средства для профилактики и лечения заболеваний суставов и способы их применения

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающая смесь пептидов H-Ala-Glu-Asp-OH, Lys-Glu-Asp и H-Lys-Glu-OH, взятых в следующем массовом соотношении:

H-Ala-Glu-Asp-OH	Lys-Glu-Asp	H-Lys-Glu-OH
0,1-10	0,1-10	0,1-10

в фармацевтически приемлемом носителе.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, выполнена в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, геля, капель для приема внутрь.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, где таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой.

4. Фармацевтическая композиция по п.2, где раствор может быть для в/в и в/м введения.

5. Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию по п.1 и хондроитин и/или его соли при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве, в масс.%:

фармацевтическая композиция по п.1	0,01-1,00
хондроитин и/или его соли	остальное

6. Средство по п.5, выполнено в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, геля, капель для приема внутрь.

7. Средство по п.6, где таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой.

8. Средство по п.6, где раствор может быть для в/в и в/м введения.

9. Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию по п.1 и глюкозамин и/или его соли при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве, в масс.%:

фармацевтическая композиция по п.1	0,01-1,00
глюкозамин и/или его соли	остальное

10. Средство по п.9, выполнено в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, геля, капель для приема внутрь.

11. Средство по п.10, где таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой.

12. Средство по п.10, где раствор может быть для в/в и в/м введения.

13. Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию по п.1, смесь хондроитина и/или его солей и глюкозамина и/или его солей при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве, в масс.%:

фармацевтическая композиция по п.1	0,01-1,00
смесь хондроитина и/или его солей и
глюкозамина и/или его солей	остальное

при этом массовое соотношение хондроитина и/или его солей: глюкозамина и/или его солей в средстве составляет (1-9):(1-9).

14. Средство по п.13, выполнено в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, геля, капель для приема внутрь.

15. Средство по п.14, где таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой.

16. Средство по п.15, где раствор может быть для в/в и в/м введения.

17. Способ профилактики и лечения заболеваний суставов, характеризующийся тем, что используют фармацевтическую композицию по п.1.

18. Способ профилактики и лечения заболеваний суставов, характеризующийся тем, что используют средство по п.5.

19. Способ профилактики и лечения заболеваний суставов, характеризующийся тем, что используют средство по п.9.

20. Способ профилактики и лечения заболеваний суставов, характеризующийся тем, что используют средство по п.13.

Описание изобретения к патенту

Группа изобретений относится к созданию средств для профилактики и лечения заболеваний суставов, в частности артрита, остеоартроза, а также и других состояний и заболеваний, сопровождающихся поражением суставов и болью, и способам их применения.

Причины болезней суставов чрезвычайно разнообразны и во многом еще не изучены. Точно известны лишь причины развития инфекционных специфических артритов (туберкулезный, гонорейный, бруцеллезный и др.), связанных с определенной инфекцией. Что касается всех остальных многочисленных форм поражения суставов, то, по современным представлениям, их развитие связано с комплексом многих внутренних и внешних факторов.

Тем не менее конечной точкой приложения этой разнородной группы заболеваний является поражение и дальнейшее разрушение хрящевой ткани, которая необходима для нормального функционирования сустава.

Например, такие заболевания суставов, как остеоартроз, представляют собой гетерогенную группу заболеваний различной этиологии, но со сходными биологическими, морфологическими и клиническими проявлениями и исходом, в основе которых лежит поражение всех компонентов сустава, в первую очередь хряща, а также субхондрального участка кости, синовиальной оболочки, связок, капсулы и периартикулярных мышц. Остеоартроз как хроническое дегенеративно-дистрофическое заболевание суставов характеризуется прогрессирующей деструкцией суставного хряща, пролиферативной реакцией хрящевой и костной тканей и сопровождается реактивным синовитом (Коваленко В.Н., Борткевич О.П. Остеоартроз. Практическое руководство. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Морион, 2005. - 592 с.).

Остеоартроз - самое частое заболевание суставов, которым страдают не менее 20% населения земного шара (оно обычно начинается в возрасте старше 40 лет), при этом почти 25% больных не могут справиться с основными ежедневными жизненными потребностями. Прогрессирование заболевания, сопровождающееся постоянными болями в пораженных суставах, и является причиной нетрудоспособности таких больных, оказывая тем самым тяжелое экономическое и психологическое воздействие не только на пациента, но и на его близких.

Развитие остеоартроза приводит к значительным расходам в экономической, социальной и психологической сферах, которые связаны с широким распространением, частой инвалидизацией пациентов и высокими экономическими затратами, включающими лечение как основного заболевания, так и профилактику и лечение возможных осложнений фармакотерапии.

То же можно сказать и в отношении других заболеваний суставов.

Поэтому разработка новых эффективных средств и методов лечения и профилактики заболеваний суставов - актуальная проблема современной фармакологии и клинической медицины, поскольку позволит не только повысить уровень социальной активности и качество жизни пациентов, но и снизить расходы системы здравоохранения, связанные с их обеспечением.

