вакцинная композиция, содержащая трансферрин-связывающий белок и hsf из грамотрицательных бактерий

Формула изобретения

1. Иммуногенная композиция для применения против заболевания, вызванного инфицированием грамотрицательными бактериями, содержащая выделенный трансферрин-связывающий белок (Tbp) и выделенный Hsf-подобный белок или их антигенные фрагменты, способные вызывать защитный ответ против инфекции, вызванной грамотрицательными бактериальными штаммами, от которых они происходят.

2. Иммуногенная композиция по п.1, в которой трансферрин-связывающий белок или его фрагмент и Hsf-подобный белок или его фрагмент происходят от Neisseria.

3. Иммуногенная композиция по п.1, в которой трансферрин-связывающий белок или его фрагмент происходит от N. meningitidis.

4. Иммуногенная композиция по п.1, в которой Hsf-подобный белок или его фрагмент происходит от N. meningitidis.

5. Иммуногенная композиция по п.1, в которой трансферрин-связывающий белок или его фрагмент происходит от N. meningitidis серогруппы В.

6. Иммуногенная композиция по п.1, в которой Hsf-подобный белок или его фрагмент происходит от N. meningitidis серогруппы В.

7. Иммуногенная композиция по п.1, в которой трансферрин-связывающий белок или его фрагмент происходит от N. gonorrhoeae.

8. Иммуногенная композиция по п.1, в которой Hsf-подобный белок или его антигенный фрагмент происходит от N. gonorrhoeae.

9. Иммуногенная композиция по п.1, в которой трансферрин-связывающий белок представляет собой TbpA или его антигенный фрагмент.

10. Иммуногенная композиция по п.9, содержащая высокомолекулярную форму TbpA или низкомолекулярную форму TbpA или как высокомолекулярную форму TbpA, так и низкомолекулярную форму TbpA.

11. Иммуногенная композиция по п.1, в которой Hsf-подобный белок представляет собой Hsf или его антигенный фрагмент.

12. Иммуногенная композиция по п.1, содержащая слитый белок Tbp и Hsf-подобного белка или их антигенных фрагментов.

13. Иммуногенная композиция по п.12, содержащая слитый белок, содержащий TbpA и Hsf или их антигенные фрагменты, способные вызывать защитный ответ против нейссериальной инфекции.

14. Выделенная иммуногенная композиция, содержащая препарат везикул наружных мембран, происходящих от грамотрицательных бактерий, в которых экспрессия как трансферрин-связывающего белка, так и Hsf-подобного белка по меньшей мере в 1,5 раза выше природной экспрессии в немодифицированных грамотрицательных бактериях.

15. Иммуногенная композиция по п.14, в которой экспрессия трансферрин-связывающего белка позитивно регулируется ростом в условиях обеднения по железу.

16. Иммуногенная композиция по п.14, в которой по меньшей мере часть препарата везикул наружных мембран происходит от Neisseria.

17. Иммуногенная композиция по п.14, в которой по меньшей мере часть препарата везикул наружных мембран происходит от Neisseria meningitidis.

18. Иммуногенная композиция по п.14, в которой по меньшей мере часть препарата везикул наружных мембран происходит от Neisseria meningitidis серогруппы В.

19. Иммуногенная композиция по п.14, в которой по меньшей мере часть препарата везикул наружных мембран происходит от Neisseria gonorrhoeae.

20. Иммуногенная композиция по п.14, где клетка-хозяин, от которой происходит препарат везикул наружных мембран, сконструирована таким образом, чтобы экспрессия одного или более из LgtB и LgtE, предпочтительно первого, регулировалась негативно.

21. Иммуногенная композиция по п.14, где клетка-хозяин, от которой происходит препарат везикул наружных мембран, не способна синтезировать капсульные полисахариды и предпочтительно сконструирована таким образом, чтобы экспрессия одного или более из siaD, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (эквивалентен synX и siaD), synB (эквивалентен siaB и synC (эквивалентен siaC)), наиболее предпочтительно siaD, регулировалась негативно, и чтобы предпочтительно один или более из siaD, ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (эквивалентен synX и siaD), synB (эквивалентен siaB и synC (эквивалентен siaC)), наиболее предпочтительно siaD, был делетирован.

22. Иммуногенная композиция по п.14, где клетка-хозяин, от которой происходит препарат везикул наружных мембран, сконструирована таким образом, чтобы экспрессия одного или более из ОрС, ОрА и PorA, предпочтительно PorA, регулировалась негативно, и чтобы предпочтительно один или более из ОрС, ОрА и PorA, предпочтительно PorA, был делетирован.

23. Иммуногенная композиция по п.14, где клетка-хозяин, от которой происходит препарат везикул наружных мембран, сконструирована таким образом, чтобы экспрессия FrpB регулировалась негативно, и чтобы предпочтительно FrpB был делетирован.

24. Иммуногенная композиция по п.14, где клетка-хозяин, от которой происходит препарат везикул наружных мембран, сконструирована таким образом, чтобы экспрессия msbB и/или HtrB, предпочтительно msbB, регулировалась негативно, и чтобы предпочтительно msbB и/или HtrB, предпочтительно msbB, был делетирован.

25. Иммуногенная композиция по п.14, где препарат везикул наружных мембран содержит ЛПС (липополисахарид), который сконъюгирован с белком наружной мембраны (БНМ).

26. Иммуногенная композиция по п.25, где ЛПС сконъюгирован (предпочтительно внутрипузырьковым образом) с БНМ in situ в препарате везикул наружных мембран.

27. Иммуногенная композиция по п.14, содержащая препарат везикул наружных мембран, выделенный из двух или более штаммов грамотрицательных бактерий.

28. Иммуногенная композиция по п.27, содержащая препарат везикул наружных мембран, в котором трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок позитивно регулируются на разных везикулах, происходящих от разных бактериальных штаммов, или на одних и тех же везикулах, происходящих от одного и того же бактериального штамма.

29. Иммуногенная композиция по п.14, содержащая препарат везикул наружных мембран, в котором усиленная экспрессия трансферрин-связывающего белка происходит от полинуклеиновой кислоты, введенной в грамотрицательные бактерии.

30. Иммуногенная композиция по п.14, содержащая препарат везикул наружных мембран, в котором усиленная экспрессия Hsf-подобного белка происходит от полинуклеиновой кислоты, введенной в грамотрицательные бактерии.

31. Иммуногенная композиция по п.14, содержащая препарат везикул наружных мембран, в котором усиленная экспрессия трансферрин-связывающего белка и Hsf-подобного белка происходит от полинуклеиновой кислоты, кодирующей оба белка, которая была введена в грамотрицательные бактерии.

32. Иммуногенная композиция по п.14, в которой бактериальный штамм был генетически сконструирован путем введения последовательности более сильного промотора в обратном направлении от гена, кодирующего трансферрин-связывающий белок.

33. Иммуногенная композиция по п.14, в которой бактериальный штамм был генетически сконструирован путем введения последовательности более сильного промотора в обратном направлении от гена, кодирующего Hsf-подобный белок.

34. Иммуногенная композиция по п.14, в которой бактериальный штамм был генетически сконструирован путем введения последовательности более сильного промотора в обратном направлении от генов, кодирующих трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок.

35. Иммуногенная композиция по п.14, в которой трасферрин-связывающий белок представляет собой TbpA, который предпочтительно является высокомолекулярным TbpA, низкомолекулярным TbpA или как высокомолекулярным TbpA, так и низкомолекулярным TbpA, наиболее предпочтительно из N. meningitidis.

36. Иммуногенная композиция по п.14, в которой Hsf-подобный белок представляет собой Hsf из Neisseria meningitidis.

37. Иммуногенная композиция по п.1 или 14, содержащая адъювант.

38. Иммуногенная композиция по п.37, содержащая соли алюминия.

39. Иммуногенная композиция по п.37, содержащая 3D-MPL (3-дез-0-ацилированный монофосфориллипид А).

40. Иммуногенная композиция по п.37, содержащая адъювант, содержащий CpG.

41. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-40 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

42. Способ предупреждения заболевания, вызываемого грамотрицательными бактериями, включающий введение защитной дозы или эффективного количества вакцины по п.41.

43. Способ по п.42, при котором предупреждают нейссериальную инфекцию.

44. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-40 в изготовлении вакцины для предупреждения инфекции, вызываемой грамотрицательными бактериями.

45. Применение по п.44 в изготовлении вакцины для предупреждения нейссериальной инфекции.

46. Генетически сконструированный штамм грамотрицательных бактерий, от которого могут происходить везикулы наружных мембран иммуногенной композиции по любому из пп.14-36.

47. Способ изготовления иммуногенной композиции по любому из пп.1-11, включающий стадию смешивания вместе выделенного трансферрин-связывающего белка и выделенного Hsf-подобного белка или их антигенных фрагментов.

48. Способ изготовления иммуногенной композиции по любому из пп.14-36, включающий стадию выделения везикул наружных мембран из культуры грамотрицательных бактерий.

49. Способ по п.48, где стадия выделения везикул наружных мембран включает экстракцию 0-0,5%, 0,02-0,4%, 0,04-0,3%, 0,06-0,2%, 0,08-0,15% или предпочтительно 0,1%-ным детергентом, предпочтительно ДОХ (дезоксихолат).

50. Способ изготовления вакцины по п.41, включающий стадию объединения иммуногенной композиции по любому из пп.1-40 с фармацевтически приемлемый эксципиентом.

51. Способ получения иммуноглобулина для применения в предупреждении или лечении нейссериальной инфекции, включающий стадии иммунизации реципиента вакциной по п.41 и выделения иммуноглобулина от реципиента.

52. Препарат иммуноглобулина, получаемый способом по п.51.

53. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат иммуноглобулина по п.52 и фармацевтически приемлемый эксципиент.

54. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональные антитела против TbpA и Hsf из Neisseria meningitidis и фармацевтически приемлемый эксципиент.

55. Способ лечения или предупреждения инфицирования грамотрицательными бактериями, включающий стадию введения пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.53 и 54.

56. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.53 и 54 в изготовлении лекарства для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого грамотрицательными бактериями.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и вакцинам на основе грамотрицательных бактерий, их изготовлению и применению таких композиций в медицине. Более конкретно, изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим как трансферрин-связывающий белок, так и Hsf. Присутствие обоих этих антигенов ведет к более высоким уровням продуцирования бактериальных антител.

Предшествующий уровень техники

Грамотрицательные бактерии являются возбудителями, вызывающими ряд патологий человека, и существует необходимость разработки эффективных вакцин против многих таких бактерий. В частности, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa и Yersinia enterocolitica представляют собой грамотрицательные бактерии, являющиеся причиной патологий, которые можно лечить вакцинированием.

Neisseria gonorrhoeae является этиологическим агентом гонореи, одного из наиболее часто регистрируемых в мире передающихся половым путем заболеваний с ориентировочной заболеваемостью 62 миллиона случаев в год (Gerbase et al., 1998, Lancet 351; (Suppl.3) 2-4). Клинические проявления гонореи включают воспаление слизистых оболочек урогенитального тракта, просвета прямой кишки и неонатальные глазные инфекции. Восходящие гонококковые инфекции у женщин могут привести к бесплодию, внематочной беременности, хроническому воспалительному заболеванию таза и образованию тубоовариального абцесса. Сепсис, артрит, эндокардит и менингит связаны с осложненной гонореей.

Большое количество штаммов гонококков с устойчивостью к антибиотикам способствует повышенной заболеваемости и осложнениям, связанным с гонореей. Заманчивой альтернативой лечению гонореи антибиотиками явилось бы ее предупреждение путем вакцинации. В настоящее время для инфекций, вызываемых N.gonorrhoeae, вакцины не существует.

Neisseria meningitidis является важным патогеном, особенно у детей и совершеннолетней молодежи. Сепсис и менингит представляют собой наиболее опасные для жизни формы инвазивного менингококкового заболевания (ИМЗ). Это заболевание из-за его высокой распространенности и смертности стало глобальной проблемой здравоохранения.

На основании антигенных различий в капсульных полисахаридах были идентифицированы тринадцать серогрупп N.meningitidis, наиболее распространенными из которых являются А, В и С, ответственные за 90% случаев заболеваний во всем мире. Серогруппа В является наиболее распространенной причиной менингококкового заболевания в Европе, США и в некоторых странах Латинской Америки.

Были разработаны вакцины на основе капсульных полисахаридов серогрупп А, С, W и Y, и было показано, что они сдерживают вспышки менингококкового заболевания (Peltola et al., 1985, Pediatrics 76; 91-96). Однако серогруппа В является слабо иммуногенной и индуцирует только временный антителогенез преимущественно IgM (иммуноглобулин М) изотипа (Ala'Aldeen D and Cartwright К 1996, J.Infect. 33; 153-157). Следовательно, в настоящее время нет достаточно эффективной вакцины против менингококков серогруппы В, которые ответственны за большую часть заболеваний в странах умеренного климата. Это представляет особую проблему в связи с тем, что распространенность заболевания серотипа В возрастает в Европе, Австралии и Америке, главным образом у детей младше 5 лет. Разработка вакцины против менингококков серогруппы В вызывает особые трудности, так как полисахаридная капсула является слабо иммуногенной благодаря своей иммунологической близости к молекуле адгезии нервных клеток человека. Соответственно стратегии получения вакцин были сосредоточены на экспонированных на поверхности структурах наружной мембраны менингококков, но затруднением являлось заметное варьирование этих антигенов среди штаммов.

Дальнейшие разработки привели к введению вакцин, изготовленных из везикул наружных мембран, которые содержат ряд белков, которые составляют нормальное содержимое бактериальной мембраны. Одной их них является VA-MENGOC-BC®, кубинская вакцина против N.meningitidis серогрупп В и С (Rodriguez et al 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440). Эта вакцина была разработана для борьбы с эпидемией инвазивного менингококкового заболевания на Кубе, которая не была элиминирована при помощи программы вакцинации с использованием капсульно-полисахаридной АС вакцины. Преобладающими серогруппами были В и С, и при помощи VA-MENGOC-BC® вакцины вспышку успешно контролировали с оцениваемой эффективностью вакцины 83% в отношении штаммов N.meningitidis серогруппы В (Sierra et al., 1990 In Neiserria, Walter Gruyter, Berlin, m. Atchman et al (eds) p.129-134, Sierra et al. 1991, NIPH Ann. 14; 195-210). Эта вакцина была эффективна в отношении конкретной эпидемии, однако вызванный иммунный ответ не предохранял бы от других штаммов N.meningitidis.

Следующие исследования эффективности, проведенные в Латинской Америке во время эпидемий, вызванных гомологичными и гетерологичными серогруппе В менингококковыми штаммами, продемонстрировали некоторую эффективность у детей старшего возраста и взрослых, но ее эффективность была значительно ниже у более младших детей, которые имеют наибольший риск инфицирования (Milagres et al., 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424). Неясно, насколько эффективной была бы вакцина в странах с многоштаммовым эндемическим заболеванием, таких как Великобритания. Исследования иммуногенности в отношении гетерологичных штаммов продемонстрировали лишь ограниченную перекрестно-реактивную сывороточную бактерицидную активность, особенно у детей (Tappero et al. 1999, JAMA 281; 1520-1527).

Вторая вакцина на основе везикул наружных мембран была разработана в Норвегии с использованием изолята серотипа В, типичного серотипа, преобладающего в Скандинавии (Fredriksen et al., 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Эту вакцину тестировали в клинических исследованиях, и было обнаружено, что она обладает защитной эффективностью 57% через 29 месяцев (Bjune et al., 1991, Lancet, 338; 1093-1096).

