способ пивоварения

Формула изобретения

1. Способ получения пивного сусла, включающий: а. получение затора посредством затирания крупки, в которой по меньшей мере 97 вес.% является несоложеным злаком (злаками), содержащим -амилазную активность, и менее 3 вес.% является соложеным злаком(злаками), при температуре, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная -амилаза являются активными; b. контактирование затора с экзогенными ферментами, содержащими: i. -амилазную активность, ii. пуллуланазную активность, iii. протеазную активность, iv. -глюканазную активность, v. липазную активность, vi. ксиланазную активность; с. отзаторивание и фильтрование затора для получения сусла.

2. Способ по п.1, в котором крупка содержит 100 вес.% несоложеного злака (злаков).

3. Способ по п.1, в котором несоложеный злак (злаки) представляет собой ячмень, спельту, пшеницу, рожь, кукурузу, овес или рис, или любую их смесь.

4. Способ по п.3, в котором несоложеный злак представляет собой ячмень.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором крупка дополнительно содержит другие источники углеводов, такие как пивные сиропы.

6. Способ по любому из пп.1-4, в котором экзогенные ферменты со стадии b. в п.1 дополнительно содержат фитазу.

7. Способ по любому из пп.1-4, в котором температура затирания находится в диапазоне, оптимизирующем -амилазную активность.

8. Способ по любому из пп.1-4, в котором первую стадию проводят при температуре 50-58°С, вторую стадию проводят при температуре 60-65°С и третью стадию проводят при температуре 70-80°С.

9. Способ по п.8, в котором процесс затирания завершают в пределах 160 мин.

10. Способ по п.1, в котором -амилазная активность обеспечивается -амилазой, обладающей по меньшей мере 50%-ной идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

11. Способ по п.1, в котором пуллуланазная активность обеспечивается пуллуланазой, обладающей по меньшей мере 50%-ной идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8.

12. Способ по п.1, в котором пуллуланаза является термостабильной и обладает относительной ферментативной активностью более 60% в течение периода 30 мин при 65°С и при уровне рН 5.

13. Способ по п.1, в котором протеазная активность обеспечивается системой протеолитических ферментов, включающей эндопротеазы, экзопептидазы или любую их комбинацию.

14. Способ по п.1, в котором протеазная активность обеспечивается протеазой, обладающей по меньшей мере 50%-ной идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3.

15. Способ по п.1, в котором липазная активность обеспечивается липазой из Fusarium, Aspergillus или Rhizopus.

16. Пивное сусло, полученное способом по любому из пп.1-15, содержащее одну или несколько аминокислот, выбранных из а. пролина в концентрации менее 2 мМ, b. серина в концентрации более 0,1 мМ и c. метионина в концентрации более 0,05 мМ.

17. Сусло по п.16, в котором концентрация мальтозы составляет более 40% общего содержания углеводов.

18. Сусло по п.16 или 17, в котором концентрация глюкозы составляет менее 10%.

19. Сусло по п.16, в котором общая концентрация глюкозы, мальтозы и мальтотриозы составляет более 60%.

Описание изобретения к патенту

Ссылка на список последовательностей

Эта заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Содержание машиночитаемой формы приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к способу получения пивного сусла, включающему ферментативную обработку крупки, содержащей до 100% несоложеной (зерновой) формы, а также относится к суслу, получаемому этим способом.

Изобретение также касается применения указанного сусла для дальнейшей переработки в высококачественные напитки и относится к способу получения высококачественного пива или пивного продукта, а также к высококачественному пиву, полученному согласно этому способу. Изобретение также относится к ферментным смесям.

Уровень техники

Затирание представляет собой способ превращения крахмала из размолотого ячменного солода и добавок в ферментируемые и неферментируемые сахара для получения сусла желательного состава. Общепринятое затирание включает смешивание размолотого ячменного солода и добавок с водой при установленных температуре и объеме для продолжения биохимических изменений, начатых во время процесса соложения. Процесс затирания проводят в течение периода времени при различных температурах, чтобы активировать эндогенные ферменты, ответственные за деградацию белков и углеводов. После процесса затирания затор фильтруют для получения сусла для ферментации до пива. Традиционно пиво варят из соложеного ячменя, хмеля, дрожжей и воды. Соложение злаков, таких как ячмень, активирует эндогенные ферменты, необходимые для деградации крахмала. Однако процесс соложения требует много энергии и времени и, таким образом, является достаточно дорогостоящим. Таким образом, одним способом является замена части солода легко доступными добавками, такими как рафинированный крахмал или легко ферментируемые углеводы, и/или заменой несоложеными злаками, такими как ячмень, кукуруза, рис, сорго и пшеница. Однако в несоложеных злаках отсутствуют эндогенные ферменты, что может приводить к неполному осахариванию, увеличенной вязкости затора/сусла, трудностям с процеживанием, плохой способности к ферментации, трудностям с фильтрацией пива, коллоидальной неустойчивости и плохому вкусу. Экзогенные ферменты, такие как альфа-амилаза и -глюканаза, ранее добавляли для компенсации отсутствующих ферментов солода. В следующих публикациях по уровню техники описана замена части соложеных злаков несоложеными злаками и экзогенно добавленными ферментами.

В ZA 9803237 описан способ получения пива посредством ферментации сусла, полученного из частично несоложеного ячменя и ферментной смеси из альфа-амилазы, -глюканазы и протеазы. В Wieg et.al. Process Biochemistry, 1970, описан также способ пивоварения со смесью соложеного и несоложеного ячменя и ферментной смесью из альфа-амилазы, -глюканазы и протеазы. Кроме того, в WO04/011591 описан способ получения сусла добавлением протеазы и целлюлазы к затору из соложеного и несоложеного ячменя. Описание пивоварения из ячменя приведено в Wieg et.al. Brewing science, 1987.

Другой способ получения сусла известен из производства японского пива Хаппошу. В Японии налоги на содержащие солод спиртные напитки являются относительно высокими, и поэтому вид пива Хаппошу варят всего лишь с 25% соложеного ячменя. Обычно затор, полученный с настолько малым содержанием солода, является невозможным фильтровать для получения сусла, так как затор слишком густой для фильтрования. Существует только немного доступных технических описаний относительно состава затора Хаппошу. Однако известно, что необходимо добавлять экзогенные ферменты к затору, чтобы получить способность к фильтрованию, например протеазы, -глюканазы и амилазы. Виды пива Хаппошу обладают отличающимися вкусовыми характеристиками, даже по сравнению с традиционными видами пива более простого лагерного типа. В JP 2004173533 описано получение такого пива с использованием прессованного ячменя и меньшего количества солода. Различные ферменты используют для облегчения, например осахаривания.

Виды сусла, полученные в ссылках на уровень техники, основаны на крупке, содержащей значительное количество солода. Состав ферментов в необработанных злаках по существу отличается от соложеных злаков, и эндогенные, и экзогенные ферменты, вовлеченные в деградацию крахмала, действуют совместно комплексным образом во время затирания, и, как правило, принимают, что некоторое количество солода должно присутствовать в крупке. Таким образом, даже с экзогенно добавленными ферментами еще существуют некоторые из вышеупомянутых проблем, например со способностью к фильтрованию, способностью к ферментации и мутностью видов сусла на основе несоложеных злаков. Следовательно, предпринимали очень мало попыток заменить большее количество или все соложеные злаки несоложеными злаками.

Одним примером является Goode et.al., где описано получение сусла из субстрата 100% сырьевого ячменя и ферментной смеси из двух различных альфа-амилаз и бета-глюканазы. Альфа-амилаза оказывает положительный эффект на разделение затора, но скорость фильтрации падает, когда присутствуют большие количества несоложеного ячменя. В US 3081172 также предложено получение сусла из несоложеного сырьевого материала, однако ничего не указано относительно FAN (свободного аминного азота), количества ферментируемых сахаров и других критических параметров полученного сусла.

Следовательно, такие проблемы, как низкая способность к ферментации, неоптимальный аминокислотный состав и высокая вязкость и мутность сусла, не разрешены, и эти препятствия проявляют тенденцию увеличиваться с увеличением количеств несоложеных злаков.

Другими недостатками пивоварения на уровне техники с несоложеными злаками является то, что может потребоваться продолжительное время затирания, чтобы экзогенные и эндогенные ферменты в заторе образовывали сусло, сравнимое, например, по отношению к способности к ферментации, с суслом, полученным из соложеных злаков. Продолжительное время затирания явно является неэкономичным и может нейтрализовать экономические преимущества замены соложеных злаков на несоложеные.

Таким образом, до настоящего времени ни одна ферментная смесь не компенсирует полностью ферменты солода, так чтобы при ее добавлении крупку, основанную на соложеных злаках, можно было полностью заменить на до 100% несоложеные злаки.

Таким образом, даже несмотря на то, что попытки получения сусла из ячменя предпринимали с поздних 1960, не разработано ни одного эффективного способа варки пива на основе сырьевого материала с большим количеством несоложеных злаков.

С учетом желания снизить расходы, связанные с соложением злаков, а также получить сусло, пригодное для производства пива, сравнимого по вкусовым характеристикам с традиционными видами пива, существует потребность в создании способа получения затора на основе, вплоть до 100%, несоложеных злаков. Способ должен являться легко адаптируемым к системам пивоварения, используемым в пивоварении, основанном на соложеном сырьевом материале. Таким образом, затор должен поддаваться фильтрации и, кроме того, другие параметры, такие как аминокислотный состав и количество ферментируемых сахаров, должно являться сравнимым с затором на основе соответствующих соложеных злаков, даже если злак(и) представляет/представляют собой 100% несоложеные злак(и). Наконец, время затирания должно являться сравнимым со временем затирания соложеного сырьевого материала, в то время как еще сохраняются хорошие характеристики, например состав сахаров затора и пивного продукта.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа получения сусла из крупки, содержащей более 70%, и даже до 100% несоложеных злаков.

Существо изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что добавлением подходящей смеси экзогенных ферментов к затору и термической активацией/инактивацией эндогенных ферментов в настоящее время можно получать сусло на основе до 100% несоложеных злаков, таких как ячмень.

Способ получения пивного сусла, включающий:

a. получение затора затиранием крупки, из которой по меньшей мере 70 вес.% представляет собой несоложеный злак(и), содержащий -амилазную активность, и из которой менее 30 вес.% представляет собой соложеный злак(и), при температуре, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная -амилаза являются активными;

b. контактирование затора с экзогенными ферментами, содержащими:

i. -амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность, и

iv. -глюканазную активность;

c. отзаторивание и фильтрование затора для получения сусла.

В предпочтительном варианте выполнения несоложеный злак(и) происходят из трибы Triticeae, например ячмень, спельта, пшеница, рожь.

В другом варианте выполнения несоложеный злак(злаки) может быть любым несоложеным злаком, в качестве неограничивающего примера, таким как ячмень, спельта, пшеница, рожь, кукуруза, овес или рис или любая их смесь. В варианте выполнения крупка может содержать смесь несоложеных злаков, в качестве неограничивающих примеров, такую как смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы, смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя.

В одном варианте выполнения изобретение относится к способу, в котором крупка дополнительно содержит другие источники углевода, такие как пивные сиропы или любую их смесь.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b. дополнительно содержат ксиланазную активность, липазную активность и/или фитазную активность.

В предпочтительном варианте выполнения температура затирания находится в диапазоне, оптимизирующем -амилазную активность и уменьшающем липоксигеназную активность.

Предпочтительный вариант выполнения изобретения относится к способу, где пуллуланаза является термостабильной, обладающей относительной ферментативной активностью более 60% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

В следующем аспекте изобретение относится к суслу, полученному способом по изобретению. Кроме того, изобретение относится к применению сусла для получения видов пива любого типа, например светлого и темного лагерных типов, светлого и темного типов эля, видов пшеничного пива, всех видов портера, стаута, концентрированных замораживанием (например, айсбок), типов ячменного вина или хаппошу.

