободных радикалов, вызываемых экзогенными и эндогенными факторами.

Сущность изобретения

Предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для антиоксидантной защиты клеток, тканей и организма в целом от гиперпродукции свободных радикалов при остром воспалении, химических, термических и радиационных поражениях, которая в качестве основного действующего вещества содержит эффективное количество пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты и фармацевтически приемлемые добавки. При этом соотношение между пероксиредксином Prx VI и дигидролипоевой кислотой находится в интервале (w/w) от 1:1 до 50:1.

Другим объектом изобретения является способ профилактики и лечения, в соответствии с которым доставку композиции в межклеточное пространство ткани, органа или организма в целом осуществляют либо посредством пассивной или активной диффузии при аппликациях или распылении, либо за счет доставки с помощью инъекций в кровь, лимфу, спинно-мозговую жидкость.

Для доставки используют парентральное или эндолюмбальное введение с помощью инъекции или используют парентральное введение с помощью инфузий, ингаляций, введение в дренаж, или используют сублингвальный, вагинальный, ректальный ввод, или используют капли в нос или глаза.

Дополнительно используют терапевтический агент, который применяют одновременно, предварительно или после применения композиции, включающей пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту.

Перечень фигур

Фиг.1. Включение ³ H-тимидина в стимулированные конканавалином А лимфоциты мыши в присутствии Prx VI. Где: 1 - среда, 2 - Т-клетки без стимуляции конканавалином А, 3 - Т-клетки, стимулированные конканавалином А, 4 - Т-клетки в присутствии Prx VI, 5 - Т-клетки, стимулированные конканавалином А в присутствии Prx VI.

Фиг.2. Влияние Prx VI на спектральные характеристики облученного оксигемоглобина. Где: 1 - оксигемоглобин; 2 - оксигемоглобин после гамма-облучения в присутствии 0,05 мг/мл Prx VI; 3 - оксигемоглобин после гамма-облучения в присутствии 0,01 мг/мл Prx VI; 4 - оксигемоглобин после гамма-облучения. Видно, что при концентрации 0,05 мг/мл Prx VI полностью предотвращает превращение оксигемоглобина в метгемоглобин.

Фиг.3. Внешний вид крыс через 12 месяцев после гамма-облучения (600 рентген). Где: А - контроль; В - крыса с введенным перед облучением Prx VI.

Фиг.4. Эпителий трахеи крысы после ожога парами соляной кислоты и последующей аппликации натурального крысиного или рекомбинантного человеческого Prx VI. Аппликация проводилась через 1 час после ожога. Где: А - контроль; В - эпителий через сутки после химического ожога; С - эпителий через сутки после химического ожога с аппликацией Prx VI через час после ожога; Е - эпителий трахеи; ВМ - базальная мембрана. Наблюдается практически полное сохранение всех клеток эпителия.

Фиг.5. Восстановленный клеточный эпителий трахеи крысы через 14 дней после ожога парами соляной кислоты. Где: А - контроль; В - эпителий через 14 суток после химического ожога; С - эпителий через 14 суток после химического ожога с аппликацией Prx VI, Е - эпителий трахеи; ВМ - базальная мембрана, F - фагоциты. Терапию проводили через сутки после ожога в течение 5 дней. Аппликацию раствора фармацевтической композиции на основе рекомбинантного человеческого Prx VI проводили один раз в сутки.

Фиг.6. Эпителий трахеи крысы после аппликации липополисахарида. Где: А - норма; В - через час после аппликации; С - через 3 часа после аппликации; Е - эпителий трахеи; ВМ - базальная мембрана; F - фагоциты. Наблюдается значительная гибель клеток эпителия и появление большого количества фагоцитирующих клеток.

Фиг.7. Эпителий трахеи крысы после аппликации в нее липополисахарида и последующей аппликации рекомбинантного человеческого Prx VI. Где: Е - эпителий трахеи; ВМ - базальная мембрана; F - фагоциты. Аппликация Prx VI проводилась сразу после аппликации липополисахарида.

Фиг.8. Сравнительные характеристики активации пероксиредоксина Prx VI разными тиолами. Антиоксидантная активность определялясь по степени защиты глутаминсинтетазы против металл-катализируемой окислительной системы. Степень активации пероксиредоксина Prx VI определялась в молярной концентрации, при которой происходила 50% защита глутаминсинтетазы. Типы тиолов: 1 - дитиотрейтол; 2 - дигидролипоевая кислота, 3 - липоевая кислота.

Фиг.9. Эффект аппликации Prx VI на рану, где а) контроль, б), в), г) - концентрация пероксиредоксина составляет соответственно: 1,0; 0,1; 0,2 мг/мл.

Фиг.10. Эффект аппликации дигидролипоевой кислоты на рану, где а) контроль, б), в), г) - концентрация дигидролипоевой кислоты составляет соответственно: 1,0; 0,5; 0,1 мг/мл.

Фиг.11. Эффект аппликации пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты, где а) контроль, б), в), г) - варианты, при которых соотношение между постоянной концентрацией пероксиредоксина, (1,0 мг/мл) и изменяемой концентрацией дигидролипоевой кислоты составляет: 20:1; 2:1; 5:1 соответственно.

Описание изобретения

Отмечая важную роль синтеза пероксиредоксинов в клетках в ответ на оксидантный стресс, авторы известных публикаций предлагали повышать содержание разных типов пероксиредоксинов в самой клетке.

В процессе экспериментов по моделированию экзогенных и эндогенных воздействий на организм животных обнаружен неочевидный факт, связанный с тем, что доставка в межклеточное пространство ткани, органа или организма млекопитающего водорастворимого антиоксиданта пероксиредоксина Prx VI и активатора в виде дигидролипоевой кислоты, приводит к высокой эффективности профилактики и/или лечения большой группы заболеваний вызванных гиперпродукцией свободных радикалов.

Этот факт дает возможность осуществить заявленный технический результат, связанный с расширением спектра эффективных фармакологических композиций для лечения и предотвращения болезней, вызываемых экзогенными и эндогенными факторами.

Другой заявленный технический результат изобретения, относящийся к повышению эффективности профилактики и/или лечения, достигается тем, что введение в состав композиции пероксиредоксина PrxVI и дигидролипоевой кислоты приводит не к аддитивному, а к неочевидному, синергетическому эффекту взаимодействия антиоксидантов в межклеточном пространстве. Результаты экспериментов по применению разных вариантов композиций (с разным соотношением концентраций между пероксиредоксином и дигидролипоевой кислотой, в интервале (w/w) от 1:1 до 50:1) для лечения ран, показали, что синергетический эффект от одновременного воздействия на межклеточное пространство пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты позволяет повысить эффективность антиоксидантной защиты млекопитающих. При этом дополнительно осуществляется возможность предупреждения развития вторичных альтеративных нарушений при химических и термических ожогах и от воздействия облучения.

Повышение антиоксидантной защиты млекопитающих от гиперпродукции свободных радикалов вызванной экзогенными и/или эндогенными факторами.

Многофункциональность применения пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты как компонентов эффективных композиций для профилактики и лечения болезней, связанных с гиперпродукцией свободных радикалов, подтверждена примерами профилактики и лечения заболеваний млекопитающих. Заболевания могут быть вызваны как экзогенными, так и эндогенными факторами, входящими в группу: а) ионизирующей радиации, б) химического ожога, в) острого воспалительного процесса, г) раны. Приведенные примеры включают, но не ограничивают других применений пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты для профилактики и/или лечения.

В общем случае способ повышения антиоксидантной защиты млекопитающих от гиперпродукции свободных радикалов в тканях или органах или во всем организме млекопитающих, заключается в доставке активного начала фармацевтической композиции включающей пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту, а также фармацевтически приемлемые добавки в межклеточное пространство тканей, органов или в организм млекопитающего в целом.

Предлагаемый способ относится к разным вариантам профилактики или лечения тканей, органов или всего организма млекопитающих в целом, включая:

А) профилактическую защиту организма, отдельных органов и отдельных зон нормальной ткани от гиперпродукции свободных радикалов. Возникновение гиперпродукции радикалов вызывается: а) ионизирующей радиацией, например, при проведении лечения рака, или при полетах на больших высотах и в космическом пространстве, б) действием термического и/или химического ожогов при ликвидации катастроф и пожаров, в) комбинацией факторов по п. а), б).

Б) защиту тканей, органов и организма млекопитающих, в которых за счет эндогенных или экзогенных факторов идет воспалительный и/или иммунный процесс, связанный с гиперпродукцией свободных радикалов. Гиперпродукция радикалов сопутствует или вносит основной вклад в процесс болезней легких, печени, почек, желудочно-кишечного тракта, иммунной системы, нервной системы, болезни глаз, воспалительных процессов, вызванных бактериальной или вирусной инфекциями, или защиту клеток организма при предотвращении последствий химиотерапии при лечении рака, лейкоза, СПИДА, или защиту от действия озона или других экзогенных факторов.

В) защиту органов, предназначенных для трансплантации, или для улучшения возможности криоконсервации.

Д) защиту органов от воспалительных процессов, вызванных механическими повреждениями кожи и ткани в результате травм, инъекций лекарственных препаратов или хирургических операций.