Однако использование везикул наружных мембран (ВНМ) в вакцинах связано с некоторыми проблемами. Например, ВНМ содержат токсичные липополисахариды, и они могут содержать иммунодоминантные антигены, которые либо являются специфичными для штамма, либо экспрессируются вариантно. Описан ряд способов, которые можно использовать, чтобы преодолеть некоторые из проблем вакцин на основе препаратов везикул наружных мембран. В WO 01/09350 описаны способы, которые направлены на решение некоторых из этих проблем, например, посредством уменьшения токсичности и модификации антигенов, присутствующих на везикулах наружных мембран.

Существуют различные проблемы, связанные с анти-менингококковыми вакцинами, имеющимися в распоряжении в настоящий момент. Вакцины из наружных мембран на основе белков обычно являются специфичными и эффективными в отношении лишь нескольких штаммов. Полисахаридные вакцины также частично оптимальны, поскольку они обычно вызывают слабые и короткие иммунные ответы, в частности в отношении серогруппы В (Lepow et al., 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96).

Инфекции, вызываемые Neisseria, представляют значительную проблему для здравоохранения, для решения которой или нет вакцины, как в случае с N.gonorrhoeae, или, как в случае с N.meningitides, имеются вакцины с ограничениями по эффективности и защитной способности в отношении гетерологичных штаммов. Очевидно, что существует необходимость разработки вакцин лучшего качества против инфекций, вызываемых Neisseria, которые улучшат эффективность имеющихся в настоящее время вакцин и сделают возможной защиту против более широкого ряда штаммов.

Описание графических материалов

Чертеж - окрашенный кумасси гель, демонстрирующий уровни экспрессии Hsf, TbpA и NspA в препаратах везикул наружных мембран, происходящих от различных штаммов N.meningitidis. Полоса 1 - маркеры молекулярной массы; полоса 2 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды регулировались негативно; полоса 3 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно; полоса 4 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а NspA регулировался позитивно; полоса 5 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а Hsf регулировался позитивно; полоса 6 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA регулировался позитивно; полоса 7 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA и Hsf регулировались позитивно; полоса 8 - везикулы наружных мембран, полученные из штамма Н44/76, в котором капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно, а TbpA и NspA регулировались позитивно.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении раскрыта комбинация антигенов, которые при их объединении в иммуногенной композиции или вакцине могут индуцировать титры бактерицидных антител, более высокие, чем титры, индуцируемые этими антигенами при введении по отдельности. Предпочтительно комбинация антигенов вызывает синергически более высокие титры бактерицидных антител. Так как бактерицидные антитела непосредственно отражают эффективность вакцин-кандидатов, результатом комбинации Tbp и Hsf в вакцинах будут высокоэффективные вакцины. Дополнительным преимуществом изобретения является то, что комбинация двух антигенов, Tbp и Hsf, также сделает возможной защиту против широкого ряда штаммов.

Данное изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок или их антигенные фрагменты. Эти белки либо выделяют, либо предпочтительно очищают по меньшей мере до 30%, 40%, более предпочтительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%-ной чистоты, или обогащают в смеси с другими антигенами. Трансферрин-связывающий белок и Hsf-подобный белок могут быть выделены или могут происходить от одного и того же или от разных штаммов грамотрицательных бактерий.

Выделенный означает выделенный из обычного окружения белка руками человека. Очищенный означает очищенный по меньшей мере до 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%-ной чистоты до того, как этот антиген комбинируют с другими компонентами иммуногенной композиции по изобретению.

Происходящий от означает, что ген, кодирующий белок, происходит от конкретного бактериального штамма, или что белок очищен из конкретного бактериального штамма. Следовательно, происходящий от включает рекомбинантные белки, продуцируемые в отдельной системе экспрессии, если ген, кодирующий этот белок, происходит от названной бактерии.

Показано, что в комбинации Tbp и Hsf взаимодействуют успешно и предпочтительно синергически, вызывая иммунный ответ, который выше в единицах бактерицидной активности (например, при измерении посредством анализа бактерицидности сыворотки, или АБС) и предпочтительно выше, чем аддитивный ответ, вызываемый этими антигенами по отдельности, более предпочтительно по меньшей мере в 1,1, 1,2, 1,5, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в десять раз. Значительным преимуществом добавления к вакцине как Tbp, так и Hsf по сравнению с существующими вакцинами будет получение сильного бактерицидного иммунного ответа и возможность защиты против многих штаммов.

Одним воплощением данного изобретения является иммуногенная композиция, содержащая как трансферрин-связывающий белок, так и Hsf-подобный белок. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, содержащую по меньшей мере один антиген, который может вызывать иммунный ответ при введении хозяину. Tbp и Hsf-подобный белок могут происходить от любого штамма грамотрицательных бактерий, включая Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Bordetella, Neisseria (включая Neiserria meningitidis, которая может являться серогруппой А, В, С, W135 или Y, и Neisseria gonorrhoeae) или от любой из грамотрицательных бактерий, описанных выше. Данное изобретение охватывает иммуногенные композиции, в которых Tbp и Hsf-подобный белок происходят либо от одного, либо от разных штаммов грамотрицательных бактерий.

Трансферрин-связывающие белки

Трансферрин-связывающий белок (transferrin binding protein, Tbp) представляет собой белок или белковый комплекс на наружной мембране грамотрицательных бактерий, который связывает трансферрин. Некоторые белки в этом семействе образуют бета-цилиндр, заякоренный в наружной мембране. В структуре трансферрин-связывающего белка может содержаться внутриклеточный N-концевой домен с TonB боксом и "plug"-домен, множественные трансмембранные бета-цепи, связанные короткими внутриклеточными и более длинными внеклеточными петлями. Другими примерами являются липопротеины, которые взаимодействуют с образованием комплекса с интегральным мембранным белком. Примерами данного семейства белков являются TbpA и TbpB. Обозначение Tbp охватывает любой из этих белков отдельно или в комбинации, а также комплекс, образованный из TbpA и TbpB. Предпочтительно в иммуногенной композиции по изобретению присутствует по меньшей мере TbpA.

Различают два семейства TbpB, имеющих высокую молекулярную массу и низкую молекулярную массу соответственно. Высоко- и низкомолекулярные формы TbpB (WO 93/06861; ЕР 586266) объединяются с разными семействами TbpA (WO 93/06861; ЕР 586266; WO 92/03467; US 5912336), которые различаются на основании гомологии. Несмотря на одинаковую молекулярную массу, TbpA известны как высокомолекулярные и низкомолекулярные семейства из-за их объединения с высоко- или низкомолекулярной формой TbpB (Rokbi et al., FEMS Microbiol. Lett. 100; 51, 1993). Известно, что TbpA и TbpB экспрессируются в ряде бактерий, включая N.meningitidis (WO 93/06861; ЕР 586266; WO 92/03467; US 5912336), N.gonorrhoeae (WO 92/03467; US 5912336), Н.influenzae (Gray-Owen et al., Infect. Immun. 1995; 63: 1201-1210, Schryvers J.Med. Microbiol. 1989; 29: 121-130; WO 95/13370; WO 96/40929), A.pleuropneumoniae, M.cararrhalis (Mathers et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997; 19: 231; Chen et al., Vaccine 1999; 18: 109; WO 97/13785; WO 99/52947) и Р.haemolytica (Cornelissen et al., Infection and Immunity 68; 4725, 2000). TbpA и TbpB также упоминаются как Tbp1 (NMB 0461) и Tbp2 (NMB 0460) соответственно (Cornelissen et al., Infection and Immunity 65; 822, 1997).

При его использовании здесь Tbp означает трансферрин-связывающий белок из грамотрицательных бактерий, включая Moraxella catarrhalis и Haemophilus influenzae, предпочтительно Neisseria, более предпочтительно N.meningitidis или N.gonorrheoea и наиболее предпочтительно N.meningitidis серотип В. Tbp охватывает как TbpA, так и TbpB, а также высокомолекулярные и низкомолекулярные формы TbpA и TbpB. Tbp охватывает отдельные белки, описанные выше, и комплексы этих белков и любых других белков или их комплексов, способные связывать трансферрин.

Хотя Tbp может относиться как к высоко-, так и к низкомолекулярной форме TbpA или TbpB, предпочтительно чтобы в иммуногенной композиции по изобретению присутствовали как высокомолекулярная, так и низкомолекулярная форма TbpA и/или TbpB. Наиболее предпочтительно присутствует высокомолекулярный и низкомолекулярный TbpA.

Предполагается, что вместо Tbp белков или в дополнение к ним в иммуногенные композиции по изобретению могут быть включены другие белки, участвующие в усвоении железа. Белки, участвующие в усвоении железа, из Moraxella catarrhalis включают TbpA, TbpB, Ton-В-зависимый рецептор, СорВ (Sethi et al., Infect. Immun. 1997; 67: 3666-3671), HasR, OmpB1 и LbpB (Du et al., Infect. Immun. 1998; 66: 3656-3665; Mathers et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997; 19: 231-236; Chen et al., Vaccine 1999; 18: 109-118). Белки, участвующие в усвоении железа, из Haemophilus influenzae включают TbpB, HasR, TonB-зависимый рецептор, гемоглобин-связывающий белок, HhuA, HgpA, HgbA, HgbB и HgbC (Соре et al. Infect. Immun. 2000; 68: 4092-4101; Maciver et al., Infect Immun. 1996; 64: 3703-3712; Jin et al., Infect. Immun. 1996; 64:3134-3141; Morton et al., J.Gen. Microbiol. 1990; 136: 927-933; Schryvers J.Med. Microbiol. 1989; 29: 121-130). Захватывающие железо белки из Neisseria meningitidis включают Tbp1 (NMB 0461), Tbp2 (NMB 0460), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), LbpA (NMB 1540), LbpB (NMB 1541), Lipo 28, также известный как GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), Ton В-зависимые рецепторы (NMB 0964 и NMB 0293) и HmbR (Tettelin et al., Science 287; 1809-1815, 2000).

Tbp белки, включаемые в иммуногенные композиции по изобретению, представляют собой белки, имеющие гомологию с TbpA и TbpB из N.meningitidis, как описано в WO 93/06861 и ЕР 586266; предпочтительно имеющие более чем 40%, 45%, 50%, 60%, 70%-ную, более предпочтительно более чем 80 или 90%-ную, наиболее предпочтительно более чем 95%, 96%, 97%, 98%, 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью TbpA и TbpB, как описано в WO 93/06861 и ЕР 586266.

Tbp содержит несколько различающихся областей. Например, в случае TbpA из штамма Н44/76 N.meningitidis, 186 аминоконцевых аминокислот образуют внутренний глобулярный домен, 22 бета-цепи охватывают мембрану, образуя бета-цилиндрическую структуру. Они связаны короткими внутриклеточными петлями и более крупными внеклеточными петлями. Внеклеточные петли 2, 3 и 5 имеют наибольшую степень изменчивости последовательности, а петля 5 является поверхностно экспонированной. Петли 5 и 4 вовлечены в лигандное связывание и предпочтительно представляют собой TbpA фрагменты для включения в иммуногенные композиции по настоящему изобретению.

Кроме методик генетического позитивного регулирования, описанных в заявке, трансферрин-связывающие белки также могут позитивно регулироваться в грамотрицательных бактериях при их росте в условиях ограничения по железу, как описано ниже. В иммуногенных композициях по изобретению, в которых трансферрин-связывающий белок позитивно регулируется в везикуле наружных мембран, позитивное регулирование предпочтительно достигается посредством культивирования штамма-хозяина в условиях ограничения по железу. Этот способ также приводит к позитивному регулированию вариабельных железо-регулируемых белков, в частности FrpB в штаммах Neisseria, и гем/гемопексин утилизирующего белка С, HgpA и HgpB в Haemophilus influenzae, которые могут стать иммунодоминантными. Следовательно, полезно негативно регулировать экспрессию (и предпочтительно делетировать кодирующие гены) таких белков, как описано ниже, чтобы гарантировать, что иммуногенная композиция по изобретению будет вызывать иммунный ответ против антигенов, присутствующих в широком разнообразии штаммов.

Hsf-подобные белки

Hsf-подобные белки являются белками-автотранспортерами, имеющими гомологию с Hsf N.meningitidis с последовательностями, описанными в WO 99/31132; предпочтительно они имеют более чем 40%, 50%, 60%, 70%-ную, более предпочтительно более чем 80%-ную, наиболее предпочтительно более чем 90%-ную, наиболее предпочтительно более чем 95%, 96%, 97%, 98%, 99%-ную идентичность с Hsf аминокислотной последовательностью, раскрытой в WO 99/31132 (предпочтительно SEQ ID NO 2, 4, 6 или 8). Hsf-подобные белки представляют собой поверхностно-экспонированные белки, и предполагается, что они функционируют как адгезины. Эти белки образуют многомерный комплекс и экспрессируются во время инфицирования и колонизации.

Hsf-подобные белки обнаружены во многих грамотрицательных бактериях, включая Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheoea, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis и Escherichia coli. Примеры Hsf-подобных белков, обнаруженных в Neisseria meningitidis, включают Hsf (также известный как NhhA - NMB 0992) (WO 99/31132), Aida-1-подобный белок (Peak et al., 2000, FEMS Imm. Med. Vicrobiol. 28; 329), IgA протеазу, Ssh-2, Нар (WO 99/55873), NadA (J.Exp. Med. 2002 195; 1445), UspA2 и Tsh. Примеры Hsf-подобных белков в Moraxella catarrhalis включают Hsf, UspA1 (WO 93/03761), UspA2 (WO 93/03761), эстеразу наружных мембран и YtfN. Примеры Hsf-подобных белков в Haemophilus influenzae включают Hia/Hsf (St Geme et al., J.Bacteriol. 2000 182: 6005-6013), Нар, IgA1 протеазу, HMW1, HMW2 (Barenkamp et al., Infect. Immun. 1992 60; 1302-1313), YadA, YadAc и YtfN (Hendrixson et al., Mol. Cell 1998; 2: 941-850; St Geme et al., Mol. Micribiol. 1994; 14:217-233; Grass and St. Geme Infect. Immunol. 201; 69; 307-314; St. Geme and Gutter J.Bacteriology 2000; 182; 6005-6013). Примеры Hsf-подобных белков в Escherichia coli включают Hsf, Hia и Нар.

Hsf имеет структуру, общую для белков-автотранспортеров. Например, Hsf из штамма Н44/76 N.meningitidis состоит из головной области по аминному концу белка (аминокислоты 52-479), которая экспонируется на поверхности и содержит вариабельные области (аминокислоты 52-106, 121-124, 191-210 и 230-234), шейной области (аминокислоты 480-509), области гидрофобной альфа-спирали (аминокислоты 518-529) и якорного домена, в котором четыре трансмембранные цепи охватывают наружную мембрану (аминокислоты 539-591).

Hsf может относиться к полноразмерным полипептидам, включая сигнальную последовательность, которая состоит из аминокислот 1-51. Данное изобретение также включает Hsf с удаленной сигнальной последовательностью, так что полипептид состоит из зрелой формы Hsf. Другие предпочтительные формы Hsf могут быть усечены так, чтобы исключить вариабельные области белка, раскрытые в WO 01/55182.

Предпочтительные варианты включают удаление одной, двух, трех, четырех или пяти вариабельных областей, как определено в WO 01/55182. В предпочтительных вариантах удалены остатки из области аминокислотной последовательности от 52 по 237, или удалены аминокислоты от 54 до 237, более предпочтительно удалены остатки между аминокислотами от 52 по 133 или аминокислоты от 55 до 133. Очевидно, что в усеченные варианты может быть включена или из них исключена сигнальная последовательность из Hsf от аминокислоты 1 до 51. Указанная выше последовательность и те, что описаны ниже, могут быть усечены или удлинены на 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 или 15 аминокислот на любом из N- и С-концов или на обоих из них.

