нуклеотидная последовательность, кодирующая tolc, содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность

Формула изобретения

1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок или слитый пептид, представляющий собой белок ToIC или его мутанты или предпочтительно его N-концевую частичную последовательность или ее мутанты, которые имеют транспортную функцию, со встроенным в находящуюся с наружной стороны мембраны пермиссивную область ToIC пептидом с определенной аминокислотной последовательностью, способным стимулировать образование антител в организме.

2. Нуклеотидная последовательность по п.1, где ToIC представляет собой ToIC, который кодируется нуклеотидной последовательностью согласно ACCESSION X54049.

3. Нуклеотидная последовательность по п.1, где определенная аминокислотная последовательность с одной стороны или с обеих сторон встроена через спейсерную последовательность.

4. Нуклеотидная последовательность по любому из пп.1-3, где определенная аминокислотная последовательность встроена в аминокислотную последовательность N-концевой области ToIC в положениях аминокислотных остатков 52-61 и/или 257-279, которые соответствуют аминокислотной последовательности ToIC.

5. Нуклеотидная последовательность по любому из пп.1-3, где определенная аминокислотная последовательность принадлежит последовательности пептида, белка, фармацевтически или биологически активного вещества, антигена, антитела или лиганда.

6. Плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пп.1-5, используемая для экспрессии слитого белка или слитого пептида.

7. Слитый белок или слитый пептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по любому из пп.1-5, используемый для стимуляции иммунного ответа.

8. Трансформированная бактерия для использования в целях прививки, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пп.1-5 или плазмиду по п.6, где ToIC осуществляет транспорт определенной аминокислотной последовательности на мембрану трансформированной бактерии.

9. Трансформированная бактерия по п.8, где определенная аминокислотная последовательность по п.1 принадлежит последовательности пептида, белка, фармацевтически или биологически активного вещества, антигена, антитела или лиганда.

10. Трансформированная бактерия по любому из пп.8-9, где бактерия представляет собой грамотрицательную бактерию или где бактерия выбрана из группы грамотрицательных бактерий, состоящей из: Salmonella spp., Escherichia coli. Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. и Yersinia spp.

11. Фармацевтическая композиция для стимуляции иммунного ответа, содержащая трансформированную бактерию по любому из пп.8-10, причем встроенный в слитый белок пептид с определенной аминокислотной последовательностью выбран из числа пептидов, которые способны стимулировать образование антител в организме, и необязательно по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель.

12. Фармацевтическая композиция для стимуляции иммунного ответа, содержащая трансформированную бактерию по любому из пп.8-10, причем встроенный в слитый белок пептид с определенной аминокислотной последовательностью представляет собой иммуноген.

13. Диагностический набор для детекции представляющего интерес вещества в организме, содержащий трансформированную бактерию по любому из пп.8-10, причем встроенный в слитый белок пептид с определенной аминокислотной последовательностью специфически связывает представляющее интерес вещество.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей TolC, плазмиде, содержащей такую нуклеотидную последовательность, протеину или пептиду, кодированному такой нуклеотидной последовательностью, бактерии, содержащей такую нуклеотидную последовательность, а также к различным применениям таких бактерий.

Аттенуированные в отношении своей вирулентности, попадающие внутрь клетки бактерии могут, в качестве живых вакцин, индуцировать длительный иммунитет. До сих пор в качестве живых вакцин использовали особенно Salmonella Typhi TY1a (Levine и др., Lancet, 1, 1049-1052 (1987)), Mycobacterium bovis BCG (вакцина Кальметта-Герена) (Fine и Rodrigues, Lancet, 335, 1016-1020 (1990)) и Vibrio cholerae (Levine и Kaper, Vaccine, 11, 207-212 (1993)).

Например, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica sv. Typhimurium и Typhi, а также варианты, подобные вакцине Кальметта-Герена (BCG), уже используют в качестве хорошо приемлемых живых вакцин против тифа и туберкулеза. Эти бактерии, включая их ослабленные мутанты, в общем, являются иммуностимулирующими и могут вызывать на достаточно хорошем уровне клеточный иммунный ответ и поэтому используются в качестве вакциноносителей.

Преимущество этих бактерий в качестве вакциноносителей состоит в том, что они прежде всего индуцируют так называемый Thl иммунный ответ (Hess и Kaufman, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 23 , 165-173 (1999)). Этот иммунный ответ отличается цитотоксическими лимфоцитами (CTL), а также наличием специфических CD4+ Т-клеток, секретирующих гамма-интерферон, (также Т-клеток-хелперов, Th) (Abbas и др., Nature, 383, 787-793 (1996)).