В зависимости от вида терапии или профилактики определяют длительность применения и дозовые характеристики лекарственных препаратов, содержащих состав композиции. Для уточнения значения дозовых характеристик можно измерять концентрацию пероксиредоксина Prx VI в биологических пробах (см. пример 8). Исходя из тяжести воспалительного процесса определяют минимально эффективное количество фармацевтической композиции и проводят лечение. Возможно применение композиции с профилактической целью.

Процедуру лечения выбирают из группы: а) однократной или многократной аппликации или распыления раствора фармацевтической композиции или лекарства на пораженный участок; б) однократных или многократных инъекций раствора фармацевтической композиции; в) однократного или многократного приема таблетированных, порошковых или жидких форм сублингвально, или в виде присыпок, паст, свечей, мазей, гелей для нанесения на поверхность кожи и эпителия, или за счет комбинации указанных способов.

В процессе этиотропной терапии ввод лекарств, содержащих пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту, осуществляют через капельницу в течение периода вывода из организма ядов или других экзогенных веществ. Наиболее предпочтительно применение композиций и лекарств, содержащих пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту, для проведения комплексных терапий. В последнее время в связи с широким распространением сердечно-сосудистых заболеваний, иммунной системы, лечением СПИД, алкогольной и наркологической зависимости препараты на основе пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты можно использовать в поддерживающей терапии наряду с другими препаратами длительного применения.

Доставку композиции в межклеточное пространство ткани, органа или организма можно осуществить различными способами. Поскольку пероксиредоксин подвержен расщеплению и потере биологической активности при прохождении через желудочно-кишечный тракт, основным способом введения является парентральный метод. При парентральном введении используют инъекции, инфузии, ингаляции, введение в дренаж. Раствор для инъекций вводят внутримышечно, внутривенно в кровь, лимфу, спинно-мозговую жидкость, ударными дозами или длительными инфузиями, внутриартериально; интратекально, интравентрикулярно, эндолюмбально. Возможно использовать раствор, порошок или таблетированные формы сублингвально. В ряде случаев требуется вагинальный и ректальный ввод препаратов. Возможно введение композиции с помощью капель в нос или глаз или с помощью промывания или клизм.

Способы доставки композиции к месту воспаления эпителиальных тканей, приведенные в данном описании, не ограничивают применения других известных способов доставки биологически активных полипептидов к месту воспаления или поражения.

Например, при лечении воспалительных процессов верхних дыхательных путей композицию, содержащую пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту, вводят в нос, и/или в трахею, и/или в бронхи легкого. Для аппликации используют или раствор композиции, или предварительно раствор распыляют, превращая его в воздушно-капельную смесь. Возможно применение композиции, выполненной в виде сухого мелкодисперсионного порошка, или композиции, которая иммобилизована в мелкодисперсные гранулы или наночастицы диаметром от 0.1 до 7000 нм (например, Esenaliev, 2000), или композиции иммобилизованной в липосомы (например, Thibeault D.W.et al., 1991).

При лечении поражений кожи композицию наносят тонким слоем и/или делают аппликацию на место поражения. Способы доставки композиции к месту воспаления эпителиальных тканей, приведенные в данном описании, не ограничивают применения других известных способов доставки биологически активных полипептидов к месту воспаления или поражения.

Пероксиредоксин Prx VI и дигидролипоевую кислоту как радиопротектор можно использовать в качестве компонента лекарств и фармацевтических композиций для профилактики или лечения широкого спектра заболеваний. Заболевания могут быть вызваны: а) ионизирующей радиацией (в первую очередь при радиотерапии, профилактических исследованиях, при работе персонала с источниками радиации); б) космической радиацией, влияющей в первую очередь на космонавтов и пилотов; в) радионуклеотидным заражением из-за приема зараженной радионуклеотидами пищи, воды или воздуха; г) воздействием неионизирующей радиации, например при томографическом исследовании; д) воздействием на организм источников ультрафиолетового излучения (солнечный свет, сварка, импульсные источники света, дисплеи). Для предотвращения или снижения действия гиперпродукции свободных радикалов возможно применение антидотов, которые содержат пероксиредоксины. Состав антидотов должен быть ориентирован на тот тип экзогенного воздействия, который существует в зоне, в которой необходимо осуществлять работы по ремонту оборудования, или устранения аварий, или устранения последствий катастроф.

При профилактике или лечении заболеваний, связанных с ионизирующим или неионизирующим воздействием на организм млекопитающего, эффективное количество пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты выбирают в зависимости от интенсивности ионизирующего или неионизирующего воздействия, учитывая параметры млекопитающего (его вес, возраст, состояние организма). В процессе лечения или профилактики выбранный состав композиции вводят однократно или многократно до воздействия, во время воздействия или после воздействия организма с радиацией или неионизирующим излучением.

Для антиоксидантной защиты клеток, тканей и организма в целом от воздействия нескольких факторов, (например, от действия ионизирующей радиации, и/или термического и/или химического ожога, и/или от заражения организма радионуклеидами через пищу, воду или воздух), используют комбинированный способ применения композиций, который состоит из внутривенных инъекций и дополнительных аппликаций на место поражения, что позволяет снизить токсикацию организма и предотвратить процесс неконтролируемой гибели клеток.

Фармацевтическая композиция

Известны способы получения натурального и рекомбинантного пероксиредоксинов. В рамках настоящего изобретения натуральный Prx VI выделяли из органов млекопитающих (Pesenko I.V. et al., 1998). Рекомбинантный белок можно получить, используя различные экспрессионные системы (Sang W.К. et al., 1998; Chen J.W. et al., 2000; Peshenko I.V. et al., 2001). Варианты получения натурального и рекомбинантного Prx VI с помощью известных способов приведены в разделе материалы и способы (примеры 1-2).

Первичная структура Prx VI крысы (Андреева С.Г. и др., 1998) содержит 223 аминокислоты с рассчитанной молекулярной массой 24630 Да. (EMBL/GenBank, Y17295). Ген, кодирующий Prx VI человека (Nagase Т. et al., 1995), выделен из клеток миелобласта (EMB/GenBank D1 4662). По данным электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия молекулярный вес определен как 28 кДа.

Синтезированный рекомбинантный Prx VI (см. пример 2) сравнивали с натуральным Prx VI крысы, который выделяли из обонятельного эпителия крысы линии Вистар (см. пример 1).

Результаты испытаний (см. пример 3) показали, что рекомбинантный Prx VI имеет антиоксидантные характеристики, близкие характеристикам Prx VI, который выделен из обонятельного эпителия крысы.

В фармацевтической композиции возможно использовать другие типы пероксиредоксинов (Prx I-Prx IV) поскольку распределение концентраций разных типов пероксиредоксинов различно в зависимости от типа ткани или органа (Knoops В. et al., 1999). Предпочтительно использовать рекомбинантный человеческий пероксиредоксин типа Prx VI, который обладает более сильными антиоксидантными характеристиками по сравнению с I-V типами пероксиредоксинов.

Для лечения воспалительных процессов минимальную концентрацию пероксиредоксина Prx VI в составе композиции определяют, во-первых, исходя из эффективной концентрации пероксиредоксина Prx VI при защите биомакромолекул от активных форм кислорода in vitro и, во-вторых, исходя из концентрации пероксиредоксина Prx VI в ткани в норме.

В зависимости от тяжести воспалительного процесса и выбранного способа лечения концентрация пероксиредоксина Prx VI в жидкой форме фармацевтической композиции может выбираться от 0.01 до 10.0 мг/мл.

Например, в случае поражения органов дыхания крысы раствором липополисахарида и в случае химического ожога эмпирически полученная концентрация пероксиредоксина Prx VI в составе композиции составила 0.5-1.0 мг/мл при аппликации 20-50 мкл его раствора непосредственно в трахею, что соответствовало от 10 до 50 мкг пероксиредоксина Prx VI на крысу. Учитывая площадь поверхности трахеи крысы, это соответствует аппликации 5-10 мкг пероксиредоксина Prx VI на 1 см² пораженной ткани. Это количество пероксиредоксина Prx VI может быть использовано при аппликации на пораженную ткань для любого млекопитающего, включая человека.

В случае применения пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты в качестве радиопротектора количество пероксиредоксина Prx VI, вводимого в организм перед облучением, может выбираться от 1 до 10 мг/кг веса животного и зависит от мощности излучения. В случае сублетальной дозы гамма-облучения эмпирически полученное количество пероксиредоксина Prx VI составило 2-5 мг/кг веса животного при инъекции 1 мл его раствора в вену. Это количество пероксиредоксина Prx VI может быть использовано при введении для любого млекопитающего, включая человека.

Так как пероксиредоксин Prx VI является хорошо растворимым белком, в качестве растворителей для создания композиций могут быть использованы водные растворы, физ. раствор, раствор Рингера и другие сбалансированные солевые растворы (Dawson R.M., 1986), а также растворы на основе моно- или полисахаридов, например глюкозы, и/или содержащие витамины. Эти же растворители могут быть использованы при создании композиции в воздушно-капельной форме, например в форме спрея.