Когда Hsf используют как субъединичную вакцину, предпочтительно использовать часть растворимого домена-"пассажира"; например полный домен из аминокислот 52-479, наиболее предпочтительно консервативную его часть, например аминокислоты 134-479.

Хотя предпочтительно использовать полноразмерные Tbp и/или Hsf-подобные белки (в частности TbpA и Hsf) или их встречающиеся в природе варианты, или такие полноразмерные последовательности, в которых отсутствует не более чем 60 аминокислот из N- и/или С-конца, антигенные фрагменты Tbp и/или Hsf-подобных белков также включены в иммуногенную композицию по изобретению. Это фрагменты, содержащие по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 20 аминокислот, более предпочтительно 30 аминокислот, более предпочтительно 40 аминокислот или наиболее предпочтительно 50 аминокислот, взятых непосредственно друг за другом из аминокислотной последовательности Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и Hsf. Кроме того, антигенные фрагменты означают фрагменты, которые иммунологически реактивны с антителами, генерируемыми против N.meningitidis Tbp или Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA или Hsf, или с антителами, генерируемыми при инфицировании хозяина-млекопитающего N.meningitidis. Антигенные фрагменты также включают фрагменты, которые вызывают иммунный ответ, специфичный против Tbp или Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA или Hsf из грамотрицательных бактерий, от которых они происходят. Предпочтительно он защищает от инфицирования бактерией, от которой он происходит, предпочтительно от инфицирования Neisseria, более предпочтительно он защищает от инфицирования N.meningitidis, наиболее предпочтительно он защищает от инфицирования N.meningitidis серогруппы В.

Предпочтительные фрагменты TbpA включают внеклеточные петли TbpA. При использовании последовательности TbpA из штамма Н44/76 N.meningitidis эти петли соответствуют аминокислотам 200-202 для петли 1, аминокислотам 226-303 для петли 2, аминокислотам 348-395 для петли 3, аминокислотам 438-471 для петли 4, аминокислотам 512-576 для петли 5, аминокислотам 609-625 для петли 6, аминокислотам 661-671 для петли 7, аминокислотам 707-723 для петли 8, аминокислотам 769-790 для петли 9, аминокислотам 814-844 для петли 10 и аминокислотам 872-903 для петли 11. Соответствующие последовательности, после выравнивания последовательностей, в других Tbp белках также составляли предпочтительные фрагменты. Наиболее предпочтительные фрагменты включают аминокислотные последовательности, содержащие петлю 2, петлю 3, петлю 4 или петлю 5 Tbp.

Хотя предпочтительные фрагменты Tbp или TbpA белков, описанных выше, относятся к N.meningitidis, специалист в данной области на основании гомологии последовательностей легко сможет найти в Tbp или TbpA белках из всех указанных выше грамотрицательных штаммов эквивалентные пептиды, которые также являются фрагментами по изобретению.

Предпочтительные фрагменты Hsf включают целую головную область Hsf, предпочтительно содержащую аминокислоты 52-473 Hsf. Дополнительные предпочтительные фрагменты Hsf включают экспонированные на поверхности головные области, включая аминокислоты 52-62, 76-93, 116-134, 147-157, 157-175, 199-211, 230-252, 252-270, 284-306, 328-338, 362-391, 408-418, 430-440 и 469-479. Наиболее предпочтительными фрагментами являются 134-591 для использования в ВНМ препарате по изобретению, и 134-479 для использования в субъединичной композиции по изобретению.

Хотя предпочтительные фрагменты Hsf-подобных или Hsf белков, описанных выше, относятся к N.meningitidis, специалист в данной области на основании гомологии последовательностей легко может найти в Hsf-подобных или Hsf белках из всех указанных выше грамотрицательных штаммов эквивалентные пептиды, которые тоже являются фрагментами по изобретению.

Также в изобретение включены слитые белки из Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и Hsf. Они могут объединять Tbp и Hsf-подобный белок, предпочтительно TbpA и Hsf, или их фрагменты, объединенные в одном и том же полипептиде. Альтернативно изобретение также включает отдельные слитые белки из Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и/или Hsf, или их фрагменты, при условии, что как Tbp, так и Hsf-подобный белок, предпочтительно TbpA и Hsf, или их фрагменты присутствуют в композиции по изобретению. TbpA или Hsf могут, например, образовать слитый белок с -галактозидазой, глутатион-S-трансферазой, зелеными флуоресцентными белками (green fluorescent proteins, GFP), tags эпитопов, такими как FLAG, myc tag, полигистидин, или поверхностными белками вирусов/бактерий, такими как гемагглютинин вируса гриппа, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин или CRM197.

Выделенные трансферрин-связывающие белки, которые можно вводить в иммуногенные композиции, хорошо известны в данной области техники (WO 0025811). Их можно экспрессировать в бактерии-хозяине, экстрагировать с использованием детергента (например 2% Elugent) и очищать аффинной хроматографией или используя стандартную процедуру колоночной хроматографии, хорошо известную в данной области техники (Oakhill et al., Biochem J. 2002 364; 613-6). Аналогично, Hsf можно выделить, используя методики, хорошо известные в данной области техники. Рекомбинантный Hsf можно экспрессировать в Е.coli или в других бактериальных штаммах. Белок можно очищать, используя аффинную хроматографию. Это может быть стандартной процедурой, если tag введена в Hsf-последовательность.

Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании, как подразумевают авторы изобретения, могут быть заменены терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" соответственно в каждом случае.

Вакцинные комбинации

Данное изобретение относится к комбинациям антигенов, включающим Tbp и Hsf-подобный белок, которые эффективно обеспечивают высокую бактерицидную активность против грамотрицательных бактерий. Антигенные композиции по изобретению могут содержать антигены в дополнение к Tbp и Hsf. Они могут содержать другие белковые антигены из грамотрицательных бактерий, предпочтительно Neisseria и более предпочтительно из N.meningitidis.

N.meningitidis

Для N.meningitidis иммуногенные композиции по изобретению предпочтительно содержат Hsf и TbpA. При получении ВНМ предпочтительно, чтобы Hsf и TbpA позитивно регулировались в штамме N.meningitidis, от которого произошла ВНМ. TbpA может присутствовать как в высоко-, так и в низкомолекулярной форме, и предпочтительно присутствуют обе формы - высокомолекулярная и низкомолекулярная. Hsf предпочтительно присутствует в ВНМ в интегрированной в мембрану усеченной форме, предпочтительно из аминокислот 134-591. Hsf также может присутствовать в виде субъединичной вакцины, предпочтительно в виде домена-"пассажира" (аминокислоты 52-479), наиболее предпочтительно в виде усеченного домена-"пассажира" из аминокислот 134-479.

К указанным выше композициям могут быть добавлены дополнительные антигены (или позитивно регулироваться, если присутствуют в ВНМ), например NspA (WO 96/29412), Нар (РСТ/ЕР 99/02766), PorA, PorB, OMP85 (также известный как D15) (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (РСТ/ЕР 99/06718), FrpB (в WO 96/31618 смотри SEQ ID NO:38), FrpA (NMB 0585) или FrpC или консервативный участок, общий для обоих, из по меньшей мере 30, 50, 100, 150, 500, 750 аминокислот (WO 92/01460), LbpA и/или LbpB (PCT/EP 98/05117; Schryvers et al., Med. Microbiol. 1999, 32: 1117), FhaB (WO 98/02547, SEQ ID NO:38 [нуклеотиды 3083-9025]), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), MltA (WO 99/57280) (NMB0033) и ctrA (PCT/EP 00/00135).

Предпочтительные комбинации антигенов в иммуногенной композиции по изобретению включают комбинации, содержащие Tbp и Hsf-подобный белок и FhaB; Tbp и Hsf-подобный белок и PilQ; Tbp и Hsf-подобный белок и NspA; Tbp и Hsf-подобный белок и FrpC; более предпочтительно содержащие Tbp и Hsf-подобный белок и Нар; Tbp и Hsf-подобный белок и FrpA/C; Tbp и Hsf-подобный белок и LbpB; Tbp и Hsf-подобный белок и D15. Наиболее предпочтительно D15 будет включен как часть препарата везикул наружных мембран.

Антигены Moraxella catarrhalis

Один или более из следующих белков Moraxella catarrhalis являются предпочтительными для включения в иммуногенную композицию по изобретению (предпочтительно, когда TbpA и Hsf-подобный белки происходят от Moraxella catarrhalis): OMP106 (WO 97/41731 и WO 96/34960), HasR (РСТ/ЕР 99/03824), PilQ (PCT/EP 99/03823), OMP85 (РСТ/ЕР 00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), Р6 (РСТ/ЕР 99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (PCT/EP 99/03822), OmplA1 (PCT/EP 99/06781), Hly3 (PCT/EP 99/03257), LbpA и LbpB (WO 98/55606), TbpA и TbpB (WO 97/13785 и WO 97/32980), OmpE, UspA1 и UspA2 (WO 93/03761) и Omp21.

Антигены Haemophilus influenzae

Один или более из следующих белков Haemophilus influenzae предпочтительны для включения в иммуногенную композицию по изобретению (предпочтительно, когда TbpA и Hsf-подобные белки происходят от Haemophilus influenzae): D15 (WO 94/12641), Р6 (ЕР 281673), TbpA, TbpB, Р2, Р5 (WO 94/26304), ОМР26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Нар, Hin47 и Hif.

Еще одним аспектом изобретения являются вакцинные комбинации, содержащие антигенную композицию по изобретению совместно с другими антигенами, которые успешно применяются против некоторых болезненных состояний, включая состояния, ассоциированные с вирусами или грамположительными бактериями.

В одной предпочтительной комбинации антигенные композиции по изобретению, содержащие Tbp и Hsf-подобный белок, готовят в виде препарата с 1, 2, 3 или предпочтительно всеми 4-мя из следующих менингококковых капсульных полисахаридов или олигосахаридов, которые могут быть чистыми или конъюгированными с белковым носителем: А, С, Y или W-135. Такую вакцину, содержащую TbpA и Hsf из N.Meningitidis, можно успешно применять в качестве глобальной менингококковой вакцины. Предпочтительно включены конъюгированный менингококковый капсульный полисахарид С, С и Y или А и С.

В еще одном предпочтительном воплощении антигенные композиции по изобретению, содержащие TbpA и Hsf, предпочтительно изготовленные в виде препарата с 1, 2, 3 или всеми 4-мя чистыми или конъюгированными менингококковыми капсульными полисахаридами (или олигосахаридами) А, С, Y или W-135, как описано выше, готовят в виде препарата с конъгированным Н.influenzae b капсульным полисахаридом или олигосахаридом, и/или с одним или более чистым или конъюгированным пневмококковым капсульным полисахаридом или олигосахаридом. Возможно вакцина также может содержать один или более белковый антиген, который может защищать хозяина от инфицирования Streptococcus pneumoniae. Такую вакцину можно успешно использовать в качестве вакцины против менингита/стрептококковой пневмонии.

В еще одном предпочтительном воплощении иммуногенную композицию по изобретению, содержащую Tbp и Hsf-подобный белок, готовят в виде препарата с капсульными полисахаридами, происходящими от одного или более из числа следующих микроорганизмов: Neisseria meningitidis, Haemophilus influezae b, Streptococcus pheumonia, стрептококки группы А, стрептококки группы В, Staphylococcus aureus или Staphylococcus epidermidis. В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды, полученные от одной или более серогрупп А, С, W-135 и Y Neisseria meningitidis. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды, полученные из Streptococcus pneumoniae. Пневмококковые капсульные полисахаридные антигены предпочтительно выбирают из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (наиболее предпочтительно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F). Еще одно предпочтительное воплощение включает ПРФ (полирибозил-рибитол-фосфат) капсульные полисахариды Haemophilus influenzae. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа 5, типа 8 или 336 Staphylococcus aureus. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа I, типа II или типа III из Staphylococcus epidermidis. Еще одно предпочтительное воплощение включает капсульные полисахариды типа Ia, типа Ic, типа II или типа III стрептококков группы В. В еще одно предпочтительное воплощение входят капсульные полисахариды стрептококков группы А, предпочтительно дополнительно содержащие по меньшей мере один белок М и более предпочтительно - различные типы белка М.

Предпочтительными пневмококковыми белковыми антигенами являются такие пневмококковые белки, которые экспонируются на наружной поверхности пневмококков (которые могут быть распознаны иммунной системой хозяина во время по меньшей мере части жизненного цикла пневмококка), или белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Наиболее предпочтительно этот белок представляет собой токсин, адгезин, 2-компонентный сигнальный трансдуктор или липопротеин из Streptococcus pneumoniae или их фрагменты. Особенно предпочтительные белки включают, но не ограничены ими: пневмолизин (предпочтительно детоксифицированный посредством химической обработки или мутации) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pheumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 и 2", Mitchell et al. Biochim. Biophys. Acta 1989, Jan 23; 1007 (1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties", WO 96/05859 (A.Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA и их варианты с трансмембранной делецией (US 5804193 - Briles et al.); PspC и их варианты с трансмембранной делецией (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA и их варианты с трансмембранной делецией (Berry & Paton, Infect. Immun. 1996 Dec; 64 (12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesion essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); пневмококковые холин-связывающие белки и их варианты с трансмембранной делецией; CbpA и их варианты с трансмембранной делецией (WO 97/41151; WO 99/51266); глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (Infect. Immun. 1996, 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164:207-14); М-подобный белок (ЕР 0837130) и адгезин 18627 (ЕР 0834568). Дополнительными предпочтительными пневмококковыми белковыми антигенами являются описанные в WO 98/18931, в частности выбранные в WO 98/18930 и PCT/US 99/30390.

Также вакцина возможно может содержать антигены, обеспечивающие защиту против одной или более дифтерийной, столбнячной и Bordella pertussis инфекций. Коклюшный компонент может представлять собой убитую цельно клеточную В.pertussis (Pw) или бесклеточный коклюшный компонент (Ра), который содержит по меньшей мере один антиген (а предпочтительно все три) из числа следующих: РТ, FHA и 69 кДа пертактин. Обычно антигены, обеспечивающие защиту против дифтерии и столбняка, представляют собой дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин. Анатоксинами могут являться химически инактивированные токсины или токсины, инактивированные путем введения точечных мутаций.

Вакцина также возможно может содержать один или более антиген, который может защищать хозяина против нетипируемых Haemophilus influenzae, RSV, и/или один или более антиген, который может защищать хозяина против вируса гриппа. Такую вакцину можно успешно использовать в качестве глобальной вакцины против среднего отита.

Предпочтительные белковые антигены нетипируемой Н.influenzae включают белок Fimbrin (US 5766608) и продукты слияния, содержащие его пептиды (например, LB1 продукт слияния) (US 584364 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, белок D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Нар и D15.

Предпочтительные антигены вируса гриппа включают целый, живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или MDCK-клетках, или Vero клетках, или целые flu виросомы (как описано R.Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как НА, NP, NA или М белки, или их комбинации.

Предпочтительные RSV (респираторно-синцитиальный вирус) антигены включают гликопротеин F, гликопротеин G, белок HN, белок М или их производные.

Очевидно, что антигенные композиции по изобретению могут содержать один или более капсульный полисахарид из одного вида бактерий.

Антигенные композиции могут также содержать капсульные полисахариды, происходящие от одного или более видов бактерий.