Например, L. monocytogenes за счет активации клеток ТН1 в особенности стимулирует пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Эти бактерии "поставляют" выделенные антигены прямо в цитозоль антигенпрезентирующих клеток (АРС; макрофаги и дендритные клетки), которые, со своей стороны, экспрессируют ко-стимулирующие молекулы и вызывают эффективную стимуляцию Т-клеток. Листерии отчасти подвергаются разложению в фагосомных компартментах и продуцированные этими бактериями-носителями антигены поэтому, с одной стороны, могут презентироваться молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС) и вместе с тем приводят к индукции Т-клеток-хелперов. С другой стороны, листерии, после высвобождения из фагосомы, реплицируются в цитозоле антигенпрезентирующих клеток (АРС); продуцированные и выделенные этими бактериями антигены поэтому предпочтительно презентируются молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС), благодаря чему индуцируются CTL ответы против этих антигенов. Кроме того, показано, что за счет взаимодействия листерий с макрофагами, естественными клетками-киллерами (NK) и нейтрофилами гранулоцитарного ряда индуцируется экспрессия таких цитокинов (альфа-фактор некроза опухоли (TNF-альфа), гамма-интерферон, интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-12 (IL-12); Unanue, Curr. Opin. Immunol., 9, 35-43 (1997); Mata и Paterson, J. Immunol., 163, 1449-1456 (1999)), для которых доказана противоопухолевая эффективность.

Рекомбинантные бактерии вследствие этого способны защищать против гетерологичной опухоли (Medina и др., Eur. J. Immunol., 29, 693-699 (1999); Pan и др., Cancer Res., 59, 5264-5269 (1999); Woodlock и др., J. Immunother., 22, 251-259 (1999); Paglia и др., Blood, 92, 3172-3176 (1998); Paglia и др., Eur. J. Immunol., 27, 1570-1575 (1997); Pan и др., Nat. Med. 1, 471-477 (1995); Pan и др., Cancer Res., 55, 4776-4779 (1995)).

Так, за счет введения L. monocytogenes, которые подвергнуты трансдукции в отношении экспрессии опухолевых антигенов, можно ингибировать антигенспецифически рост экспериментальных опухолей (Pan и др., Nat. Med., 1, 471-477 (1995); Cancer Res., 59, 5264-5269 (1999); Voest и др., Natl. Cancer Inst., 87, 581-586 (1995); Beatty и Paterson, J. Immunol., 165, 5502-5508 (2000)).

Аттенуированные в отношении вирулентности штаммы Salmonella enterica, в которые введены нуклеотидные последовательности, кодирующие опухолевые антигены, в виде бактериальных носителей, экспрессирующих опухолевые антигены, после орального введения могут вызывать специфическую защиту против различных экспериментальных опухолей (Medina и др., Eur. J. Immunol., 30, 768-777 (2000); Zoller и Christ, J. Immunol., 166, 3440-3450 (2001); Xiang и др., PNAS, 97 , 5492-5497 (2000)).

Рекомбинантные штаммы Salmonella также в качестве профилактических вакцин оказались эффективными против вирусных инфекций (вирус папилломы человека (HPV); Benyacoub и др., Infect. Immun., 67, 3674-3679 (1999)) и для терапевтической обработки иммортализированной онкогенным вирусом (вирус папилломы человека) опухоли мыши (Revaz и др., Virology, 279, 354-360 (2001)).

Для применения в качестве вакциноносителей разработаны способы, обеспечивающие экспрессию продуктов нуклеотидных последовательностей, введенных в бактерии, в клеточные мембраны этих бактерий, или секретирование этими бактериями. Основой этих способов является гемолизиновая система Escherichia coli HlyAs, которая представляет собой прототип секреторной системы типа I грамотрицательных бактерий. С помощью HlyAs сконструированы векторы секреции, которые обеспечивают эффективное выведение антигенов протеинов в случае Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica и Vibrio cholerae. Такого рода векторы секреции содержат кДНК любого протеинового антигена, связанную с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида HlyA, аппарата секреции гемолизина, hlyB и hlyD и специфичного к hly промотора. С помощью этого вектора секреции протеин можно экспрессировать, например, на поверхности этой бактерии. Такого рода генетически модифицированные бактерии в качестве вакцин индуцируют гораздо более сильную иммунную защиту, чем бактерии, в которых экспрессированный введенной нуклеиновой кислотой протеин остается внутри клетки (Donner и др., заявка на Европейский патент ЕР-1015023-А; Gentschev и др., Gene, 179, 133-140 (1996); Vaccine, 19, 2621-2618 (2001); Hess и др., PNAS, 93, 1458-1463 (1996)). Недостатком этой системы, однако, является то, что за счет применения специфичного к Hly промотора количество протеина, экспрессированного бактерией, является незначительным.