В процессе экспериментов по моделированию экзогенных и эндогенных воздействий на организм животных исследовались различные типы активаторов. Классическим активатором пероксиредоксинов является дитиотрейтол (Novoselov S.V. et al., 1999). Однако ввиду его токсичности применение его в лекарственных формах исключается. Одним из естественных активаторов пероксиредоксина VI является дигидролипоевая кислота, которая нетоксична и может быть получена восстановлением S-S связи широко используемой в медицине альфа-липоевой кислоты (1,2-дитиолан-3-пентановая кислота) (Sang W.К. et al., 1998). Дигидролипоевая кислота как активатор пероксиредоксина, исследована в работе (Peshenko I.V. Shichi H., 2001) в in vitro экспериментах. Синергетический эффект от применения дигидролипоевой кислоты в качестве активатора пероксиредоксина in vivo продемонстрирован в примере 5.

Концентрацию дигидролипоевой кислоты в жидкой форме композиции выбирают в пределах от 0.01 до 10 мг/мл в зависимости от концентрации пероксиредоксина (см. фиг.9). Отношение пероксиредоксина к дигидролипоевой кислоте (w/w) составляет от 1:1 до 50:1.

Жидкая форма композиции:

а) для внутривенного введения содержит от 0,01 до 0,5% (от 0,1 до 5 мг/мл), предпочтительно от 0,01 до 0,1% (от 0,1 до 1 мг/мл), основного действующего вещества пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты;

б) для обработки раневых поверхностей содержит от 0,1 до 1,0% (от 1 до 10 мг/мл) основного действующего вещества пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты;

в) для глазных капель содержит от 0,1 до 0,3% (от 1 до 3 мг/мл) основного действующего вещества;

При создании жидких сред используют растворитель, выбираемый из группы: а) сбалансированного солевого раствора, б) сбалансированного солевого раствора и активатора пероксиредоксина в концентрации от 0,01% до 1,0% (w/w).

Мазевая форма или форма для суппозитарного введения (свечи для ректального или для интравагинального введения) содержит от 0,1 до 1,0 мас.% основных действующих веществ пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты.

Концентрация пероксиредоксина в составе порошка составляет от 0,1 до 90 мас.%. В таблетированной форме, которую используют сублингвально, концентрация пероксиредоксина может составлять от 0,01 до 1,0 мас.%.

При создании лиофилизированных форм в качестве стабилизаторов используют один или более: моно- или полисахариды или сахарные спирты, аминокислоты, низкомолекулярные белки, которые используют для стабилизации и последующей лиофилизации композиции.

Лиофилизированные формы могут быть использованы для приготовления жидких форм композиции и порошков выбираемых из группы: порошок для приготовления инъекционных, инфузионных растворов, порошок для ингаляций, порошок для применения в мазях, гелях, суспензиях, порошок для приготовления таблетированных форм. Концентрация активного начала пероксиредоксина в лиофилизированных формах может составлять от 10,0 до 90,0 мас.%.

Возможно применение композиции, включающей пероксиредоксин и активатор, совместно с по крайней мере, одним терапевтическим агентом широкого спектра действия.

Терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из: а) антибактериальных, антивирусных, антигрибных, антигистаминных препаратов, гормонов, витаминов, цитокинов; б) высокомолекулярных ферментов, которые обеспечивают дополнительную защиту от свободных радикалов (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза);

в) низкомолекулярных соединений, обеспечивающих дополнительное снижение уровня свободных радикалов внутри клетки (токоферол глютатион, убихинон); г) препаратов, используемых для трансплантации или криоконсервации органов; д) биологически активных белков, например инсулина.

Терапевтический агент, применяемый совместно с пероксиредоксином, не должен ингибировать биологическую активность пероксиредоксина как фермента.

При генерализации воспалительного процесса (например, при возникновении сепсиса) с вовлечением нескольких органов и/или систем рекомендуется проводить комбинированную терапию и использовать антибиотики и/или глюкокортикоиды в комбинации с применением пероксиредоксина и активатора.

Представленные формы композиции и способы ее применения не ограничивают других вариантов, которые известны из области медицины или ветеринарии при применении антиоксидантной терапии. Вариации, вытекающие из данного изобретения и очевидные каждому специалисту, имеющему средний уровень знаний в данной области, должны рассматриваться в рамках предлагаемого изобретения.

1. Материалы и способы для получения пероксиредоксина и исследования его свойств.

Известно несколько способов получения пероксиредоксинов, В рамках настоящего изобретения пероксиредоксин выделяли из органов млекопитающих (Pesenko I.V. et al. 1998), или получали рекомбинантный белок, используя различные экспрессионные системы (Sang Won Kang et al. 1998, Chen J.W. et al. 2000).

Пример 1. Получение натурального Prx VI пероксиредоксина крысы

Получение натурального Prx VI пероксиредоксина крысы проводили по следующей процедуре. Натуральный Prx VI пероксиредоксин крысы выделяли из обонятельного эпителия крысы линии Вистар, который содержит максимальное количество этого белка. Изолированный обонятельный эпителий дважды промывали в физиологическом растворе и гомогенизировали в нем же. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 500g, супернатант повторно дважды центрифугировали при 20000g и диализовали в течение 12 часов против раствора А, в состав которого входит: 12 мМ Трис/HCl, рН 7.8, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитола. После диализа экстракт наносили на хроматографическую колонку (305×12.5 мм), заполненную гелем ДЭАЭ-сефарозой (DEAE-Sepharose, Pharmacia) и предварительно уравновешенную раствором А. Белки элюировали при линейном изменении градиента NaCl от 0 мМ до 500 мМ в растворе А при 17°С. Объем раствора составлял 750 мл, скорость элюции 0.7 мл/мин. Фракции анализировали по антиоксидантной активности. Фракции, содержащие Prx VI пероксиредоксин, концентрировали и затем хроматографировали на колонке, заполненной гелем Sephacryl S-200 (820×16 мм). Колонку элюировали буфером Б: 25 мМ Трис/HCl, рН 7.8, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитол. Скорость элюции - 0.6 мл/мин при 4°C. Фракции, содержащие Prx VI пероксиредоксин, собирали, концентрировали, диализовали против физиологического раствора и использовали в дальнейших экспериментах.

Пример 2. Получение человеческого рекомбинантного Prx VI пероксиредоксина

Человеческий рекомбинантный Prx VI пероксиредоксин получали следующим образом. Комплементарная ДНК, кодирующая человеческий Prx VI пероксиредоксин, была выделена из клона НА0683 (Nagase Т. et al., 1995) (GenBank, D 14662) известными методами. Затем ДНК была клонирована в экспрессионную плазмиду рЕТ-23а (+) фирмы Novagen no сайтам рестрикции NdeI и EcoRI, с помощью рестрикционных ферментов фирмы MBI Fermentas. Полученную плазмиду использовали для трансформации клеток E.coli (штамм BL 21 (DE3), из библиотеки штаммов ИБФМ РАН) для получения рекомбинантного человеческого Prx VI пероксиредоксина. Клетки E.coli, экспрессирующие пероксиредоксин, разрушали ультразвуком на генераторе УЗДН-2 при частоте 22 кГц в течение пяти минут при 0°С. Гомогенат центрифугировали 5 мин при 500 g, супернатант повторно дважды центрифугировали при 20000 g и диализовали в течение 12 часов против раствора А (см. пример 2). Рекомбинантный Prx VI пероксиредоксин выделяли по методу выделения натурального крысиного Prx VI пероксиредоксина (см. пример 1).

Пример 3. Сравнительные характеристики крысиного натурального и человеческого рекомбинантного натурального пероксиредоксинов Prx VI.

Рекомбинантный человеческий пероксиредоксин Prx VI (GenBank, D 14662) сравнивают по фактору антиоксидантной активности с натуральным крысиным пероксиредоксином Prx VI (EMBL/GenBank, Y 17295). Для определения активности пероксиредоксина Ргх VI используют его способность защищать глутаминсинтетазу против ДТТ/Fe⁺³/О₂ окислительной системы. Инкубационную смесь объемом 60 мкл, которая содержит 5 мкг глутаминсинтетазы, 3 мМ ДТТ, 3 мкМ Fe³⁺, 50 мМ HEPES, рН 7.3, инкубируют 10 мин при 37°С. В качестве активатора Prx VI пероксиредоксина используют дигидролипоевую кислоту в концентрации 3 мМ. Остаточную активность глутаминсинтетазы определяют приливанием к пробе 200 мкл реакционной смеси, которая содержит: АДФ - 0.4 мМ, глутамин - 150 мМ, K-AsO₄ - 10 мМ, NH₂OH - 20 мМ, MnCl₂ - 0.4 мМ, HEPES - 100 мМ рН 7.4. После инкубации в течение 10 мин при 37°С, к пробе приливают 100 мкл красителя. В состав красителя входит: 5,5 г FeCl₃·6Н ₂О, 2 г ТХУ, 2.1 мл конц. HCl (38%) на 100 мл Н₂ О. Степень активности пероксиредоксина определяют по значению концентрации белка, при которой наблюдалось 50% сохранение активности глутаминсинтетазы. Рекомбинантный пероксиредоксин Prx VI имеет антиоксидантные характеристики, близкие к натуральному крысиному пероксиредоксину Prx VI. В дальнейшем человеческий рекомбинантный пероксиредоксин Prx VI используют для отработки способов лечения или в качестве компонента фармацевтических композиций.