Такие капсульные полисахариды могут быть неконъюгированными или могут быть сконъюгированы с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин, фрагмент С столбнячного анатоксина, дифтерийный анатоксин, CRM197, пневмолизин, белок D (US6342224), TbpA или Hsf. Одно воплощение данного изобретения включает отдельные капсульные полисахариды, конъюгированные с TbpA и Hsf.

Полисахаридный конъюгат можно получить при помощи любой известной методики сочетания. Например, полисахарид может присоединяться через тиоэфирную связь. Этот способ конъюгирования основывается на активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (ЦДАП) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный таким образом полисахарид можно присоединять к аминогруппе на белке-носителе непосредственно или через спейсерную группу. Предпочтительно проводят сочетание цианатного сложного эфира с гександиамином и аминодериватизированный полисахарид конъюгируют с белком-носителем, используя химию гетеролигирования, включая образование тиоэфирной связи. Такие конъюгаты описаны в опубликованной заявке РСТ WO 93/15760 Uniformed Services University.

Конъюгаты также можно получить методами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие методы описаны в ЕР-0-161-188, ЕР-208375 и ЕР-0-477508.

Еще один способ включает сочетание активированного цианогенбромидом полисахарида, дериватизированного гидразидом адипиновой кислоты (АКГ), с белком-носителем посредством карбодиимидной конденсации (Chu С. et al., Infect. Immunity, 1983, 245-256).

Антигенные композиции, содержащие везикулы наружных мембран

Предпочтительным аспектом настоящего изобретения является позитивная регуляция, или сверхэкспрессиия, Tbp и Hsf в ВНМ. Грамотрицательные бактерии отделены от внешней среды двумя последовательными слоями мембранных структур, цитоплазматической мембраной и наружной мембраной. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий является динамической и в зависимости от окружающих условий может подвергаться сильным морфолическим трансформациям. Среди этих проявлений у многих грамотрицательных бактерий было изучено и документально зафиксировано образование везикул наружных мембран или "пузырьков" (Zhou et al., 1998). Среди прочих неисчерпывающий перечень бактериальных патогенов, о которых сообщалось, что они образуют пузырьки, включает: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudumonas aeroginosa и Yersinia enterocolitica. Хотя биохимический механизм, ответственный за продуцирование ВНМ/пузырьков, до конца неясен, такие везикулы наружных мембран интенсивно исследовались, поскольку они представляют мощную методологию для выделения препаратов белков наружных мембран в их нативной конформации. В данном контексте использование препаратов наружных мембран представляет особенный интерес для разработки вакцин против Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa и Chlamydia. Кроме того, пузырьки наружных мембран объединяют различные белковые и небелковые антигены, которые, как предполагается, могли бы обеспечить широкую защиту против внутривидовых вариантов.

Везикулы наружных мембран по изобретению содержат Tbp и Hsf-подобный белок (предпочтительно TbpA и Hsf), которые позитивно регулируются. Этого можно достичь, имея позитивно-регулируемые Hsf-подобный белок и Tbp в везикулах наружных мембран, происходящих от одного штамма грамотрицательных бактерий, предпочтительно штамма Neisseria. Hsf-подобный белок и Tbp также могут позитивно регулироваться по раздельности в везикулах наружных мембран, происходящих от различных штаммов грамотрицательных бактерий, предпочтительно штаммов Neisseria. В предпочтительном воплощении разные штаммы Neisseria, в которых Tbp и Hsf-подобный белок, более предпочтительно TbpA и Hsf, позитивно регулируются, представляют собой L2 и L3 или L3 и L2, в соответствии с иммунотипом N.meningitidis.

Изготовить препараты пузырьков из штаммов Neisseria можно любыми способами, хорошо известными специалистам. Предпочтительно используются способы, описанные в ЕР 301992, US 5,597,572, ЕР 11243 или US 4,271,147, Frederikson et al. (NIPH Annals [1991], 14:67-80), Zollinger et al., (J.Clin. Invest. [1979], 63:836-848), Saunders et al., (Infect. Immun. [1999], 67:113-119], Drabick et al. (Vaccine [2000], 18:160-172) или WO 01/09350 (Пример 8). В общем случае ВНМ экстрагируют детергентом, предпочтительно дезоксихолатом, и нуклеиновые кислоты возможно удаляют энзиматически. Очистку осуществляют ультрацентрифугированием, возможно с последующей вытеснительной хроматографией по размеру. Если включены 2 или более разных пузырька по изобретению, они могут быть объединены в одном контейнере с образованием поливалентного препарата по изобретению (хотя препарат также считается поливалентным, если разные пузырьки по изобретению представляют собой отдельные композиции в отдельных котейнерах, которые хозяину вводят одновременно [за один визит ко врачу]). ВНМ препараты обычно стерилизуют фильтрацией через 0,2 мкм фильтр и предпочтительно хранят в растворе сахарозы (например 3%-ном), который, как известно, стабилизирует пузырьковые препараты.

Позитивного регулирования Tbp и Hsf-подобного белка в препаратах везикул наружных мембран можно достичь путем вставки дополнительной копии гена в грамотрицательную бактерию, от которой происходит ВНМ препарат. Альтернативно, промотор гена можно заменить на более сильный промотор в бактериальном штамме, от которого происходит ВНМ препарат. Такие методики описаны в WO 01/09350. Позитивное регулирование белка приведет к более высокому уровню белка, присутствующего в ВНМ, по сравнению с уровнем белка, присутствующего в ВНМ, происходящих от немодифицированного N.meningitidis (например, штамма Н44/76). Предпочтительно уровень будет по меньшей мере в 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 7, 10 или 20 раз выше.

Когда предполагается, что дополнительным антигеном в ВНМ будет являться ЛПС (липополисахарид), в способе получения ВНМ предпочтительно можно использовать протокол с применением низкой концентрации экстрагирующего детергента (например, дезоксихолата, или ДОХ) так, чтобы сохранить высокие уровни связанного ЛПС при удалении особенно токсичного, слабо связанного ЛПС. Используемая концентрация ДОХ предпочтительно составляет 0-0,5% ДОХ, более предпочтительно 0,02-0,4%, 0,03-0,3%, 0,04-0,2%, 0,05-0,15%, 0,05-0,2% ДОХ, наиболее предпочтительно приблизительно или точно 0,1% ДОХ.

"Более сильная промоторная последовательность" относится к регуляторному контролирующему элементу, который увеличивает транскрипцию гена, кодирующего интересующий антиген.

"Позитивное регулирование экспрессии" относится к любым средствам усиления экспрессии интересующего антигена по сравнению с немодифицированным (то есть встречающимся в природе) пузырьком. Очевидно, что величина "позитивного регулирования" будет меняться в зависимости от конкретного интересующего антигена, но не будет превышать количества, которое разрушит целостность мембраны пузырька. Позитивное регулирование антигена относится к экспрессии, которая по меньшей мере на 10% выше, чем у немодифицированного пузырька. Предпочтительно она по меньшей мере на 50% выше. Более предпочтительно она по меньшей мере на 100% (в 2 раза) выше. Наиболее предпочтительно она по меньшей мере в 3, 4, 5, 7, 10, 20 раз выше. Предпочтительно уровень экспрессии оценивают, когда пузырьки происходят от бактерии, выращенной в условиях ограничения по железу (например, в присутствии хелатора железа).

Альтернативно или дополнительно, позитивное регулирование экспрессии может относиться к превращению экспрессии в не зависящую от метаболических изменений или изменений в питании, в частности в случае TbpA, TbpB, LbpA и LbpB.

Для целей ясности, термины "конструирование бактериального штамма для продуцирования меньшего количества указанного антигена" или "негативное регулирование" относятся к любым средствам уменьшения экспрессии интересующего антигена (или экспрессии функционального генного продукта) относительно экспрессии немодифицированного (то есть встречающегося в природе) пузырька, предпочтительно посредством делеции, так чтобы эта экспрессия была по меньшей мере на 10% ниже, чем у немодифицированного пузырька. Предпочтительно она по меньшей мере на 50% ниже, и наиболее предпочтительно полностью отсутствует. Если негативно регулируемый белок представляет собой фермент или функциональный белок, то негативного регулирования можно достичь введением одной или более мутаций, приводящих к 10%, 20%, 50%, 80%-ному или предпочтительно 100%-ному снижению ферментативной или функциональной активности.

Стадии конструирования, которые требуются для модуляции экспрессии белков Neisseria, можно осуществить разными методами, известными специалистам. Например, можно вставлять последовательности (например, промоторы или открытые рамки считывания), и промоторы/гены можно разрушать методом вставки транспозона. Например, для позитивного регулирования экспрессии гена можно вставить сильный промотор через транспозон вплоть до 2 т.п.о. в обратном направлении от инициирующего кодона гена (более предпочтительно 200-600 п.о. в обратном направлении, наиболее предпочтительно приблизительно 400 п.о. в обратном направлении). Также можно использовать точечную мутацию или делецию (в частности для негативного регулирования экспрессии гена).

Такие методы, однако, могут быть достаточно нестабильными или неопределенными, и поэтому предпочтительно, чтобы стадию конструирования осуществляли через эпизод гомологичной рекомбинации. Предпочтительно эпизод имеет место между последовательностью (рекомбиногенная область) из по меньшей мере 30 нуклеотидов на бактериальной хромосоме и последовательностью (вторая рекомбиногенная область) из по меньшей мере 30 нуклеотидов на векторе, трансформированном в штамме. Предпочтительно эти области представляют собой 40-100 нуклеотидов, более предпочтительно 100-800 нуклеотидов, наиболее предпочтительно 500 нуклеотидов. Эти рекомбиногенные области должны быть достаточно схожими, чтобы они могли гибридизироваться друг с другом в достаточно жестких условиях.

Методы, используемые для осуществления генетических модификаций, описанных здесь (таких как позитивное или негативное регулирование генов посредством рекомбинаций и введения дополнительных последовательностей генов в геном Neisseria), описаны в WO 01/09350. Типичными сильными промоторами, которые можно интегрировать в Neisseria, являются porA, porB, lgtF, Opa, р110, Ist и hpuAB. PorA и PorB являются предпочтительными в качестве конститутивных сильных промоторов. Установлено, что PorB промоторная активность содержится во фрагменте, соответствующем нуклеотидам от -1 до -250 в обратном направлении от инициирующего кодона porB.

Позитивное регулирование экспрессии белков, участвующих в усвоении железа, посредством роста в условиях ограничения по железу

Позитивного регулирования трансферрин-связывающего белка в препарате везикул наружных мембран по изобретению предпочтительно достигают посредством выделения везикул наружных мембран из родительского штамма грамотрицательных бактерий, выращенных в условиях ограничения по железу. Низкая концентрация железа в среде приводит к увеличению экспрессии белков, вовлеченных в усвоение железа, включая TbpA и TbpB. Экспрессия этих белков поэтому позитивно регулируется без необходимости в рекомбинантной модификации вовлеченного гена, например посредством вставки более сильного промотора или вставки дополнительной копии гена. Данное изобретение также охватывает позитивное регулирование трансферрин-связывающего белка посредством роста на среде с ограничением по железу, когда гены также были рекомбинантно модифицированы.

Ограничения по железу достигают добавлением хелатора железа к культуральной среде. Подходящие хелаторы железа включают 2,2-дипиридил, ЭДДГУК (этилендиамин-ди(орто-гидроксифенилуксусная кислота) и Десферал (Desferal) (дефероксамина мезилат, Sigma). Предпочтительным хелатором железа является Десферал, и его добавляют к культуральной среде в концентрации между 10 и 100 мкМ, предпочтительно 25-75 мкМ, более предпочтительно 50-70 мкМ, наиболее предпочтительно 60 мкМ. Содержание железа в среде обусловлено главным образом компонентами, представляющими собой дрожжевой экстракт и соевый пептон, и его количество в партиях может меняться. Следовательно, разные концентрации Десферала могут быть оптимальными для достижения позитивного регулирования белков, участвующих в усвоении железа, в разных партиях среды. Специалист должен иметь возможность легко определить оптимальную концентрацию. В общих словах, к среде должно быть добавлено количество хелатора железа, достаточное для того, чтобы позитивно регулировать экспрессию целевого железо-регулируемого белка, но не настолько большое, чтобы нежелательным образом воздействовать на рост бактерий.

Предпочтительно позитивное регулирование трансферрин-связывающего белка посредством роста в условиях ограничения по железу комбинируют с рекомбинантным позитивным регулированием Hsf-подобного белка так, чтобы получить везикулы наружных мембран по изобретению.

Негативное регулирование/удаление вариабельных и не являющихся защитными иммунодоминантных антигенов

Многие поверхностные антигены являются вариабельными в штаммах бактерий и, следовательно, защищают только от ограниченного ряда близкородственных штамммов. Аспект данного изобретения охватывает везикулы наружных мембран, содержащие TbpA и Hsf-подобный белок, предпочтительно TbpA и Hsf, в которых экспрессия других белков ослаблена, или предпочтительно ген(ы), кодирующие вариабельный(е) поверхностный(е) белок(ки), делетирован(ы). Такая делеция приводит к тому, что бактериальный штамм продуцирует пузырьки, которые при введении в вакцине обладают большим потенциалом перекрестной реактивности против различных штаммов, благодаря более сильному влиянию, оказываемому консервативными белками (сохраняющимися на наружных мембранах) на иммунную систему вакцинируемого. Примеры таких вариабельных антигенов включают: для Neisseria - пилин (pilC), который подвержен антигенным изменениям, PorA, Ора, OpC, PilC, PorB, TbpB, FrpB; для Н.influezae - Р2, Р5, пилин, IgA1-протеазу; и для Moraxella - ОМР106.

Другими типами генов, которые можно негативно регулировать или выключать , являются гены, которые in vivo могут легко включаться (экспрессироваться) или выключаться бактериями. Так как белки наружных мембран, кодируемые такими генами, не всегда присутствуют на бактерии, наличие таких белков в пузырьковых препаратах также может ухудшать эффективность вакцин по причинам, изложенным выше. Предпочтительным примером негативного регулирования или делетирования является Орс белок из Neisseria. Анти-Орс иммунитет, индуцированный Орс-содержащей пузырьковой вакциной, будет обладать лишь ограниченной защитной способностью, так как инфицирующий организм может легко стать Орс^-. Другими примерами таких белков являются HgpA и HgpB из Н.influenzae.

Например, такие вариабельные или не являющиеся защитными гены можно негативно регулировать при экспрессии, или окончательно выключить. Преимуществом этого является концентрация иммунной системы на более подходящих антигенах, которые присутствуют в небольших количествах на наружной поверхности пузырьков.

Способы негативного регулирования экспрессии раскрыты в WO 01/09350.

Под негативным регулированием иммунодоминантного белка наружной мембраны подразумевается, что уровни экспрессии понижены и предпочтительно она выключена, или что мутации и/или делеции экспонированных на поверхности иммунодоминантных петель делают белки наружных мембран менее иммунодоминантными. Под негативным регулированием белка с ферментативной функцией подразумевается, что уровень экспрессии этого белка уменьшен или предпочтительно она выключена, или может подразумеваться, что экспрессия функционального фермента снижена или предпочтительно элиминирована.

Предпочтительные менингококковые штаммы бактерий для использования в изготовлении иммуногенных композиций по изобретению имеют негативное регулирование, предпочтительно делецию 1, 2 или 3 Poa, OpA и Opc. Негативно регулируются предпочтительно PorA и Opa; PorA и OpC; OpA и OpC; PorA и Opa и OpC.