В следующем аспекте сусло по изобретению содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из

a. пролина в концентрации менее 2 мМ, предпочтительно менее 1 мМ и наиболее предпочтительно менее 0,5 мМ в сусле;

b. серина в концентрации более 0,1 мМ, предпочтительно более 0,125 мМ и наиболее предпочтительно более 0,15 мМ; и

c. метионина в концентрации более 0,05 мМ, предпочтительно более 0,08 мМ и наиболее предпочтительно более 0,10 мМ.

Изобретение также относится к ферментной смеси, содержащей:

i. -амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность, где пуллуланаза является термостабильной,

iii. протеолитическую активность и

iv. -глюканазную активность.

Конкретный вариант ферментной смеси содержит:

i. -амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность,

iv. -глюканазную активность и

v. ксиланазную активность.

В другом варианте ферментная смесь дополнительно содержит липазную активность.

Фигуры:

На фиг.1 показана мутность (NTU) сусла, полученного из увеличивающегося количества ячменя при экзогенном добавлении только Ultraflo Max.

На фиг.2 показана способность к ферментации сусла, полученного из 100% несоложеного ячменя или 100% соложеного ячменя.

Определения:

В данном описании использованы различные термины, обычно понятные специалистам в данной области. Однако некоторые термины используются со специфическими значениями, и они означают следующее, как определено ниже.

Термин «соложение» представляет собой процесс, посредством которого зерна заставляют прорастать и затем высушивают.

Термин «соложеное зерно» означает любое зерно злаков, в частности ячменя, которое подвергали процессу соложения.

Термин «несоложеное зерно» означает любое зерно злаков, в частности ячменя, которое не подвергали процессу соложения.

Термин «крупка» означает крахмалосодержащий или сахаросодержащий материал, который является основой для получения пива. Он может содержать соложеные и несоложеные злаки, а также добавки.

Термин «злаки» означает виды зерна, которые представляют собой любой крахмалосодержащий материал, используемый в качестве сырьевого материала, например, для получения пива, такие как, в качестве неограничивающих примеров, ячмень, пшеница, сорго, маис, рис, овес и рожь. Злаки могут быть соложеными или несоложеными.

Термин «добавки» означают сырьевой материал, который добавляют к главному ингредиенту крупки, который традиционно представляет собой соложеные злаки. Таким образом, поскольку виды несоложеного зерна обычно составляют только малую часть крупки, несоложеные злаки обычно определяют как добавку вместе с жидкими углеводами, такими как сахара и сиропы. Добавки могут являться либо твердыми, либо жидкими, либо и такими, и другими, где твердая часть может представлять собой несоложеные злаки, такие как ячмень, кукуруза и рис, в то время как жидкая часть может представлять собой легко ферментируемые углеводы, такие как сахар и сиропы.

Однако в этом контексте то, что можно рассматривать как добавку, может представлять собой главный ингредиент. Таким образом, несоложеные злаки, которые в традиционном контексте представляют собой добавку, могут в соответствии с настоящим изобретением составлять 100% сырьевого материала.

Соответственно несоложеные злаки обычно включены в термин добавка, однако, поскольку несоложеные злаки предпочтительно составляют более 70% сырьевого материала, а соложеные злаки предпочтительно составляют менее 30% сырьевого материала, термины в этом контексте наиболее просто понимать как:

Крупка может содержать соложеные и несоложеные злаки и добавки. Добавки в этом контексте понимают как часть крупки, которая представляет собой несоложеный или несоложеный злак. Таким образом, добавки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой жидкую часть, такую как пивоваренные сиропы и сахара.

В то время как несоложеные злаки представляют собой любой несоложеный злак, содержащий зерновой крахмал, такой как, в качестве неограничивающих примеров, ячмень, кукуруза, рис, рожь, виды овса, сорго и пшеница. Соответственно крупка из 100% несоложеного зерна может содержать несоложеный ячмень и другие, не относящиеся к ячменю несоложеные злаки, такие как рис и пшеница.

В другом варианте выполнения изобретения крупка содержит смесь несоложеных злаков, такую как, в качестве неограничивающих примеров, смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы, смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя. Таким образом, крупка может содержать 50% несоложеного ячменя и 50% несоложеных других злаков, таких как пшеница и рис.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения несоложеный злак(и) составляет более 70% крупки, и соложеные злаки составляют менее 30% крупки.

Термин «затор» понимают как содержащую крахмал суспензию, содержащую измельченный ячменный солод, другой содержащий крахмал материал или их комбинации, погружаемые в воду для получения сусла.

Термин «процесс затирания» или профиль затирания, или просто затирание понимают как процесс объединения зерна с водой и нагревания смеси с перерывами при конкретных температурах, чтобы позволить ферментам в заторе расщепление крахмала в зерне на сахара для получения сусла.

«Отзаторивание» или отделение затора происходит, когда температура затора поднимается. Это высвобождает до приблизительно на 2% больше крахмала и делает затор менее вязким.

Термин «сусло» понимают как неферментированный жидкий слив после экстракции крупки во время затирания. Термины сусло для пивоварения и сусло используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

Термин «пивная дробина» понимают как высушенные твердые вещества, оставшиеся после экстракции крупки и отделения сусла.

Термин «пиво» в настоящем документе понимают как ферментированное сусло.

Термин «пивной продукт» в настоящем документе понимают как включающий «затор», «сусло», «пивную дробину» и «пиво».

Термин «DP1» обозначает глюкозу.

Термин «DP2» обозначает мальтозу.

Термин «DP3» обозначает мальтотриозу.

Термины «DP4+» или «DP4/4+» обозначают декстрин, или мальтоолигосахариды степени полимеризации 4 или выше.

Термин «Fru» обозначает фруктозу.

Термин «RDF» обозначает истинную степень ферментации.

Термин «FAN» обозначает свободный аминный азот.

Термин «Плато» (°P) обозначает грамм экстракта на 100 г сусла (грамм экстракта/100 г сусла).

Подробное описание изобретения

Посредством добавления комбинации экзогенных ферментов, например -амилазы, изоамилазы/пуллуланазы, с активностью образования FAN (протеазы) и с активностью усиления способности к фильтрации (бета-глюканазы и/или ксиланазы), к затору и посредством одновременной термической активации образующей мальтозу эндогенной -амилазы можно получать сусло на основе до 100% несоложеного злака(злаков).

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу получения пивного сусла, включающему:

a. получение затора затиранием крупки, из которой по меньшей мере 70 вес.% представляет собой несоложеный злак(и), содержащий -амилазную активность, и из которой менее 30 вес.% представляет собой соложеный злак(и), при температуре, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная -амилаза являются активными;

b. контактирование затора с экзогенными ферментами, содержащими:

i. -амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность и

iv. -глюканазную активность;

c. отзаторивание и фильтрация затора для получения сусла.

В предпочтительном аспекте изобретение относится к способу, где крупка содержит по меньшей мере 70 вес.% несоложеного злак(а), например, по меньшей мере 75 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 80 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 85 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 86 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 87 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 88 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 89 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 90 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 91 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 92 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 93 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 94 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 95 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 96 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 97 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 98 вес.%, еще предпочтительнее 99 вес.% и наиболее предпочтительно 100 вес.% несоложеного злака(злаков).

Следует понимать, что по меньшей мере 70 вес.% несоложеного злака(злаков) может представлять собой один или несколько злак(злаков), где по меньшей мере один из злака(злаков) содержит -амилазную активность.

В одном аспекте изобретения крупка содержит менее 30 вес.% соложеных злаков, более предпочтительно менее 25 вес.%, более предпочтительно менее 20 вес.%, более предпочтительно менее 15 вес.%, более предпочтительно менее 10 вес.%, более предпочтительно менее 5 вес.% и еще предпочтительнее менее 3 вес.%, и наиболее предпочтительно крупка содержит 0 вес.% соложеных злаков.

В предпочтительном варианте выполнения несоложеный злак(и) происходят из трибы Triticeae. Предпочтительными среди этой трибы являются ячмень, спельта, пшеница и рожь. Triticeae представляет собой трибу внутри подсемейства злаковых Pooideae, которое включает роды со многими одомашненными видами, EA Kellogg, R Appels, RJ Mason-Gamer - SYSTEMATIC BOTANY, 1996. Роды основных культур обнаружены в этой трибе, включая пшеницу, ячмень и рожь. В другом предпочтительном варианте выполнения крупка содержит несоложеные злаки, отличные от злаков из трибы Triticeae, такие как, в качестве неограничивающих примеров, рис, кукуруза, овес, сорго.

В другом предпочтительном варианте выполнения несоложеные злак(и) выбраны из группы, содержащей ячмень, спельту, пшеницу, рожь, кукурузу, овес или рис, или любую их смесь.

Таким образом в одном варианте выполнения изобретение относится к способу, где крупка дополнительно содержит один или несколько несоложеный злак(ов), таких как кукурузная крупка, кукурузный крахмал и рис. Крупка, таким образом, может содержать смесь несоложеных злаков, такую как, в качестве неограничивающих примеров, смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы или смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения несоложеный злак представляет собой ячмень.

В другом аспекте крупка дополнительно содержит 0-50 вес.% других источников углевода, таких как сиропы для пивоварения или любые их смеси.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат ксиланазную активность, предпочтительно семейства GH10 (гликозил-гидролаза семейства 10), которая может улучшать фильтрование сусла и пива.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат липазную активность, которая может улучшать фильтрование сусла и уменьшать мутность.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат фитазную активность.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат одну или несколько из следующих видов активности; ксиланазная активность, липазная активность и/или фитазная активность.

В предпочтительном варианте выполнения температура затирания, т.е. температура, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная -амилаза являются активными, находится в диапазоне, оптимизирующем активность каждого из различных ферментов на каждой стадии нагревания. Процесс затирания предпочтительно проводят в три стадии, где каждая оптимизирована для различных ферментов. Эти стадии можно обозначать как выдержки с ферментами или ферментативные стадии.

Таким образом, определенный вариант выполнения изобретения относится к температурному профилю процесса затирания для получения сусла для пивоварения, где

Первую стадию проводят между 50 и 58°C,

Вторую стадию проводят между 60 и 65°C, и

Третью стадию проводят между 70 и 80°C.

Различные ферменты в процессе затирания, как экзогенные, так и эндогенные, имеют различный температурный оптимум, и процесс затирания можно проводить при различных температурах в течение конкретного периода времени, чтобы позволить ферментам прореагировать. Эти периоды часто обозначают как выдержки с ферментами.

На первой стадии, которую можно назвать протеолитической стадией, температура предпочтительно находится в диапазоне оптимизации, например, для протеолитического фермента, температура предпочтительно составляет между 45°C и 58°C, например предпочтительно между 46°C и 57°C, например предпочтительно между 47°C и 56°C, например предпочтительно между 48°C и 55°C, например предпочтительно между 49°C и 54°C, например предпочтительно между 50°C и 54°C, например предпочтительно между 51°C и 54°C, например предпочтительно между 52°C и 54°C, наиболее предпочтительно между 53°C и 54°C, например 54°C.

На второй стадии температура предпочтительно находится в диапазоне оптимизации, например, для превращающих крахмал ферментов, таких как -амилаза и пуллуланаза. Эту стадию часто обозначают как стадию осахаривания, и температура предпочтительно составляет между 60°C и 72°C, например предпочтительно между 60°C и 70°C, например предпочтительно между 62°C и 68°C, например предпочтительно между 63°C и 67°C, например предпочтительно между 64°C и 66°C и наиболее предпочтительно между 64°C и 65°C, например 64°C.

На третьей стадии, которую можно также обозначать, как отзаторивание или отделение затора, высвобождается до около 2% более крахмала, что делает затор менее вязким, позволяя процеживанию протекать быстрее. Температура отделения затора составляет предпочтительно между 72°C и 82°C, например предпочтительно между 73°C и 81°C, например предпочтительно между 74°C и 80°C, например предпочтительно между 75°C и 79°C, например предпочтительно между 76°C и 78°C, наиболее предпочтительно температура составляет между 78-80°C, например 80°C.