Пример 4. Определение цитотоксичности пероксиредоксина Prx VI

Цитотоксичность пероксиредоксинов определяют по влиянию Prx VI пероксиредоксина на уровень пролиферации клеток линии L929 лимфобластомы человека и Т-лимфоцитов из селезенки мышей линии NRRI, стимулированных конканавалином А.

Клетки двух линий с концентрацией 10⁴ клеток/мл среды культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% бычьей эмбриональной сыворотки. Стимуляцию Т-лимфоцитов проводили при концентрации конканавалина А 0.1 мкг/мл. В случае Т-лимфоцитов уровень пролиферации определяли по включению ³H-тимидина. Количество живых клеток линии L929 определяли в 96-луночной плашке с помощью красителя тренанового с последующим сканированием на многоканальном фотометре Мультискан (LKB, Швеция).

Натуральный крысиный и рекомбинантный человеческий Prx VI пероксиредоксины (в концентрации 0,1-10 мг/мл) не оказали никакого влияния на количество живых клеток линии L929.

В случае Т-лимфоцитов, стимулированных конканавалином А, уровень пролиферации клеток увеличивался примерно в 2 раза в присутствии натурального крысиного или рекомбинантного человеческого Prx VI пероксиредоксина (в концентрации 0.1-1.0 мг/мл) по сравнению с просто стимулированными конканавалином А клетками (см фиг.1). Таким образом, можно сделать вывод о том, что тестированные соединения являются малотоксичными.

Пример 5. Сравнительные характеристики активаторов пероксиредоксина.

Для определения эффективности активации Prx VI дитиотреитолом и дигидролипоевой кислотой (натуральный активатор) использовалась способность пероксиредоксина защищать глутаминсинтетазу от инактивации, вызванной металл-катализируемой окислительной системой. Инкубационная смесь объемом 60 мкл содержала 5 мкг глутаминсинтетазы, 50 мкг Prx VI, 3 мМ аскорбиновой кислоты, 3 мкМ Fe⁺³, 50 мМ HEPES, рН 7.3 и дитиотреитол или дигидролипоевую кислоту разных концентраций, инкубировалась 10 мин при 37°С. Остаточную активность глутаминсинтетазы определяли приливанием к пробе 200 мкл реакционной смеси (АДФ - 0.4 мМ, глугамин - 150 мМ, K-AsO₄ - 10 мМ, NH₂OH - 20 мМ, MnCl₂ - 0.4 мМ, HEPES - 100 мМ, рН 7.4). После инкубации в течение 10 мин при 37°С, к пробе приливали 100 мкл красителя. В состав красителя входит 5,5 г FeCl₃ ·6Н₂О, 2 г ТХУ, 2.1 мл конц. HCl (38%) на 100 мл Н₂О. Степень активности пероксиредоксина определяли по значению концентрации белка, при которой наблюдалось 50% сохранение активности глутаминсинтетазы.

На фиг.8 представлена степень защиты глутаминсинтетазы в зависимости от концентрации тиолов. Как видно из графиков, антиоксидантная эффективность дигидролипоевой кислоты практически идентична дитиотреитолу.

Пример 6. Распределение пероксиредоксина Prx VI в организме животного после его инъекции.

Для выявления распределения экзогенгного пероксиредоксина Prx VI в различных тканях организма в вену крысы вводился рекомбинантный человеческий Prx VI, меченный флуоресценизотиоцианатом в количестве 10 мг на животное. Через определенные промежутки времени животных убивали, выделяли ткани различных органов и проводили люминесцентный анализ полученных образцов. Полученные данные показали, что через 15 минут после инъекции меченного пероксиредоксина Prx VI, последний равномерно распределяется по всем органам крысы, включая мозг. Исключение составляет костный мозг, где количество экзогенного пероксиредоксина Prx VI было мало по сравнению с другими тканями. Таким образом, способ введения пероксиредоксина Prx VI с помощью инъекции в вену позволяет повысить его содержание практически во всех тканях организма.

2. Материалы и способы для определения пероксиредоксина в пробах и анализ свойств пероксиредоксина в исследованиях in vitro и in vivo.

Пример 7. Защита оксигемоглобина от действия ионизирующего облучения с помощью пероксиредоксина Prx VI.

Проведенные эксперименты показали, что после воздействия на млекопитающих летальной дозы облучения клеточные возможности синтеза антиоксидантных ферментов ограничены и их концентрации не хватает даже при предварительной стимуляции клеточного синтеза пероксиредоксина.

Для проверки возможности защиты пероксиредоксинами биомакромолекул от деструкции, вызванной ионизирующим излучением, было исследованы характеристики облученного оксигемоглобина в контроле и в присутствии пероксиредоксина Prx VI. В контроле использовали раствор оксигемоглобина (0.16 D при 540 нм) в 0.1 М трис-HCl (рН 7.0), который облучали в установке ГУБЕ с общей дозой облучения 10 Гр. В качестве радиопротектора использовали пероксиредоксин Prx VI при различных концентрациях (0,005-0,1 мг/мл) в присутствии 50 мкМ дитиотреитола в качестве активатора пероксиредоксина. Образование окисленных форм оксигемоглобина (метгемоглобин) регистрировали при 635 нм, а агрегацию метгемоглобина регистрировали при 700 нм.

Облучение раствора гемоглобина приводит к существеннным изменениям в структуре. гемоглобина (появление пиков при 635 нм и повышение светорассеивания, см. фиг.2), что свидетельствует о превращении оксигемоглобина в метгемоглобин с последующей его агрегацией.

Добавление Prx VI в раствор гемоглобина в концентрации около 0,05 мг/мл до облучения приводит к значительному снижению образования окисленных форм гемоглобина, концентрация которых снижалась практически до нуля.

Пример 8. Определение пероксиредоксина Prx VI в биологических пробах.

Поликлональные кроличьи антитела против рекомбинантного пероксиредоксина получали стандартным способом путем двухкратной иммунизации животного рекомбинантным человеческим пероксиредоксином. Титр полученных антител по ELISA составил 1:10000, по иммуноблотингу - 1:2000. Специфичность антител проверяли иммуноблотингом с использованием водорастворимого экстракта трахеи человека и иммуногистохимическими методами, используя парафиновые срезы легких человека, которые показали высокую степень специфичности полученных антител.

Очищенные кроличьи антитела получали из сыворотки осаждением сульфатом аммония с последующей хроматографией на ДЭАЭ целлюлозе. Конъюгаты антител с пришитой пероксидазой хрена плучали стандартным методом перийодатного окисления по способу Вильсона и Накане с молярным отношением иммуноглобулина к пероксидазе, равным 1:3.

Титр конъюгата для человеческого пероксиредоксина составил: для ELISA 1:1000 и для иммуноблотинга и иммуногистохимии 1:500. Специфичность конъюгата соответствовала специфичности сыворотки, которая была использована для получения IgG.

Протокол иммуноферментного определения пероксиредоксина Prx VI в биологических пробах:

1. В лунки плашки заливают 200 мкл раствора иммуноглобулина G против человеческого рекомбинантного пероксиредоксина (разведение 1:1000) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.

2. Плашки промывают физраствором (3×5 мин) и блокируют 1% сухим молоком в течение 30 мин при комнатной температуре.

3. В лунки заливают 200 мкл исследуемых проб и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.

4. Плашки промывают физраствором, содержащим 0,1% Твин 40 (3×5 мин).

5. В лунки плашки заливают 200 мкл раствора конъюгата (разведение 1:500) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.

6. Плашки промывают физраствором, содержащим 0,1% Твин 40 (3×5 мин).

7. В лунки заливают раствор ABTS (25 мг ABTS в 25 мл цитратного буфера, рН 4,0 + 40 мкл 3% перекиси).

8. Плашки сканируют на Мультискане при 405 нм.

Чувствительность системы составляет десятки нанограмм в миллилитре пробы.

Пример 9. Иммуногистохимическое выявление пероксиредоксина Prx VI в тканях человека.

Выделенную ткань фиксировали в 4% формальдегиде и 0,25% глутаральдегида на 20 мМ фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl. Фиксацию проводили в течение 12 часов при 37°С. Ткань промывали в физрастворе 4 раза в течение часа. Ткань дегидратировали последовательной проводкой через этиловый спирт с возрастающей концентрацией (40-100%). Ткань промывали раствором ксилол-спирт (1:1) в течение часа, ксилолом и ксилол-парафин (1:1) в течение 12 часов. Ткань заключали в парафин и получали 5 мк срезы на микротоме. Срезы депарафинизировали в ксилоле и уменьшающимися концентрациями спирта. Срезы промывали физраствором, блокировали 5% фетальной сывороткой, эндогенную пероксидазу ингибировали 0,3% перекисью водорода и инкубировали с конъюгатом в течение часа, трижды промывали физраствором и окрашивали диаминобензидином (6 мг на 10 мл 50 мМ трис-HCl буфера, рН 7,6 плюс 200 мкл 3% перекиси водорода).

