способ получения комплексного препарата для профилактики и лечения патологий обмена веществ и нарушений функций иммунной системы животных

Формула изобретения

Способ получения комплексного препарата для профилактики и лечения патологий обмена веществ и нарушений функций иммунной системы животных, включающий смешивание янтарной кислоты, новокаина, иммуностимулятора, растворение в дистиллированной воде, стерилизацию полученного препарата автоклавированием, отличающийся тем, что в качестве иммуностимулятора вводят нуклеинат натрия или деринат при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Янтарная кислота	1,5
Нуклеинат натрия	2,0
Новокаин	0,25
Дистиллированная вода	остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к разработке комплексных средств для профилактики и лечения нарушений обменных и иммунных процессов у животных. Для профилактики и лечения патологий обмена веществ и приобретенных иммунодефицитов предложены и широко используются витаминные, ферментные, иммунотропные препараты, аминокислоты (Мозгов И.Е. Фармакология. - М., Колос, 1979, с.204, 247, 253).

Наряду с безусловной эффективностью вышеуказанных средств общим недостатком их является односторонний механизм действия. Между тем, проведенные в последние десятилетия многочисленные теоретические и клинические исследования показали тесную взаимосвязь между состоянием обменных процессов и функционированием иммунной системы. В настоящее время все больше внимания уделяется концепции одновременной коррекции обменных процессов и иммунной системы для устранения различных патофизиологических состояний. В клинической практике врачу значительно удобнее, когда стимуляторы обменных процессов и иммунной системы находятся в одной лекарственной форме. К таким средствам относятся комбинированные препараты. К этому классу лекарственных средств относится целый ряд комплексных препаратов иммунометаболического направления, таких как Мастим, включающий в своем составе АСД Ф № 2 и аскорбиновую кислоту (Игнатов П.Е. Очерки об инфекционных болезнях у собак. М. ИПО Профиздат, 1995, с.95); Янтарный биостимулятор на основе янтарной кислоты и АСД ф № 2 (Лебедев А.Ф. и др. Патент РФ № 2303979 от 10.08.07.); Биостил на основе ароксилалканкарбоновой кислоты и АСД Ф № 2 (Патент РФ № 2282973 от 10.09.06). Эти препараты выражено стимулируют обменные и иммунные процессы. Однако все они содержат в качестве иммуностимулятора АСД Ф № 2, который не относится к числу официально зарегистрированных субстанций, рекомендованных для приготовления комплексных препаратов. Отчасти это связано с тем, что химический состав органических соединений АСД Ф № 2 имеет значительную вариабельность, зависящую от качества используемого исходного сырья при его изготовлении. Кроме того, технология получения АСД Ф № 2, предусматривающая высокотемпературную (500°С) возгонку мясокостной муки, в целом является весьма энергозатратной (Абрамов В.Е. и др. Определение показателей качества препарата АСД-2. Ветеринария, 2004, № 9, с.13-16).

Задачей настоящего изобретения является разработка комплексного препарата, обладающего метаболическим и иммуностимулирующим действием.

В качестве наиболее близкого прототипа нами взят янтарный биостимулятор (Патент РФ № 2303979 от 10.08.07), включающий в своем составе 1% янтарной кислоты; 4% АСД Ф № 2; 0,25% новокаина. Однако данный комплексный препарат в качестве иммуностимулятора содержит АСД Ф № 2, который в силу вышеуказанных причин не может считаться оптимальным для решения поставленной задачи. В качестве альтернативы АСД при комплектовании препарата с заданными свойствами стимулятора обменных и иммунных процессов может быть использован нуклеинат натрия, деринат или любой другой иммуностимулятор, сочетающийся с янтарной кислотой и выдерживающий температурное воздействие при стерилизации. Способ обеспечивает комплексную коррекцию обменных и иммунных процессов при разного рода патофизиологических состояниях. Полученное комплексное средство включает физиологически безвредные компоненты, которые оказывают выраженное корригирующее воздействие на разбалансированные системы организма, что повышает противоинфекционную и антитоксическую резистентность.

Янтарная кислота является мощным стимулятором обмена веществ живой клетки. Объектом действия янтарной кислоты являются клетки и ткани, находящиеся в состоянии возбуждения или патологическом изменении. Стимулирующее действие янтарной кислоты особо выражено при ослаблении организма к его заболеваниям. Кроме того, янтарная кислота является универсальным компонентом, усиливающим эффективность других лекарственных средств.