Известно, что эндогенная липоксигеназа является источником неприятного привкуса, и в предпочтительном варианте выполнения температура затирания на первой стадии затирания, указанной выше, находится в диапазоне, уменьшающем активность липоксигеназы по меньшей мере на 50%, предпочтительно на 55%, предпочтительно на 60%, предпочтительно на 65%, предпочтительно на 70%, предпочтительно на 75%, предпочтительно на 80%, предпочтительно на 85%, наиболее предпочтительно на 90% относительно активности при затирании при 54°C.

Кроме того, изобретение относится к ферментной смеси, содержащей:

i. -амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность, где пуллуланаза является термостабильной,

iii. протеолитическую активность и

iv. -глюканазную активность;

или в другом варианте выполнения изобретение относится к ферментной смеси, содержащей:

v. -амилазную активность,

vi. пуллуланазную активность,

vii. протеолитическую активность,

viii. -глюканазную активность и

ix. ксиланазную активность.

Ферментные смеси могут дополнительно содержать липазную активность.

Термины ферментная смесь и смесь ферментов используются взаимозаменяемо в тексте описания настоящей заявки. Эти термины следует понимать как смесь или комбинацию различных ферментов или видов ферментативной активности. Ферменты можно добавлять в такую смесь или комбинацию по отдельности или одновременно. Ферменты, если их не добавляют вместе, можно добавлять в любом порядке, и не обязательно добавлять их в порядке, перечисленном выше.

Ферменты по изобретению можно добавлять в любое время при затирании или перед затиранием. Таким образом, ферменты можно добавлять к ингредиентам затора, например к воде и/или крупке до, во время или после формирования затора. Ферменты можно добавлять вместе или по отдельности.

В предпочтительном аспекте -амилазная активность обеспечивается -амилазой, происходящей из грибов, например из Aspergillus niger, или происходящей из бактерий, например Bacillus . Таким образом, -амилаза может представлять собой вариант бактериальной -амилазы, обладающий увеличенной термостабильностью при кислом pH и/или низкой концентрации Ca²⁺. Предпочтительно, -амилазная активность в заторе составляет 0,1-1,0 KNU(S)/г, более предпочтительно 0,2-0,4 KNU(S)/г и наиболее предпочтительно 0,25-0,35 KNU(S)/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно -амилаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 91%, предпочтительно по меньшей мере 92%, предпочтительно по меньшей мере 93%, предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 96%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (вариант -амилазы B. stearothermophilus с мутациями I181 ^* G182^* N193F, описанный в WO99/19467 и доступный как Termamyl® SC из Novozymes A/S).

В предпочтительном варианте выполнения изобретения деветвящую крахмал активность обеспечивает пуллуланаза. В другом варианте выполнения изобретения деветвящую активность обеспечивают другие деветвящие ферменты, такие как, в качестве неограничивающих примеров, изоамилаза или предельная декстриназа. В конкретном варианте выполнения изобретения деветвящую активность обеспечивает смесь деветвящих ферментов, таких как, в качестве неограничивающих примеров, пуллуланаза и изоамилаза.

Таким образом, в предпочтительном варианте выполнения изобретения ферментативная пуллуланазная активность (E.C. 3.2.1.41) обеспечивается экзогенно, и она присутствует в заторе. Пуллуланазу можно добавлять к ингредиентам затора, например к воде и/или крупке, до, во время или после формирования затора.

Пуллуланазы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой пуллуланазу, например, из Pyrococcus или Bacillus, такого как Bacillus acidopullulyticus, например, описанную в FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, или пуллуланазу, доступную из Novozymes как Промозим 400L и имеющую последовательность SEQ ID NO:2. Пуллуланаза может происходить также из Bacillus naganoencis или Bacillus deramificans, например, такая как получена из Bacillus deramificans (патент США 5736375), и иметь последовательность SEQ ID NO:7. Пуллуланазы могут также представлять собой модифицированные пуллуланазы, например, из штамма Bacillus .

Другие пуллуланазы можно получать из Pyrococcus woesei, описанного в PCT/DK91/00219, или пуллуланазу можно получать из Fervidobacterium sp. Ven 5, описанного в PCT/DK92/00079, или пуллуланазу можно получать из Thermococcus celer, описанного в PCT/DK95/00097, или пуллуланазу можно получать из Pyrodictium abyssei, описанного в PCT/DK95/00211, или пуллуланазу можно получать из Fervidobacterium pennavorans , описанного в PCT/DK95/00095, или пуллуланазу можно получать из Desulforococcus mucosus, описанного в PCT/DK95/00098.

Наиболее предпочтительно пуллуланаза получена из Bacillus acidopullulyticus. Предпочтительный фермент пуллуланаза для применения в способах и/или композициях по изобретению представляет собой пуллуланазу, обладающую аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 55%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 65%, например по меньшей мере на 66%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 85%, например по меньшей мере на 86%, например по меньшей мере на 87%, например по меньшей мере на 88%, например по меньшей мере на 89%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 91%, например по меньшей мере на 92%, например по меньшей мере на 93%, например по меньшей мере на 94%, например по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 97%, например по меньшей мере на 98%, например по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:8 (NS26062, PulC, из Bacillus acidopullulyticus); в частности, при выравнивании с использованием программного обеспечения Needle с использованием матрицы: BLOSUM62; штраф за открытие делеции 10,0; штраф за расширение делеции 0,5; матрицы идентичности без делеций. Термины PulC, NS26062 и пуллуланаза C используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

Пуллуланазу добавляют в дозе 0,1-3 PUN/г сухого вещества, например 0,2-2,9, например 0,3-2,8, например 0,3-2,7, например 0,3-2,6, например 0,3-2,5, например 0,3-2,4, например 0,3-2,3, например 0,3-2,2, например 0,3-2,1, например 0,3-2,0, например 0,3-1,9, например 0,3-1,8, например 0,3-1,7, например 0,3-1,6, наиболее предпочтительно пуллуланазу добавляют в дозе, например, 0,3-1,5, предпочтительно 0,4-1,4, более предпочтительно 0,5-1,3, более предпочтительно 0,6-1,2, более предпочтительно 0,7-1,1, более предпочтительно 0,8-1,0, более предпочтительно 0,9-1,0. В конкретном варианте выполнения изобретения добавляют 0,3 PUN/г сухого вещества фермента, например 0,4 PUN/г сухого вещества, например 0,5 PUN/г сухого вещества; в особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения доза ферментов не превышает 1 PUN/г сухого вещества. Предпочтительно изоамилазная или/и пуллуланазная активность в заторе составляет 0,1-2,0 PUN/г, более предпочтительно 0,5-1,0 PUN/г сухой массы злака(злаков).

Относительная деветвящая ферментативная активность, такая как пуллуланазная активность, может значительно меняться при различных температурах, например, как показано в примере 2 заявки. Деветвящие ферменты действуют вместе с другими ферментами в заторе, в частности -амилазой, которая обычно является эндогенной, и -амилазой, которая может являться эндогенной или экзогенно добавленной. Таким образом, предпочтительный деветвящий фермент по изобретению представляет собой фермент, обладающий высокой относительной ферментативной активностью в диапазоне температур, в котором как -амилаза, так и -амилаза являются активными. -Амилаза обычно является активной при более высокой температуре, чем -амилаза, и стадию осахаривания процесса затирания, стадию, где крахмал превращают в ферментируемые сахара посредством -амилазы, -амилазы и деветвящего фермента, предпочтительно проводят при высокой температуре, такой как по меньшей мере 63°С. Таким образом, деветвящий фермент по изобретению предпочтительно является термостабильным и термоактивным. Термины термостабильный и термоактивный используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

В этом контексте термостабильный фермент представляет собой фермент, обладающий относительной ферментативной активностью выше 60%, измеренной в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

Относительную активность, которая в этом контексте представляет собой относительную ферментативную активность, рассчитывают, устанавливая наивысшую активность на 100% (максимум) и устанавливая активности при других температурах относительно температурного максимума.

Таким образом, предпочтительно деветвящий фермент представляет собой пуллуланазу, и еще предпочтительнее пуллуланазная активность обеспечивается пуллуланазой, которая является термостабильной и обладает относительной ферментативной активностью более 60% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5. Пример термостабильной пуллуланазы приведен в примере 2.

В одном варианте выполнения относительная ферментативная пуллуланазная активность составляет более 60%, например более 61%, например более 62%, например более 63%, например более 64%, например более 65%, например более 66%, например более 67%, например более 68%, например более 69%, например более 70%, например более 71%, например более 72%, например более 73%, например более 74%, например более 75%, например более 76%, например более 77%, например более 78%, например более 79%, например более 80%, например более 81%, например более 82%, например более 83%, например более 84%, например более 85%, например более 86%, например более 87%, например более 88%, например более 89%, например более 90%, например более 91%, например более 92%, например более 93%, например более 94%, например более 95%, например более 96%, например более 97%, например более 98%, например более 99% и даже 100% при 65°C, при измерении в течение периода 30 минут, при pH 5,0.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения термостабильная пуллуланаза обладает относительной ферментативной активностью более 80% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

В конкретном варианте выполнения пуллуланаза обладает более 80%, например более 85%, например более 90%, например более 95%, или даже 100% остаточной ферментативной активности в течение периода 30 мин при условиях затирания с 12 °P ячменя, при температуре желатинизации несоложеного ячменя и при pH в диапазоне 5,6-6,2, по сравнению с активностью до инкубации при температуре желатинизации несоложеного ячменя.

В другом варианте выполнения протеазная активность обеспечивается системой протеолитических ферментов, обладающих подходящей FAN-генерирующей активностью, включая эндопротеазы, экзопептидазы или любую их комбинацию, предпочтительно металлопротеазу. Предпочтительно протеазная активность в заторе составляет 0,0005-0,002 AU/г, более предпочтительно 0,001-0,0015 AU/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно протеаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 (металлопротеаза из Bacillus amyloliquefaciens, описанная в WO9967370, доступна как Neutrase® из Novozymes A/S).

В следующем варианте выполнения в затор добавляют -глюканазную активность (E.C 3.2.1.4.). Предпочтительно -глюканазная активность в заторе составляет 0,1-1,5 FBG/г, например 0,2-1,2 FBG/г, например 0,4-1,0 FBG/г, например 0,5-1,0 FBG/г сухой массы злака(злаков). -Глюканазу называют также целлюлазой, и она может происходить из грибов или бактерий. Например, из Aspergillus orzyae , Aspergillus niger или из bacillus, такого как B subtilis. Добавленная -глюканазная активность может также происходить из солода. В одном особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения -глюканазу добавляют вместе с ксиланазой в ферментную смесь, названную Ultraflo Max. Ultraflo Max представляет собой комбинацию ферментов ксиланазы и -глюканазы, смесь описана в заявке WO2005/059084 A1.

В другом варианте выполнения ксиланазная активность обеспечивается ксиланазой из семейства гликозил-гидролаз (GH10). Предпочтительно ксиланазная активность в заторе составляет 0,02-0,1 FXU-S/г, более предпочтительно 0,04-0,08 FXU-S/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно ксиланаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4 (описана в WO 94/21785, доступна как Shearzyme® из Novozymes A/S).