Известен препарат глюкозамин для лечения заболеваний суставов и способ терапии данных заболеваний, основанный на его введении, которые широко применяют, например, при первичном и вторичном остеоартрозе для уменьшения боли в суставах и замедления прогрессирования заболевания. Однако данный способ с использованием глюкозамина нельзя признать достаточно эффективным, поскольку его действие связано только с одним из механизмов защиты хряща от повреждения, а именно стимулирование биосинтеза аминогликанов (Зупанец И.А. Экспериментальное обоснование использования глюкозамина и его производных в медицине: Дис. в форме научного доклада докт. мед. наук. - Купавна, 1993. - 90 с.)

В то же время данные заболевания приводят к дегенеративно-дистрофическим поражениям суставов с прогрессирующей деструкцией суставного хряща, пролиферативной реакцией хрящевой и костной тканей и развития синовита. Кроме того, одной из немаловажной причиной их развития является наличие сопутствующих заболеваний, вызывающих нарушение кровоснабжения (атеросклероз, сахарный диабет и др.), которые могут способствовать повреждению хрящевой ткани и развитию болезней суставов.

Исходя из изложенного, возникает необходимость изыскания новых средств пептидной природы и способов лечения, основанных на их введении больным с заболеваниями суставов, обладающих хондропротекторной активностью, обезболивающими, репарирующими и вазоактивными свойствами, что позволит с успехом применять их для лечения заболеваний суставов различной этиологии, поскольку активность этих средств будет направлена на коррекцию основных проявлений заболевания и причин его возникновения.

Из уровня техники известна фармацевтическая композиция для профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, включающая пептид H-Ala-Glu-Asp-ОН и способ ее применения для лечения вышеуказанных заболеваний. Данный пептид, входящий в состав известной композиции, обладает выраженной хондропротекторной активностью в отношении костной и хрящевой тканей. Дозировка пептида составляет 0,01-100 мг/кг массы тела (патент РФ 2299741 С1 от 2007 г.).

Однако данную композицию и соответственно способ ее применения нельзя признать эффективным, поскольку они основаны на введении только одного пептида в виде активного начала, пусть и с выраженным хондропротективным действием.

В то же время очевидно, что увеличение эффективности может быть получено путем введения разных пептидов, обладающих разнонаправленной активностью, что позволит усилить эффективность проводимой терапии.

Из уровня техники известен пептид Lys-Glu-Asp (патент РФ 2295970 С1 от 2007 г.) представляющий собой:

1. Название соединения: лизил-глутамил-аспарагиновая кислота.

2. Структурная формула:

H-Lys-Glu-Asp-OH

3. Брутто-формула без противоиона: C ₁₅H₂₆N₄O₈.

4. Молекулярный вес без противоиона: 390,39.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

Пептид применяется для коррекции метаболического сосудистого синдрома и заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудистой стенки и ломкостью капилляров. Эффективная дозировка пептида составляет 0,01-100 мг/кг массы тела. При этом пептид никогда не применялся для лечения заболеваний суставов.

Также известен пептид H-Lys-Glu-OH (патента РФ 2139085 С1), обладающий способностью стимулировать репаративные процессы. Эффективная дозировка пептида составляет 0,01-100 мг/кг массы тела. Данный пептид также не использовался для лечения заболеваний суставов.

Из документа - Справочник РЛС от 2009, известно использование комбинации хондроитин сульфата и глюкозамина в качестве средства, стимулирующего регенерацию хрящевой ткани. Препарат «Терафлекс» содержит 500 мг глюкозамина гидрохлорида и 400 мг хондроитина сульфата натрия. Препарат «Кондронова капсулы» содержит 250 мг глюкозамина сульфата и 200 мг хондроитина сульфата. Препарат «Кондронова мазь для наружного применения» содержит 25 мг глюкозамина сульфата и 50 мг хондроитина сульфата. Препарат «Артра» содержит 500 мг глюкозамина гидрохлорида и 500 мг хондроитина сульфата натрия.

Таким образом, задачей настоящей работы явилась разработка фармацевтических композиций, а также способов профилактики и лечения заболеваний суставов, направленных на использование как непосредственно трех пептидов в составе композиции, которые подобраны в оптимальном соотношении, обладающей разнонаправленной активностью, что позволит усилить эффективность проводимой терапии, так и их сочетание с глюкозамином и/или хондроитина сульфатом.

Также задачей настоящей работы явилось исследование фармакологических свойств (кондропротекторных, обезболивающих) новой смеси пептидов, а также смеси пептидов с глюкозамина сульфатом (гидрохлорид) и смеси пептидов с хондроитина сулфатом и смеси пептидов с глюкозамина сульфатом (гидрохлорид) и хондроитина сульфатом.

Поставленная задача достигается группой изобретения, направленной на решение одной задачи и с достижением одного результата.

Техническим результатом заявляемой группы изобретений является создания единой фармацевтической композиции, объединяющей разные пептиды в своем составе, используемые в определенном разработанном нами весовом соотношении, с возможностью включения в состав данной композиции других соединений, влияющих на этиопатогенез заболеваний суставов, с достижением синергетического действия от такого включения.