Известно, что в менингококковом геноме существуют четыре разных Ора гена (Aho et al. 1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37), следовательно, когда указано, что при экспрессии Ора негативно регулируется, это означает, что предпочтительно 1, 2, 3 или (предпочтительно) все 4 гена, присутствующие в менингококке, таким образом негативно регулируются. Такое негативное регулирование можно осуществить генетически, как описано в WO 01/09350, или путем поиска легко обнаружимых природных стабильных менингококковых штаммов, которые не экспрессируют или экспрессируют в низкой степени в Ора локусах. Такие штаммы можно обнаружить, используя методику, описанную в Poolman et al. (1985. J.Med. Micro. 19: 203-209), где клетки, которые представляют собой Ора^-, имеют фенотип, отличный от клеток, экспрессирующих Ора, что можно увидеть, глядя на внешний вид клеток на чашках или под микроскопом. После обнаружения можно показать, что штамм стабильно является Ора^-, посредством осуществления вестерн-блоттинга на содержимом клеток после ферментации для установления отсутствия Ора.

Когда позитивное регулирование трансферрин-связывающего белка в везикулах наружных мембран достигается посредством роста в условиях ограничения по железу, вариабельные железо-регулируемые белки также могут позитивно регулироваться. Они включают FrpB в Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J.Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)), и гем/гемопексин утилизирующий белок С (J.Bacteriol. 177; 2644-2653 (1995)), а также HgpA, HgpB и HgpC (Infect. Immun. 66; 4733-4741 (1998), Infect. Immun. 67; 2729-2739 (1999), Microbiology 145; 905-914 (1999)) в Haemophilus influenzae. Авторы изобретения обнаружили, что полезно негативно регулировать экспрессию по меньшей мере вариабельных частей таких белков, когда используется ограничение по железу для позитивного регулирования экспрессии трансферрин-связывающих белков. Это достигается как использованием способов, описанных в WO 01/09350, так и посредством делеции вариабельной(ых) части(ей) белка. Это гарантирует, что иммунный ответ, вызываемый иммуногенной композицией, будет направлен против антигенов, которые присутствуют в широком ряде штамов. Негативное регулирование FrpB предпочтительно комбинируют с негативным регулированием PorA и OpaA; PorA и OpC; OpA и OpC; PorA и OpA и OpC в пузырьковых иммуногенных композициях по изобретению, происходящих от грамотрицательных бактериальных штаммов, предпочтительно штаммов Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae или Neisseria (более предпочтительно N.meningitidis).

В альтернативном воплощении изобретения FrpB негативно регулируется в везикулах наружных мембран, которые были получены из грамотрицательных бактериальных штаммов, предпочтительно штаммов Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae или Neisseria (более предпочтительно N.meningitidis), не обязательно выращенных в условиях ограничения по железу.

Детоксификация ЛПС

ВНМ в иммуногенной композиции по изобретению можно детоксифицировать способами детоксификации ЛПС, которые раскрыты в WO 01/09350. В частности, способы детоксификации ЛПС включают негативное регулирование, предпочтительно делецию htrB и/или msbB ферментов, которые раскрыты в WO 01/09350. Делеционные мутанты этих генов фенотипически характеризуются msbB-мутантным ЛПС, потерявшим одну вторичную ацильную цепь по сравнению с диким типом, и htrB- мутантным ЛПС, потерявшим 2 (или обе) вторичные ацильные цепи. Такие способы предпочтительно комбинируют с методами экстракции ВНМ с использованием низких уровней ДОХ, предпочтительно 0-0,3% ДОХ, более предпочтительно 0,05-0,2% ДОХ, наиболее предпочтительно приблизительно 0,1% ДОХ.

Дополнительные способы детоксификации ЛПС включают добавление к пузырьковым препаратам нетоксичного пептидного функционального эквивалента полимиксина В [молекула с высоким сродством к липиду А] (предпочтительно SAEP 2) (смотри в WO 93/14115, WO 93/03327, Velucchi et al. (1997), J.Endotoxin. Res. 4: 1-12, и ЕР 976402 дополнительные подробности относительно нетоксичных полипептидных функциональных эквивалентов полимиксина В - в частности применение пептида SAEP 2 (последовательности KTKCKFLKKC, где 2 цистеина образуют дисульфидный мостик)).

Перекрестно-реактивные полисахариды

Выделение бактериальных пузырьков наружных мембран из инкапсулированных грамотрицательных бактерий часто имеет результатом их выделение совместно с капсульным полисахаридом. В некоторых случаях это "загрязняющее" вещество может быть полезным, так как полисахарид может усиливать иммунный ответ, вызываемый другими компонентами пузырьков. Однако в других случаях присутствие загрязняющего полисахаридного вещества в бактериальных пузырьковых препаратах может быть вредным для применения пузырьков в вакцине. Например, по меньшей мере в случае N.meningitidis показано, что капсульный полисахарид серогруппы В не вызывает защитного иммунитета и допускает индуцирование нежелательного аутоиммунного ответа у людей. Следовательно, везикулы наружных мембран по изобретению могут быть выделены из бактериального штамма для получения пузырьков, которые изменены посредством конструирования таким образом, что не содержат капсульных полисахаридов. Тогда эти пузырьки будут пригодны для применения у людей. Особенно предпочтительным примером такого пузырькового препарата является препарат из N.meningitidis серогруппы В, не имеющий капсульного полисахарида. В общем случае выделение везикул наружных мембран должно происходить из грамотрицательных бактериальных штаммов, которые не могут синтезировать капсульные полисахариды, в частности, когда такой штамм представляет собой msbB-мутант, описанный выше.

Это может быть достигнуто посредством использования модифицированных продуцирующих пузырьки штаммов, в которых гены, необходимые для капсульного биосинтеза и/или экспорта, повреждены. Инактивации гена, кодирующего биосинтез или экспорт капсульных полисахаридов, можно достичь посредством мутации (точечной мутации, делеции или вставки) либо контролирующей области, либо кодирующей области, либо обоих областей (предпочтительно используя методики гомологичной рекомбинации, описанные выше), или любым другим путем снижения ферментативной функции таких генов. Кроме того, инактивации генов капсульного биосинтеза можно также добиться посредством анти-смысловой сверхэкспрессии или транспозонного мутагенеза. Предпочтительным способом является делеция некоторых или всех Neiseria meningitidis капсульных полисахаридных (cps) генов, необходимых для биосинтеза и экспорта полисахаридов. С этой целью для осуществления мутации, делетирующей cpsCAD (+gaIE) генный кластер, можно использовать плазмиду замещения pMF121 (описана у Frosh et al., 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218).

Когда указанные выше иммуногенные композиции по изобретению происходят от штамма менингококка В, также предпочтительно, чтобы капсульный полисахарид (который также содержит сахаридные структуры, подобные человеческим) также был удален. Хотя для достижения этого результата могут быть выключены многие гены, авторы изобретения успешно показали, что предпочтительно, чтобы штамм, продуцирующий пузырьки, был модифицирован генно-инженерным образом для постоянного негативного регулирования экспрессии функционального генного продукта siaD гена (то есть негативного регулирования -2-8 полисиалилтрансферазной активности), предпочтительно посредством выключения гена, наиболее предпочтительно посредством делеции всего промотора и/или открытой рамки считывания гена или их части. Такая инактивация описана в WO 01/09350. siaD (также известная как synD) мутация является наиболее предпочтительной из числа многих мутаций, которые могут привести к удалению эпитопа, аналогичного человеческому, из капсульного полисахарида, так как она является единственной мутацией, которая не оказывают влияния на биосинтез защитных эпитопов ЛОС (липоолигосахарид), таким образом являясь полезной в способе, целью которого является в конечном счете использование ЛОС в качестве защитного антигена, и оказывает минимальное воздействие на рост бактерий. Предпочтительным аспектом изобретения является, следовательно, иммуногенный пузырьковый препарат, как описано выше, который происходит от lgtE^- siaD^-, LgtA^- siaD^- или предпочтительно lgtB^- siaD^- менингококкового В мутантного штамма. Этот штамм сам по себе составляет еще один аспект изобретения.

Хотя siaD^- мутация является предпочтительной по указанным выше причинам, можно использовать другие мутации, которые выключают синтез нейссериальных капсульных полисахаридов (предпочтительно менингококка В). Таким образом, продуцирующий пузырьки штамм можно модифицировать методами генной инженерии для постоянного негативного регулирования экспрессии функционального генного продукта одного или более следующих генов: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (эквивалентен synX и siaA), synB (эквивалентен siaB) или synC (эквивалентен siaC), предпочтительно посредством выключения гена, наиболее предпочтительно посредством делеции всего промотора и/или открытой рамки считывания этого гена или их части. LgtE^- мутация может быть скомбинирована с одной или более такими мутациями. Предпочтительно lgtB ^- мутация скомбинирована с одной или более такими мутациями. Следовательно, дополнительным аспектом данного изобретения является иммуногенный пузырьковый препарат, как описано выше, который происходит от такого комбинированного мутантного штамма менингококка В. Сам штамм является еще одним аспектом данного изобретения.

Гетерогенность в пределах олигосахаридной группировки ЛПС обусловливает структурное и антигенное многообразие разных нейссериальных штаммов (Griffiss et al., Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800). Это явление использовали для разделения менингококковых штаммов на 12 имунотипов (Scholtan et al., J.Med. Microbiol. 1994, 41: 236-243). Иммунотипы L3, L7 & L9 иммунологически идентичны и структурно подобны (или даже одинаковы) и поэтому были обозначены L3, 7, 9 (или в данном описании в общем виде как "L3"). Менингококковые LPS L3, 7, 9 (L3), L2 и L5 могут быть модифицированы сиалилированием или посредством добавления цитидин-5'-монофосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты. Хотя L2, L4 и L6 ЛПС иммунологически различимы, они структурно подобны, и когда в описании упоминается L2, он может быть заменен либо L4, либо L6 в пределах объема данного изобретения. Смотри в М.Р.Jennings et at., Microbiology 1999, 145, 3013-3021 и Mol. Microbiol. 2002, 43: 931-43 дополнительную иллюстрацию ЛПС структуры и гетерогенности.

Безопасность антител, выработанных к L3 или L2 ЛПС, подвергалась сомнению из-за присутствия структуры, сходной с лакто-N-неотетраозной олигосахаридной группой (Gal 1-4GlcNAc 1-3Gal 1-4Glc 1-), присутствующей в гликосфинголипидах человека. Даже если большое количество людей благополучно вакцинировали экстрагированными дезоксихолатом везикулярными вакцинами, содержащими остаточное количество L3 ЛПС (G.Bjune et al., Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierra et al., NIPH ann. (1991), 14, 195-210), делеция терминальной части сахаридного ЛОС является полезной в предупреждении любого перекрестного взаимодействия со структурами, присутствующими на поверхности человеческих тканей. В предпочтительном воплощении инактивация lgtB гена приводит к промежуточной структуре ЛПС, в которой отсутствуют терминальный галактозный остаток и сиаловая кислота (после мутации остается 4GlcNAc 1-3Gal 1-4Glc 1-структура в L2 и в L3 ЛОС). Такие промежуточные соединения можно получить в L3 и L2 ЛПС штамме. Альтернативный и менее предпочтительный (короткий) вариант ЛПС можно получить выключением lgtE гена. Еще один альтернативный и менее предпочтительный вариант ЛПС можно получить выключением lgtA гена. Если выбирают такую lgtA ^- мутацию, предпочтительно также выключить lgtC экспрессию, чтобы предотвратить образование неиммуногенного L1 иммунотипа.

LgtB^- мутанты являются наиболее предпочтительными, так как авторы изобретения обнаружили, что это оптимальное усечение для разрешения проблемы безопасности, в то время как остающийся ЛПС защитный олигосахаридный эпитоп все еще может индуцировать образование бактерицидных антител.

Следовательно, иммуногенные композиции по изобретению, дополнительно содержащие L2 или L3 препараты (либо очищеные, либо в выделенном пузырьке) или менингококковые пузырьковые препараты в общем случае преимущественно происходят от штамма Neisseria (предпочтительно менингококкового), который посредством генной инженерии был модифицирован для постоянного негативного регулирования экспрессии функционального генного продукта lgtB, lgtA или lgtE гена, предпочтительно посредством выключения гена, наиболее предпочтительно посредством делеции всего промотора и/или открытой рамки считывания этого гена или их части.

Локус Neisseria, содержащий различные lgt гены, включая lgtB и lgtE, и его последовательность известны из уровня техники (смотри М.Р.Jennings et al., Microbiology, 1999, 145, 3013-3021 и ссылки, приведенные в данном описании, и J.Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]).

В пузырьковых препаратах, в частности в препаратах, экстрагированных низкими концентрациями ДОХ, ЛПС можно использовать в качестве антигена в иммуногенной композиции по изобретению. Однако предпочтительно негативно регулировать/делетировать/инактивировать ферментативную функцию либо lgtE, lgtA (в частности в комбинации с lgtC), либо предпочтительно lgtB генов/гена для удаления лакто-N-неотетраозных структур, подобных человеческим. Локус Neisseria (и его последовательность), содержащий lgt гены для биосинтеза ЛПС олигосахаридных структур, известен из уровня техники (Jennings et al., Microbiology, 1999, 145; 3013-3021 и ссылки, приведенные в данном описании, и J.Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994]). Негативное регулирование/делеция lgtB (или функционального генного продукта) является предпочтительным, так как оно оставляет ЛПС защитный эпитоп интактным.

В пузырьковых препаратах N.meningitidis серогруппы В по изобретению предпочтительным является негативное регулирование/делеция как siaD, так и lgtB (хотя комбинация lgtB^- с любым из ctrA^-, ctrB^-, ctrC^-, ctrD ^-, synA^- (эквивалентен synX^- и siaA ^-), synB^- (эквивалентен siaB^-) или synC^- (эквивалентен siaC^-) в продуцирующем пузырьки штамме менингококка В также может быть использована), имеющие результатом пузырьковый препарат с оптимальной безопасностью и сохранением ЛПС защитного эпитопа.

Иммуногенная композиция по изобретению может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре или пять разных препаратов везикул наружных мембран. Когда включены два или более ВНМ препаратов, по меньшей мере один антиген по изобретению позитивно регулируется в каждой ВНМ. Такие ВНМ препараты могут происходить от штаммов Neisseria одного вида и серогруппы, или предпочтительно от штаммов Neisseria другого класса, серогруппы, серотипа, подсеротипа или иммунотипа. Например, иммуногенная композиция может содержать один или более препаратов везикул наружных мембран, которые содержат ЛПС иммунотипа L2 и один или более препаратов везикул наружных мембран, которые содержат ЛПС иммунотипа L3. L2 или L3 ВНМ препараты предпочтительно происходят от стабильного штамма, который обладает минимальной фазовой изменчивостью в локусе гена синтеза ЛПС олигосахаридов.

Предпочтительные Neisseria пузырьковые препараты

Кроме Hsf и Tbp, один или более из следующих генов (кодирующих защитные антигены) является предпочтительным для позитивного регулирования, когда его несет штамм Neisseria, включая гонококк и менингококк (в частности N.meningitidis В): NspA (WO 96/29412), Нар (РСТ/ЕР 99/02766), PorA, PorB (NMB 2039), ОМР85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (PCT/EP 99/06718), FrpB (WO 96/31618), FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP 98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), MltA (WO 99/57280), MafA (NMB 0652), MafB (NMB 0643), Omp26 (NMB 0181), адгезин NMB 0315, адгезин NMB 0995, адгезин NMB 1119, Р2086 (NMB 0399), Lipo28 (NMB 2132), NM-ADPRT (NMB 1343), VapD (NMB 1753) и ctrA (PCT/EP 00/00135). Они также предпочтительны в качестве генов, которые можно гетерологически вводить в другие грамотрицательные бактерии.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для негативного регулирования: PorA, PorB, PilC, LbpA, LbpB, Opa, Opc, htrB, msbB и lpxK.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для позитивного регулирования: pmrA, pmrB, pmrE и pmrF.

