молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями

Формула изобретения

Молекулярная бивалентная вакцина для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями (E. Coli, V. Cholera и другие), отличающаяся тем, что в качестве специфического начала используется белок внешних мембран бруцелл с молекулярной массой 25 kDa и аминокислотной последовательностью

MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGYGWN KAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVKQGFEGS LGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLTDNILGRVE YRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF,

конъюгированный с молекулярным носителем, в качестве которого используются В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам конструирования вакцины и ее применения для профилактики бруцеллеза и диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera и другими.

Уровень техники

Для профилактики бруцеллеза в настоящее время используются живые вакцины на основе аттенуированных штаммов Brucella abortus 82, 82рп и 75/79 в России, Brucella abortus RB51 и S19 в США [1-4]. Живые бактериальные вакцины являются эффективным инструментом для создания защитного иммунитета против внутриклеточных паразитов, но в случае с бруцеллами такие вакцины не обеспечивают достаточного уровня защиты. Все перечисленные вакцины не обеспечивают 100% защиту животных от бруцеллеза. Кроме того, они не безопасны для человека и при вакцинации могут провоцировать развитие инфекционного процесса. Практическое использование этих вакцин показало, что вакцинация во многих случаях приводит к развитию вялотекущей бруцеллезной инфекции с разнообразными осложнениями аллергенного характера.

Известна также вакцина на основе инактивированных нагреванием при 80°С клеток бруцелл штамма 45/20 и разрушенных ультразвуком [4]. Антигенная субстанция осаждается 10% трихлоруксусной кислотой и лиофильно высушивается. Данная вакцина требует двукратного введения и обладает высокореактогенными свойствами.

Другим известным препаратом является вакцина на основе белково-полисахаридного комплекса, выделенного химическим путем из клеток бруцелл [5]. Основным недостатком этого препарата является неизвестный состав и отсутствие возможности введения стандартизации различных партий.

Для профилактики диарей, вызванных энтеропатогенными бактериями Е. coli, V. cholera, используется иммунизация животных препаратами, содержащими В-субъединицы термолабильного или холерного токсина.

Настоящее изобретение позволяет решить такие задачи, как высокая стандартизация препарата на основе точного химического состава вакцины, дозируемость и возможность введения различными способами (внутримышечно, подкожно, интраназально и перорально), при этом достигается следующий результат: при двукратном подкожном введении создает напряженный и длительный (не менее одного года) иммунитет у привитых животных, эффективный против экспериментального заражения бруцеллами за счет индукции специфических цитотоксических лимфоцитов [6].

Сущность изобретения

Сущностью изобретения - это молекулярная вакцина для профилактики бруцеллеза на основе белка внешних мембран бруцелл с молекулярным весом и аминокислотной последовательностью

MRTLKSLVIVSAALLPFSATAFAADAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWAGGYTGLYLGY GWNKAKTSTVGSIKPDDWKAGAFAGWNFQQDQIVYGVEGDAGYSWAKKSKDGLEVK QGFEGSLGARVGYDLNPVMPYLTAGIAGSQIKLNNGLDDESKFRVGWTAGAGLEAKLT DNILGRVEYRYTQYGNKNYDLAGTTVRNKLDTQDIRVGIGYKF, [1]

конъюгированного с молекулярным носителем, в качестве которого были использованы В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Е. coli.

Рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии. Культуры штаммов E. coli BL21, продуцентов белков, выращивали на L-бульоне с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) до OD₆₀₀=0,6-0,8 и индуцировали экспрессию рекомбинантных белков с помощью 1-2 mM изопропил-D-тиогалактопиранозила (ИПТГ). Через три часа после культивирования с индуктором бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 30 минут и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (3 раза по 30 секунд с минутным интервалом при мощности 150 Вт) в присутствии ингибитора протеаз PMSF. После удаления центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут клеточного дебриса супернатант наносили на колонку сефарозой, к которой ковалентно были присоединены антитела против В-субъединиц термолабильного токсина. Связанный белок элюировали 3М гуанидинхлорида. Очищенный препарат рекомбинантных белков обессоливали на колонке с биогелем Р6, уравновешенным Na-фосфатным буферным раствором рН 7,2 и хранили при температуре 4°С.