Кроме того, использование композиции позитивно изменяет динамику клинико-биохимических показателей, способствует нормализации морфоструктуры суставных тканей (в том числе цитоархитектоники хрящевой ткани с уменьшением количества хондроцитов, подверженных апоптозу, особенно на конечных его стадиях) и благоприятно влияет на обменные процессы в хондроцитах (активизация синтетических процессов и нормализация биополимерного состава хрящевого матрикса), при этом проявляется выраженный обезболивающий эффект.

Предложена фармацевтическая композиция для профилактики и лечения заболеваний суставов, представляющая собой порошок, или раствор, или гель, или суспензию смеси пептидов H-Ala-Glu-Asp-OH, Lys-Glu-Asp и H-Lys-Glu-OH, взятых в следующем массовом соотношении:

H-Ala-Glu-Asp-OH	Lys-Glu-Asp	H-Lys-Glu-OH
0,1-10	0,1-10	0,1-10

в фармацевтически приемлемом носителе.

Пептиды получают путем тонкого органического синтеза, исходя из оптически чистых L-аминокислот, согласно вышеуказанным патентам:

Фармацевтическая композиция может быть выполнена в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, крема, мази, линимента, геля, капель для приема внутрь, при этом таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой, и раствор может быть для в/в и в/м введения. Также предложено три варианта средства.

Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию, указанную выше, содержащую пептиды и хондроитин и/или его соли при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве в масс.%:

фармацевтическая композиция, содержащая пептиды	0,01-1,00
хондроитин и/или его соли	остальное

Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию, указанную выше, содержащую пептиды и глюкозамин и/или его соли при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве в масс.%:

фармацевтическая композиция, содержащая пептиды	0,01-1,00
глюкозамин и/или его соли	остальное

Средство для профилактики и лечения заболеваний суставов, включающее фармацевтическую композицию, указанную выше, содержащую пептиды, смесь хондроитина и/или его солей и глюкозамина и/или его солей при следующем соотношении указанных ингредиентов в средстве в масс.%:

фармацевтическая композиция, содержащая пептиды	0,01-1,00
смесь хондроитин и/или его солей и
глюкозамина и/или его солей	остальное

массовое соотношение хондроитина и/или его солей: глюкозамина и/или его солей в средстве составляет (1-9):(1-9).

Средство по всем трем вариантам может быть выполнено в виде таблетки, спрея назального (дозированного), аэрозоля подъязычного (дозированного), капсулы, порошка, раствора, лиофилизата для приготовления раствора, крема, мази, линимента, геля, капель для приема внутрь, при этом таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой, и раствор может быть для в/в и в/м введения.

Предложено также четыре варианта способа профилактики и лечения заболеваний суставов с использованием фармацевтической композиции и трех вариантов средств.

Хондропротекторные свойства описываемой новой смеси пептидов были изучены экспериментально по известным методикам.

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

СМЕСИ ПЕПТИДОВ В СОСТАВЕ КОМПОЗИЦИИ (ПРИМЕР-ПРИ МАССОВОМ СООТНОШЕНИИ КОМПОНЕНТОВ В СМЕСИ 1:1:1)

Каррагениновый отек лапы у крыс (Winter et al., 1962). Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина. Выраженность воспалительной реакции оценивали через 3 часа (ч) после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрическим способом с помощью плетизмометра). Исследуемую смесь пептидов в виде композиции в различных дозах вводили за 10-60 минут (мин) до введения каррагенина. Эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах к контролю.

Перитонит у крыс. Острую экссудативную реакцию - перитонит - вызывали внутрибрюшинным (в/б) введением 1% раствора уксусной кислоты (1 мл на 100 г массы). Через 3 ч животных забивали, вскрывать брюшную полость и собирать экссудат. Исследуемую смесь пептидов в виде композиции в различных дозах вводили за 10-60 мин до введения уксусной кислоты. Антиэкссудативный эффект оценивали по уменьшению объема экссудата в процентах к контролю.

Корчи, вызванные уксусной кислотой у мышей (В.М. Булаев, Н.В. Коробов, 2005). В опытах на мышах специфическую болевую реакцию «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) вызывали в/б введением 0,75% раствора уксусной кислоты (0,1 мл/10 мг массы). В течение последующих 15 мин после введения смеси пептидов в виде композиции в различных дозах (за 10-60 мин) подсчитывали количество «корчей» для каждого животного (по 8-10 животных в группе). Эффект оценивали по уменьшению количества «корчей» в процентах к контролю.

Острую токсичность (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000) смеси пептидов в виде композиции исследовали на мышах. При этом регистрировали гибель животных через 24 ч после в/б введения новой смеси пептидов в дозе 2 мг/кг. Поскольку смесь пептидов в дозах 1-800 мкг/кг при однократном внутрибрюшинном или внутримышечном введении достоверно не изменяла исследуемые показатели (в отличие от препаратов сравнения индометацина и диклофенака, данные о которых представлены ниже в табл.1-3), было решено исследовать действие указанной смеси при двукратном внутримышечном введении - за 4 ч и за 30 мин до введения флогогенных агентов. Результаты этой серии опытов представлены ниже в табл.1-3.