3. Примеры фармацевтических композиций (варианты), в состав которых входит пероксиредоксин или пероксиредоксин и дигидролипоевая кислота.

К формам композиции можно отнести: сухой препарат, жидкую форму, мазевую или гелевую формы.

В общем случае технология приготовления композиций состоит из следующих операций: подготовка помещения для работы, подготовка оборудования для фасовки, стерилизация посуды, подготовка основных компонентов композиции, фасовка и контроль.

3.1. Приготовление сухих форм композиции

3.1.1. Лиофилизированный препарат пероксиредоксина

Технология получения сухого лиофилизированного препарата включает в себя следующие операции: выделение натурального или синтез рекомбинантного пероксиредоксина; очистку субстанции с помощью известных методов очистки биологически активных полипептидов и белков, введение, по крайней мере, одного стабилизатора, последующую лиофилизацию раствора пероксиредоксина и стабилизатора.

Стабилизаторы могут быть выбраны из группы состоящей из: а) одного или более моно- или полисахаридов или сахарных спиртов, б) аминокислот, в) полипептидов или белков. Как примеры первой группы могут быть упомянуты, например, мальтоза, глюкоза, лактоза, трегалоза, сахароза, маннит, инозит, галактоза, рибоза, ксилоза, манноза, сахароза, целлобиоза, рафиноза и мальтотриоза. В группу аминокислот могут входить, например, аланин, глицин. Полипептиды и белки может представлять, например, альбумин.

Стабилизаторы необходимы для сохранения активности пероксиредоксина на более длительный срок, не менее одного года, и в более доступных условиях, при температуре от +4 до -20°С в зависимости от срока хранения.

Пример 10. Получение лиофилизированного препарата пероксиредоксина для приготовления жидких, твердых и мазевых фармацевтических композиций.

Фракции, содержащие пероксиредоксин VI (см примеры 1, 2), концентрировали до концентрации 5-10 мг/мл с использованием концентраторов Ultrafree-15 10K с использованием центрифуги (15 мин, 2000 g) и диализовали против деионизованной воды. В раствор пероксиредоксина вводят, по крайней мере, один стабилизатор и лиофилизируют при -20°С до образования сухого порошка.

Лиофилизированный препарат расфасовывают в стерилизованные в автоклаве при 120°С флаконы (в зависимости от применения по дозам от 1 до 100 мг и хранят при -20°С).

Получают готовый продукт следующего состава:

Лиофилизированный препарат для приготовления жидких, твердых и мазевых фармацевтических композиций с использованием пероксиредоксина и стабилизаторов (мас.%):

Пероксиредоксин - около 90;

Стабилизатор - около 10.

3.1.2. Препарат пероксиредоксина в виде порошка

Технология получения сухого порошка, например, предназначенного для ингаляций или приготовления других форм композиции, включает в себя следующие операции: выделение натурального или синтез рекомбинантного пероксиредоксина; очистку субстанции с помощью известных методов очистки биологически активных полипептидов и белков, введение в раствор пероксиредоксина, по крайней мере, одного стабилизатора, включение в раствор пероксиредоксина и стабилизатора добавок в виде наночастиц (например, в виде микрокристаллической целлюлозы, гидроксипропил метилцеллюлозы, моногидрата лактозы), гранул или липосом с последующей лиофилизацией или сушкой полученного препарата.

Для изготовления аэрозольных препаратов используют известные способы дозирования биологически активных полипептидов в виде порошков, водных растворов или с применением ожиженного газа (Бекстрем и др. патент RU 2175866, 2001). Специалист средней квалификации в данной области может легко определить без лишних экспериментов соответствующие дозировки этих аэрозольных составов.

Пример 11. Получение пероксиредоксина в виде порошка для приготовления фармацевтических композиций с использованием добавок в виде наночастиц. гранул или липосом

Фракции, содержащие пероксиредоксин VI (см примеры 1, 2) концентрируют до значения 5-10 мг/мл с использованием концентраторов Ultrafree-15 10K и с использованием центрифуги (15 мин, 2000 g). Фракцию диализуют против деионизованной воды. В раствор пероксиредоксина вводят стабилизаторы и добавки в виде наночастиц, гранул или липосом и затем лиофилизируют при -20°С до образования сухого порошка. Лиофилизированный препарат расфасовывают в стерилизованные в автоклаве при 120°С флаконы (в зависимости от применения по дозам от 1 до 100 мг и хранят при -20°С).

Препарат в форме порошка для приготовления фармацевтических композиций с использованием добавок в виде наночастиц, гранул или липосом (мас.%):

Пероксиредоксин - 0,1-90,0;

Стабилизатор - 0,01-10;

Добавка - остальное.

3.1.3. Препарат пероксиредоксина в таблетированном виде

Технология получения таблетированной формы пероксиредоксина включает в себя следующие операции: выделение натурального или синтез рекомбинантного пероксиредоксина; очистку субстанции с помощью известных методов очистки биологически активных полипептидов и белков; введение в раствор, по крайней мере, одного стабилизатора; лиофилизацию или сушку препарата; стадию смешения действующего начала с основными наполнителями; влажное и сухое гранулирование; опудривание сухого гранулята и таблетирование.

В качестве наполнителя можно использовать моногидрат лактозы, кукурузный крахмал, тальк, для опудривания можно использовать стеарат магния.

Пример 12. Таблетированная форма пероксиредоксина для приготовления фармацевтических композиций

Препарат в таблетированной форме для приготовления фармацевтических композиций (мас.%):

Пероксиредоксин - 0,1-1,0;

Стабилизатор - 0,01-0,1;

Добавки и наполнители - остальное.

3.2. Приготовление жидких форм композиции

Технология получения жидких форм основана на применении сухой лиофилизированной формы композиции.

Пример 13. Раствор для создания жидкой формы композиции для внутривенного введения, ингаляций и орошении на основе пероксиредоксина.

Приготавливают препарат сухую форму препарата пероксиредоксина в соответствии с примером 10. Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного пероксиредоксина растворяют в дистиллированной воде или в физрастворе в требуемой концентрации. Растворы используют сразу или хранят перед употреблением при +4°С. Для профилактики от поражающего действия ионизирующего облучения выбирают композицию следующего состава (мас.%):

Пероксиредоксин 0,1;

Стабилизатор - около 0,01;

Физраствор - остальное.

Примеры 14-16.

Повторяют процесс, описанный в примере 13, но при этом используют указанные в приведенной ниже таблице 1 массовые количества ингредиентов вместо соответствующих количеств, использованных в указанном примере:

Таблица 1. Содержание пероксиредоксина в жидкой форме композиции
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	Физраствор (мас.%)
14	0,01	0,001	99,99
15	0,5	0,05	99,45
16	1,0	0,1	98,9

Пример 17. Раствор для внутривенного введения, ингаляций и орошений с применением дигидролипоевой кислоты

Приготавливают препарат порошка пероксиредоксина в соответствии с примером 10. Непосредственно перед использованием лиофилизированный пероксиредоксин растворяют в физрастворе в требуемой концентрации. Приготавливают раствор дигидролипоевой кислоты. Растворы используют сразу или хранят перед употреблением при +4°С. Непосредственно перед употреблением смешивают растворы пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты. Для лечения небольших ран выбирают композицию следующего состава (мас.%):

пероксиредоксин 0,05;

стабилизатор 0,005;

дигидролипоевая кислота 0,01;

физраствор - остальное.

Примеры 18-24.

Для приготовления композиций с другими объектами лечения или профилактики повторяют процесс, описанный в примере 17, но при этом используют указанные в приведенной ниже таблице 2 массовые количества ингредиентов вместо соответствующих количеств, использованных в указанном примере:

Таблица 2. Содержание пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты в жидкой форме композиции
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	Дигидролипоевая кислота (мас.%)	Физраствор (мас.%)
18	0,01	0,001	0,01	99,98
19	0,5	0,05	0,5	98,95
20	1,0	0,1	1,0	97,9
21	0,5	0,05	0,02	99,43
22	1,0	0,1	0,04	98,86
23	0,5	0,05	0,01	99,44
24	1,0	0,1	0,02	98,88

Пример 25. Раствор для создания фармакологической композиции для внутривенного введения ингаляций или орошении с применением пероксиредоксина и терапевтического агента.

Приготавливают препарат порошка пероксиредоксина в соответствии с примером 10. Непосредственно перед использованием лиофилизированный пероксиредоксин растворяют в физрастворе в требуемой концентрации. Приготавливают раствор интерферона. Растворы используют сразу или хранят перед употреблением при +4°С. Смешивают растворы пероксиредоксина и раствор интерферона (мас.%):

пероксиредоксин 0,5;

стабилизатор 0,05;

интерферон ME 100000;

Физраствор - остальное.