Другие транспортные системы в бактериях представляют собой, например, i) транспортный сигнал протеина S-ряда (Rsa A) Caulobacter crescentus, в случае которого для секреции и для постоянной мембранной экспрессии нужно применять С-концевой транспортный сигнал RsaA (Umelo-Njaka и др., Vaccine, 19, 1406-1415 (2001)), и ii) транспортный сигнал интерналина А Listeria monocytogenes. Для секреции необходим N-концевой транспортный сигнал, а для постоянной мембранной экспрессии необходим N-концевой транспортный сигнал вместе с С-концевой частью, содержащей мотив LPXTG, ответственный за анкеровку клеточной оболочки (Dhar и др., Biochemistry, 39, 3725-3733 (2000)).

Согласно другим обстоятельствам известен интегральный мембранный протеин TolC бактерии E. coli. Он представляет собой многофункциональный порообразующий протеин наружной мембраны бактерии E. coli, который наряду с такими функциями, как, например, поглощение колицина Е1 (Morona и др., J. Bacteriol., 153, 693-699 (1983)) и секреция колицина V (Fath и др., J. Bacteriol., 173, 7549-7556 (1991)), также служит в качестве рецептора U3-фага (Austin и др., J. Bacteriol., 172, 5312-5325 (1990)). Этот протеин находится не только у E. coli, но и также у множества грамотрицательных бактерий (Wiener, Structure Fold. Des., 8, 171-175 (2000)).

Кристаллическая структура протеина TolC показывает, что он как гомотример образует туннельный канал длиной примерно 120 ангстрем, причем бульшая часть гомодимера, туннельного домена, локализована в периплазме и только две маленькие петли (аминокислоты 52-61 и 257-279) расположены на поверхности бактерии (Koronakis и др., Nature, 405, 914-919 (2000)). tolC-Ген обладает нуклеотидной последовательностью, опубликовнной Niki и др., "Nucleotide sequence of the tolC gene of Escherichia coli", Nucleic Acids Res., 18 (18), 5547 (1990). TolC является частью по меньшей мере четырех различных бактериальных систем экскреции, где он представляет мембранный туннель, через который возможна экскреция бактериального протеина. Например, в транспортной системе HlyA соединение между HlyD и периплазматическим концом TolC позволяет осуществляться экскреции гемолизина из HlyD в мембранный туннель TolC (Gentchev и др., Trends in Microbiology, 10, 39-45 (2002)).

Технической задачей изобретения является поиск транспортной системы, с помощью которой продукт экспрессии с более высокой эффективностью может презентироваться в наружной клеточной мембране бактерии.

Поставленная техническая задача согласно изобретению решается посредством нуклеотидной последовательности, кодирующей TolC, а также определенной аминокислотной последовательности, при этом определенная аминокислотная последовательность встроена в пермиссивную, находящуюся с наружной стороны мембраны область TolC.

Согласно изобретению предлагается новая транспортная система в грамотрицательных бактериях, с помощью которой могут транспортироваться гораздо большие количества протеина, экспрессированного геном внутри бактерии, к наружной клеточной мембране бактерии, чем это было возможно с помощью до сих пор известных транспортных систем. Неожиданно, транспортная система TolC-протеина бактерии Escherichia coli обеспечивает гораздо более интенсивную постоянную мембранную экспрессию (любого) пептида или протеина, чем было известно для прежних транспортных протеинов, а именно в случае множества грамотрицательных бактерий. Постоянная мембранная экспрессия определенной аминокислотной последовательности или вырабатываемого геном продукта при этом достигается только благодаря TolC.

Определенная аминокислотная последовательность может представлять собой любой имеющийся пептид или протеин, любое фармацевтическое активное вещество, любой антиген, любое антитело или любой лиганд.