Предпочтительными последовательностями репрессивной регуляции, которые следует модифицировать, являются: область fur оператора (в частности одного из TbpB или LbpB генов или обоих); и область DtxR оператора.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для негативного регулирования: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC и ctrD.

Иммуногенные композиции по изобретению также могут содержать ВНМ/пузырьковые препараты, происходящие от грамотрицательных бактерий, включая Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis и Haemophilus influenzae b.

Предпочтительные пузырьковые препараты Pseudomonas aeruginosa

Кроме Hsf и Tbp, один или более из следующих генов (кодирующих защитные антигены) являются предпочтительными для позитивного регулирования: PcrV, OprF, OprI. Они также являются предпочтительными в качестве генов, которые можно гетерологически вводить в другие грамотрицательные бактерии.

Предпочтительные пузырьковые препараты Moraxella catarrhalis

Кроме Hsf и Tbp, один или более из следующих генов (кодирующих защитные антигены) являются предпочтительными для позитивного регулирования: ОМР106 (WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (PCT/EP 99/03824), PilQ (PCT/EP 99/03823), OMP85 (PCT/EP 00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP 99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, et al (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (PCT/EP 99/03822), OmplA1 (PCT/EP 99/06781), Hly3 (PCT/EP 99/03257), LbpA и LbpB (WO 98/55606), TbpA и TbpB (WO 97/13785, WO 95/13370 & WO 97/32980), OmpE, UspA1 и UspA2 (WO 93/03761) и Omp21. Они также являются предпочтительными в качестве генов, которые можно гетерологически вводить в другие грамотрицательные бактерии.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для негативного регулирования: CopB, OMP106, OmpB1, LbpA и LbpB.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для негативного регулирования: htrB, msbB и lpxK.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для позитивного регулирования: pmrA, pmrB, pmrE, pmrF.

Предпочтительные пузырьковые препараты Haemophilus influenzae

Кроме Hsf и Tbp, один или более из следующих генов (кодирующих защитные антигены) являются предпочтительными для позитивного регулирования: D15 (WO 94/12641, WO 95/12641), Р6 (ЕР 281673), Р2, Р5 (WO 94/26304), ОМР26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Нар, Hin47 и Hif (все гены в этом опероне должны позитивно регулироваться для позитивного регулирования пилина). Они также являются предпочтительными в качестве генов, которые можно гетерологично вводить в другие грамотрицательные бактерии.

Один или более из следующих генов являются предпочтительными для негативного регулирования: Р2, Р5, Hif, IgA1-протеаза, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, htrB, msbB и lpxK.

Один или более из следующих генов является предпочтительным для позитивного регулирования: pmrA, prmB, pmrE и prmF.

Предпочтительно иммуногенные композиции или вакцины по изобретению не состоят из и/или не содержат конкретных комбинаций SEQ IDs, перечисленные в таблице, начиная со стр.3, строка 18, до стр.52, строка 2, в WO 00/71725, и/или любой другой частной комбинации, описанной в примерах 1-11 в WO 00/71725.

Кроме того, предпочтительно или альтернативно любые конкретные комбинации, раскрытые в WO 01/52885, не заявлены в настоящем изобретении.

Вакцинные препараты

Предпочтительным воплощением данного изобретения является изготовление препарата иммуногенной композиции по изобретению в виде вакцины, которая также может содержать фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель.

Изготовление препаратов везикул наружных мембран из любого из указанных выше модифицированных штаммов можно осуществить любыми способами, хорошо известными специалистам. Предпочтительно используются способы, раскрытые в ЕР 301992, US 5597572, ЕР11243 или US 4271147. Наиболее предпочтительно используется способ, описанный в WO 01/09350.

Приготовление вакцин в общем описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).

Антигенные композиции по настоящему изобретению в вакцинном препарате по изобретению могут быть адъювантными. Подходящие адъюванты включают в себя соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы) или алюминия фосфат, но также могут представлять собой соль кальция (в частности карбонат кальция), железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных полисахаридов или полифосфазенов.

Подходящие Th1 адъювантные системы, которые можно использовать, включают монофосфориллипид А, в частности 3-дез-O-ацилированный монофосфориллипид А, и комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-дез-O-ацилированного монофосфориллипида A (3D-MPL) с солью алюминия. Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, как описано в WO 94/00153, или менее реакционноспособную композицию, где QS21 гасится холестерином, как описано в WO 96/33739. Особенно сильный адъювантный препарат, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описан в WO 95/17210 и является предпочтительным препаратом.

Вакцина может содержать сапонин, более предпочтительно QS21. Она также может содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол. Неметилированный CpG, содержащий олигонуклеотиды (WO 96/02555), также является предпочтительным индуктором TH1 ответа и подходит для применения в настоящем изобретении.

Вакцинный препарат по настоящему изобретению можно использовать для защиты или лечения млекопитающего, подверженного инфекции, посредством введения указанной вакцины системным путем или через слизистую оболочку. Такие введения могут включать инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путем; или введение через слизистую в рот/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракт. Таким образом, одним аспектом настоящего изобретения является способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызываемого инфицированием грамотрицательными бактериями, включающий введение этому хозяину иммунозащитной дозы пузырькового препарата по настоящему изобретению.

Количество антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов в типичных вакцинах. Это количество будет меняться в зависимости от конкретного используемого иммуногена и того, как он будет представлен. В общем случае предполагается, что каждая доза будет содержать 1-100 мкг белкового антигена, предпочтительно 5-50 мкг и наиболее типично в пределах 5-25 мкг.

Оптимальное количество для конкретной вакцины может быть установлено посредством стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько повторных иммунизации с адекватным разделением во времени.

Полинуклеотиды по изобретению

"Полинуклеотид" в общем случае относится к полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые могут представлять собой немодифицированные РНК или ДНК, либо модифицированные РНК или ДНК. "Полинуклеотиды" включают без ограничения одно- и двунитевые ДНК, ДНК, которые являются смесью одно- и двунитевых областей, одно- и двунитевые РНК и РНК, которые являются смесью одно- и двунитевых областей, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или, более типично, двунитевыми или смесью одно- и двунитевых областей. Кроме того, "полинуклеотид" относится к трехнитевым областям, содержащим РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Термин "полинуклеотид" также включает ДНК или РНК, содержащие одно или более модифицированных оснований, и ДНК или РНК, скелеты которых модифицированы для стабильности или по другим причинам. "Модифицированные" основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК было осуществлено множество модификаций; таким образом "полинуклеотид" охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, как обычно встречающиеся в природе, так и химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. "Полинуклеотид" также охватывает относительно короткие полинуклеотиды, часто упоминаемые как олигонуклеотиды.

Другой аспект изобретения относится к иммунологическому/вакцинному препарату, который содержит один или более полинуклеотидов, кодирующих Tbp и Hsf-подобный белок, в частности к таким, которые соответствуют белковым комбинациям по изобретению. Такие методики известны из уровня техники, смотри, например, Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-8.

Экспрессия Tbp и Hsf-подобного белка, предпочтительно TbpA и Hsf, в таком полинуклеотиде будет находиться под контролем эукариотического промотора, способного управлять экспрессией в клетке млекопитающего. Полинуклеотид может дополнительно содержать последовательность, кодирующую другие антигены. Примеры таких эукариотических промоторов включают промоторы из вирусов, использующих клетки млекопитающих в качестве хозяина, включая аденовирусные промоторы, ретровирусные промоторы. Альтернативно для регулирования TbpA и Hsf-подобного белка можно использовать промоторы млекопитающих.

Антитела и пассивная иммунизация

Другим аспектом данного изобретения является применение иммуногенной композиции, содержащей TbpA и Hsf-подобный белок, для синтеза иммуноглобулина, который можно использовать для лечения или предупреждения инфицирования грамотрицательными бактериями или предпочтительно Neisseria, более предпочтительно Neisseria meningitidis и наиболее предпочтительно Neisseria meningitidis серогруппы В.

Инокулят для продуцирования поликлональных антител обычно готовят посредством диспергирования антигенной композиции в физиологически приемлемом разбавителе, таком как физиологический раствор или другие адъюванты, подходящие для применения у человека, с образованием водной композиции. Иммуностимулирующее количество инокулята вводят млекопитающему, а затем инокулированное млекопитающее выдерживают в течение времени, достаточного для того, чтобы антигенная композиция индуцировала защитные антитела.

Эти антитела могут быть выделены до желаемой степени хорошо известными способами, такими как аффинная хроматография.

Антитела могут включать препараты иммунной сыворотки от ряда обычно используемых животных, например коз, приматов, ослов, свиней, лошадей, морских свинок, крыс или человека. У животных отбирают кровь и извлекают сыворотку.

Иммуноглобулин, продуцируемый в соответствии с настоящим изобретением, может включать в себя целые антитела, фрагменты или субфрагметы антител. Антитела могут быть целыми иммуноглобулинами любого класса, например IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, химерными антителами или гибридными антителами с двойной специфичностью к Tbp и Hsf. Они также могут быть фрагментами, например F(ab')2, Fab', Fab, Fv и подобными, включая гибридные фрагменты. Иммуноглобулин также включает природные, синтетические или генно-инженерные белки, которые действуют как антитело, связывающееся со специфическими антигенами с образованием комплекса.

Вакцину по настоящему изобретению можно вводить реципиенту, который после этого выступает источником иммуноглобулина, продуцируемого в ответ на стимулирующее заражение от конкретной вакцины. Субъект, которого обрабатывают подобным образом, будет давать плазму, из которой будут получать гипериммуноглобулин посредством методики фракционирования плазмы. Гипериммуноглобулин будут вводить другому субъекту, чтобы передать резистентность к нейссериальной инфекции, или лечить ее. Гипериммуноглобулин по изобретению, в частности, полезен для лечения или предупреждения нейссериального заболевания у детей, иммунонедостаточных индивидуумов или когда требуется лечение и нет времени на продуцирование индивидуумом антител в ответ на вакцинацию. Дополнительным аспектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая моноклональные антитела, реактивные против TbpA и Hsf, которые можно использовать для лечения или предупреждения инфицирования грамотрицательными бактериями или предпочтительно Neisseria, более предпочтительно Neisseria meningitides, и наиболее предпочтительно Neisseria meningitidis серогруппы В.

Такие фармацевтические композиции содержат моноклональные антитела, которые могут представлять собой целые иммуноглобулины любого класса, например IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, химерные антитела или гибридные антитела с двойной специфичностью к Tbp и Hsf-подобному белку. Они также могут быть фрагментами, например F(ab')2, Fab', Fab, Fv и подобными, включая гибридные фрагменты.

Методы получения моноклональных антител хорошо известны из уровня техники и могут включать слияние спленоцитов с клетками миеломы (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual, Harlow and Lane 1988). Альтернативно, моноклональные Fv фрагменты можно получить путем скрининга соответствующей библиотеки фагового дисплея (Vaughan Т.J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 535). Моноклональные антитела также могут быть гуманизированы или частично гуманизированы с использованием методик, хорошо известных из уровня техники.

Анализ бактерицидности сыворотки

Анализ бактерицидности сыворотки является предпочтительным способом оценки синергических взаимооотношений между антигенами при их комбинировании в иммуногенной композиции.

Такой синергический ответ можно характеризовать посредством SBA (бактерицидная активность сыворотки), вызываемой комбинацией антигенов, которая по меньшей мере на 50%, в два раза, в три раза, предпочтительно в четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз и наиболее предпочтительно в десять раз выше, чем SBA, вызываемая каждым антигеном отдельно. Предпочтительно измеряют SBA против гомологичного штамма, от которого эти антигены получены, и предпочтительно также против ряда гетерологичных штаммов. (Смотри типичный ряд ниже, например BZ10 (В:2b:Р1.2), принадлежащий к А-4 кластеру; В16В6 (В:2а:Р1.2), принадлежащий к ЕТ-37 комплексу; и Н44/76 (В:15:Р1.7,16)). SBA является наиболее общепринятым иммунологическим маркером для оценки эффективности менингококковой вакцины (Perkins et al., J.Infect. Dis. 1998, 177: 683-691). Удовлетворительным образом SBA можно выявить любым известным способом. SBA можно проводить, используя сыворотки, полученные от животных моделей (смотри примеры 6-9) или от людей.

Другим предпочтительным способом проведения SBA с человеческими сыворотками является следующий способ. Образец крови отбирают перед первой вакцинацией, через два месяца после второй вакцинации и через один месяц после третьей вакцинации (при этом три вакцинации за один год являются режимом типичной первичной вакцинации людей, при введении, например, в 0, 2 и 4 месяца, или 0, 1 и 6 месяцев). Такие режимы первичной вакцинации могут быть осуществлены у детей в возрасте менее 1 года (например, одновременно с проведением Hib вакцинаций), или для тестирования SBA можно также вакцинировать детей в возрасте 2-4 года или подростков с таким же режимом первичной вакцинации. Через 6-12 месяцев после первичной вакцинации и через один месяц после повторной дозы, если это применимо, можно отобрать дополнительный образец крови.

SBA будет удовлетворительной для антигена или пузырькового препарата с гомологичной бактерицидной активностью, если через один месяц после третьей дозы вакцины (в режиме первичной вакцинации) (у детей в возрасте 2-4 лет или подростков, но предпочтительно у детей первого года жизни) процент субъектов с четырехкратным увеличением в единицах титра SBA (разведение антител) (по сравнению с титром до вакцинирования) против штамма менингококка, из которого антигены по данному изобретению были получены, выше 30%, предпочтительно выше 40%, более предпочтительно выше 50% и наиболее предпочтительно выше 60% от общего количества субъектов.

Конечно, антигенный или пузырьковый препарат с гетерологичной бактерицидной активностью также может входить в состав пузырькового препарата с гомологичной бактерицидной активностью, если он также может вызывать удовлетворительную SBA против менингококкового штамма, от которого он происходит.

SBA будет удовлетворительной для антигенного или пузырькового препарата с гетерологичной бактерицидной активностью, если через один месяц после третьей дозы вакцины (в режиме первичной вакцинации) (у детей в возрасте 2-4 года или подростков, но предпочтительно у детей первого года жизни) процент субъектов с четырехкратным увеличением в единицах титра SBA (разведение антител) (по сравнению с титром до вакцинирования) против трех гетерологичных штаммов менингококков выше 20%, предпочтительно выше 30%, более предпочтительно выше 35% и наиболее предпочтительно выше 40% от общего количества субъектов. Такой тест является хорошим показателем того, может ли антигенный или пузырьковый препарат с гетерологичной бактерицидной активностью индуцировать перекрестно-бактерицидные антитела против различных штаммов менингококков. Три гетерологичных штамма предпочтительно должны иметь разный (ЭТ)-комплекс электрофоретического типа или характер мультилокусного типирования последовательности (МЛТП) (смотри Maiden et al. PNAS USA 1998, 95: 3140-5) друг к другу и предпочтительно к штамму, от которого этот антигенный или пузырьковый препарат с гетерологичной бактерицидной активностью получен или произошел. Специалист сможет легко определить три штамма с разным ЭТ-комплексом, которые отражают генетическое разнообразие, наблюдаемое среди менингококков, в частности среди штаммов менингококков типа В, которые признаны причиной значительной отягощенности заболеваний и/или которые представляют признанные MenB гипервирулентные линии (смотри Maiden et al., выше). Например, можно использовать, следующие три штамма: BZ10 (В:2b:Р1.2), принадлежащий к А-4 кластеру; В16В6 (В:2а:р1.2), принадлежащий к ЕТ-37 комплексу; и Н44/76 (В:15:Р1.7,16), принадлежащий к ЕТ-5 комплексу, или любые другие штаммы, принадлежащие к тому же ЕТ/кластеру. Такие штаммы можно использовать для тестирования антигенного или пузырькового препарата с гетерологичной бактерицидной активностью, полученного или происходящего от, например, менингококкового штамма CU385 (В:4:Р1.15), который принадлежит к ЕТ-5 комплексу. Другим образцом штамма, который можно использовать, является штамм из линии 3 эпидемического клона (например, NZ124 [В:4:Р1.7,4]. Другим ЕТ-37 штаммом является NGP165 (В:2а:Р1.2).