Как видно из табл.1, смесь пептидов в дозах 2, 10, 50, 150, 300 и 600 мкг/кг/сут значимо не оказывала антиэкссудативного действия. В отличие от нее препарат сравнения индометацин при однократном введении (в дозе 10 мг/кг) давал выраженный антиэкссудативный эффект.

Как видно из табл.2, смесь пептидов в дозах 2, 10, 50, 150, 300 и 600 мкг/кг/сут значимо не оказывала антиэкссудативного действия. В отличие от нее препарат сравнения диклофенак при однократном введении (в дозе 10 мг/кг) давал выраженный аятиэкссудативный эффект.

Как видно из табл.3, смесь пептидов в дозах 2, 10, 150 и 300 мкг/кг/сут достоверно не влияла на количество корчей, а в дозах 50 и 600 мкг/кг/сут значимо уменьшало их количество с 28±1 (контроль) до 23±1 (p<0,01) и 22±1 (p<0,001) соответственно (или на 18-21%). Препарат сравнения диклофенак при однократном введении (в дозе 10 мг/кг) давал выраженный эффект, значимо уменьшая количество корчей до 17±1 (p<0,001), или на 39%.

В отдельной серии экспериментов оценивали острую токсичность у 9 мышей массой 22-27 г. Смесь пептидов вводили в/б в дозе 2 мг/кг. Было обнаружено, что через 24 ч после однократного в/б введения смесь пептидов не вызывает ни гибели животных, ни существенных токсических реакций.

ВЫВОДЫ

1. Новая смесь пептидов в дозах 1-800 мкг/кг при однократном внутрибрюшинном или внутримышечном введении достоверно не изменяет исследуемые показатели (в отличие от препаратов сравнения индометацина и диклофенака).

2. Новая смесь пептидов в дозах 2, 10, 50, 150, 300 и 600 мкг/кг/сут при двукратном внутримышечном введении значимо не оказывает антиэкссудативного действия на моделях каррагенинового отека лапы и перитонита у крыс. Препараты сравнения индометацин и диклофенак при однократном введении дают выраженный антиэкссудативный эффект.

3. Новая смесь пептидов в дозах 2, 10, 150 и 300 мкг/кг/сут достоверно не изменяет количество корчей у мышей, а в дозах 50 и 600 мкг/кг/сут значимо уменьшает их количество. Препарат сравнения диклофенак при однократном введении дает выраженный эффект.

4. Новая смесь пептидов в дозе 2 мг/кг (однократно внутрибрюшинно) не вызывает существенных токсических реакций у мышей.

Далее исследовали уровень хондропротекторной активности смеси пептидов в условиях развития экспериментального артроза на фоне лечения животных глюкозамина гидрохлоридом.

Задачи исследования

Определить влияние совместного введения смеси пептидов и глюкозамина гидрохлорида на течение системного стероидного артроза у крыс.

Исследуемый препарат:

Смесь пептидов - лиофилизированный порошок для приготовления инъекций для внутримышечного введения.

Референтные объекты.

Субстанция глюкозамина гидрохлорида производства Protein Chemicals (Япония).

Животные:

Вид - крысы

Пол - самцы

Масса - 250-300 г

Общее количество - 90 животных

Путь введения препаратов: Внутримышечно (в/м), перорально (п/о). Распределение животных по группам:

1 группа - интактный контроль (n=10);

2 группа - контрольная патология (n=20);

3 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 100 мкг/кг n=12);

4 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 150 мкг/кг (n=12);

5 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 100 мкг/кг и п/о ГА г/х в дозе 50 мг/кг (n=12);

6 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 150 мкг/кг и п/о ГА г/х в дозе 50 мг/кг (n=12);

7 группа - крысы с артрозом, получающие п/о ГА г/х в дозе 50 мг/кг (n=12).

Схема исследования:

Исследование проводим на белых беспородных крысах-самцах массой 250-300 г, полученных из одного помета (идентичного возраста и массы, с нормальными основными показателями клинических и биохимических анализов). Предварительно животных разделяем на группы, взвешиваем, наносим индивидуальные метки. Далее проводим моделирование стероидного артроза путем троекратного в/м введения дексаметазона с интервалом в 1 неделю в разовой дозе 7 мг/кг. Первые проявления артропатии возникают уже на 4 неделю эксперимента. Степень активности патологического процесса оцениваем в контрольной группе по биохимическим показателям анализа крови, для чего часть животных выводим из эксперимента (10 крыс) и собираем кровь. Начиная с 28 дня эксперимента и на протяжении 4 недель все животные ежедневно получают препараты в соответствующих дозах с помощью определенного пути введения. Исследуемую смесь пептидов вводим в/м, растворяя в необходимом количестве физраствора, ГА гидрохлорид вводим п/о в физрастворе с помощью внутрижелудочного зонда. На протяжении исследования проводится клиническое наблюдение за животными, контролируется функциональное состояние суставов крыс (степень подвижности, устойчивости к физической нагрузке, отечности, гиперемии). По окончании введения препаратов (на 56-е сутки эксперимента) животных подвергают декапитации под эфирным наркозом с целью получения биоматериалов для биохимических и гистоморфологических исследований. Исследуемые показатели учитываем в виде исходных данных, для чего используем интактных животных, а также по состоянию на 28 сутки (для группы контрольной патологии) и 56 сутки исследования.