Для приготовления композиций с другими объектами лечения или профилактики повторяют процесс, описанный в примере 25, но при этом используют указанные в приведенной ниже таблице 3 массовые количества ингредиентов вместо соответствующих количеств, использованных в указанном примере:

Таблица 3. Содержание пероксиредоксина и интерферона в жидкой форме композиции
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	интерферон (ME)	Физраствор (мас.%)
26	0,01	0,001	100000	99,98
27	1,0	0,1	100000	98,9

Пример 28. Раствор для внутривенного введения ингаляций или орошении с применением пероксиредоксина, дигидролипоевой кислоты и терапевтического агента

Приготавливают препарат порошка пероксиредоксина в соответствии с примером 10. Непосредственно перед использованием лиофилизированный пероксиредоксин растворяют в физрастворе в требуемой концентрации. Приготавливают раствор интерферона. Приготавливают раствор дигидролипоевой кислоты. Растворы используют сразу или хранят перед употреблением при +4°С. Смешивают растворы пероксиредоксина, дигидролипоевая кислоты и раствор интерферона (мас.%):

пероксиредоксин 0,5;

стабилизатор 0,05;

дигидролипоевая кислота 0,05;

интерферон ME 200000;

Физраствор - остальное.

Для приготовления других композиций повторяют процесс, описанный в примере 28, но при этом используют указанные в приведенной ниже таблице 4 массовые количества ингредиентов вместо соответствующих количеств, использованных в указанном примере:

Таблица 4. Содержание пероксиредоксина, дигидролипоевой кислоты и интерферона в жидкой форме композиции
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор(мас.%)	Дигидролипоевая кислота (мас.%)	Интерферон (ME)	Физраствор (мас.%)
29	0,01	0,001	0,01	100000	99,98
30	0,1	0,01	0,01	100000	99,88
31	1,0	0,1	0,5	500000	98,4

Пример 32 Косметическое средство

Известно, что антиоксидантные добавки введенные в состав крема предотвращают окислительные реакции, защищают кожу от неблагоприятных внешних воздействий (например УФ-лучей), несут противовоспалительную, антибактериальную активность, повышают иммунитет. Кроме того, они предотвращают перекисное окисление содержащихся в креме или эмульсии масел. Приведенный ниже пример относится к композиции, состоящей из водной основы, в которой растворяют активное начало композиции, содержащей пероксиредоксин и супероксиддисмутазу (СОД), жировой основы, улучшающей качество крема и вспомогательных веществ, которые содержат биологически активные и антиоксидантные вещества, например масло из зародышей пшеницы, масло из виноградных косточек и дополнительно содержат низкомолекулярные антиоксиданты например токоферол при следующем соотношении ингредиентов (мас.%):

жировая основа 6-10;

пероксиредоксин 0,1-0,5;

супероксиддисмутаза 0,01-0,05;

вспомогательные вещества 2-6;

водная основа - остальное.

Взаимодействие недорогих низкомолекулярных антиоксидантов, восстанавливающих или предохраняющих от окисления высокомолекулярные антиоксиданты в процессе хранения, позволяет снизить концентрацию дорогих и высокоэффективных антиоксидантов типа пероксиредоксина или супероксиддисмутазы и добиться максимального защитного эффекта крема.

Приведенные примеры не следует рассматривать в контексте ограничения областей использования данного изобретения. Вариации, вытекающие из данного изобретения и очевидные каждому специалисту, имеющему средний уровень знаний в данной области, должны рассматриваться в рамках предполагаемого изобретения.

Пример 33. Протекторный эффект пероксиредоксина Prx VI при поражающем действии ионизирующего облучения.

Одновременное облучение всех животных (крысы линии Вистар весом 200 г) проводили на установке ГУБЭ. Доза облучения - 6 Гр. Крыс распределили на две группы. Первая группа животных (n=6) использовалась для контроля. Животным второй группы (n=6) за 30-60 минут до облучения внутривенно вводили 1 мл физраствора с концентрацией пероксиредоксина 1 мг/мл. После облучения животных содержали в общем помещении с достаточным количеством корма, освещением и вентиляцией. На гистологическое исследование отбирали животных из каждой группы с признаками ухудшившегося общего состояния.

Результаты

Данные по смертности млекопитающих после облучения представлены в таблице 5, в которой указано число выживших крыс в каждой группе в указанное время.

Таблица 5. Выживаемость крыс при введении пероксиредоксина Prx VI до облучения.
Время эксперимента	3 месяца	6 месяцев	12 месяцев	15 месяцев
Выживаемость вконтрольной группе (шт.)	4	3	2	1
Выживаемость в группе, в которой в качестве протектора использовали Prx VI (шт.)	6	5	4	4

Как видно из таблицы, смертность крыс, которым перед облучением был введен пероксиредоксин Prx VI, существенно ниже, чем в контрольной группе. Общее состояние выживших животных через год после облучения существенно отличалось в пользу второй группы по сравнению с контрольной группой (фиг.3б). У животных из первой группы по сравнению с животными второй группы отмечается: большая потеря массы тела (кахексия) (вес 180-200 г), скудное оволосение тела, низкая двигательная активность, наличие опухолевого процесса.

Пример 34. Терапевтические и протекторные свойства пероксиредоксина Prx VI при лечении верхних дыхательных путей крысы после химического ожога

Терапевтические свойства пероксиредоксина Prx VI при лечении верхних дыхательных путей крысы через сутки после ожога проверяли на группе из 4 крыс линии Вистар весом 150-200 грамм.

Химический ожог верхних дыхательных путей.

Крыс аналгезировали анальгином (100 мг/кг веса) и помещали в эксикатор, насыщенный парами соляной кислоты, на 10 мин (объем эксикатора - 10 литров) (всего использовано 20 животных). После химического ожога крыс выдерживали определенное время (40 мин, 6 час, 1 сутки, 2 суток, 14 суток, 30 суток), усыпляли гексеналом (300 мг/кг веса) и выделяли пробу эпителиальной ткани трахеи. Для гистохимических исследований выделенную пробу помещали в фиксирующий раствор, содержащий 2% формальдегида и 0.5% глутаральдегида. Ткань дегидратировали последовательной проводкой через этиловый спирт с возрастающей концентрацией (40-100%). Ткань заливали в смолу LR white resin. Полимеризация смолы проводилась при комнатной температуре. Срезы толщиной 0,5 мкм получали на ультратоме LKB, Швеция, используя стеклянные ножи. Срезы окрашивались смесью гематоксилина-эозина, анализировались на световом микроскопе.

Для разработки более эффективного способа лечения исследовали этапы развития патологии после воздействия ожога.

На первом этапе исследовали динамику изменения уровня нейтрофилов и ферментов-антиоксидантов в клеточном эпителии трахеи крыс после ожога парами соляной кислоты. Наблюдали два периода резкого возрастания количества активных нейтрофилов: через 40 минут и 6 часов после ожога. Резкое повышение количества активных нейтрофилов усугубляет степень поражения, так как происходит выброс перекиси водорода нейтрофилами.

Биохимические исследования (см. пример 9) показали, что уровень активности пероксиредоксина в клетках эпителия увеличивается примерно в два раза сразу после ожога. В то же время активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, которые являются основными ферментами-антиоксидантами организма, уменьшается в слизи трахеи примерно на 30%. Через сутки наблюдали снижение уровня активности всех перечисленных ферментов, в том числе и пероксиредоксина.

Гистохимические исследования (см. пример 10) показали, что через 40 минут после ожога в эпителии трахеи и бронхах начинаются процессы гибели клеток циллиарного эпителия, которые в последующее время носят лавинообразный характер. Максимум гибели клеток эпителия слизистой верхних дыхательных путей наблюдается через сутки после ожога. При этом происходит практически полная гибель клеток мерцательного эпителия, осуществляющего мукоцилиарный транспорт в трахее и бронхах. Это состояние эпителия было принято в качестве контроля для сравнительной оценки степени ожога и эффективности проводимого лечения.

Без лечения частичное восстановление эпителия слизистой трахеи после химического ожога наблюдается через 30 дней.

На фиг.4б показан срез эпителия трахеи крысы через сутки после ожога, на фиг.7 - через 14 дней после ожога. Максимальное разрушение эпителия наблюдается через сутки после ожога, при этом реснитчатые клетки, обеспечивающие ток слизи в трахее, практически отсутствуют. Через две недели наблюдается частичное восстановление реснитчатых клеток.

Протекторные и терапевтические свойства пероксиредоксина

Аппликацию раствора композиции начинали через час после ожога (протекторный эффект пероксиредоксина Prx VI) или через сутки после химического ожога (время максимального разрушения эпителия слизистой трахеи, терапевтический эффект пероксиредоксина Prx VI). В последнем случае аппликацию проводили один раз в день в течение 5 дней. Крыс предварительно усыпляли при помощи внутрибрюшинного введения гексенала (70 мг/кг), животных фиксировали на операционном столе и под визуальным контролем с помощью бинокулярной лупы через катетер диаметром 1 мм им вводили в трахею раствор пероксиредоксина объемом от 20 до 100 мкл. Концентрацию пероксиредоксина выбирали в пределах от 0,5 до 5.0 мг/мл. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор NaCl.

Гистологические исследования проводили через сутки после ожога (в случае протекторного эффекта пероксиредоксина и через 14 дней в случае лечебного эффекта пероксиредоксина. Гистохимические исследования проводили по процедуре, приведенной в примере 10.