В другом варианте выполнения липазная активность обеспечивается липазой, обладающей активностью по отношению к триглицеридам и/или галактолипидам, и/или фосфолипидам. Предпочтительно липазная активность обеспечивается липазой из Fusarium (включая F. oxysporum и F. heterosporum), Aspergillus (включая A. tubigensis ), Rhizopus (включая R. oryzae) или Thermomyces (включая T. lanuginosus) или вариант этого. Пример представляет собой Липопан X (Липопан Xtra), вариант липазы

Thermomyces lanuginosus с заменами

G91A +D96W +E99K +P256V +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270A

+271G +272G +273F (+274S), описанный в WO2004/099400 A2. Предпочтительно липаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с остатками 1-316 или 1-273 аминокислотной последовательности, показанной на SEQ ID NO:5 (липаза/фосфолипаза из Fusarium oxysporum, описанная в EP 869167, доступна из Novozymes A/S как Lipopan® F). Предпочтительно липазная активность в заторе составляет 0-50 LU/г, например 0-40 LU/г, например 0-30 LU/г, например 0-20 LU/г сухой массы злака(злаков). В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения липаза представляет собой Липозим TL или липолазу, эта липаза оказывает значительный хороший эффект на скорость фильтрации и уменьшение мутности. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения липаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9. Липаза может также представлять собой Липекс, вариант Липозима, обладающий по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью, показанной на SEQ ID NO:10. Липазы деградируют липид ячменя, например триглицерид, на частичные глицериды и свободные жирные кислоты. Это приводит к более низкой мутности и намного улучшенным свойствам фильтрации и процеживания затора.

В другом варианте выполнения фитазная активность обеспечивается фитазой из Aspergillus niger, Peniophora или Citrobacter. Предпочтительно фитазная активность в заторе составляет 0-5 FYT/г, более предпочтительно 0,5-1,5 FYT/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно фитаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% или даже 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6 (вариант фитазы Peniophora lycii, описанный в WO 2003/066847).

В одном варианте выполнения изобретения добавляют Флавозим. Флавозим представляет собой композицию ферментов, полученную из штамма NN000562 A. oryzae, депонированного в ATCC под номером 20386. ФЛАВОЗИМ обладает щелочной и кислой протеазной активностью.

В следующем аспекте изобретение относится к суслу, полученному способом по изобретению.

Более того, изобретение относится к применению сусла для получения видов пива любого типа, например светлого и темного лагерного типов, светлого и темного типов эля, видов пшеничного пива, всех видов портера, стаута, концентрированных замораживанием (например, айсбок), типов ячменного вина или хаппошу.

Содержащие азот компоненты являются важными компонентами сусла, поскольку они влияют на характеристики пива, такие как вкус и характер ферментации. Содержащие азот соединения являются важными питательными веществами для дрожжей, за исключением пролина, который дрожжи тяжело усваивают, таким образом, является благоприятным малое количество пролина или отсутствие пролина в сусле. Таким образом, в следующем аспекте сусло содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из

a. пролина в концентрации менее 2 мМ, предпочтительно менее 1 мМ и наиболее предпочтительно менее 0,5 мМ в сусле;

b. серина в концентрации более 0,1 мМ, предпочтительно более 0,125 мМ и наиболее предпочтительно более 0-15 мМ и

c. метионина в концентрации более 0,05 мМ, предпочтительно более 0,08 мМ и наиболее предпочтительно более 0,10 мМ.

Таким образом в одном аспекте концентрация пролина составляет менее 2 мМ, например менее 1,5 мМ, например менее 1 мМ, например менее 0,5 мМ, например менее 0,25 мМ.

В другом аспекте концентрация серина составляет более 0,1 мМ, например 0,125 мМ, например 0,15 мМ, например 0,2 мМ.

В другом аспекте концентрация метионина составляет более 0,005 мМ, например 0,008 мМ, например 0,1 мМ, например 0,125 мМ, например 0,15 мМ.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что даже с очень большими количествами, например более 80% несоложеных злаков, таких как несоложеный ячмень, можно получить сусло с большим количеством ферментируемых сахаров, которые в этом контексте представляют собой DP1-DP3 (глюкоза, мальтоза и мальтотриоза), и в особенно предпочтительном аспекте по изобретению количество мальтозы является высоким по сравнению с количеством глюкозы, что является благоприятным, поскольку предотвращает осмотическое давление на дрожжи и регулирует образование сложных эфиров, и таким образом, профиль вкуса и аромата конечного пива.

Таким образом, один аспект изобретения относится к суслу, где концентрация мальтозы составляет более 45%, предпочтительно более 50%, предпочтительно более 55%, предпочтительно более 56%, предпочтительно более 57%, предпочтительно более 58%, предпочтительно более 59%, предпочтительно более 60%, предпочтительно более 61%, предпочтительно более 62%, предпочтительно более 63%, предпочтительно более 64%, предпочтительно более 65%, наиболее предпочтительно концентрация мальтозы составляет более 70% общей концентрации углеводов.

В другом аспекте изобретение относится к суслу, где концентрация глюкозы составляет менее 10%, предпочтительно менее 9%, предпочтительно менее 8%, предпочтительно менее 7%, предпочтительно менее 6%, предпочтительно менее 5%, наиболее предпочтительно менее 4%.

Другой аспект изобретения относится к суслу по любому из следующих далее пунктов формулы изобретения, где общая концентрация глюкозы, мальтозы и мальтотриозы составляет более 50%, предпочтительно более 55%, предпочтительно более 60%, предпочтительно более 61%, предпочтительно более 62%, предпочтительно более 63%, предпочтительно более 64%, предпочтительно более 65%, предпочтительно более 66%, предпочтительно более 67%, предпочтительно более 68%, предпочтительно более 69%, предпочтительно более 70%, предпочтительно более 71%, предпочтительно более 72%, предпочтительно более 73%, предпочтительно более 74%, предпочтительно более 75%, предпочтительно более 76%, предпочтительно более 77%, предпочтительно более 78%, предпочтительно более 79% и предпочтительно более 80% общей концентрации углеводов.

RDF (истинную степень ферментации) вычисляют как RDF% = 100^*(OE%P - ER%)/OE%P, где OE обозначает начальный экстракт в %P, и ER обозначает действительный экстракт в % P, измеренных денситометром (ссылка Analytica EBC).

Таким образом, в одном аспекте изобретения RDF в сусле составляет более 60%, например по меньшей мере 65%, например по меньшей мере 70%, например по меньшей мере 75%, например по меньшей мере 76%, например по меньшей мере 77%, например по меньшей мере 78%, например по меньшей мере 79%, например по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 81%, например по меньшей мере 82%, например по меньшей мере 83%, например по меньшей мере 84%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 86%, например по меньшей мере 87%, например по меньшей мере 88%, например по меньшей мере 89%, например по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 91%, например по меньшей мере 92%, например по меньшей мере 93%, например по меньшей мере 94%, например по меньшей мере 95%, например по меньшей мере 96%, например по меньшей мере 97%, например по меньшей мере 98%, например по меньшей мере 99%, например по меньшей мере 100%.

На некоторых пивных заводах добавляют сироп для пивоварения, например сироп для пивоварения с высоким содержанием мальтозы, в котел для сусла, что может увеличивать количество ферментируемых сахаров. Однако, хотя сироп для пивоварения можно добавлять, согласно изобретению это не является необходимым для увеличения количества ферментируемых сахаров или RDF.

Другой вариант выполнения изобретения относится к способу, в котором соотношение мальтоза:глюкоза в сусле более 5:1, например более 6:1, например более 7:1, предпочтительно более 8:1, предпочтительно более 9:1, предпочтительно более 10:1, предпочтительно более 11:1; в особенно предпочтительном варианте выполнения соотношение мальтоза:глюкоза в сусле более 12:1.

Во время процесса затирания крахмал деградирует на ферментируемые и не ферментируемые сахара, а белковый материал превращается в свободные аминокислоты, используемые дрожжами. По изобретению сырьевой материал, применяемый для затирания, может составлять до 100% несоложеных злаков, таких как несоложеный ячмень, без уменьшения способности к ферментации сусла или уменьшения количества аминокислот, доступных для дрожжей.

Кроме того, пивоварение с несоложеными злаками может приводить к проблемам со способностью к фильтрации из-за избытка не подвергнувшегося превращению крахмала и -глюкана или ксилана, что также может вызывать мутность пива. Добавление облегчающих фильтрование ферментов, таких как -глюканаза, может увеличивать способность сусла к фильтрации. Однако, когда несоложеный злак составляет основную часть крупки, одной -глюканазы недостаточно для получения способного к фильтрации сусла.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что при добавлении экзогенных ферментов по изобретению, содержащих -амилазную активность, пуллуланазную активность, протеолитическую активность, липазную активность и -глюканазную активность, к затору, полученному из крупки, содержащей по меньшей мере 70% несоложеного злака(злаков), получают сусло, сравнимое или даже лучшее по отношению, например, к FAN, ферментируемым сахарам (DP1-DP3), и которое поддается фильтрации и также имеет приемлемую низкую мутность при сравнении с суслом, полученным из соложеной крупки.

На время в фильтрационном чане, время, которое занимает фильтрация затора в фильтрационном чане, если это происходит в отдельном сосуде, влияет, например, мутность. Таким образом, в конкретном аспекте изобретения сусло поддается фильтрованию и обладает низкой мутностью, и в одном варианте выполнения изобретения мутность составляет ниже 20 NTU (единицы мутности по откалиброванному нефелометру, нефелометрические единицы мутности), например менее 19 NTU, например менее 18 NTU, например менее 17 NTU, например менее 16 NTU, например менее 15 NTU, например менее 14 NTU, например менее 13 NTU, например менее 12 NTU, например менее 11 NTU, например менее 10 NTU.

Одним из способов увеличения количества ферментируемых сахаров является увеличение времени затирания, например, посредством увеличения стадии осахаривания. Однако в другом важном аспекте изобретения время затирания, требуемое для получения высокоферментируемого сусла, не является увеличенным по сравнению со временем затирания для получения в равной степени ферментируемого сусла на основе такого же количества солода.

Это является неожиданным, поскольку обычно более длительное время затирания является необходимым, когда затор основан на большом количестве несоложеных злаков, например 70% ячменя, для получения такой же способности к ферментации и FAN, как у сусла, полученного из соответствующих количеств (70%) солода.

Таким образом, в конкретном варианте выполнения изобретения процесс затирания завершают в пределах 160 минут, предпочтительно в пределах 120 минут.

В одном варианте выполнения изобретения процесс затирания, включающий все выдержки с ферментами и все стадии нагревания, завершают в пределах 180 минут, например в пределах 170 минут, например в пределах 160 минут, например в пределах 155 минут, например в пределах 150 минут, например в пределах 145 минут, например в пределах 140 минут, например в пределах 135 минут, например в пределах 130 минут, например в пределах 125 минут, например в пределах 120 минут, например в пределах 115 минут, например в пределах 110 минут, например в пределах 105 минут, например в пределах 100 минут, например в пределах 95 минут, например в пределах 90 минут, например в пределах 85 минут, например в пределах 80 минут, например в пределах 75 минут, например в пределах 70 минут, например в пределах 65 минут, например в пределах 60 минут.

Когда солод заменяют такими зерновыми культурами, как рис и кукуруза, может потребоваться отварка крупки или затирание с отваркой или дополнительной отваркой, то есть способ, в котором часть зерна кипятят отдельно с термостабильной -амилазой и затем возвращают в затор. Этот способ часто требуется использовать для тех типов зерна, у которых температура желатинизации является более высокой, чем температура желатинизации ячменя, солода и, например, пшеницы. Таким образом, предварительная желатинизация является необходимой, чтобы сделать крахмал доступным для всех необходимых эндогенных и добавленных ферментов. Способ можно использовать также для придания солодового запаха пиву.

Несоложеные злаки, такие как ячмень, показали поведение при размалывании, в основном отличающееся от поведения соложеных злаков; например, ячмень имеет более высокое содержание воды, является немодифицированным и более твердым, чем солод.

Чтобы проводить процесс в фильтрационном чане с солодом и достигать приемлемой производительности (выхода и времени процеживания), необходим конкретный состав крупки, где состав крупки можно измерять гранулометрическим анализом.

На состав крупки, полученной посредством вальцовых мельниц, в основном влияет просвет между парой(парами) вальцов (двухвальцовая мельница = одна пара, четырехвальцовая мельница = две пары). Первая пара всегда обладает более широким просветом, чем вторая пара. Чтобы получить производительность процеживания, сравнимую с крупкой, полученной из солода, авторы изобретения изменяли этот просвет(ы) между вальцами.