Исследуемые показатели и сроки их наблюдения

ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Параметры	Сроки наблюдения
Масса тела	1, 14, 28, 56 сутки
Употребление пищи	ежедневно
Поведение животных	ежедневно
Функциональное состояние суставов	ежедневно
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Сиаловые кислоты крови	28, 56 сутки
Фракции и сумма ГАГ крови	28, 56 сутки
Гликопротеины крови	28, 56 сутки
Хондроитинсульфаты крови	28, 56 сутки
Общий N-ацетилглюкозамин крови	28, 56 сутки
Свободный N-ацетилглюкозамин крови	28, 56 сутки
Связанный N-ацетилглюкозамин крови	28, 56 сутки
N-ацетилглюкозамин хрящевой ткани	28, 56 сутки
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Морфоструктура суставного хряща	56 сутки
Ультраструктура суставного хряща	56 сутки

Длительность исследования 6 месяцев.

Исследования уровня хондропротекторной активности смеси пептидов в условиях развития экспериментального артроза показали увеличение эффективности применения смеси пептидов по сравнению с контрольным глюкозамин гидрохлоридом.

Кроме того, совместное применение смеси пептидов и глюкозамин гидрохлорида (количество смеси пептидов составляет 0,2-0,3% от массы глюкозамин гидрохлорида) превзошло действие смеси пептидов и глюкозамина гидрохлорида по отдельности (в перерасчете на отдельные компоненты), что позволяет сделать вывод о синергетическом эффекте совместного применения, причем увеличение количества смеси пептидов в составе вызывает медленный нелинейный рост эффективности применения с выраженным обезболивающим эффектом.

Доклиническое исследование влияние смеси пептидов на процессы апоптоза хондроцитов в условиях развития экспериментального артроза

1. Цель исследования

Исследовать влияние смеси пептидов на процессы апоптоза хондроцитов в условиях развития экспериментального артроза.

2. Задачи исследования

Определить влияние смеси пептидов при внутримышечном введении на интенсивность процессов апоптоза хондроцитов в суставном хряще крыс на фоне развития системного стероидного артроза.

3. Исследуемый препарат.

Смесь пептидов - лиофилизированный порошок для приготовления инъекций для внутримышечного введения.

4. Референтные объекты.

Субстанция глюкозамина гидрохлорида, производства Protein Chemicals (Япония).

5. Обоснование избранной схемы исследования.

В ходе предварительных исследований было обнаружено, что оригинальная субстанция, содержащая смесь короткоцепочечных пептидов, является средством, обладающим хондропротекторной активностью. На этапе электронно-микроскопического исследования влияния данной субстанции на структуру суставного хряща было обнаружено уменьшение количества хондроцитов, подверженных процессам апоптоза (хондроптоза), особенно на конечных его стадиях. Это позволяет предположить наличие у данной субстанции антиапоптозного эффекта. При этом наибольшая активность наблюдалась в интервале доз 50-150 мкг/кг.

Известно, что апоптоз возникает в суставном хряще в ответ на сдавливание, механическое повреждение, нарушение трофики, экспериментальное воздействие и является основным механизмом гибели клеток суставного хряща при остеоартрозе. При этом апоптоз хондроцитов имеет ряд морфологических особенностей, что позволяет использовать в экспериментальной практике даже отдельный гермин - хондроптоз.

В связи с этим с целью углубленного изучения механизмов хондропротекторного действия данной субстанции большой научный и практический интерес представляет исследование процессов апоптоза в патологически измененном суставном хряще под ее воздействием в дозах 100 и 150 мкг/кг. Для этого можно предложить использовать в качестве маркера апоптозных клеток иммуногистохимический метод TUNEL-реакций (TdT-mediated X-dUTP nick end labeling) на полутонких парафиновых срезах суставного хряща с помощью наборов In Situ Cell Death Detection Kit (Roche, Германия). Основным преимуществом данного метода является высокая чувствительность и избирательность, что позволяет высокоточно идентифицировать клетку на ранних этапах клеточной гибели. Также важным моментом является возможность проведения морфометрической оценки на больших площадях хрящевой ткани, чего не позволяет сделать электронная микроскопия.

В качестве параметров оценки интенсивности течения патологического процесса в опытных группах целесообразно использовать следующие биохимические показатели: содержание в сыворотке крови сиаловых кислот, гликопротеинов, хондроитинсульфатов, гликозаминогликанов, N-ацетилглюкозамина, поскольку данные показатели информативно отображают интенсивность течения дегенеративно-дистрофических процессов в соединительной ткани. В качестве препарата сравнения целесообразно использование глюкозамина гидрохлорида как одного из наиболее распространенных и изученных средств хондропротекторного действия, в дозе 50 мг/кг, соответствующей среднеэффективной дозе по противовоспалительной активности

6. Животные:

Вид - крысы

Пол - самцы

Масса - 250-300 г

Общее количество - 66 животных

7. Путь введения препаратов.

Внутримышечно (в/м), перорально (п/о)

8. Распределение животных по группам.