Нуклеинат натрия - натриевая соль рибонуклеиновой кислоты. Нуклеинат натрия является классическим стимулятором Т-клеточного звена иммунитета, однако эффективен и для коррекции гуморальной системы иммунитета. Начиная с 1980 г., нуклеинат натрия применяется в качестве средства, повышающего противоинфекционную и антитоксическую резистентность, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, протекающих на фоне иммунодефицитных состояний, для стимуляции лейкопоэза, а также для усиления иммуногенности вакцин. К достоинствам препарата относится хорошая совместимость с другими лекарственными средствами. Отрицательным свойством нуклеината натрия является болезненная реакция при парентеральном методе введения препарата. Нуклеинат натрия детально изучен и рекомендуется для применения перорально в количестве 0,2-1 г и для инъекций в количестве 2-5 мл 2% раствора.

Данных по использованию нуклеината натрия и янтарной кислоты в одной лекарственной форме в литературе нет.

Деринат - натрия дезоксирибонуклеат - биологически активное вещество, представляющее собой вытяжку из молок осетровых рыб. Препарат оказывает иммуномодулирующее действие на клеточном и гуморальном уровнях, активизирует антиинфекционный иммунитет, регулирует гемопоэз, стимулирует репаративные и регенераторные процессы. Применяется как в моно-, так и комплексной терапии при различных патофизиологических состояниях, протекающих на фоне нарушений функционирования иммунной системы. Хорошо совместим с другими лекарственными средствами, что находит применение при разработке комплексных препаратов, в частности ферровирадеринат в комплексе с поливалентным железом. Для внутримышечного применения используют 1,5% раствор дерината. Данных по применению дерината в комплексе с янтарной кислотой в литературе нет.

Для снятия болезненной реакции при инъекциях препарата в его состав включен водный раствор новокаина в 0,25% концентрации. Кроме того, известно, что препараты на растворе новокаина оказывают более быстрое действие, чем на физиологическом растворе.

Предлагаемое лекарственное средство позволяет получить новый технический эффект, выражающийся в повышении метаболической и иммуностимулирующей активности за счет повышенного содержания янтарной кислоты, оказывающей выраженное метаболическое действие, и включения в его состав нуклеината натрия или дерината, оказывающих повышенный иммуностимулирующий эффект, по сравнению с прототипом, янтарным биостимулятором, включающим в качестве иммуномодулятора АСД Ф № 2. Указанный результат подтверждается данными биохимических и иммунологических исследований (таблицы 3 и 4).

В предварительных исследованиях было установлено, что комплексные составы препаратов, содержащие 1% янтарной кислоты, 4% АСД Ф № 2 (по прописи 1), или 1,5% янтарной кислоты и 2% нуклеината натрия (по прописи 2), или 1,5% янтарной кислоты и 2% дерината (по прописи 3) при учащенном, через каждые 24 часа в течение 10 дней, внутрибрюшинном введении белым мышам в объеме 0,5 мл не вызывали ухудшения их самочувствия. Это свидетельствует о том, что они малотоксичны для животных и не обладают анафилактогенностью.

Пример 1. Для приготовления комплексного препарата использовали 950 мл дистиллированной воды, в которой при нагревании растворили 15 г янтарной кислоты, 20 г нуклеината натрия и 2,5 г новокаина. Дробным добавлением раствора гидроокиси натрия довели до рН 6,8 - 7,0. Выпадения осадка не наблюдалось, что свидетельствовало о совместимости компонентов. Добавили дистиллированную воду до 1000 мл.

Препарат расфасовали по флаконам емкостью 50 мл и провели стерилизацию автоклавированием в режиме 1,0-1,12 атм в течение 25 мин. Стерилизация автоклавированием не изменила физических свойств препарата. Раствор был прозрачен и выпадение осадка не наблюдалось.

При контрольных высевах препарата на мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ) рост микрофлоры отсутствовал, что свидетельствовало о его стерильности

Пример 2. Аналогично примеру 1 готовят комплексный препарат по прописи 3 с использованием в качестве иммуностимулятора субстанции дерината в количестве 20 г, янтарной кислоты 15 г и новокаина 2,5 г.

Препаратом для сравнения во всех биологических экспериментах использовали янтарный биостимулятор на основе 1% янтарной кислоты, 4% АСД Ф № 2, 0,25% новокаина (по прописи 1).

Во всех экспериментах дозы и схемы применения сравниваемых препаратов были одинаковыми.

Нами представлены конкретные примеры экспериментальной оценки описываемых препаратов.

Изучение протективной активности проведено с использованием тестов антиинфекционной и антитоксической защиты.

В первом тесте изучение протективной активности проведено на белых мышах массой 20-23 г. Моделирование острого инфекционного процесса осуществлялось введением культуры золотистого стафилококка. Комплексные препараты ввели внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. В аналогичном объеме внутрибрюшинно контрольной группе мышей ввели 0,25% раствор новокаина. Спустя сутки провели заражение мышей культурой золотистого стафилококка в дозе 2 LD_50. В каждой группе было по 7 мышей. Результаты проведенного опыта представлены в таблице 1.