Пример. Профилактическую эффективность разработанного препарата изучали на мышиной модели бруцеллеза. В качестве модели экспериментального бруцеллеза использовали мышей линии СВА, инфицированных дозой в 10⁴ КОЕ (колонеобразующих единиц) штамма Brucella abortus SI9. Через 7-10 дней высевы из селезенки демонстрировали инфицированность на уровне 10^5,5-6 КОЕ. Животным (в каждой группе по 10) вводили препарат рекомбинантных белков в дозах от 100 нг до 5 мкг подкожно в объеме 0,1 мл. Через месяц проводили повторную иммунизацию. Через 6 месяцев после последней иммунизации животным внутрибрюшинно в дозе 10⁴ КОЕ вводили культуру Brucella abortus SI9, выращенную на чашках с эритрит-агаром, в объеме 0,5 мл. Вскрытие проводили на 7-10 сутки после заражения. Селезенку взвешивали и помещали в стерильную ступку, тщательно растирали пестиком до получения однородной массы. В ступку с гомогенатом вносили 5 мл стерильного Na-фосфатного буфера с 0,2% Tween-80, дополнительно гомогенизировали и титровали шагом 1:10. Из каждого разведения производили посев в объеме 0,1 мл на чашки с эритрит-агаром с добавлением полимиксина. Предварительный учет результатов проводили через 5 суток, окончательный учет - через 10 суток.

Таблица 1. Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных подкожно различными дозами препарата.
Препарат	Высеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах
	10 2 КОЕ	104 KOE
Контроль 1 (физиологический р-р)-	3,67±0,52	5,94±0,81
Контроль 2 (A201-258 -BLT, 5	3,34±0,65	5,88±0,87
omp25-A 201-258-BLT, 100 нг	2,11±0,53	4,15±0,75
omp25-A201-258-BLT, 500 нг	0	2,81±0,33
omp25-A201-258-BLT, 1 мкг	0	2,03±0,41
omp25-A201-258-BLT, 5 мкг	0	1,48±0,45

Таблица 2. Инфицированность селезенки бруцеллами у животных, иммунизированных перорально различными дозами препарата.
Препарат	Высеваемость (log КОЕ) при различных инфицирующих дозах
	102 KOE	10 4 KOE
Контроль 1 (физиологический р-р)	3,81±0,61	6,43±0,84
Контроль 2 (A 201-258-BLT, 5	3,74±0,59	6,80±0,89
omp25-A201-258-BLT, 100 нг	2,93±0,67	5,75±0,63
omp25-A201-258-BLT, 500 нг	1,96±0,73	4,81±0,57
omp25-A201-258 -BLT, 1 мкг	0,98±0,76	2,99±0,48
omp25-A 201-258-BLT, 5 мкг	0	1,87±0,42

Таблица 3. Титр антител против В-субъединиц термолабильного энтертоксина у животных, иммунизированных подкожно и перорально различными дозами препарата.
Препарат	Титр антител против В-субъединиц у животных
	подкожно	перораль
Контроль 1 (физиологический р-р)	0	0
Контроль 2 (A 201-258-BLT, 5 мкг)	1/1280	1/640
omp25-A201-258 -BLT, 100 нг	1/160	1/160
omp25-A201-258 -BLT, 500 нг	1/320	1/320
omp25-A201-258 -BLT, 1 мкг	1/1280	1/640
omp25-A201-258 -BLT, 5 мкг	1/1280	1/640

Таким образом, разработанная молекулярная вакцина индуцирует специфический и длительный иммунитет, эффективно защищающий от инфицирования высокими дозами бруцелл: двукратное введение молекулярной вакцины подкожно в дозе от 500 нг до 5 мкг эффективно и статистически достоверно снижает инфицированность более чем в 1000 раз при инфицирующей дозе 10⁴ КОЕ и демонстрирует отсутствие высеваемости при инфицирующей дозе 10² КОЕ, при пероральном введении отсутствие высеваемости бруцелл наблюдается только при высокой дозе в 5 мкг и значительное более чем в 600 раз снижение инфицированности при высокой дозе инфицирования. При обоих способах вакцинации рекомбинантными препаратами титр антител против В-субъединицы термолабильного энтеротоксина достигал тех же значений, что и против нативных В-субъединиц (1/1280 при дозе в 5 мкг).

Источники информации

1. Сухая живая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма №19, ГОСТ 1859-73.

2. Патент Франции №2479000, кл. F 61 K 39/10, 1983.

3. Авторское свидетельство СССР №467933, кл. F 61 K 39/08, опубл. 1975.

4. Ветеринарные препараты. Справочник /Сост. Ю.Ф.Борисевич, Л.В.Кириллов./ Под ред. Д.Ф.Осидзе. М.: Колос, 1981, с.178-180.

5. Изучение иммуногенной активности искусственных бруцеллезных антигенов. /Петров Р.В. и др./ - ЖМЭИ №7, 1988, с.39-42.

6. Induction of specific cytotoxic lymphocytes in mice vaccinated with Brucella abortus RB51. /He Y, Vemulapalli R, Zeytun A, Schurig GG./ Infect Immun. 2001. 69(9), p.5502-5508.

7. Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the major 25-kilodalton outer membrane protein of Brucella ovis: Evidence for antigenic shift, compared with other Brucella species, due to a deletion in the gene /Cloeckaert A, Verger JM, Grayon М, Zygmunt MS, Grepinet O./ Infect Immun. 1996 Jun; 64(6): 2047-55.