1 группа - интактный контроль (n=10)

2 группа - контрольная патология (n=20);

3 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 100 мкг/кг (n=12);

4 группа - крысы с артрозом, получающие в/м смесь пептидов в дозе 150 мкг/кг (n=12);

5 группа - крысы с артрозом, получающие п/о препарат сравнения глюкозамина гидрохлорид в дозе 50 мг/кг (n=12).

9. Схема исследования

Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 250-300 г, полученных из одного помета (идентичного возраста и массы, с нормальными основными показателями клинических и биохимических анализов). Предварительно животных разделяем на группы, взвешиваем, наносим индивидуальные метки. Далее проводим моделирование стероидного артроза путем троекратного в/м введения дексаметазона с интервалом в 1 неделю в разовой дозе 7 мг/кг. Первые проявления артропатии возникают уже на 4 неделю эксперимента. Степень активности патологического процесса оцениваем в контрольной группе по биохимическим показателям анализа крови, для чего часть животных выводим из эксперимента (10 крыс) и собираем кровь. Начиная с 28 дня эксперимента и на протяжении 4 недель все животные ежедневно в/м получают смесь пептидов в соответствующих дозах. Животные 5 группы ежедневно получают глюкозамина гидрохлорид в дозе 50 мг/кг, который вводится перорально в растворе с помощью внутрижелудочного зонда. На протяжении исследования проводится клиническое наблюдение за животными, контролируется функциональное состояние суставов крыс (степень подвижности, устойчивости к физической нагрузке, отечности, гиперемии). По окончании введения препаратов (на 56-е сутки эксперимента) животных подвергают декапитации под эфирным наркозом с целью получения биоматериалов для биохимических и иммуногистохимических исследований. Идентификацию апоптированных клеток в тканях суставного хряща проводим иммуногистохимически на полутонких парафиновых срезах методом TUNEL-реакции с помощью наборов In Situ Cell Death Detection Kit производства компании Roche (Германия).

10. Исследуемые показатели и сроки их наблюдения

ИНТЕГРАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Параметры	Сроки наблюдения
Масса тела	1, 14, 28, 56 сутки
Употребление пищи	ежедневно
Поведение животных	ежедневно
Функциональное состояние суставов	ежедневно
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
Сиаловые кислоты крови	28, 56 сутки
Фракции и сумма ГАГ крови	28, 56 сутки
Гликопротеины крови	28, 56 сутки
Хондроитинсульфаты крови	28, 56 сутки
N-ацетилглюкозамин	28, 56 сутки
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Апоптоз хондроцитов		56 сутки

Длительность исследования 6 месяцев.

В результате проведенных экспериментальных данных рекомендовано назначать данные средства при остеоартрозе периферических суставов и позвоночника (остеоартрозы; артропатии; межпозвонковый остеоартроз, в качестве лечения и профилактики остеоартроза.

С целью изучения широты варьирования соотношения пептидов в смеси нами были проведены дополнительные исследования, которые отражены в таблице 1 и 2.

В таблице 1 отражена динамика массы тела крыс под воздействием исследуемой смеси пептидов (0,1-1-10) на фоне развития системного стероидного артроза.

В таблице 2 отражена динамика массы тела крыс под воздействием исследуемой смеси пептидов (10-2-0,1) на фоне развития системного стероидного артроза.

Кроме того, экспериментальные исследования показали следующую возможность создания разных лекарственных форм и рекомендации по их применению:

Пример 1

Твердые формы (таблетки, в том числе и для рассасывания, и капсулы):

Капсулы получают общеизвестным способом (Чуешов В.И. и др. Промышленная технология лекарств, Т.2, МТК - Книга; Изд-во НФАУ, 2002 г., стр.400-413).

Для приготовления капсул смешивают ингредиенты из расчета состава одной капсулы: смесь пептидов в виде порошка, например, в соотношении 1:1:1 - 150 мкг; глюкозамин (и его соли) - 750 мг; вспомогательные вещества: магния стеарат 5 мг, марганца сульфат 1 мг, стеариновая кислота 10 мг.

Одним из способов производства капсул является метод грануляции: массу для капсулирования готовят следующим образом: порошки смеси петидов и/или глюкозамина (и его соли), и/или хондроитин (и его соли), лактозы и стеарата кальция или магния, или любые другие фармацевтически приемлемые носители, просеивают через сито и взвешивают. Затем порошки смешивают в определенных, согласно техническому регламенту предприятия-производителя, соотношениях ингредиентов по массе, полученную промежуточную смесь порошков увлажняют 70%-ным этиловым спиртом, влажную промежуточную смесь просеивают через сито с диаметром отверстий 3 мм, получая влажные гранулы (гранулят). Гранулы сушат, опудривают, после чего наполняют ими желатиновые капсулы.

Таблетки получали общеизвестным способом (там же, стр.335-368).

Для приготовления таблеток смешивают ингредиенты из расчета состава одной таблетки: смесь пептидов (какая в виде порошка, например, в соотношении 1:2:1) - 150 мкг; хондроитин (и его соли) - 200 мг; вспомогательные вещества: кальция стеарат 4.8 мг, кросповидон 12.39 мг, магния карбонат, повидон 9.312 мг, целлюлоза микрокристаллическая 96 мг).