TolC может представлять собой TolC-протеин (дикого типа) согласно ACCESSION X54049, на что конкретно здесь указывается, или его (предпочтительно N-концевая) частичная последовательность или мутант протеина или частичной последовательности, причем для частичной последовательности или мутанта установлена транспортная функциональность. Под N-концевой частичной последовательностью при этом подразумевают фрагмент, начинающийся в N-концевой области аминокислот 1-50 TolC-протеина и оканчивающийся у С-конца петли, которая расположена на поверхности бактерии. Таким образом, предпочтительны N-концевой транспортный сигнал TolC, а также средняя часть протеина, которая представляет собой внеклеточные области TolC. Мутант может включать инсерцию, делецию или замену до тех пор, пока отчетливо не ухудшается его транспортная функциональность.

Для определенных случаев применения может оказаться целесообразным, если определенная аминокислотная последовательность с одной стороны или с обеих сторон встроена через спейсерную последовательность. Однако это имеет смысл, если определенная аминокислотная последовательность должна презентироваться в определенной пространственной структуре, например в случае антигена, однако даже благодаря определенной аминокислотной последовательности это в желательной мере не происходит по стерическим или конфигурационным причинам. В таком случае спейсерная последовательность может быть образована в особенности за счет последовательности, естественным образом следующей за определенной аминокислотной последовательностью, благодаря чему определенная аминокислотная последовательность образует складчатую структуру, как в природном антигене. Спейсерная последовательность, однако, также может быть синтетической, если благодаря этому достигается желательная презентация и/или образование складчатой структуры определенной аминокислотной последовательности. Это без труда можно рассчитывать теоретически при учете пространственных условий в области вставки в TolC.

В частности, предпочтительно, если определенная аминокислотная последовательность встроена в N-концевую область TolC, в особенности в область аминокислот 52-61 и/или 257-259 (соответственно, по отношению к TolC-протеину).

Объектом изобретения, далее, является плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность согласно изобретению, а также протеин или пептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью согласно изобретению.

Изобретение относится, далее, к бактерии, содержащей нуклеотидную последовательность согласно изобретению, причем TolC вызывает транспортировку определенной аминокислотной последовательности к мембране бактерии. Говоря другими словами, благодаря TolC-протеину в бактерии возникает постоянная мембранная экспрессия вырабатываемого геном продукта. Объектом изобретения, таким образом, является также грамотрицательная бактерия, содержащая по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну определенную аминокислотную последовательность и по меньшей мере один, вырабатываемый геном TolC E. coli продукт. Этот вырабатываемый геном TolC E. coli продукт предпочтительно является продуктом дикого типа. Объектом изобретения, однако, являются также мутированные, вырабатываемые геном TolC E. coli продукты, в случае которых сохранена транспортная сигнальная активность. Бактерию предпочтительно выбирают из группы, состоящей из "Salmonella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. и Yersinia spp.".

Предлагаемые согласно изобретению нуклеотидные последовательности и соответственно бактерии используют для самых различных применений. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей предлагаемую согласно изобретению бактерию, а также, в случае необходимости, по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель, причем определенную аминокислотную последовательность выбирают в зависимости от связываемого в организме вещества. С помощью такой фармацевтической композиции можно связывать и, таким образом, ингибировать мешающие нормальному клеточному метаболизму вещества, например экзогенные ядовитые вещества или обусловленные мутацией эндогенные вещества, как онкогены. Также путем связывания определенных клеточных веществ-мишеней можно модулировать процесс метаболизма благодаря удалению нормальных или регулируемых в сторону увеличения за счет заболевания комплексных компонентов. Благодаря этому, например, ингибируют определенную ассоциацию и регулируют в сторону уменьшения связанное с этим изменение челночного типа. Такой процесс можно снова использовать для регуляции в сторону увеличения других связанных процессов. В этом отношении определенную аминокислотную последовательность нужно выбирать только в зависимости от молекулы-мишени, ингибируемой с высокой специфичностью. Такая фармацевтическая композиция служит в конечном счете для терапевтических целей.

Пригодная в целях прививки фармацевтическая композиция содержит предлагаемую согласно изобретению бактерию, а также, необязательно, по меньшей мере один физиологически приемлемый носитель, причем определенной аминокислотной последовательностью является иммунизирующая последовательность. Иммунизирующая последовательность стимулирует в организме образование антител против природного антигена, который в виде частичной последовательности содержит иммунизирующую последовательность или состоит из нее.