Таблица 1
Уровень защиты белых мышей при заражении культурой золотистого стафилококка
Состав препарата	Число погибших мышей после заражения в дни наблюдения
2 день	3 день	4 день	5 день	6 день	Осталось в живых
ЯБ по	1	1	-	-	-	5/71,4%
прописи 1
ЯБ по прописи 2	2	-	-	-	-	5/71,4%
ЯБ по прописи 3	1	1	-	-	-	5/71,4%
0,25% раствор новокаина	5	1				1/10,4%

Во втором тесте изучение протективной активности проведено на белых мышах при моделировании у них острого токсикоза экзотоксином золотистого стафилококка в дозе 2 LD₅₀. Спустя 2 часа после введения токсина всем подопытным мышам внутрибрюшинно инъецировали испытуемые составы комплексных препаратов в объеме 0,5 мл на одну мышь В каждой группе было по 7 мышей. Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2
Уровень защиты белых мышей при моделировании острого токсикоза токсином золотистого стафилококка
Состав препарата	Число погибших мышей после заражения в дни наблюдения
1 день	2 день	3 день	4 день	5 день	Осталось в живых
ЯБ по прописи 1	3	1	-	-	-	3/42,9%
ЯБ по прописи 2	2	1	-	-	-	4/57,1%
ЯБ по прописи 3	2	1	-	-	-	4/57,1%
0,25% раствор новокаина	5	1				1/10,4%

Из проведенных экспериментов следует, что комплексные препараты, содержащие в качестве метаболита янтарную кислоту и в качестве иммуностимулятора АСД Ф № 2, или нуклеинат натрия, или деринат, обеспечивают высоко достоверный и одинаковый уровень протективной активности.

Изучение метаболической активности провели на коровах в период регистрации у них выраженных нарушений обменных процессов.

По результатам биохимических исследований было отобрано 28 коров с явлениями ацидоза, из которых сформировали 4 подопытные группы по 7 животных в каждой.

Коровам первой группы однократно внутримышечно в объеме 10,0 мл вводили янтарный биостимулятор (ЯБ) по прописи 1 (прототип). Коровам 2 и 3 групп соответственно в аналогичном объеме инъецировали препараты, изготовленные по прописям 2 и 3. Коровам 4 группы были сделаны инъекции 0,25% раствора новокаина в объеме 10,0 мл. Влияние препаратов на обменные процессы определялось на основании биохимических исследований сыворотки крови. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3
Влияние испытуемых препаратов на обменные процессы у коров при ацидозе
Показатели	Препараты
Прототип, ЯБ по прописи 1	ЯБ по прописи 2	ЯБ по прописи 3	0,25% р-р новокаина
Белок, г/л
до введения	9,52±0,98	9,21±1,46	9,27±0,84	9,24±1,30
через 7 дней	8,46±1,25	8,15±1,29	8,42±1,15	9,32±1,24
через 14 дней	8,52±0,74	8,04±0,78*	8,21±0,89*	9,04±0,97
Резервная щелочность, мг %
до введения	32,61±5,24	33,72±6,23	33,21±5,28	33,93±6,12
через 7 дней	45,72±4,32	55,81±4,31*	56,24±6,18*	40,25±5,96
через 14 дней	44,92±5,12	54,63±5,43*	55,21±4,86*	34,52±6,12
Кетоновые тела, мг %
до введения	14,73±2,12	15,12±1,82	14,48±1,24	15,26±1,28
через 7 дней	8,55±1,37	5,46±1,74*	5,52±1,36*	15,62±1,75
через 14 дней	10,12±1,55	6,48±1,32*	5,96±0,98*	16,29±1,27
Кальций, мг %
до введения	7,48±0,52	7,84±0,36	7,56±0,22	8,17±0,12
через 7 дней	9,76±0,44	10,68±0,27	10,72±0,34	8,19±0,22
через 14 дней	9,56±0,28	10,14±0,31	10,19±0,42	8,14±0,17
Фосфор, мг %
до введения	7,75±0,46	7,86±0,75	7,94±0,69	7,82±0,58
через 7 дней	6,48±0,27	5,22±0,24*	5,28±0,37*	7,46±0,84
через 14 дней	6,32±0,58	5,94±0,26*	5,37±0,28*	7,84±0,32
* р<0,001 по сравнению с прототипом.