Стадия приготовления таблеток включает следующие операции: исходные вещества подготовительная стадия + составление рабочей прописи отвешивание измельчение просеивание (возможно влажное гранулирование) смешивание порошков увлажнение гранулирование сушка опудривание прессование фасовка

Полученные лекарственные формы возможно использовать следующим образом.

Взрослым и детям старше 12 лет по 1 единице (содержание смеси пептидов 150 мкг, содержание глюкозамина сульфат 500 мг) 2 раза в день в течение трех первых недель; по 1 единице 1 раз в день в течение последующих недель и месяцев. Устойчивый лечебный эффект достигается при приеме препарата не менее 6 месяцев.

Пример 2

Инъекционные растворы получали общеизвестным способом (там же, стр.510-543).

Для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения смешивают ингредиенты из расчета состава одной ампулы (2 мл): смесь пептидов в виде порошка, например, в соотношении 1:3:1 - 100 мкг; хондроитин (и его соли) - 100 мг; глюкозамин (и его соли) - 100 мг; лидокаина гидрохлорид 10 мг, трометамол до pH 2-3, вода для инъекций - до 2 мл.-

Стадия приготовления раствора включает следующие операции: исходные вещества подготовительная стадия + составление рабочей прописи отвешивание растворение изотонирование стабилизация введение консервантов фильтрование розлив по ампулам фасовка. В зависимости от свойств лекарственных веществ некоторые из операций могут быть исключены, например, изотонирование, стабилизация, введение консервантов)

Раствор прозрачный, бесцветный или со слегка желтоватым оттенком, без запаха.

Полученные лекарственные формы необходимо использовать следующим образом.

Инъекции: Препарат назначают в/м по 50 мг (1 амп. содержание смеси пептидов 50 мкг, глюкозамина гидрохлорида 50 мг) ежедневно. При хорошей переносимости дозу увеличивают до 100 мг (2 амп.), начиная с четвертой инъекции. Курс лечения - 25-30 инъекций. При необходимости возможно проведение повторных курсов лечения.

Пример 2а.

Для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения смешивают ингредиенты из расчета состава одной ампулы (2 мл): смесь пептидов в виде порошка, например, в соотношении 1:2:1 - 150 мкг; лидокаина гидрохлорид 10 мг, трометамол до pH 2-3, нипагин 10 мг, вода для инъекций - до 2 мл.

Раствор прозрачный, бесцветный или со слегка желтоватым оттенком, без запаха.

Инъекции: Препарат назначают в/м по 2 мл (1 амп. содержание смеси пептидов 150 мкг) ежедневно. При хорошей переносимости дозу увеличивают до 300 мкг (по 2 амп. ежедневно), начиная с четвертой инъекции. Курс лечения - 25-30 инъекций. При необходимости возможно проведение повторных курсов лечения.

Пример 3

Назальная форма: Капли в нос 5 мл (содержание смеси пептидов 75 мкг, глюкозамина сульфата 800 мг). Взрослые и дети старше 15 лет: применять капли по 1-2 капли в каждый носовой ход 2-3 раза в день в течение трех первых недель, по 1-2 капле 1 раз в день в течение последующих 24 недель. Для инжекционных форм соотношение активных веществ аналогичное.

Пример 4

Стадия приготовления аэрозольных форм выпуска включает следующие операции:

1. исходные вещества подготовительная стадия + составление рабочей прописи отвешивание измельчение просеивание смешивание порошков (приготовление эвтектической смеси действующих веществ)

2. приготовление эвтектической смеси вспомогательных веществ

3. введение эвтектической смеси в эмульсию вспомогательных веществ

4. Готовый препарат из реактора перекачивают или перелавливают в сборники, откуда он самотеком или под давлением подается на линию заполнения к аппарату дозировки препарата.

5. Приготовление смеси пропеллентов. Технологические операции, связанные с приготовлением пропеллентов, различаются в зависимости от того, как транспортируется пропеллент к линии заполнения. Транспортирование можно осуществлять либо с помощью насоса, либо под давлением, создаваемым инертным газом - азотом или парами самих пропеллентов.

6. фильтрация эмульсии заполнение эмульсией флаконов установка дозатора и закатывание флакона фасовка. Линия заполнения может представлять собой либо серию отдельных полуавтоматов, либо автоматическое оборудование, компактно объединенное в одну линию согласно последовательности технологических операций.

Аэрозольная форма 100 мл (содержание смеси пептидов 1,2 мг, хондроитина сульфата 2,5 гр, глюкозамин сульфата 3,5 гр.) Препарат применяют местно. Перед применением с распылителя снимают защитный колпачок, при использовании баллон следует держать вертикально так, чтобы распылитель находился сверху; нельзя пользоваться баллоном в перевернутом состоянии. После применения препарата на распылитель следует надеть защитный колпачок. Взрослые и дети старше 12 лет: распылять по 1-2 распылению 2-3 раза в день в течение трех первых недель, по 1-2 распылению 1 раз в день в течение последующих 24 недель.