Результаты

В качестве одного из вариантов лечения млекопитающих после химического ожога был использован вариант аппликации верхних дыхательных путей крысы раствором пероксиредоксина. На фиг.5 показан срез эпителия трахеи крысы через 14 суток после ожога при ежедневной 5-кратной аппликации пероксиредоксина. Наблюдается практически полностью сохранный эпителий слизистой трахеи, что свидетельствует о практически полной регенерации мерцательных клеток эпителия. Присутствие элементов слизистого секрета, в котором определяются фагоциты, свидетельствует о наличии остаточного воспалительного процесса в трахее.

Пример 35. Терапевтические свойства пероксиредоксина Prx VI при лечении верхних дыхательных путей крысы непосредственно после воздействия раствора ЛПС.

Терапевтические свойства пероксиредоксина Prx VI при лечении верхних дыхательных путей крысы непосредственно после аппликации ЛПС проверяли на группе из 4 крыс линии Вистар весом 150-200 грамм.

Аппликация липополисахарида в трахею крысы.

Крыс анестезировали гексеналом и через катеттер вводили 100 мкл раствора липополисахарида (концентрация липополисахарида 10-9 - 10-11 мг/мл, всего использовано 20 животных). После аппликации липополисахарида выдерживали определенное время (1 час, 3 часа, 6 часов, 7 часов, 9 часов), усыпляли гексеналом (300 мг/кг веса) и выделяли пробу эпителиальной ткани трахеи. Для гистохимических исследований выделенную пробу помещали в фиксирующий раствор, содержащий 2% формальдегида и 0.5% глутаральдегида. Ткань дегидратировали последовательной проводкой через этиловый спирт с возрастающей концентрацией (40-100%). Ткань заливали в смолу LR white resin. Полимеризация смолы проводилась при комнатной температуре. Срезы толщиной 0,5 мкм получали на ультратоме LKB, Швеция, используя стеклянные ножи. Срезы окрашивались смесью гематоксилина-эозина, анализировались на световом микроскопе.

После аппликации липополисахарида, вызывающего острую воспалительную реакцию в трахее, исследовали динамику изменения уровня нейтрофилов, TNF- и пероксиредоксина Prx VI в клеточном эпителии трахеи крыс. Для определения характеристик способа лечения проводили исследование динамики уровня нейтрофилов и антиоксидантов, а также биохимические и гистохимические исследования воздействия воспалительного процесса на организм млекопитающего.

Наблюдали резкое возрастание количества активных нейтрофилов через час после введения ЛПС. Резкое повышение количества активных нейтрофилов в свою очередь усугубляет степень поражения, так как происходит выброс Н₂O₂ нейтрофилами.

Биохимические исследования (см. пример 9) показали, что уровень активности пероксиредоксина Prx VI в клетках эпителия увеличивается примерно в два раза через час после аппликации липополисахарида.

Гистологические исследования (см. пример 10) показали, что в случае применения концентрации ЛПС, равной 10^-7 мг/животное, отмечалась массивное накопление нейтрофилов в стенке трахеи, развитие отека с последующим отслоением слизистой в просвет трахеи и гибелью клеток через 3 часа (см. фиг.6).

Иммуногистохимические исследования показали, что во многих областях эпителия трахеи уже через час наблюдается массовая гибель клеток, секретирующих пероксиредоксин Prx VI, что приводило к отсутствию пероксиредоксина Prx VI в слизи, покрывающей данные области трахеи. Это состояние эпителия было принято в качестве контроля для сравнительной оценки степени воспалительной реакции и эффективности проводимого лечения.

На фиг.7б показаны срезы эпителия трахеи крысы через 3 час после аппликации липополисахарида. Гистологические исследования показали, что в случае применения ЛПС 10^-7 мг/животное препарата отмечалось массивное накопление нейтрофилов в стенке трахеи, развитие отека с последующим отслоением слизистой в просвет трахеи и гибелью клеток через 3 часа.

Иммуногистохимические исследования показали, что во многих областях эпителия трахеи уже через час наблюдается массовая гибель клеток, секретирующих пероксиредоксин Prx VI, что приводило к отсутствию пероксиредоксина Prx VI в слизи, покрывающей данные области трахеи.

Для биохимических исследований соскабливали эпителий трахеи тонким шпателем, соскоб смывали физиологическим раствором и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Концентрацию перекиси водорода определяли методом люминисценции. Динамика активностей пероксиредоксина Prx VI, TNF- и респираторный взрыв нейтрофилов после аппликации ЛПС в трахею крысы показали, что максимум секреции пероксиредоксина наблюдался через час после аппликации ЛПС, в то время как максимум экспрессии TNF- наблюдался через 3 часа и респираторный взрыв нейтрофилов через 6 часов.

Терапевтические свойства пероксиредоксина Prx VI при лечении ЛПС

После ЛПС проводили аппликацию раствора композиции на основе пероксиредоксина Prx VI в трахею. Предварительно крыс усыпляли при помощи внутрибрюшинного введения гексенала (70 мг/кг). Животных фиксировали на операционном столе и под визуальным контролем с помощью бинокулярной лупы через катетер диаметром 1 мм им вводили в трахею раствор пероксиредоксина (20-100 мкл). Концентрация пероксиредоксина - 0,5-5.0 мг/мл, в качестве растворителя использовались 0,9% NaCl. Аппликацию раствора композиции проводили однократно непосредственно после аппликации ЛПС. В качестве контроля использовалась аппликация чистого растворителя, растворы сывороточного альбумина (10 мг/мл) и глутатиона (10 мМ).

Через сутки после аппликации ЛПС проводили гистологическое исследование трахеи. Гистохимические исследования проводили способом, описанным в разделе примере 3.

Результаты

Прямая однократная аппликация человеческого пероксиредоксина Prx VI в трахею крысы сразу после аппликации липополисахарида приводила к практически полному восстановлению эпителиальной ткани через 2 недели (см фиг.7), в то время как у животных контрольной группы, не получивших лечения после аппликации ЛПС, мерцательный эпителий практически не восстановился (см. пример 3, фиг.6).

Введение пероксиредоксина в область поражения эпителиальных клеток предупреждает развитие вторичных альтеративных нарушений, тем самым ограничивая объем патологических изменений. Нейтрализация активных форм кислорода восстанавливает пролиферативные клеточные процессы, способствует быстрой регенерации поврежденного эпителия, уменьшает риск развития инфекционных осложнений в очаге поражения.

Применение других антиоксидантов, например глутатиона, не дало значительного эффекта (см. таблицу 6).

Таблица 6. Сохранность эпителия трахеи при аппликации различных антиоксидантов после поражения эпителия трахеи (согласно гистологическим данным).
Время после воздействия ЛПС	Глутатион	Prx VI
1 час	30%	90%
3 часа	20%	80%
6 часов	10%	65%
Лечение через сутки в течение 5 дней и сохранность эпителия через 2 недели	20%	80%

На фиг.7 показан срез эпителия трахеи крысы через сутки после аппликации ЛПС с аппликацией пероксиредоксина сразу после ЛПС. Наблюдается полная сохранность эпителия. Единственное отличие от интактной трахеи состоит в том, что увеличилось количество макрофагов и тучных клеток. Как видно из фотографии, наблюдалось практически полное сохранение или восстановление эпителия трахеи.

Пример 36. Терапевтические свойства пероксиредоксина Ргх VI и дигидролипоевой кислоты при лечении ран.

А) Предварительно крыс усыпляли при помощи внутрибрюшинного введения гексенала (70 мг/кг). Животных фиксировали на операционном столе и наносили с помощью лезвия порезы кожи обоих лап глубиной 2-3 мм и длиной 1 см. Контрольные порезы промывали физраствором и накладывали марлевую повязку.

Б) Приготовляли растворы пероксиредоксина по примеру 14, но при этом использовали указанные в приведенной ниже таблице 7 массовые количества ингредиентов вместо соответствующих количеств, использованных в указанном примере:

Таблица 7. Содержание пероксиредоксина в жидкой форме раствора
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	Физраствор (мас.%)
37	0,01	0,001	99,99
38	0,02	0,002	99,98
39	0,1	0,01	99,89

В) Приготовляли растворы дигидролипоевой кислоты, при этом использовали указанные в приведенной ниже таблице 8 массовые количества ингредиентов.

Таблица 8. Содержание дигидролипоевой кислоты в жидкой форме раствора
Пример	Дигидролипоевая кислота (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	Физраствор (мас.%)
40	0,01	0,001	99,99
41	0,05	0,005	99,95
42	0,1	0,01	99,89

Г) Приготовляли растворы пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты по примеру №17, при этом использовали указанные в приведенной ниже таблице 9 массовые количества ингредиентов.

Таблица 9. Содержание пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты в жидкой форме композиции
Пример	Пероксиредоксин (мас.%)	Стабилизатор (мас.%)	Дигидролипоевая кислота (мас.%)	Соотношение пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты	Физраствор (мас.%)
43	0,1	0,01	0,05	2:1	99,84
44	0,1	0,01	0,02	5:1	98,87
45	0,1	0,01	0,005	20:1	99,885

Раны промывали растворами, приготовленным по примерам 37-45 и накладывали марлевую повязку, смоченную теми же растворами. Повязку меняли раз в сутки.