Авторы изобретения обнаружили, что четырехвальцовая мельница и шестивальцовая мельница (три пары), которые могут перемалывать с регулируемыми просветами между вальцами, хорошо подходят для перемалывания ячменя в применимую крупку. Это важно, поскольку хорошей производительности процеживания можно достигать только при оптимизированном составе крупки, который отличается от оптимального состава крупки для солода.

Гранулометрический анализ проводили согласно гранулометрическому анализу, описанному в Anger, H.: MEBAK Band Rohstoffe. 1. Auflage Brautechnische Analysenmethoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK.

Таблица 1 Молотый ячмень по сравнению с солодом
	Ячмень	Солод
Сито 1	25%	18%
Сито 2	15%	8%
Сито 3	38%	33%
Сито 4	10%	21%
Сито 5	3%	10%
Дно	9%	11%

Результаты показывают, что для успешной 100% производительности процеживания ячменя более крупная крупка, сосредотачивающаяся больше на ситах 1-3, приводит к хорошей производительности процеживания. Можно видеть также, что ячменная крупка значительно отличается от крупки из солода.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Ферменты

Альфа-амилазная активность (KNU)

Амилолитическую активность можно определять с использованием картофельного крахмала в качестве субстрата. Этот способ основан на расщеплении модифицированного картофельного крахмала ферментом, и реакцию контролируют посредством смешивания образцов раствора крахмал/фермент с раствором иода. Сначала образуется черно-синяя окраска, однако в ходе расщепления крахмала синяя окраска становится слабее и постепенно переходит в рыжевато-бурую, которую сравнивают со стандартом из окрашенного стекла.

Одна килоединица альфа-амилазы Novo (KNU) эквивалентна 1000 NU. Одну KNU определяют как количество фермента, которое в стандартных условиях (т.е. при 37°C ± 0,05; 0,0003 M Ca2+; и pH 5,6) превращает 5,26 г сухого вещества крахмала (Merck Amylum solubile) в декстрины, достаточно малые, чтобы не вызывать цветную реакцию с иодом.

Деветвящая активность (PUN)

Пуллуланазную активность можно определять по отношению к субстрату пуллулану. Пуллулан представляет собой линейный полимер D-глюкозы, состоящий по существу из мальтотриозных единиц, соединенных 1,6-альфа-связями. Эндопуллуланазы гидролизуют 1,6- -связи случайным образом, высвобождая мальтотриозу, 6 ³-альфа-мальтотриозил-мальтотриозу, 6³-альфа-(6 ³-альфа-мальтотриозил-мальтотриозил)мальтотриозу и т.д. Число гидролизованных связей определяют как восстанавливающий углевод с использованием модифицированного способа Сомоджи-Нельсона.

Одна единица пуллуланазы (PUN) представляет собой количество фермента, которое в стандартных условиях (т.е. после 30 минут времени реакции при 40°C и pH 5,0; и с 0,2% пуллулана в качестве субстрата) гидролизует пуллулан, высвобождая восстанавливающий углевод с восстанавливающей способностью, эквивалентной 1 микромолю глюкозы в минуту.

Протеолитическая активность (AU)

Протеолитическую активность можно определять с использованием денатурированного гемоглобина в качестве субстрата. По способу Ансона с гемоглобином для определения протеолитической активности денатурированный гемоглобин расщепляют и нерасщепленный гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой (TCA). Количество растворимого в TCA продукта определяют с использованием фенольного реагента, дающего синюю окраску с тирозином и триптофаном.

Одну единицу Ансона (AU) определяют как количество фермента, которое в стандартных условиях (т.е. 25°C, pH 7,5 и время реакции 10 мин) расщепляет гемоглобин с начальной скоростью, такой, что высвобождается такое количество растворимого в TCA продукта в минуту, которое дает такую же окраску с фенольным реагентом, как один миллиэквивалент тирозина.

-Глюканазная активность (FBG)

Одна единица бета-глюканазы грибов (FBG) представляет собой количество фермента, которое согласно стандартным условиям, описанным ниже, высвобождает восстанавливаемые олигосахариды или восстанавливает углевод с восстанавливающей способностью, эквивалентной 1 моль глюкозы в минуту.

Бета-глюканаза грибов реагирует с бета-глюканом во время процесса формирования до глюкозы или восстанавливающего углевода, которые определяют как восстанавливающий сахар по способу Сомоджи-Нельсона.

Образец следует развести для получения активности 0,02-0,10 FBG/мл. Стандартные условия реакции представляют собой: Субстрат: 0,5% бета-глюкан ячменя, температура: 30°C, pH: 5,0 и время реакции 30 мин.

Однако целлюлитическую активность в коммерческом продукте измеряют как единицы эндоглюканазы (EGU), которые можно перевести в FBG. Для целлюкласта EGU можно переводить в FBG умножением EGU на коэффициент 3,2.

Ксиланаза (FXU(S))

Ксиланолитическую активность можно выражать в FXU(S)-единицах, определяемых при pH 6,0 с помощью ремазол-ксилана (4-O-метил-D-глюкуроно-D-ксилан, окрашенный Ремазолом бриллиантовым синим R, Fluka) в качестве субстрата. Образец ксиланазы инкубируют с субстратом ремазол-ксилан. Фон не деградированного окрашенного субстрата осаждают этанолом. Оставшаяся синяя окраска в супернатанте (как определяют спектрофотометрически при 585 нм) пропорциональна активности ксиланазы, и затем единицы ксиланазы определяют относительно стандарта фермента при стандартных условиях реакции, т.е. концентрация субстрата 0,45 вес.%/об., концентрация фермента 0,04-0,14 FXU(S)/мл при 50,0°C, pH 6,0, и при времени реакции 30 минут. Ксиланазную активность в FXU(S) измеряют относительно стандарта фермента Novozymes FXU(S) (доступного от Novozymes), содержащего монокомпонентный препарат ксиланазы Шеарзим из Aspergillus aculeatus.

Липаза (LU)

Одна единица липазы (LU) представляет собой количество фермента, которое высвобождает 1 микромоль титруемой масляной кислоты в минуту при 30,0°C; pH 7,0; с гуммиарабиком в качестве эмульгатора и трибутирином в качестве субстрата.

Фитаза (FYT)

Одна единица фитазы (FYT) представляет собой количество фермента, которое высвобождает 1 микромоль неорганического ортофосфата в мин в следующих условиях: pH 5,5; температура 37°C; субстрат: фитат натрия (C₆H₆O₂₄P₆ Na₁₂) в концентрации 0,0050 моль/л.

Единица лейцинаминопептидазы (LAPU)

1 единица лейцинаминопептидазы (LAPU) представляет собой количество фермента, расщепляющее 1 микромоль субстрата в минуту в следующих условиях: 26 мМ

L-лейцин-п-нитроанилид в качестве субстрата, 0,1 M Трис-буфер (pH 8,0), 40°C, время реакции 10 минут.

Лабораторный способ затирания

Если не указано иначе, способ затирания, используемый в примерах, осуществляли следующим образом:

Сначала ячмень размалывают до тонкой крупки (B hler Unirvisale, просвет 0,2 мм), затем 50 г размолотого ячменя добавляют в чашу для затирания и добавляют 200 г предварительно нагретой воды (с хлоридом кальция). Чашу помещают в баню для затирания (Lochner LB 12 Electronic с 12 чашами), устанавливают схему затирания (например, затирание-инфузионное при 50°C или 54°C, поддержание температуры в течение 20-30 минут, увеличение на 1°C/минуту до 64°C, поддержание в течение 40-60 минут, увеличение на 1°C/минуту до 78 или 80°C, поддержание в течение 10-20 минут и уменьшение температуры до 20°C). Раствор фермента добавляют в чаши на старте и начинают затирание с получением общего периода затирания 140-160 минут. После затирания добавляют воду, всего 300 г в чашу, и затор фильтруют с помощью складчатого фильтра Whatman 597 1/2 (Schleicher & Schuell) для получения сусла, после чего сусло можно анализировать.

Концентрации сахара/декстрина (углевода) в сусле анализировали в системе Waters HPLC (способ Novozymes: 345-SM-2004.01/01) с предколонкой (Cation H перезаполняемая кат. 1250129), двумя колонками BoiRad Aminex HPX 87 H, нагретыми до 60°C и потоком 0,4 мл/минуту с детекцией RI (детектор Waters 2410 RI).

RDF: истинную степень ферментации определяли способом, описанным в способе MEBAK: 2.9.2. Принципиально: Восстановление сухого вещества сусла, в %, ферментацией до спирта и CO2

NTU: Мутность в сусле анализировали способом MEBAK 2.15.1

Как правило, дозы фермента вычисляли следующим образом:

Фермент	Намеченная доза/г сухого вещества	Специфическая активность	г ферментного белка (EP)/1000 кг сухого вещества ячменя
Термамил SC	0,3 KNU(S)/г	43 KNU(S)/мг	6,98 г
Ultraflo Max	300 м.д. (миллионные доли)	4000 EGU/г общего белка	52,5 г
30 FXU/мг	2,5 г
Пуллуланаза NS26062	1,0 PUN/г	57 PUN(G)/мг	17,54 г
Нейтраза	0,001 AU/г	60 AU/г	33,3 г
Липозим TL	20 LU/г	6100 LU/мг	3,28 г

Пример 1

Целью этого примера являлся выбор наилучшей подходящей пуллуланазы для получения сусла на основе RDF и DP2 (мальтоза). Крупку, содержащую 100% несоложеного ячменя, получали, как описано выше.

Затем во все чаши добавляли 50 м.д. Na₂SO₃ и ферменты:

-амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г,

-глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 м.д.,

Протеаза (Нейтраза 0,8) 0,002 AU/г,

Flavourzyme 1000 L: 0,1 LAPU/г, и

Пуллуланаза, как описано в таблице 2:

Проводили затирание и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали и результаты в таблице 1 ниже получали анализом сусла:

Таблица 1 100% ячменя: RDF, % и сахар в сусле
	Доза фермента, PUN/г	DP2, % от общего	DP4+, % от общего	RDF, %
-	0,00	48,7	33,2	62,0
Промозим	0,1	49,4	31,6	64,0
Промозим	0,2	49,7	30,6	65,0
Промозим	0,3	50,3	29,6	65,8
Промозим	0,5	51,6	27,6	67,0
-	0,00	48,7	33,2	62,0
NS26062	0,1	50,0	30,2	64,6
NS26062	0,2	50,8	28,4	66,1
NS26062	0,3	51,3	27,3	67,3
NS26062	0,5	52,4	25,0	69,5
Определено по линейной регрессии.

RDF составляет более 60% с обеими пуллуланазами, однако RDF выше при добавлении NS26062 (PUL C). Количество мальтозы (DP2) относительно количества декстринов (DP4) также было выше для обеих пуллуланаз, но снова количество мальтозы относительно декстринов было выше для NS26062 (PUL C). Таким образом, в заключение: для NS26062 (пуллуланаза C или PulC) показали наилучшую производительность по сравнению с промозимом (промозим 400 L), по активности PUN, по RDF% и по образованию мальтозы (DP2). В этом эксперименте ясно показали преимущество термостабильной NS26062 (пуллуланаза C или PULC).

Пример 2

В следующем примере показаны различные температурные оптимумы и относительная активность при различных температурах. Анализировали относительную ферментативную активность трех различных пуллуланаз. Способ анализа пуллуланазной активности представляет собой детекцию увеличенной производительности восстанавливающего сахара (реакция Сомоджи-Нельсона) в следующих условиях:

Субстрат: 0,2% пуллулан, pH 5,0, время реакции 30 минут, остановка ферментативной реакции добавлением медного реагента Сомоджи, затем цветного реагента Нельсона и кипячением в течение 20 минут. Образцы инкубировали при 30°C, 45°C, 55°C, 60°C, 62,5°C, 65°C и 70°C в течение 30 минут. Образцы анализировали на спектрофотометре при OD520 нм и разницу между образцом и нулем (увеличение ферментативной активности) использовали для расчета результатов.