Пример 5

Оральная форма 10 мг (капли, содержащие смеси пептидов 400 мкг, глюкозамина гидрохлорида 1,8 гр.): Вводят взрослым и детям. старше 15 лет по 1-2 капли раствора 2-3 раза в день в течение трех первых недель, по 1-2 капле 1 раз в день в течение последующих 24 недель. Аналогичное соотношение для орально-аэрозольных комплексов.

Проведенный анализ полученных данных показал, что при лечении экспериментального остеоартроза у крыс смесь пептидов и смесь пептидов с глюкозамина сульфатом (гидрохлорид) и смеси пептидов с хондроитина сульфатом и смеси пептидов с глюкозамина сульфатом (гидрохлорид) и хондроитина сульфатом позитивно изменяет динамику клинико-биохимических показателей, способствует нормализации морфоструктуры суставных тканей (в том числе цитоархитектоники хрящевой ткани с уменьшением количества хондроцитов, подверженных апоптозу, особенно на конечных его стадиях) и благоприятно влияет на обменные процессы в хондроцитах (активизация синтетических процессов и нормализация биополимерного состава хрящевого матрикса), при этом проявляется выраженный обезболивающий эффект.

Таблица 1
Влияние новой смеси пептидов при внутримышечном введении (2 раза) и препарата сравнения индометацина (1 раз) на развитие каррагенинового отека у крыс
Вещество (доза, мкг/кг/сут)	Число крыс	Антиэкссудативный эффект, прирост объема лапы, %
Контроль	10	139±6
Смесь (2)	6	159±10
Смесь (10)	7	148±8
Смесь (50)	8	125±4
Смесь (150)	7	129±5
Смесь (300)	8	135±4
Смесь (600)	8	126±4
Индометацин (10 мг/кг однократно)	8	36±2
Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): -p<0,001

Таблица 2
Действие новой смеси пептидов при внутримышечном введении (2 раза) и препарата сравнения диклофенака (1 раз) на модели перитонита у крыс
Вещество (доза, мкг/кг/сут)	Число крыс	Антиэкссудативный эффект (уменьшение объема экссудата), в % к контролю
Смесь (2)	6	125±13
Смесь (10)	6	117±11
Смесь (50)	8	89±6
Смесь (150)	7	98±6
Смесь (300)	7	101±7
Смесь(600)	8	92±5
Диклофенак (10 мг/кг однократно)	8	54±2
Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): - p<0,001

Таблица 3
Действие новой смеси пептидов при внутримышечном введении (2 раза) и препарата сравнения диклофенака (1 раз) на модели «уксусные корчи»
Вещество (доза, мкг/кг/сут)	Число мышей	Количество корчей (M±m)	Эффект, %
Контроль	12	28±1	-
Смесь (2)	10	30±1	107 (+7)
Смесь (10)	10	29±1	104 (+4)
Смесь (50)	10	23±1	82 (-18)
Смесь (150)	8	25±2	89 (-11)
Смесь (300)	10	26±1	93 (-7)
Смесь (600)	10	22±1	79 (-21)
Диклофенак (10 мг/кг однократно)	10	17±1	61 (-39)
Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): - p<0,01, - p<0,001

Таблица 4
Условия опыта	Доза препарата	Масса тела, г
		Исходные данные	14 сутки	28 сутки	56 сутки
Контрольная патология (n=40)		262,0±4,0	273,5±3,7	287,9±3,3	320,4±4,5
Смесь пептидов (0,1-1-10) (n=12)	10 мкг/кг	260,3±3,4	270,7±3,6	282,2±3,2	316,7±4,0
	50 мкг/кг	261,3±4,2	272,4±3,2	280,1±3,4	307,7±3,9
	150 мкг/кг	263,0±4,7	274,1±3,6	285,3±3,2	302,4±3,8 /
	600мкг/кг	260,9±3,4	269,3±3,5	280,0±3,4	300,6±3,8 /
Глюкозамина гидрохлорид (п=12)	50 мг/кг	260,8±3,2	269,4±3,5	287,8±3,2	302,2±4,0
Примечания:
1) -- p 0,05 относительно исходных данных
2) - p ,05 относительно группы контрольной патологии

Таблица 5
Условия опыта	Доза препарата	Масса тела, г
		Исходные данные	14 сутки	28 сутки	56 сутки
Контрольная патология (n=40)		262,0±4,0	273,5±3,7	287,9±3,3	320,4±4,5
Смесь пептидов (10-2-0,1) (n=12)	10 мкг/кг	260,4±2,5	269,6±3,5	280,0±3,1	310,8±3,3
	50 мкг/кг	261,8±3,9	270,4±2,2	275,1±2,2	305,4±2,7
	150 мкг/кг	263,0±2,7	273,2±3,1	281,3±3,9	301,0±3,8 /
	600 мкг/кг	260,7±1,7	267,2±3,8	280,0±1,2*	289,6±2,4 /
Глюкозамина гидрохлорид (n=12)	50 мг/кг	260,8±3,2	269,4±3,5	287,8±3,2	302,2±4,0
Примечания:
1) -- p 0,05 относительно исходных данных
2) - p ,05 относительно группы контрольной патологии