Способы измерения SBA известны из уровня техники. Например, способ, который можно использовать, описан в WO 99/09176 в Примере 10С. В общих словах, культуру тестируемого штамма выращивают (предпочтительно в условиях обеднения по железу - посредством добавления хелатора железа, такого как ЭДДУК (этилендиаминдиортогидроксифенилуксуная кислота), к среде для роста) в логарифмической фазе роста. Она может быть суспендирована в среде с БСА (бычий сывороточный альбумин) (такой как среда Хэнкса с 0,3% БСА) с получением рабочей клеточной суспензии, доведенной до приблизительно 20000 КОЕ(колониеобразующие единицы)/мл. Серии реакционных смесей можно получить путем смешивания серий двухкратных разведений тестируемых сывороток (предпочтительно инактивированных нагреванием при 56°С в течение 60 мин) [например, в объеме 50 мкл/лунку] и тестируемой суспензии штамма менингококков 20000 КОЕ/мл [например, в объеме 25 мкл/лунку]. Реакционный сосуд следует инкубировать (например, 37°С в течение 15 минут) и встряхивать (например, при 210 об/мин). Конечная реакционная смесь [например, в объеме 100 мкл] дополнительно содержит источник комплемента [такой как 25% от конечного объема предварительно протестированной сыворотки крольчонка], и инкубируют, как описано выше [например, 37°С в течение 60 минут]. Для этого анализа можно использовать стерильный полистирольный 96-луночный титрационный микропланшет с U-образным дном. Из каждой лунки можно отобрать аликвоту [например, 10 мкл], используя многоканальную пипетку, и каплями нанести на агаровые пластинки Мюллера-Хинтона (предпочтительно содержащие 1% Isovilatex и 1% инактивированной нагреванием сыворотки лошади) и инкубировать (например, в течение 18 часов при 37°С в 5% CO₂). Предпочтительно отдельные колонии могут составлять до 80 КОЕ на аликвоту. В качестве контролей можно использовать следующие три тестируемые образца: буфер + бактерии + комплемент; буфер + бактерии + инактивированный комплемент; сыворотка + бактерии + инактивированный комплемент. SBA титры могут быть непосредственно рассчитаны с использованием программы, которая посредством регрессионных вычислений обрабатывает данные с получением величины разведения, которая соответствует 50%-ной летальности клеток.

Все ссылки или заявки на патенты, приведенные в пределах данной заявки на патент, включены в данное описание изобретения ссылкой.

Способ промышленного применения изобретения

Примеры, приведенные ниже, осуществляют, используя стандартные методики, которые хорошо известны и общеприняты специалистами в данной области техники, за исключением тех, которые подробно описаны. Эти примеры являются иллюстративными, но не ограничивают данное изобретение.

Пример 1: Способы конструирования штаммов Neisseria meningitidis серогруппы В, используемых в препаратах везикул наружных мембран

В WO 01/09350 предложены подробные способы получения везикул наружных мембран и обращения с бактериальными штаммами, от которых происходят везикулы наружных мембарн. Когда везикулы наружных мембран предназначены для удерживания липопротеинов, таких как TbpB, и/или липополисахаридов, предпочтительными являются способы выделения с низкими уровнями дезоксихолата или без него.

Пример 2: Позитивное регулирование Hsf белкового антигена в рекомбинантном штамме Neisseria meningitidis серогруппы В, у которого отсутствуют функциональные cps гены, но экспрессируется PorA

Как описано в примерах в WO 01/09350, в некоторых странах присутствие PorA в везикулах наружных мембран может быть полезным и может увеличивать эффективность вакцин на основе рекомбинантных улучшенных пузырьков. В следующих примерах авторы использовали модифицированный рСМК(+) вектор для позитивного регулирования экспрессии Hsf белкового антигена в штамме, у которого отсутствуют функциональные cps гены, но экспрессируется PorA. Исходный рСМК(+) вектор содержит химерный porA/lacO промотор, репрессированный в Е.coli хозяине, экспрессирующем lacl^q, но транскрипционно активный в Neisseria meningitidis. В модифицированном рСМК(+) нативный porA промотор используют для запуска транскрипции hsf гена. Ген, кодирующий Hsf, амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция), используя HSF 01-NdeI и HSF 02-NheI олигонуклеотидные праймеры, представленные в таблице ниже. Из-за последовательности HSF 01-NdeI праймера экспрессированный Hsf белок будет содержать два метиониновых остатка на 5' конце. Условиями, используемыми для ПЦР амплификации, были условия, описанные производителем (HiFi ДНК полимераза, Boehringer Mannheim, GmbH). Термическое цитирование было следующим: 25 раз (94°С 1 мин, 48°С 1 мин, 72°С 3 мин) и 1 раз (72°С 10 мин, 4°С до возврата). Соответствующий ампликон последовательно клонировали в соответствующие сайты рестрикции рСМК (+) вектора доставки. В этой рекомбинантной плазмиде, сконструированной как pCMK(+)-Hsf, авторы изобретения удалили lacO, присутствующий в химерном porA/lacO промоторе посредством стратегии рекомбинантной ПЦР. рСМК(+)-Hsf плазмиду использовали в качестве матрицы для ПЦР амплификации 2 отдельных фрагментов ДНК:

- фрагмент 1 содержит porA 5' рекомбиногенную область, ген устойчивости к канамицину и porA промотор. Используемые олигонуклеотидные праймеры RP1 (SacII) и RP2 представлены в таблице ниже. RP1 праймер гомологичен последовательности, находящейся непосредственно в обратном направлении от lac оператора;

- фрагмент 2 содержит последовательность Шайна-Далгарно (Shine-Dalgarno) из porA гена, hsf ген и porA 3' рекомбиногенную область. Используемые олигонуклеотидные праймеры, RP3 и RP4 (Apal) представлены в таблице ниже. RP3 праймер гомологичен последовательности, находящейся непосредственно в прямом направлении от lac оператора. 3'-конец фрагмента 1 и 5'-конец фрагмента 2 имеет 48 перекрывающихся оснований. 500 нг из каждой ПЦР партии (1 и 2) использовали для конечной ПЦР реакции с использованием праймеров RP1 и RP4. Последний полученный ампликон субклонировали в вектор pSL1180, подвергнутый рестрикции ферментами SacII и ApaI. Модифицированную плазмиду pCMK(+)-Hsf очищали в крупном масштабе, используя набор QIAGEN maxiprep, и 2 мкг этого вещества использовали для трансформации штамма Neisseria meningitidis серогруппы В, не имеющего функциональных cps генов. Для сохранения экспрессии porA с помощью комбинации методик ПЦР и скрининга посредством вестерн-блоттинга отбирали интеграцию, полученную в результате одного кроссинговера. Устойчивые к канамицину клоны, оцененные положительно посредством porA-специфичной ПЦР и вестерн-блоттинга, хранили при -70°С в виде исходных растворов в глицерине и использовали для дальнейших исследований. Бактерии (соответствующие приблизительно 5×10⁸ бактерий) ресуспендировали в 50 мкл ПААГ-ДСН буфера, замораживали (-20°С)/кипятили(100°С) три раза и затем разделяли посредством ПААГ-ДСН (полиакриламидный гель-додецилсульфат натрия) электрофореза в 12,5%-ном геле. Экспрессию Hsf исследовали на цельноклеточных бактериальных лизатах (ЦКБЛ), полученных от NmB [Cps-, PorA+] или NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. Окрашивание кумасси выявило значительное увеличение экспрессии Hsf (относительно эндогенного уровня Hsf). Это результат подтверждает, что модифицированный pCMK(+)-Hsf вектор является функциональным и может быть успешно использован для позитивного регулирования экспрессии белков наружной мембраны без прекращения продуцирования главного белкового PorA антигена наружной мембраны.

Олигонуклеотиды, использованные в данном исследовании

Олигонуклеотиды	Последовательность	Примечание(я)
Hsf 01-Nde	5' - GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AAT ATA CCG C - 3'	NdeI сайт клонирования
Hsf 02-Nhe	5' - GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GAT AAC CGA C - 3'	Nhe I сайт клонирования
GFP-mut-Asn	5' - AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC - 3'	AsnI сайт клонирования, совместимый с NdeI
GFP-Spe	5' - GAC ATA СТА GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG - 3'	Spe I сайт клонирования, совместимый с NheI
RP1 (SacII)	5' - TCC CCG CGG GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC-3'	SacII сайт клонирования
RP2	5' - CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGG CAA АСА CCC GAT ACG TCT TCA - 3'
RP3	5' - AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG - 3'
RP4 (ApaI)	5'- GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGA CGG CGC AGC AGG - 3'	ApaI сайт клонирования

Пример 3: Позитивное регулирование TbpA гена N.meningitidis серогруппы В посредством замещения промотора

Целью эксперимента была замена эндогенной промоторной области TbpA гена сильным porA промотором для позитивного регулирования продуцирования TbpA антигена. С этой целью была сконструирована плазмида для замещения промотора с использованием методологии Е.coli клонирования. Область ДНК (731 п.о.), расположенная в обратном направлении от TbpA кодирующей последовательности, была обнаружена в частной Incyte PathoSeq базе данных Neisseria meningitidis штамм АТСС 13090. Эта ДНК содержит последовательность, кодирующую TbpB антиген. Эти гены организованы в оперон. TbpB ген делетируют и заменяют CmR/porA промоторной кассетой. С этой целью фрагмент ДНК 3218 п.о., соответствующий 5'-фланкирующей области длиной 509 п.о. tbpB гена, tbpB кодирующую последовательность длиной 2139 п.о., межгенную последовательность длиной 87 п.о. и 483 первые нуклеотида TbpA кодирующей последовательности амплифицировали посредством ПЦР из геномной ДНК Neisseria meningitidis серогруппы В, используя олигонуклеотиды BAD16 (5' - GGC СТА GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC - 3') и BAD17 (5' - GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC - 3'), содержащие последовательности захвата и NheI и HindIII сайты рестрикции (подчеркнуты). Этот ПЦР фрагмент очищали с помощью High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Германия) и непосредственно клонировали в pGemT вектор (Promega, США). Эту плазмиду подвергали циклическому ПЦР мутагенезу (Jones & Winistofer (1992)) для того, чтобы 1) ввести подходящие сайты рестрикции, позволяющие клонировать CmR/PorA промоторную кассету, и 2) для делетирования последовательности длиной 209 п.о. 5'-фланкирующей последовательности tbpB и tbpB кодирующей последовательности. Циклическую ПЦР осуществляли, используя BAD 18 (5' - ТСС ССС GGG AAG ATCTGG ACG ААА AAT CTC AAG ААА CCG - 3') & BAD 19 (5' - GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT ТАС ААА AGG AAG CCG ATA TGC ААС AGC ААС АТТ TGT ТСС G - 3') олигонуклеотиды, содержащие подходящие сайты рестрикции XmaI, BglII и XhoI (подчеркнуты). CmR/PorA промоторную кассету амплифицировали из pUC D15/Omp85 плазмиды, описанной ранее, используя праймеры BAD21 (5' - GGA AGA TCT CCG CTC GAG АСА TCG GGC AAA CAC CCG-3') & BAD20 (5'-TCC CCC GGGAGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC - 3'), содержащие подходящие сайты рестрикции XmaI, SpeI, BglII и Xhol (подчеркнуты). Этот ПЦР фрагмент клонировали в циклическую ПЦР плазмиду. Эта плазмида используется для трансформации штаммов Neisseria meningitidis серогруппы В [cps-] и [cps-porA-]. Интеграция посредством двойного кроссинговера в области, расположенной в обратном направлении от TbpA, направляет инсерцию porA промотора непосредственно в обратном направлении от TbpA ATG.

Пример 4: Конструирование штамма N.meningitidis серогруппы В с позитивным регулированием экспрессии двух антигенов: TbpA и Hsf

Целью данного эксперимента было позитивное регулирование экспрессии TbpA и Hsf одновременно в одном и том же штамме N.meningitidis серогруппы В. Продуцирование TbpA позитивно регулировали посредством замены области его эндогенного промотора сильным porA промотором (промоторная замена). В данном контексте tbpB ген, локализованный в обратном направлении от TbpA, делетирован, и TbpB белок более не присутствует в наружной мембране. Экспрессию Hsf позитивно регулировали посредством инсерции (гомологической рекомбинацией) второй копии соответствующего гена в porA локусе (генная доставка). Оба штамма описаны в отдельном патенте, упоминаемом как WO 01/09350. Селективные маркеры, используемые в обеих стратегиях (Cm^R или Kan^R), допускают комбинирование обеих интеграций в одной и той же хромосоме.

Тотальную геномную ДНК экстрагировали из рекомбинантного Nm.B cps-TbpA+/PorA+ штамма, следуя Qiagen Genomic tip 500-G протоколу. Десять микрограмм ДНК подвергали рестрикции o/n DraIII ферментом рестрикции и использовали для трансформации Neisseria meningitidis серогруппы В согласно классическому протоколу трансформации. Клетки, используемые для трансформации, представляли собой либо рекомбинантный NmB cps-/Hsf+/PorA+ (гомологичная рекомбинация посредством 1 кроссинговера в porA локус), либо рекомбинантный NmB cps-/Hsf+/PorA- (аллельный обмен/гомологичная рекомбинация посредством 2 кросинговеров в porA локус). Их помещали на ночь на GC агар (гонококковый агар), содержащий 200 мкг/мл канамицина, разбавляли до ОП₆₅₀=0,1 в GC жидкой среде с 10 мМ MgCl₂ и инкубировали 6 часов при 37°С при интенсивном перемешивании с 10 мкг рестриктированной с помощью DraIII геномной ДНК. Рекомбинантную Neisseria meningitidis, полученную в результате двойного кроссинговера за один акт (ПЦР скрининг), отбирали на GC среде, содержащей 200 мкг/мл канамицина и 5 мкг/мл хлорамфеникола, и анализировали на TbpA и Hsf экспрессию в OMV препаратах. Как показано на чертеже, продуцирование как TbpA, так и Hsf значительно увеличивалось в ВНМ, полученных из TbpA/Hsf-рекомбинантного NmB штамма, по сравнению с ВНМ, полученными из контрольных NmB cps-штаммов. Уровень сверхэкспрессии каждого белка в двойном рекомбинанте сравним с уровнем экспрессии, полученным в соответствующих единичных рекомбинантах. Уровень сверхэкспрессии TbpA и Hsf был сравним в porA+ и PorA- штаммах (данные не представлены). Вместе эти данные демонстрируют, что: 1) экспрессия TbpA и Hsf может совместно и сопутствующим образом позитивно регулироваться в N.Meningitidis, и 2) рекомбинантные пузырьки, обогащенные TbpA и Hsf, могут быть получены и использованы для иммунизации.