Для диагностических целей, изобретение предлагает диагностический набор, содержащий бактерию по любому из пп. 7-9 формулы изобретения, при этом определенная аминокислотная последовательность специфически связывает определяемое вещество-маркер. Если, например, из организма отбирают пробу ткани или жидкости и эту пробу, в случае необходимости, после предварительной обработки с целью отделения нежелательных составных частей пробы, инкубируют с бактерией, то обнаруживают факт связывания с определенной аминокислотной последовательностью и в случае связывания устанавливают, что в пробе содержится вещество, специфически связывающееся с определенной аминокислотной последовательностью. Обнаружение наличия связывания при этом можно проводить самым простым способом, который может осуществлять средний специалист.

Наконец, изобретение относится к препаративному связывающему средству, содержащему предлагаемую согласно изобретению бактерию, при этом определенная аминокислотная последовательность специфически связывает выделяемое из раствора вещество-мишень. С помощью такого связующего из образца можно специфически удалять, с одной стороны, нежелательные вещества благодаря тому, что раствор инкубируют с бактерией и бактерию после отделения удаляют. С другой стороны, можно осуществлять соответствующим образом отделение или накопление вещества-мишени, за счет того, что после инкубации вещество-мишень элюируют из бактерии. Также, в соответствии с этим, изобретение можно применять для отделения и/или накопления антигенов, антител, пептидов, протеинов или лигандов.

Примеры осуществления

Пример 1

Получение TolC- вектора

TolC-ген из Е. coli, включая его промоторы дикого типа, амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) (1 мин. 94^оС; 1 мин. 66 ^оС; 1 мин. 30 секунд 72^оС) с помощью олигонуклеотидов 5'-TolC (5'-TAACGCCCTATGTCGAC TAACGCCAACCTT-3') и 3'-TolC (5'-AGAGGAT GTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA-3') из плазмиды рАХ629 (C. Wandersman, Institute Pasteur, Париж). При этом по обоим концам вводили дополнительный сайт расщепления Sa1I. Очищенный продукт ПЦР (набор "QIAquick PCR Purification"; Quiagen, Hilden, Германия) расщепляли с помощью рестрикционной эндонуклеазы Sa1I и клонировали в предварительно подвергнутом расщеплению векторе pBR322. Таким образом сконструированный вектор обозначали как pBR322tolC. Функциональность клонированного tolC-гена исследовали затем в нескольких тестах.

Пример 2

Встраивание антигенной последовательности в последовательность TolC-протеина

В tolC-последовательности, которая кодирует одну из внеклеточных петель, идентифицировали сайт расщепления KpnI. Его затем использовали для клонирования антигенной пептидной последовательности протеина р60 (iap-ген) бактерии Listeria monocytogenes и осуществляли вставку чужеродных антигенов после аминокислоты 271 зрелого TolC-протеина.

iap-Последовательность, которая кодирует В-клеточный эпитоп (аминокислоты 291-301) и подвергнутый рестрикции CD4 Т-клеточный эпитоп (аминокислоты 301-312) протеина р60, клонировали в виде фрагмента KpnI в предварительно подвергнутом расщеплению KpnI векторе pBR322tolC (фиг. 1). Таким образом образовавшуюся плазмиду обозначали как pBR322tolC::LisTB.

На чертеже представлена стратегия клонирования в векторе pBR322 для вставки специфичных к протеину р60 эпитопных последовательностей в tolC-ген E. coli дикого типа, кодируемый плазмидой. Введены следующие обозначения: bla - ген резистентности к ампициллину; Тс - тетрациклин; Т - Т-клеточный эпитоп протеина р60 из L. monocytogenes (аминокислоты 301-312); В - В-клеточный эпитоп протеина р60 из L. monocytogenes (аминокислоты 291-301); PtolC - tolC-промотор из E. coli дикого типа.

Пример 3

Экспрессия антигена в мембране грамотрицательной бактерии (Escherichia coli)

Экспрессию эпитопов протеина р60 из L. monocytogenes в TolC-протеине выявляли методом вестерн-блотинга. Для этого выделяли протеины клеточного лизата из E. coli CC118tolC, E. coli CC118tolC/pBR322tolC и E. coli CC118tolC/pBR322tolC::LisTB в поздней логарифмической фазе. Выделенные полные клеточные протеины соответствовали примерно 100 млн бактерий.

Протеины разделяли в полиакриламидном геле в присутствии 15% додецилсульфата натрия и экспрессию химерных TolC-протеинов, соответственно, встроенных эпитопов детектировали, во-первых, с помощью поликлональной сыворотки против TolC-протеина и, во-вторых, с помощью моноклонального антитела К317 (Rowan и др., J. Clin. Microbiol., 38 , 2643-2648 (2000)), которое специфически направлено против В-клеточного эпитопа из L. monocytogenes (фиг. 2В).