Наибольшую активность устанавливали на 100% (максимум) и активности при других температурах устанавливали относительно температурного максимума.

Таблица 2 Относительная активность различных пуллуланаз при различных температурах
Температура в течение 30 минут	PulC/NS26062, %	Промозим 400 L, %	Промозим D2/Оптимакс 1000 L, %
30°C	19,7	20,1	34,4
45°C	47,3	56,8	68,1
55°C	76,8	100,0	100,0
60°C	86,8	87,9	80,0
62,5°C	92,8	76,9	58,4
65°C	100,0	37,2	51,1
70°C	75,6	8,3	11,9

Этот пример ясно показывает, что PulC является наиболее термостабильной и термоактивной из трех пуллуланаз, поскольку она обладает значимо более высокой относительной активностью выше 62,5°C, и поскольку наиболее высокая активность была измерена в течение 30 минут при 65°C. Пуллуланаза PulC обладает наибольшей активностью из всех трех пуллуланаз между 62,5°C и 65°C, что представляет собой предпочтительную температуру для затирания, таким образом, применение PulC в качестве деветвящего фермента в процессе затирания явно является преимущественным.

Пример 3

Целью этого эксперимента являлась оценка эффективной дозы ферментного белка (EP) на г dm (грамм сухого вещества) 3 различных пуллуланаз (NS26062/PulC, Промозим 400 L и Промозим D2 (Оптимакс 1000 L) при осахаривании либо 100% несоложеного ячменя, либо 100% соложеного ячменя при применении в инфузионном затирании в течение 2 часов.

Во все чаши добавляли ферментную смесь, 2 кг/1000 кг ячменя:

-амилаза (Термамил SC) 0,3 KNU(S)/г,

-глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max/Viscoflow XL) 300 м.д.,

Протеаза (Нейтраза) 0,001 AU/г,

Липаза (Липозим TL 20 LU/г).

Добавляли различные дозы пуллуланаз.

Специфическая активность:

NS26062: 57 PUN/мг EP,

Промозим 400 L: 136 PUN/мг EP,

Промозим D2: 236 NPUN/мг EP.

Изоамилаза из Hayashibara Co Ltd: Специфическая активность неизвестна.

Специфическую активность измеряли после того, как пуллуланазы очищали общепринятыми хроматографическими способами.

Условия затирания: 54°C в течение 30 минут, увеличение до 64°C в течение 10 минут и выдержка 45 минут, увеличение до 80°C в течение 16 минут и выдержка 10 минут, получение сусла с 12,6 Плато.

Таблица 3 Действие пуллуланазы на деградацию декстрина при затирании 100% несоложеного ячменя: показаны % не ферментируемого углевода в сусле (декстрин/DP4+) с различными дозами (г (грамм) EP (ферментного белка)/1000 кг несоложеного ячменя. Некоторые эксперименты выполняли несколько раз
г EP/1000 кг сухого вещества несоложеного ячменя	NS26062 PulC	Промозим 400 L	Промозим D2	Изоамилаза Hayashibara
0 (контроль)	30,5-30,8%	30,5-30,8%	30,5-30,8%	30,5-30,8%
8,77	20,1-21,4% 22,3%	-	-	-
17,5	15,4-18,8% 17,9-18,3%	19,8-20,4%	27,4-27,5%	-
26,3	13,6-16,1% 16,0-16,7%	-	-	-
35,0	14,9-15,5%	17,1%	-	-
52,5	13,2%
87,5	-	13,2-13,7%	21,9-22,4%	-
175	-	11,8-12,3%	18,7-19,3%	-

В таблице 3 показано, что все три пуллуланазы, но не изоамилаза Hayashibara, могут уменьшать количество неферментируемых сахаров (декстрин DP4+) и таким образом увеличивать количество ферментируемых сахаров. Однако наилучшей производительностью явно обладает пуллуланаза NS26062 (PulC), которая уменьшает количество неферментируемых сахаров по отношению к количеству добавленных ферментов намного больше, чем пуллуланаза 400 L и пуллуланаза D2. Это представляет собой ясную демонстрацию преимущества применения термостабильной PulC. Более того, это показывает, что DP4+ менее 20%, соответствующее 80% глюкозы, мальтозы и мальтотриозы, можно достигать за 120 минут затирания.

Таким образом, выбор пуллуланазы является важным для контроля количества ферментируемых сахаров и для возможного восстановления неферментируемых DP4+ декстринов. Это важно, поскольку хороший профиль сахаров (много ферментируемых сахаров по сравнению с неферментируемыми сахарами) способствует хорошей ферментации сусла.

Пример 4

Целью этого примера являлась оценка эффекта пуллуланазы NS26062 на образование DP2 (мальтозы) в сусле. Крупку, содержащую 100% несоложеного ячменя, получали, как описано выше.

Затем во все чаши добавляли 50 м.д. Na₂ SO₃ + 3,0 мл 1 M H₃PO₄ и ферменты:

-амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г,

-глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 м.д. ~ 0,23 EGU/г,

Протеаза (Нейтраза 0.8 L): 0,002 AU/г,

Пуллуланазы, как описано в таблице 4:

Проводили затирание, и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали и результаты в таблице 4 ниже получали анализом сусла:

Таблица 4 100% ячменя: RDF, % и сахар в сусле
Доза фермента, PUN/г (NS26062)	DP1 % от общего	DP2 % от общего	DP4+ % от общего	RDF %
-	0	3,8	47,5	34,0	61,2
NS26062	0,1	3,8	48,2	32,0	63,2
NS26062	0,3	3,8	49,8	28,8	65,7
NS26062	0,5	3,7	51,2	26,4	68,6
NS26062	1	3,7	52,6	23,9	71,0
NS26062	2	3,6	55,6	20,1	74,3

Концентрацию мальтозы (DP2) увеличивали увеличением дозы NS26062 (PulC), и увеличение % мальтозы сопровождалось увеличением сбраживания (RDF%). В то же самое время фракция декстрина (анализ HPLC DP4/4+) уменьшалась.

Только -амилаза ячменя могла образовывать мальтозу в этой реакции, и NS26062 (PulC) облегчала действие бета-амилазы ячменя.

Таким образом, NS26062 (PulC) представляла собой пригодную пуллуланазу, обеспечивая сусло с высокой RDF и низкой глюкозой.

Пример 5

Целью этого примера являлась оценка трех протеаз Нейтразы 0.8 L, Алкалазы и Флавозима для развития FAN и образования мальтозы. Крупку, содержащую 100% несоложеного ячменя, получали, как описано выше. Затем во все чаши (испытания 1-3 ниже) добавляли ферменты, как указано в таблицах 5-7 ниже. Проводили затирание, и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали, и результаты в таблицах 5-7 получали анализом сусла:

Испытание 1:

Во все образцы добавляли: -амилазу (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г, -глюканазу и ксиланазу (Ultraflo Max): 300 м.д. (0,23 EGU/г) и протеазы Алкалазу и Нейтразу 0.8 L с различной активностью, как указано в таблице 5.

Таблица 5 FAN и % сахара в сусле при различных дозах Алкалазы и Нейтразы 0.8 L (активность ферментов на г сухого вещества затора)
№ чаши	Алкалаза AU/г	Нейтраза 0.8 L AU/г	FAN мг/л/Плато	DP2, % от общего	DP4/4+, % от общего
1	-	-	5,05	42,2	37,4
2	-	0,0005	6,73	45,4	35,5
3	-	0,001	7,32	44,6	35,8
4	-	0,0015	7,92	46,5	34,4
5	-	0,002	8,33	46,0	34,7
6	-	0,003	9,00	46,1	34,6
7	0,001	0,002	8,59	46,1	34,6
8	0,002	0,002	8,38	45,9	34,7
9	0,0025	0,002	8,35	46,5	34,3
10	0,003	0,002	8,59	46,9	34,1
11	0,004	0,002	8,92	46,6	34,2
12	0,005	0,002	9,29	47,1	34,0

Испытание 2:

Во все образцы добавляли: -амилазу (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г, -глюканазу и ксиланазу (Ultraflo Max): 300 м.д. (0,23 EGU/г), флавозим: 0,1 LAPU/г, и протеазы Алкалазу и/или Нейтразу 0.8 L, как указано в таблице 6.

Таблица 6 FAN и % сахара в сусле при различных дозах Алкалазы и Нейтразы 0.8 L (активность ферментов на г сухого вещества затора)
№ чаши	Алкалаза AU/г	Нейтраза 0.8 L AU/г	FAN мг/л/Плато	DP2, % от общего	DP4/4+, % от общего
1	-	-	5,47	43,8	36,0
2	-	0,0005	6,75	46,4	34,3
3	-	0,001	7,20	47,5	33,7
4	-	0,0015	7,57	47,1	33,8
5	-	0,002	8,26	47,3	33,7
6	-	0,003	8,64	47,3	33,6
7	0,001	0,002	9,09	47,1	33,9
8	0,002	0,002	8,46	48.2	33,1
9	0,0025	0,002	8,64	47,9	33,4
10	0,003	0,002	8,49	47,3	33,8
11	0,004	0,002	8,96	47,5	33,6
12	0,005	0,002	10,15	47,4	33,7

Испытание 3:

Во все образцы добавляли: -амилазу (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г, -глюканазу и ксиланазу (Ultraflo Max): 300 м.д. 0,23 EGU/г, флавозим: 0,1 LAPU/г, и протеазы Алкалазу или Нейтразу 0.8 L, как указано в таблице 7.

Таблица 7 FAN и % сахара в сусле при различных дозах Алкалазы и Нейтразы 0.8 L (активность ферментов на г сухого вещества затора)
№ чаши	Алкалаза AU/г	Нейтраза 0.8 L AU/г	FAN мг/л/Плато	DP2, % от общего	DP4/4+, % от общего
1	-	-	5,24	44,8	35,3
2	0,001		5,37	44,8	35,3
3	0,002		5,02	44,6	35,4
4	0,0025		5,20	45,7	34,6
5	0,003		5,29	44,2	35,7
6	0,004		5,66	44,4	35,0
7	0,005		5,91	45,0	35,0
8	-	0,002	5,66	44,4	35,5
9	0,004	0,001	8,45	47,1	33,9
10	0,004	0,0015	8,96	47,7	33,4
11	0,004	0,002	9,65	48,3	33,0
12	0,004	0,003	10,25	48,7	32,6

В этих примерах ясно показано, что добавление протеаз Алкалазы и Нейтразы, но не Флавозима, оказывает положительный эффект на образование доступного свободного аминного азота (FAN), и что Нейтраза оказывает наиболее положительный эффект на образование FAN. Таким образом, выбор протеазы является критическим параметром для образования FAN.

Пример 6

Крупку, содержащую 0-90% несоложеного ячменя, получали, как описано выше. Затем во все чаши добавляли ферменты -глюканазу и ксиланазу. Проводили затирание, и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали и результаты в таблице 8 получали анализом сусла:

Следующий эксперимент предназначен для демонстрации эффекта мутности (NTU) с увеличением количества несоложеного ячменя при добавлении только ферментной смеси для фильтрации -глюканазы и ксиланазы (Ultraflo Max 300 м.д.).

Таблица 8 NTU, когда увеличивающееся количество соложеного ячменя заменяют несоложеным ячменем, от 0% несоложеного ячменя до 90% несоложеного ячменя
	% ячменя	NTU
1	0	19,8
2	8	19,7
3	16	15,3
4	24	12,4
5	32	12
6	40	10,2
7	48	10,8
8	56	8,43
9	64	10,9
10	72	21
11	80	35,7
12	90	56,2

Результаты показаны также на фиг.1. По этому эксперименту доказано, что затирание несоложеного ячменя с простой смесью ферментов (только ферменты для фильтрации) становится все более трудным с увеличением количества несоложеного ячменя, заменяющего соложеный ячмень, и когда количество превышает 80%, мутность является настолько высокой, что сусло трудно фильтровать. Таким образом, при наличии большого количества несоложеного ячменя добавления только ферментов для фильтрации недостаточно для получения хорошо фильтрующегося сусла.