Исходя из результатов биохимических исследований янтарный биостимулятор, включающий более высокую, чем в прототипе, концентрацию янтарной кислоты и в качестве иммуностимулятора нуклеинат натрия или деринат оказал более выраженное воздействие на обменные процессы. Так, через 14 дней после введения препаратов соотношение кальций/фосфор составляло в контрольной группе животных 1,04, что свидетельствует о нарушении минерального обмена. Данный показатель в первой, второй и третьей опытных группах составил 1,51; 1,71 и 1,9 соответственно. При этом содержание кальция и фосфора находилось в пределах физиологической нормы, что указывает на нормализацию обменных процессов. Введение препаратов по прописи № 2 и 3 выраженно устраняло гиперпротеинемию (повышенное содержание белка), содержание белка в сыворотке крови животных опытных групп находилось в пределах физиологической нормы. Под действием препаратов достоверно снижалась концентрация в крови кетоновых тел. У животных первой опытной группы, которым вводился янтарный биостимулятор по прописи № 1, содержание кетоновых тел составило 10,12±1,55 мг %, второй опытной группы - 6,48±1,32 мг %, третьей - 5,96±0,98 мг %, тогда как у животных контрольной группы содержание кетоновых тел несколько превысило фоновые показатели и составило 16,29±1,27 мг %, что указывает на нарушение обменных процессов. Повышение под действием препаратов резервной щелочности, наиболее выраженное во второй и третьей группах, свидетельствует о нормализации кислотно-щелочного состояния и устранении явления ацидоза.

Более выраженный нормализующий обменные процессы эффект обусловлен повышенной концентрацией янтарной кислоты в новых составах препаратов до 1,5% по отношению к прототипу - 1%.

Изучение иммуностимулирующей активности сравниваемых составов янтарного биостимулятора провели на телятах 20-25-дневного возраста с клиническими признаками гипотрофии (иммунодефицитное состояние). Были сформированы 4 подопытные группы по 5 животных в каждой. Телятам 1 группы однократно внутримышечно в объеме 2,5 мл вводили янтарный биостимулятор по прописи 1 (прототип), телятам 2 и 3 групп, соответственно, в аналогичном объеме инъецировали препараты, изготовленные по прописям 2 и 3. Телятам 4 группы в том же объеме были сделаны инъекции 0,25% раствора новокаина.

Оценку влияния препаратов на изменение иммунологических показателей провели на 5 сутки. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4
Влияние испытуемых препаратов на иммунный статус телят-гипотрофиков
Показатели	Препараты
Прототип, ЯБ по прописи 1	ЯБ по прописи 2	ЯБ по прописи 3	0,25% р-р новокаина
Лейкоциты 109/л
до введения	6,82±0,71	6,72±0,66	6,74±0,84	6,62±0,81
после введения	7,72±0,74	7,91±0,45	7,82±0,46	6,61±0,72
Лимфоциты, %
до введения	32,61±2,81	34,62±2,11	35,21±1,82	33,73±2,62
после введения	39,62±2,62	40,33±1,63	42,21±2,36*	33,25±2,52
Т-лимфоциты, %
до введения	19,43±1,42	19,21±0,82	20,18±0,74	19,62±0,86
после введения	25,61±1,55	28,32±1,12*	27,26±0,98*	20,15±1,25
В-лимфоциты, %
до введения	3,58±0,32	3,64±0,76	3,56±0,42	3,57±0,82
после введения	7,85±0,68	7,24±0,41	7,59±0,32	3,64±0,77
Иммуноглобулины М, мг/мл
до введения	1,41±0,08	1,52±0,07	1,44±0,29	1,57±0,18
после введения	1,92±0,58	1,84±0,26	1,73±0,28	1,56±0,32
Иммуноглобулины G, мг/мл
до введения	16,72±1,86	15,96±2,05	15,84±1,39	16,32±1,28
после введения	19,82±1,78	19,72±1,63	18,65±1,42	16,84±1,32
* р<0,001 по сравнению с прототипом.

Как следует из данных таблицы 4, составы, приготовленные по прописям 2 и 3, не уступают по своей активности прототипу, при этом у препаратов, изготовленных на основе янтарной кислоты и нуклеината натрия (пропись 2), и дерината (пропись 3) выявлено более выраженное стимулирующее влияние на Т-систему клеточного иммунитета, о чем свидетельствует достоверное увеличение содержания Т-лимфоцитов до 28,32±1,12% при введении препарата, включающего нуклеинат натрия и 27,26±0,98% под действием препарата, содержащего деринат. Это может существенно увеличить эффективность лечения инфекционных заболеваний, сопровождающихся угнетением данной функции системы иммунитета.

В целом по результатам проведенных экспериментальных опытов янтарные биостимуляторы, в состав которых включены янтарная кислота в качестве метаболита и в качестве иммуностимуляторов нуклеинат натрия или деринат, обладали хорошо выраженным антиинфекционным защитным эффектом и превосходили прототип в эффективности нормализации обменных процессов.

Преимущество изобретения заключается в том, что разработан способ получения высокоактивного комплексного препарата для инъекций для профилактики и лечения патологии обмена веществ и нарушения функций иммунной системы, обладающий повышенной метаболической и иммуностимулирующей активностью.