Согласно ожиданию, в клеточном лизате из E. coli CC118tolC не смогли обнаружить никакого TolC-протеина, что может быть объяснено мутацией в хромосомном tolC-гене этого штамма (Schlor и др., Mol. Gen. Genet., 256, 306-319 (1997)). Комплементация с помощью pBR322tolC в этом штамме приводила к экспрессии TolC-протеина с молекулярной массой 52 кДа. Вставка эпитопа из L. monocytogenes в TolC-протеин не оказывала влияния на экспрессию TolC и приводила к небольшому сдвигу молекулярной массы химерного протеина, составляющему примерно 3 кДа.

Экспрессию специфичных к протеину р60 эпитопов в E. coli CC118tolC/pBR322tolC::LisTB смогли подтвердить с помощью моноклонального антитела против протеина р60 К317.

Пример 4

Обнаружение экспонированной локализации эпитопов протеина р60 L. monocytogenes в Salmonella enteritidis SM6T (tolC)

Так как инсерционный сайт обоих листерийных эпитопов из протеина р60 во внеклеточной петле TolC находится после аминокислоты 271 зрелого протеина, они должны быть экспонированы на поверхности S. enteritidis SM6T (Stone и др., Mol. Microbiol., 17, 701-712 (1995)). Дефинитивную внеклеточную локализацию специфичных к р60 эпитопов в S. enteritidis SM6T исследовали путем непрямой иммунной флуоресценции.

По 25 мкл ночной культуры S. enteritidis SM6T/pBR322tolC и S. enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB наносили путем накапывания на предметное стекло и высушивали на воздухе. Клетки окрашивали с помощью моноклонального антитела против протеина р60 К317 (1:200) и связанные антитела затем исследовали с помощью маркированной флуоресцеинизотиоцианатом вторичной антимышиной сыворотки (Dianova; Германия; рабочий титр: 1:40).

Анализ флуоресценции с помощью микроскопа подтвердил внеклеточную локализацию специфичных к L. monocytogenes эпитопов в штамме S. enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB.

Пример 5

Опыты по иммунизации с помощью грамотрицательной бактерии и анализ протективных иммунных ответов после инфекции с помощью L. monocytogenes дикого типа

Для исследования того, приводит ли к защите экспонированная экспрессия Т-клеточного эпитопа из протеина р60 L. monocytogenes в мышиной модели листериоза, 8 самок Balb/c-мышей (Charles River, Sulzfeld, Германия) в возрасте шести недель перорально иммобилизировали с помощью дозы 1х10 ⁷ S. enteritidis/pBR322tolC::LisTB. Для контроля, 5 самок мышей перорально иммунизировали с помощью S. enteritidis SM6T. Спустя три недели животных второй раз иммунизировали с помощью такой же дозы бактерий.

Успех иммунизации определяли спустя пять недель после первой иммунизации по иммуноблоту, на который наносили протеины супернатанта из бактерии Listeria monocytogenes. При этом в сыворотке мышей, иммунизированных с помощью S. enteritidis/ pBR322tolC::LisTB, можно было обнаружить антитела, специфичные против протеина р60.

Спустя три недели после второй иммунизации животных инфицировали внутривенно с помощью дозы 5х10 ⁴ L. monocytogenes EGD, представляющей собой пятикратную ЛД50 (доза с 50%-ным летальным исходом). В то время как процент выживаемости в случае иммунизированных с помощью S. enteritidis/pBR322tolC::LisTB Balb/c-мышей после внутривенной инфекции с помощью L. monocytogenes EGD составлял 88%, в контрольной группе процент выживаемости составлял только 20%.

Таким образом, экспрессия специфичных к р60 эпитопов во внеклеточном петлевом фрагменте TolC в случае аттенуированного штамма-носителя S. enteritidis SM6T приводила к индукции специфичных к Listeria monocytogenes иммунных ответов, которые способны защищать Balb/c-мышей против, как правило, смертельной инфекции. Так как индукцию антител против В-клеточного эпитопа из протеина р60 можно было обнаружить согласно вестерн-блотингу, понятно, что иммунная реакция при участии антител вызывала наблюдаемую в данном случае защиту мышей от иначе летальной инфекции с помощью L. monocytogenes.