Пример 7

Целью этого примера являлась оценка мутности (NTU) и фильтрации сусла из 100% ячменя при инфузионном затирании с различными дозами Липопана F, Липопана X,

-глюканазы и ксиланазы (Ultraflo Max). Исследование включало два независимых испытания для Липопана F и Липопана X, соответственно, т.е. 2×12 чаш, как указано в таблице 9 ниже. Крупку, содержащую 100% несоложеного ячменя, получали, как описано ранее. Затем во все чаши добавляли ферменты.

В каждую чашу добавляли:

- 3,0 мл 1 M H₃PO₄ ,

- 0,3 KNU(S )/г -амилазы (Термамил SC),

- 0,002 AU/г протеазы (Нейтраза 0.8 L),

- 0,5 PUN/г пуллуланазы (NS26062), и ферменты в таблице 9.

Проводили затирание, и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали, и результаты в таблице 9 ниже получали анализом сусла:

Таблица 9 Активность дозы фермента/г сухого вещества при затирании
Номер чаши	Ultraflo Мах EGU/г	Липопан F LU/г	Липопан Х LU/г	NTU	Фильтрация мл/10 мин	Фильтрация мл, окончательно
1	0,24	-		116	105	194
2	0,24	1		120	86,0	165
3	0,24	5		78,3	110	195
4	0,24	10		66,1	131	195
5	0,24	20		50,1	168	210
6	0,24	50		22,7	190	210
7	0,16	50		19,7	170	208
8	0,08	50		19,8	178	205
9	-	50		18,5	142	195
10	0,16	10		67,8	114	200
11	0,08	10		69,2	130	200
12	-	10		49,7	95	180
1	0,24		-	110	105	200
2	0,24		1	92,0	70,0	165
3	0,24		5	50,0	100	200
4	0,24		10	107	94,0	198
5	0,24		20	5,91	135	205
6	0,24		50	3,36	160	210
7	0,16		50	3,53	150	205
8	0,08		50	3,84	151	205
9	-		50	4,96	100	200
10	0,16		10	24,9	110	200
11	0,08		10	21	110	200
12	-		10	8,9	75	180

Обе липазы Липопан F и Липопан X заметно уменьшали мутность (NTU) сусла. Липопан X является наиболее эффективным (по ферментативной активности LU(г)) для уменьшения мутности в сусле, но Липопан F может уменьшать мутность до уровня в пределах спецификации сусла. Количество ферментов для фильтрации можно уменьшать до 100 м.д. в присутствии липазы без значительного уменьшения скорости фильтрации.

Пример 8

Целью этого примера являлась оценка эффекта протеазы Нейтразы 0.8 L, фитазы и пуллуланазы NS26062 (PulC) на образование FAN и профиль сахара в сусле при общепринятом затирании. Крупку, содержащую 100% несоложеного ячменя, получали, как описано выше. Затем во все чаши добавляли -амилазу (Термамил SC) 0,3 KNU(S)/г, 300 м.д. -глюканазы и ксиланазы (Ultraflo Max), доводили pH до 5,3, и ферменты протеазу Нейтразу 0.8 L, фитазу и пуллуланазу NS26062 (PulC), добавляли, как указано в таблицах 10A и 10B ниже, и получали результаты:

Таблица 10А 100% ячмень: образование FAN в сусле. Дозы представляют собой единицы ферментативной активности и м.д. (100 м.д.=100 г/1000 кг несоложеного ячменя). FYT представляет собой единицу фитазы, PUN представляет собой пуллуланазную активность, и AU представляет собой протеолитическую активность
Дозы ферментов	FAN мг/л/Плато
0	5,09
1,5 FYT	5,09
0,5 PUN	5,11
1,5 FYT + 0,5 PUN	5,22
0,002 AU	8,58
0,002 AU + 1,5 FYT	7,53
0,002 AU + 0,5 PUN	7,85
0,002 AU + 1,5 FYT + 0,5 PUN	7,91
0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT	7,87
0,002 AU + 0,5 PUN + 5 FYT	7,77
0,001 AU + 0,5 PUN + 5 FYT	7,35

Таблица 10В 100% ячмень: профиль сахара в сусле
Доза фермента Нейтраза 0.8 L (AU)	DP1 %	DP2 %	DP3 %	DP4/4+ %	Fru %
0	4,15	31,80	14,82	38,13	1,82
0,002 AU	3,81	46,61	12,79	34,97	1,82
1,5 FYT	4,13	42,11	14,78	37,14	1,85
0,5 PUN	4,06	44,28	18,28	31,55	1,82
0	4,15	31,80	14,82	38,13	1,82
5,0 FYT + 0,5 PUN	4,14	47,01	18,17	28,82	1,86
5,0 FYT + 0,5 PUN + 0,001 AU	3,84	50,67	17,42	26,25	1,81
5,0 FYT + 0,5 PUN + 0,002 AU	3,88	49,26	17,61	27,41	1,83
0	4,15	31,80	14,82	38,13	-
0,002 AU	3,81	46,61	12,79	34,97	-
0,002 AU + 0,5 PUN	3,81	47,78	17,74	28,87	-
0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT	3,88	49,26	17,61	27,41	-
0,002 AU + 0,5 PUN + 1,5 FYT	3,91	50,12	17,56	26,58	-
0,001 AU + 0,5 PUN + 5,0 FYT	3,84	50,67	17,42	26,25	-

В таблице 10A показано, что протеаза увеличивает FAN в сусле, и в таблице 10B показано, что при добавлении фитазы и пуллуланазы к протеазе сравнимо большое количество DP1-DP3 можно получить с концентрациями протеазы 0,001 и 0,002 AU соответственно. Таким образом, концентрацию протеазы можно уменьшать при получении мальтозного сусла, когда присутствуют фитаза и пуллуланаза, без уменьшения количества ферментируемых сахаров (DP1-DP3).

Пример 9

Целью этого примера являлась оценка некоторых основных параметров, касающихся сусла, полученного из 100% несоложеного ячменя, чтобы определить критические показатели по сравнению с суслом, полученным из соложеного ячменя.

Затирание солода (100%) без добавления ферментов и затирание несоложеного ячменя (100%) с сочетанием ферментов. Сусло кипятили и проводили ферментацию пива с 100% (ячменным) солодом и с суслом из 100% несоложеного ячменя.

Данные:

Затирание:

Ячмень: Скарлетт и солод из той же партии Скарлетт.

Затор: 10 кг солода или ячменя, + 35 л жидкости для затора и промывание дробины 25 л, всего до 60 л.

Профиль: 54°C 30 минут, увеличение до 64°C (1°C/минуту) и выдержка в течение 60 минут, увеличение до 80°C (1°C/минуту) и выдержка в течение 10 минут, и перемещение для процеживания.

Ферментная смесь в заторе из 100% ячменя:

- -амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г сухого вещества

- -глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max): 300 м.д.

- Протеаза (Нейтраза 0.8 L): 0,0015 AU/г сухого вещества

- Пуллуланаза (NS26062, PulC): 1,0 PUN/г сухого вещества

Проанализированный аминокислотный состав сусла (таблица 11):

Свободные аминокислоты, анализированные в сусле, упорядочены согласно статье «Elucidation of the Role of Nitrogenous Wort Components in yeast Fermentation» (J. Inst. Brew. 1 13(1), 3-8, 2007)

Таблица 11 FAN в сусле
	Сусло из соложеного ячменя	Сусло из несоложеного ячменя
Группа A, быстрая абсорбция:	мМ	мМ
Аспарагиновая кислота	0,076	0,151
Глутаминовая кислота	0,244	0,210
Аспарагин	0,310	0,273
Серин	0,007	0,187
Глутамин	0,074	0,048
Треонин	0,210	0,188
Аргинин	0,149	0,265
Лизин	0,216	0,354
Сумма	1,286	1,675 (130%)
Группа B, промежуточная абсорбция:
Валин	0,245	0,252
Метионин	0,047	0,111
Лейцин	0,236	0,446
Изолейцин	0,114	0,163
Гистидин	0,157	0,091
Сумма	0,798	1,064 (133%)
Группа C, медленная абсорбция:
Глицин	0,149	0,158
Фенилаланин	0,196	0,206
Тирозин	0,131	0,158
Триптофан	0,087	0,062
Аланин	0,312	0,361
Сумма	0,875	0,945 (108%)
Группа D, малая абсорбция или отсутствие абсорбции:
Пролин	2,500	0,413 (16,5%)
Всего - сумма	5,458	4,098

В таблице 11 показано, что при затирании со 100% несоложеного ячменя и смесью ферментов, содержащими -амилазную активность, -глюканазную активность, протеазную активность и пуллуланазную активность, можно получать сусло, имеющее значительно менее неиспользуемой дрожжами аминокислоты пролина, что является явно преимущественным, поскольку присутствие этой аминокислоты в пивном продукте придает неприятный вкус. Кроме того, количество аминокислот в группах A и B, которые могут подвергаться быстрому метаболизму в дрожжах, значительно увеличено при затирании несоложеного ячменя и ферментной смеси, содержащей -амилазную активность, -глюканазную активность, активность протеазы и пуллуланазы. Таким образом, из этого примера ясно, что концентрация пролина составляет менее 2 мМ, а концентрация серина и метионина составляет более 0,1 мМ и 0,05 мМ соответственно.

Пример 10

В следующем эксперименте анализировали сусло, полученное из крупки, содержащей 100% несоложеного ячменя и 100% солода. Испытания проводили в Ziemann GmbH, Ludwigburg, Germany. Все анализы выполняли согласно Analytica EBC или MEBAK соответственно (van Erde, P., Analytica-EBC. 1998, N rnberg: Verlag Hans Carl.; Anger, H., MEBAK Band Rohstoffe. 1. Auflage ed. Brautechnische Analysenmethoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK).

Использованный ячмень представлял собой двухрядный весенний ячмень из германского урожая 2008. Добавленные ферменты представляли собой:

- -амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г злака

- -глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max): 300 м.д.

- Протеаза (Нейтраза 0.8 L): 0,001 AU/г сухого вещества

- Пуллуланаза (NS26062, PulC): 2,0 PUN/г сухого вещества

- Липаза (Липозим TL 100): 20 LU/г сухого вещества

Используемый профиль затирания представлял собой 54°C при 30 мин; увеличение температуры 1°C/мин до 64°C и выдержка в течение 60 мин; увеличение температуры 1°C/мин до 78°C и выдержка в течение 30 мин, общее время затирания 144 мин.

Таблица 12 Состав сусла при пивоварении из 100 % ячменя по сравнению со всеми спецификациями солода
Анализ	Единица	Метод	100% несоложеного ячменя	100% соложеного ячменя
Вязкость (12%)	мПа с	MEBAK II	1,76	<1,8
Количество иода		MEBAK II	0,28	<0,35
RDF	%	MEBAK II	69,2	68-72
Растворимый азот	мг/100 мл	MEBAK II	102,5
FAN (12%)	м.д.	MEBAK II	180
Мутность	ЕВС	MEBAK II	<80 NTU	<80 NTU

Результаты показывают, что 100% несоложеного ячменя в комбинации с ферментной смесью, содержащей -амилазную активность, -глюканазную активность, протеолитическую активность и деветвящую пуллуланазную активность, может полностью соответствовать всем спецификациям солода по всем ключевым параметрам, таким как вязкость, мутность, источники свободного аминного азота, выход и конечное сбраживание, соответствующим спецификациям полного солода (100% солода).

Исследовали также производительность процеживания. Мутность процеживаемого сусла описывает качество производительности процеживания. Компонент липазы в смеси ферментов являлся способным уменьшать в норме значительно более высокий уровень мутности для способов с несоложеным ячменем до уровней мутности ниже 80 NTU в пределах сравнимого времени процеживания.