Результаты

Эффекты действия растворов: а) пероксиредоксина Prx VI, б) дигидролипоевой кислоты, в) пероксиредоксина PrxVI и дигидролипоевой кислоты на заживление ран через одни сутки приведены на фигурах 9-11. На фиг.9а, 10а, 11а представлен контроль.

На фиг.9 представлены варианты воздействие на рану раствора пероксиредоксина. На фиг.9б, 9в, 9г - представлены варианты экспериментов, в которых концентрации пероксиредоксина в растворах составляют: 1,0; 0,1; 0,2 мг/мл соответственно.

Воздействие на рану раствора дигидролипоевой кислоты представлено на фиг.10. На фиг.10б, 10в, 10г - представлены варианты экспериментов, в которых концентрации дигидролипоевой кислоты в растворах составляют соответственно: 1,0; 0,5; 0,1 мг/мл.

Синергетическое воздействие на рану пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты представлено на фиг.11. На фиг.11б, 11в, 11г приведены варианты состава композиций, в которых соотношение между постоянной концентрацией пероксиредоксина (1,0 мг/мл) и изменяемой концентрацией дигидролипоевой кислоты составляет: 20:1; 2:1; 5:1 соответственно.

По внешнему виду ран, на которые воздействовали дигидролипоевой кислотой (см фиг.10), видно, что хотя дигидролипоевая кислота и является антиоксидантом, в чистом виде она препятствует заживлению и в больших концентрациях раздражает рану.

Пероксиредоксин способствует заживлению ран (см. фиг.9), однако лучшие результаты были получены при обработке ран композициями, в состав которых входят пероксиредоксин и дигидролипоевая кислота (см. фиг.11).

По внешним признакам ран и более короткому времени заживления можно говорить не о аддитивном, а о синергетическом воздействии пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты на межклеточное пространство участка повреждения кожного покрова. Гистологические исследования также показали существенно меньшие рубцы в случае применения пероксиредоксина Prx VI и дигидролипоевой кислоты.

Практически полное заживление раны в контроле происходит за 7 дней. Заживление раны при применении перкосиредоксина происходит за 5 дней. При применении композиции на основе пероксиредоксина и дигидролипоевой кислоты полное заживление происходит за 3 дня.

Промышленная применимость

Фармакологическая композиция, содержащая, по крайней мере, один тип пероксиредоксина, может найти профилактическое и/или лечебное применение для многих болезней, которые сопровождаются гиперпродукцией свободных радикалов. Более высокая эффективность композиции на основе пероксиредоксина по сравнению с известньми антиоксидантами позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения.

Фармакологическая композиция не обладает токсичностью и биосовместима с организмом млекопитающих, в том числе и человека, так как в ней в качестве основного элемента используется рекомбинантный человеческий пероксиредоксин. Низкая токсичность композиции позволяет повысить эффективность лечения за счет одновременного комбинированного воздействия на локальные области организма и весь организм в целом за счет аппликаций и внутривенного введения композиции. Это особенно важно при лечении многофакторных воздействий на организм, например радиации, термического, химического ожогов, ран, ушибов возникающих во время катастроф и пожаров. Композиция имеет высокую растворимость и быстро проникает в межклеточное пространство организма, что позволяет лечить заболевания практически всех органов. Композиция совместима с любыми фармацевтически пригодными носителями, не снижающими биологическую активность фермента.

Источники информации

1. Babish J.G., Howell T. Compositions containing carotenoids and tocotrienols and having synergistic antioxidant effect. PCT appl. WO 0230419 (2002-04-18).

2. Chae H.Z., Robison K., Poole L.B., Church G.. Storz G., and Rhee S.G. (1994) Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain: alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91, pp.7017-7021.

3. McGonigle S., Dalton J.P., and James E.R. (1998) Peroxidoxins: a new antioxidant family. Parasitology Today.14, 139-145.

4. Prosperi M.T., Ferbus D., Rouillard D., and Goubin G. (1993) A human cDNA corresponding to a gene over expressed during cell proliferation encodes a product sharing homology with amoebic and bacterial proteins. J. Biol. Chem. 268, 11050-11056.

5. Pesenko I.V., Novoselov V.I., Evdokimov V.A., Nikolaev Ju.V., Kamzalov S.S., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. (1998) Identification of a 28 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium as a thiol-specific antioxidant. Free Rad. Biol. Med., 25, 654-659.

6. Novoselov S.V., Peshenko I.V., Popov V.V., Novoselov V.I., Bystrova M.F., Evdokimov V.A., Kamzalov S.S., Merkulova M.I., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. (1999) Localization of the 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties. Cell. Tissue. Res. 298, 471-480.

7. Butterfield L.H. From cytoprotection to tumor suppression: the multifactorial role of peroxiredoxins. Antioxid Redox Signal 1999 Winter; 1(4): 385-402.

8. Chung YM, Yoo YD, Park JK, Kim YT, Kim HJ. Increased expression of peroxiredoxin II confers resistance to cisplatin. Anticancer Res 2001 Mar-Apr; 21(2A): 1129-33.

9. Kinnula V.L. et al. Overexpression of peroxiredoxins I, II, III, V, and VI in malignant mesothelioma. J Pathol 2002 Mar; 196(3): 316-23.

10. Kim S.H. et al. Protein levels of human peroxiredoxin subtypes in brains of patients with Alzheimer's disease and Down syndrome. J Neural Transm Suppl 2001; (61): 223-35.

11. Das K.C. et al. Induction of peroxiredoxin gene expression by oxygen in lungs of newborn primates. Am J Respir Cell Mol Biol 2001 Aug; 25(2): 226-32.

12. Kim H.S. et al. Regulation of 1-cys peroxiredoxin expression in lung epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2002 Aug; 27(2): 227-33.

13. Fujii Т. Augmented expression of peroxiredoxin VI in rat lung and kidney after birth implies an antioxidative role. Eur J Biochem 2001 Jan; 268(2): 218-25.

14. Lee SC. et al. Peroxiredoxin is ubiquitously expressed in rat skin: isotype-specific expression in the epidermis and hair follicle. J Invest Dermatol 2000 Dec; 115(6): 1108-14.

15. Park S.H. et al. Antisense of human peroxiredoxin II enhances radiation-induced cell death. Clin Cancer Res 2000 Dec; 6(12): 4915-20.

16. Chandrashekar R., Tsuji N. Dirofilaria and brugia thioredoxin peroxidase type-2 proteins and uses thereof. US Patent 6,352,836 March 5, 2002.

17. Novoselov V.I., Amelina S.E., Kravchenko I.N., Novoselov S.V., Sadovnikov V.B., Fesenko E.E. Application of peroxiredoxine in the healing of lung. Problems of biological and ecological safety international conference. Obolensk p.203 (22-25 May 2000)

18. Walker B.D., Lynn R.G. Peroxiredoxin drugs for treatment of HIV-1 infection and methods of use thereof. PCT appl. WO 02077294 (03.10.2002)

19. Андреева С.Г. и др. (1998) Структурные исследования секреторного 28 кДа белка из обонятельного эпителия крысы. Биоорганическая химия, т.24, N11 с.816-821

20. Sang Won Kang, Bains I.C., Rhee S.G. (1998) Characterization of a mammalian peroxiredoxin contains one conserved cystein. JBC, 273,11, pp.6303-6311.

21. Chen J.W., Dodia С., Feinstein S.I., Mahendra K.J., Fisher A.B. (2000) 1-Cys Peroxiredoxin, a bifunctional enzyme with glutathione peroxidase and phospholipase A activities. JBC, 275, 37, pp.28421-28427.

22. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite. Free Radic Biol Med 2001 Aug 1; 31(3): 292-303.

23. Nagase Т., Miyajima N., Tanaka A., Sazuka Т., Seki N., Sato S., Tabata S., Ishikawa K.,Kawarabayasi Y., Kotani H., and Nomura N. (1995) Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. DNA Res., 2, pp.37-43.

24. Knoops В., Clippe A, Bogard C., Arsalane K., Wattiez R., Hermans C., Duconseiulle E., Falmagne P., Bernard A. (1999) Clonning and characterization of AOEB166, a novel mammalian antioxidant enzyme of the peroxiredoxin family. J. Biol. Chem. 274, pp.30451-30458.

25. Dawson R.M., Elliott D.C., Elliott W.H., Jones K.M. (1986) Data of Biochemical Research. Clarendon Press, Oxford,

26. Esenaliev R.O. Radiation and nanoparticles for enhancement of drug delivery in solid tumors. US Patent 6,165,440 (26.12.2000)

27. Thibeault D.W., Rezaiekhaligh M., Mabry S. and Beringer T. (1991) Prevention of chronic pulmonary oxygen toxicity in young rats with liposome encapsulated catalase administered intratracheally. Pediatr. Pulmonol., 11: 318-327.

28. Бекстрем и др. (2001) Аэрозольные препараты пептидов и белков, патент RU 2175866.

29. Novoselov V.I., Amelina S.E., Kravchenko I.N., Novoselov S.V., Sadovnikov V.B., Fesenko E.E. Application of peroxiredoxine in the healing of lung. Problems of biological and ecological safety international conference. Obolensk p.203 (22-25 May 2000).