Анализ содержания Hsf и TbpA везикул наружных мембран

ДСН-ПААГ, окрашенный кумасси синим

15 мкг белка в препаратах на основе везикул наружных мембран с позитивным регулированием Hsf или TbpA либо как Hsf, так и TbpA, разбавляли в буфере для образцов, содержащем -меркаптоэтанол, и нагревали при 95°С в течение 10 минут. Эти образцы затем подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ полиакриламидном геле (Novex 4-20% трис-глицин 1,5 мм 2Dwell SDS Page), окрашивали кумасси синим в течение одного часа и обесцвечивали посредством нескольких промывок обесцвечивающим агентом. Результаты представлены на чертеже и показывают, что уровень Hsf и TbpA значительно выше в препаратах везикул наружных мембран, полученных из N.meningitidis, где их уровень экспрессии был повышен.

Пример 5: Иммуногенность ВНМ с позитивным регулированием Hsf и/или TbpA

Группы из 20 мышей иммунизировали три раза ВНМ внутримышечным путем на сутки 0, 21 и 28. Каждую инокуляцию выполняли 5 мкг (содержание белка) ВНМ, приготовленными на AlPO₄ с MPL (монофосфориллипид). ВНМ были получены от N.meningitidis штамм Н44/76, сконструированного таким образом, чтобы капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно. Сравнивали с ВНМ, в которых Hsf, TbpA, как Hsf, так и TbpA, или ни один из них регулировались позитивно. На 41-ые сутки отбирали образцы крови для анализа ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или анализа бактерицидности сыворотки.

ELISA для обнаружения антител против Hsf

96-луночные микропланшеты (Nunc, Maxisorb) покрывали в течение ночи при 4°С 100 мкл 1 мкг/мл специфического антигена в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор). После промывания NaCl 150 мМ твин-20 0,05% планшеты насыщали 100 мкл ЗФР-БСА (бычий сывороточный альбумин) 1%, при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 минут. Между каждой стадией (осуществляемой при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 минут и с ЗФР-БСА 0,2% в качестве буфера для разбавления) избыток реагентов удаляли, промывая NaCl-твин 20. На микролунку добавляли сто микролитров разбавленных образцов сыворотки. Связанные антитела распознавали при помощи биотинилированного анти-мышиного Ig (Prosan) (1/2000). Комплекс антиген/антитело обнаруживали посредством инкубирования с конъюгатом стрептавидин-биотинилированная пероксидаза (Amersham) (1/4000). Для обнаружения в анализе использовали ортофенилендиамин/Н ₂O₂ (4 мг/10 мл цитратного буфера 0,1 М рН 4,5+5 мкл Н₂O₂). Планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте, затем реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 н. HCl. Считывали поглощение при 490 нм.

	Средняя точка титрования (на объединенной сыворотке)
g1, пузырьки TbpA-HSF, IM	15471
g2, пузырьки TbpA, IM	15,41
g3, пузырьки HSF, IM	14508
g4, пузырьки CPS(-)PorA(-), IM	-
g5, MPL/AlPO4, IM	-

Результаты, представленные в таблице выше, показывают, что высокие и эквивалентные титры антител против Hsf были достигнуты посредством иммунизации ВНМ с позитивным регулированием Hsf или как Hsf, так и TbpA. Практически никаких антител против Hsf не было обнаружено в сыворотках после инокуляции одним адъювантом или ВНМ, в которых ни Hsf, ни TbpA не регулировались позитивно, или ВНМ, в которых только TbpA регулировался позитивно.

Пример 6: Сывороточная бактерицидная активность антисывороток, полученных против ВНМ с позитивным регулированием Hsf и/или TbpA

Сывороточную бактерицидную активность антисывороток от мышей, инокулированных ВНМ с позитивным регулированием Hsf, TbpA, как Hsf, так и TbpA, или без позитивного регулирования сравнивали в анализах, используя либо гомологичный штамм Н44/76, либо гетерологичный штамм Cu385. Как было показано, анализ бактерицидности сыоротки демонстрирует хорошую корреляцию с защитой и, следовательно, является хорошим показателем того, насколько эффективно испытываемая композиция вызывает защитный иммунный ответ.

Штаммы дикого типа Neisseria meningitidis серогруппы В (Н44/76 штамм = В:15 Р1. 7,16 L3, 7, 9 и CU385 штамм = В:4 Р1. 19,15 L3, 7, 9) культивировали в течение ночи на чашках Петри с МН+1% Polyvitex +1% лошадиной сыворотки при 37°С +5% CO₂. Их субкультивировали в течение 3 часов в жидкой TSB среде, обогащенной 50 мкМ Десферала (Desferal, хелатор железа) при 37°С при встряхивании до достижения оптической плотности (ОП) приблизительно 0,5 при 470 нм.

Объединенную или отдельную сыворотку инактивировали в течение 40 мин при 56°С. Образцы сыворотки разбавляли 1/100 в ССРХ (сбалансированный солевой раствор Хэнкса)-БСА 0,3% и затем последовательно разводили в два раза (8 разведений) в объеме 50 мкл в круглодонных микропланшетах.

Бактерии при соответствующей ОП разбавляли ССРХ-БСА 0,3% с получением 1,3·10⁴ КОЕ на мл. 37,5 мкл этого разведения добавляли к разведениям сыворотки и микропланшеты инкубировали в течение 15 минут при 37°С при встряхивании. Затем в каждую лунку добавляли 12,5 мкл комплемента кролика. Через 1 час инкубации при 37°С и при встряхивании микропланшеты помещали на лед, чтобы остановить уничтожение.

Используя метод наклона, 20 мкл из каждой лунки пересевали на чашки Петри с МН+1% Polyvitex +1% лошадиной сыворотки и инкубировали в течение ночи при 37°С + CO₂. Подсчитывали КОЕ и рассчитывали процент убитых клеток. Титр сывороточной бактерицидности представляет собой последнее разведение, вызывающее не менее чем 50%-ное уничтожение.

	H44/76	CU385
ВНМ	GMT	% респондеров	GMT	% респондеров
CPS(-) PorA(-)	93	30%	58	5%
CPS(-) PorA(-) Hsf	158	40%	108	20%
CPS(-) PorA(-) TbpA	327	60%	147	30%
CPS(-) PorA(-) Hsf - TbpA	3355	100%	1174	80%

Результаты, подобные показанным в таблице выше, были получены в двух других аналогичных экспериментах.

Значительные увеличения титров бактерицидности (GMT) против гомологичного штамма и гетерологичного штамма наблюдались после вакцинации ВНМ, когда как Hsf, так и TbpA регулировались позитивно. Для сравнения бактерицидные GMTs, измеренные на мышах, вакцинированных Hsf или TbpA, позитивно регулируемыми ВНМ, были аналогичны полученным для мышей, вакцинированных контрольными ВНМ.

Преимущество двойного позитивного регулирования также явно наблюдалось в проценте мышей, продуцирующих значительный уровень бактерицидных антител (титры более 1/100), в частности в экспериментах с использованием гетерологичного штамма.

Пример 7: Влияние смешивания анти-Hsf и анти-TbpA сывороток на бактерицидную активность

Группы из 20 мышей иммунизировали три раза ВНМ внутримышечным путем на сутки 0, 21 и 28. Каждую инокуляцию осуществляли 5 мкг (содержание белка) ВНМ, приготовленных на AlPO₄ с MPL. ВНМ происходили от штамма N.meningitidis H44/76, сконструированного таким образом, что капсульные полисахариды и PorA регулировались негативно. Одну группу мышей иммунизировали контрольными ВНМ, в которых не было позитивного регулирования белков. Во второй группе экспрессия Hsf регулировалась позитивно, в третьей группе экспрессия TbpA регулировалась позитивно, а в четвертой группе экспрессия как Hsf, так и TbpA регулировалась позитивно.

Сыворотки объединяли, либо используя сыворотку мышей в той же группе, или посредством смешивания сывороток, выделенных из группы, в которой один Hsf или один TbpA регулировался позитивно. Сывороточную бактерицидную активность измеряли для каждой объединенной сыворотки, результаты показаны в таблице ниже.

SBA, выполненный на объединенных сыворотках мышей, иммунизированных:	SBA титр
TbpA-Hsf пузырьки	774
TbpA пузырьки	200
Hsf пузырьки	50
CPS(-) PorA(-) пузырьки	50
Смесь анти-TbpA + анти-Hsf сывороток	1162

Результаты в приведенной выше таблице показывают, что следствием смешивания анти-Hsf и анти-TbpA антисывороток являлась сывороточная бактерицидная активность, значительно более высокая, чем достигавшаяся любой антисывороткой отдельно. Представляется, что синергический эффект достигается за счет присутствия антител как против Hsf, так и против TbpA.

Пример 8: Усеченные Hsf белки могут синергически объединяться с TbpA

Были получены серии усеченных Hsf конструктов с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Они включают конструкт, который кодирует аминокислоты 1-54, включающие сигнальную последовательность Hsf, и аминокислоты 134-592 Hsf (Tr1Hsf). Второй усеченный Hsf содержал аминокислоты 1-53 сигнальной последовательности Hsf и следующие за ними аминокислоты 238-592 Hsf (Tr2Hsf). Эти два усеченных Hsf конструкта и полноразмерный Hsf вводили в N.meningitidis В штамм МС58 siaD-, Opc-, PorA- так, чтобы их экспрессия позитивно регулировалась, и получали везикулы наружных мембран с помощью способов, описанных выше.

Препараты везикул наружных мембран адсорбировали на Al(ОН)₃ и инъецировали мышам на сутки 0, 21 и 28. На сутки 42 у мышей отбирали кровь и готовили сыворотки. Эти сыворотки смешивали с сыворотками мышей, вакцинированных ВНМ с позитивно регулируемыми TbpA, и анализы бактерицидности сыворотки проводили так, как описано выше.

Сывороточные бактерицидные титры
Группа	H44/76	CU385
МС58 PorA+siaD+	25600	25600
МС58 PorA-siaD-Hsf	1530	800
MC58 PorA-siaD-Tr1Hsf	1015	1360
MC58 PorA-siaD-Tr2Hsf	50	50
Отрицательный контроль	50	50
TbpA + MC58 PorA+siaD+	25600	24182
TbpA + MC58 PorA-siaD-Hsf	2595	1438
TbpA + MC58 PorA-siaD-Tr1Hsf	4383	2891
TbpA + MC58 PorA-siaD-Tr2Hsf	1568	742
TbpA + Отрицательный контроль	778	532

Результаты, представленные в таблице выше, показывают, что первое усечение (Tr1Hsf) вызывает иммунный ответ, который способен комбинироваться с антисыворотками против TbpA с получением более высокой сывороточной бактерицидной активности, чем при использовании полноразмерного Hsf. Однако важной является степень усечения, и усечение, произведенное в Tr2, оказывает неблагоприятный эффект по сравнению с полноразмерным Hsf. Усиленная бактерицидная активность Tr1Hsf наблюдалась против обоих использовавшихся штаммов.

Пример 9: Сывороточная бактерицидная активность антител против TbpA, Hsf и третьего менингококкового белка

N.meningitidis штамм Н66/76, в котором PorA и капсульные полисахариды регулировались негативно, как описано выше, использовали в качестве фонового штамма для позитивного регулирования TbpA и Hsf, LbpB, d15, PilQ или NspA, используя метод, описанный выше. Везикулы наружных мембран готовили из каждого штамма, как описано выше. Рекомбинантые FhaB, FrpC, FrpA/C и Нар получали, используя методики, хорошо известные в данной области техники, как описано в РСТ/ЕР 99/02766, WO 92/01460 и WO 98/02547.

Препараты везикул наружных мембран и рекомбинантные белки адсорбировали на Al(ОН)₃ и инъецировали мышам на сутки 0, 21 и 28. На сутки 42 у мышей отбирали кровь и готовили сыворотки. Сыворотки против TbpA и Hsf позитивно регулируемых ВНМ смешивали с сыворотками мышей, вакцинированных позитивно регулируемыми LbpB, D15, PilQ или NspA OMVs или рекомбинантными FhaB, FrpC, FrpA/C или Нар, и анализы сывороточной бактерицидности проводили так, как описано выше.

Результаты

Результаты приведены в таблице ниже. В анализах с использованием гомологичного штамма Н44/76 добавление антител против третьего менингококкового антигена, за исключением FrpC, не генерировало более высокого сывороточного бактерицидного титра, чем титр, генерируемый с использованием антител только против TbpA и Hsf.

Однако добавление антител против третьего антигена было полезным в анализах бактерицидности сыворотки с использованием гетерологичного штамма. Антитела против D15 (ОМР85), Нар, Frp/C и LbpB были особенно эффективны в увеличении сывороточного бактерицидного титра против штамма CU 385.

	Сывороточные бактерицидные титры
Смесь антисывороток	Н44/76	CU385
анти-TbpA-Hsf и неиммунные сыворотки	5378	2141
анти-TbpA-Hsf и анти-FhaB	5260	2563
анти-TbpA-Hsf и анти-Нар	4577	5150
анти-TbpA-Hsf и анти-FrpA/C	5034	4358
анти-TbpA-Hsf и анти-LbpB	5400	4834
анти-TbpA-Hsf и анти-D15	4823	4657
анти-TbpA-Hsf и анти-PilQ	4708	2242
анти-TbpA-Hsf и анти-NspA	4738	2518
анти-TbpA-Hsf и анти-FrpC	6082	2300

Пример 10: Влияние FrpB КО в везикулах наружных мембран на их способность вызывать бактерицидный иммунный ответ в гомологичных и гетерологичных штаммах

Два штамма Н44/76 N.meningitidis использовали для получения препаратов везикул наружных мембран, как описано в WO 01/09350, используя экстракцию 0,1%-ным ДОХ таким образом, чтобы содержание ЛОС составляло приблизительно 20%. Штамм В1733 представляет собой siaD(-), PorA(-), имеет позитивное регулирование Tr1Hsf (пример 8), a lgtB нокаутирован . Штамм В1820 В1733 представляет собой siaD(-), PorA(-), имеет позитивное регулирование Tr1Hsf, lgtB нокаутирован , и FrpB также нокаутирован . Оба штамма культивировали в среде, обогащенной 60 мкМ Десферала так, чтобы регулируемые железом белки, такие как LbpA/B и TbpA/В, регулировались позитивно.

Пузырьковые препараты адсорбировали на Al(ОН)₃, и 5 мкг инъецировали внутримышечно группам из 30 мышей на сутки 0 и 21. Образцы крови отбирали на сутки 28.

Анализы бактерицидности сыворотки проводили на трех L3 штаммах (гомологичный штамм Н44/76 дикого типа и два гетерологичных L3 штамма: NZ124 и М97250687), как описано в примере 6.

Результаты
Пузырьки, используемые для инокуляции	Н44/76	М97250687	NZ124
GMT	SC	GMT	SC	GMT	SC
В1733	1518	30/30	151	11/30	70	4/29
В1820	781	19/30	1316	24/30	276	19/30

GMT указывает среднегеометрический титр сывороток в СБА.

SC указывает количество сероконвертирующих мышей (BSA титр более 1/100).

Результаты ясно показывают, что FrpB КО (В1820) пузырьки индуцируют лучший гетерологичный перекрестно-бактерицидный ответ, чем FrpB(+) пузырьки (В1733). BSA титры были выше, и у большей части мышей имела место сероконверсия в штаммах М97250687 и NZ124. Результаты в гомологичном штамме были не такими хорошими, когда FrpB был удален.

Эти данные позволяют предположить, что FrpB вызывает иммунный ответ, но поскольку этот белок наружной мембраны является высоко вариабельным, антитела против данного белка способны только индуцировать уничтожение гомологичного штамма.