Тестировали также производительность ферментации: проводили ферментацию 8 гл (гектолитров) сусла из 100% солода и 8 гл сусла из 100% несоложеного ячменя. Результат показан на фиг.2.

Оба вида сусла ферментировали со штаммом дрожжей низового брожения W34, на фиг.2 показан сравнимый спад экстракции для обоих случаев пивоварения. Более того, не обнаружили различий в продукции этанола.

Наконец, ячменное пиво дегустировала профессиональная дегустационная комиссия в институте технологии пивоварения 1 в Weihenstephan, Germany. Результаты показывают сравнимый результат со стандартным лагерным пивом с показателями улучшенной стабильности запаха.

Таблица 13 Оценка вкуса пива из 100% несоложеного ячменя в Weihenstephan
	100% несоложеного ячменя	100% несоложеного ячменя	100% несоложеного ячменя	100% несоложеного ячменя
Свежее	Ускорено состаренное	Свежее	Ускорено состаренное
Вкус	4,0	3,5	3,8	3,5
Запах	4,0	3,4	3,8	3,4
Экстрактивность	4,0	3,8	4,0	3,8
Общая горечь	4,1	3,9	4,1	3,9
Всего	4,03	3,61	3,91	3,56
Общая оценка: DLG 5 = очень хорошо, 1 неприемлемо.

Пример 11

Следующие примеры присутствовали для оценки различных важных параметров при затирании в крупке, содержащей 30% кукурузной крупки или риса (несоложеных) с основным затором из 70% несоложеного ячменя и смесь ферментов, содержащую -амилазную активность, -глюканазную активность, активность протеазы и пуллуланазы.

Используемый способ представлял собой отварочное затирание, где часть риса или кукурузной крупки кипятили с термостабильной -амилазой и затем смешивали с затором, содержащим несоложеный ячмень. Ферменты, добавляемые к затору из 70% ячменя + 30% кукурузной крупки или риса:

- -амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г сухого вещества

- -глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max): 300 м.д. (0,23 EGU/г)

- Протеаза (Нейтраза 0.8 L): 0,001 и 0,002 AU/г сухого вещества.

Пуллуланазу также добавляли к затору из несоложеного ячменя, и концентрацию меняли, см. таблицы 14 и 15, добавляемая пуллуланаза представляет собой (NS26062, PulC).

Затирание проводили следующим образом: размолотый ячмень добавляли в чашу для затирания (40,0 г, как есть) и добавляли 115 г воды при 60°C, CaCl (330 г/1000 кг ячменя) добавляли в дополнение к смеси ферментов, указанных выше. Смесь выдерживали при 54°C в течение 30 минут, затем добавляли отварочный затор (15,4 г сухого вещества) и температуру поддерживали при 64°C в течение 60 минут, увеличивали до 80°C и выдерживали 10 минут, охлаждали и фильтровали. Все заторы возможно было фильтровать без каких-либо проблем и без значительных различий между различными дозами ферментов.

Получение отварочного затора проводили следующим образом: рис или кукурузную крупку смешивали с водой (5,66 частей) при температуре 60°C - 70°C, добавляли CaCl₂ (220 г/1000 кг крупки) в дополнение к -амилазе (Термамил SC 0,600 кг/1000 кг крупки). Смесь нагревали до 85°C и выдерживали при этой температуре в течение 20 минут, нагрев увеличивали до 100°C (кипение) и выдерживали при этой температуре (кипение) в течение 15 минут. Смесь охлаждали до 80°C и смешивали с содержащим ячмень затором.

Проводили затирание, и в чаши добавляли водопроводную воду всего до 300 г после затирания. Затор фильтровали и результаты в таблице 14 ниже получали анализом сусла. В некоторых примерах сусло кипятили 10 минут, разводили до 9,7 Плато и ферментировали посредством принудительной ферментации, Analytica - EBC nr. 8.6.

Таблица 14 FAN, RDF и содержание сахара в сусле из затора на основе отваривания затора из 30% кукурузной крупки и 70% несоложеного ячменя, которые смешивают
Номер чаши	Нейтраза AU/г	NS26062 PUN/г	Профиль углеводов в сусле в %	Плато0	FAN м.д.	RDF%
DP1:	DP2:	DP3:	DP4+:
1	0,001	-	5,17	54,31	12,02	28,50	14,48	106	64,4
2	0,001	0,5	5,47	58,23	14,73	21,56	14,45	106	70,7
3	0,001	1,0	5,48	60,48	15,79	18,25	14,54	107	73,6
4	0,001	1,5	5,59	61,77	16,35	16,29	14,45	107	75,3
5	0,001	2,0	5,57	62,88	16,66	14,89	14,49	108	76,5
6	0,001	2,5	5,60	63,35	16,96	14,09	14,46	106	77,2
7	0,002	-	5,54	54,29	12,50	27,67	14,28	131	64,6
8	0,002	0,5	5,60	58,37	15,13	20,90	14,34	131	70,8
9	0,002	1,0	5,53	60,43	16,10	17,93	14,83	129	73,8
10	0,002	1,5	5,66	61,83	16,58	15,93	14,34	130	75,3
11	0,002	2,0	5,66	62,71	16,92	14,70	14,33	131	76,4
12	0,002	2,5	5,73	63,21	17,18	13,88	14,31	130	77,3

Таблица 15 FAN, RDF и содержание сахара в сусле из затора на основе отваривания затора из 30% кукурузной крупки и 70% несоложеного ячменя, которые смешивают
Номер чаши	Нейтраза AU/г	NS26062 PUN/г	Профиль углеводов в сусле в %	Плато0	FAN м.д.	RDF%
DP1:	DP2:	DP3:	DP4+:
1	0,001	-	5,37	53,14	12,33	29,16	14,37	103	62,0
2	0,001	0,5	5,40	57,06	15,03	22,50	14,75	104	68,8
3	0,001	1,0	5,57	59,18	16,02	19,24	14,53	106	72,1
4	0,001	1,5	5,57	60,72	16,65	17,15	14,61	104	74,1
5	0,001	2,0	5,59	61,64	17,00	15,77	14,51	104	75,5
6	0,001	2,5	5,65	62,38	17,28	14,67	14,52	105	76,6
7	0,002	-	5,50	53,23	12,79	28,48	14,45	125	62,4
8	0,002	0,5	5,55	57,09	15,28	22,08	14,45	124	69,0
9	0,002	1,0	5,65	59,17	16,32	18,86	14,44	126	72,1
10	0,002	1,5	5,68	60,38	16,95	16,99	14,45	127	73,9
11	0,002	2,0	5,67	61,37	17,38	15,58	14,45	126	75,3
12	0,002	2,5	5,72	62,11	17,56	14,59	14,39	127	76,7

В таблицах 14 и 15 показаны профиль сахаров, Плато, FAN и RDF сусла, основанного на затирании крупки, содержащей 30% кукурузы или риса и 70% несоложеного ячменя (100% несоложеных зерен). Результат ясно показывает, что количество ферментируемых сахаров (DP1-3) является очень высоким (выше 80%), RDF составляет выше 60% и увеличивается с увеличением концентрации пуллуланазы, и FAN является высоким и увеличивается с увеличением концентрации протеазы, когда сусло получают из 100% несоложеных зерен, содержащих 70% несоложеного ячменя и 30% несоложеной кукурузной крупки или риса, и ферментной смеси, содержащей -амилазную активность, -глюканазную активность, активность протеазы и пуллуланазы. Не существовало значимой разницы между использованием риса или кукурузной крупки.

Пример 12

Следующие примеры присутствовали для оценки различных важных параметров при затирании в крупке, содержащей 50% ячменя + 50% пшеничного затора и следующие ферменты:

- -амилаза (Термамил SC): 0,3 KNU(S)/г dm (сухого вещества)

- -глюканаза и ксиланаза (Ultraflo Max): 300 м.д./0,23 EGU/г сухого вещества

- Протеаза (Нейтраза): 0,001 AU/г сухого вещества

- Липаза (Липозим TL): 20 LU/г сухого вещества

- Пуллуланаза (NS26062, PulC): 0-3,0 PUN/г сухого вещества

В одном примере концентрацию пуллуланазы меняли, см. таблицу 17, добавленная пуллуланаза представляет собой (NS26062, PulC).

В двух других примерах концентрацию ферментной смеси на кг сырьевого материала меняли, см. таблицу 18.

Затор получали смешиванием размолотого ячменя и пшеницы (25 г каждого (всего 50,0 г) с 200 г воды, добавленной в чаши для затирания, затем добавляли Ca2+ и ферментную смесь, указанную выше, и начинали затирание.

Профиль затирания являлся следующим: затор нагревали до 54°C (1°C/мин) и выдерживали при этой температуре в течение 30 минут, температуру увеличивали до 64°C в течение 10 минут и выдерживали при этой температуре в течение 45 минут, температуру увеличивали до 80°C в течение 16 минут и выдерживали при этой температуре в течение 10 минут. Добавляли воду всего до 300 г и затор фильтровали.

Сусло фильтровали и в некоторых примерах сусло кипятили 10 минут, разводили до 9,7 Плато и ферментировали посредством принудительной ферментации.

Результаты показаны на фиг.3 и в таблицах 16 и 17.

Таблица 16 Ферментная смесь была такой, как описано выше, Термамил SC, Ultraflo Max, Нейтраза и Липозим TL с добавленными различными концентрациями (PUN/г) пуллуланазы (NS26062)
	Фильтрация	Плато	рН	NTU	RDF%
Ферменты	мл через 10 минут	всего мл
0 PUN/г + ферментная смесь	158	208	12,96	5,80	4	64,2
0,5 PUN/г + ферментная смесь	179	215	12,84	5,70	4	69,8
1,0 PUN/г + ферментная смесь	159	206	13,06	5,70	3	72,0
1,5 PUN/г + ферментная смесь	154	213	13,08	5,70	3	72,5
2,0 PUN/г + ферментная смесь	159	209	13,05	5,50	3	73,0
2,5 PUN/г + ферментная смесь	146	206	13,10	5,6	3	73,4
3,0 PUN/г + ферментная смесь	159	208	13,08	5,70	3	73,6

В таблице 16 показано, что сусло, полученное из крупки, содержащей 50% пшеницы и 50% ячменя, то есть 100% несоложеных зерен, и затертое с ферментной смесью, содержащей -амилазную активность, -глюканазную активность, активность протеазы, активность липазы и пуллуланазы, поддается фильтрации и обладает низкой мутностью, и, важно, RDF является высокой (выше 65%) и увеличивается с увеличением количества пуллуланазы NS26062 (PulC).

В таблице 17 ферментная смесь была такой, как описано выше, Термамил SC, Ultraflo Max, Нейтраза и Липозим TL в том же относительном количестве, но в этом примере изменяли количество смеси относительно количества сырьевого материала. Все смеси были с добавленной 1,0 PUN пуллуланазы (NS26062).

Таблица 17 Различные дозы ферментной смеси
Ферменты	Фильтрация	Плато	рН	NTU	RDF%
мл через 10 минут	всего мл
100% ферментная смесь	159	206	13,06	5,70	3	72,0
125% ферментная смесь	169	208	13,12	5,70	4	72,0
150% ферментная смесь	164	204	13,12	5,70	3	72,4
175% ферментная смесь	145	204	13,06	5,70	3	72,9
200% ферментная смесь	147	205	13,10	5,70	3	72,9
300% ферментная смесь	150	204	13,21	5,70	3	73,5

Со всеми тестированными количествами ферментных смесей, содержащих -амилазную активность, -глюканазную активность, активность протеазы, активность липазы и пуллуланазы, полученное сусло обладало очень большой величиной RDF выше 70%, она немного увеличивалась с увеличением количеств ферментной смеси. Однако высокую RDF и хорошую способность к фильтрации получали с 2 кг/1000 кг ферментной смеси/сырьевого материала, что соответствует 100% ферментной смеси. Важно, что общее время затирания составляло 2 часа.