способ определения активности нейтральной коллагеназы
Классы МПК: | C12Q1/34 использующие гидролазу C12N9/50 протеиназы C12N9/52 получаемые из бактерий C12N9/64 получаемые из животной ткани, например реннин |
Автор(ы): | Замыслова Т.И., Кухарева Л.В., Фейгельман Б.И. |
Патентообладатель(и): | Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток |
Приоритеты: |
подача заявки:
1991-05-08 публикация патента:
30.04.1995 |
Использование: энзимология, медицинская биохимия, пищевая промышленность. Сущность изобретения: навеску коллагена обрабатывают 0,5%-ным раствором красителя - активного оранжевого ЖТ при рН 8,0 и температуре 40°С в течение 2 ч (соотношение красителя и окрашиваемого вещества от 20 до 200 мас.%), отмывают водой от избытка красителя и высушивают при комнатной температуре. Составляют реакционную смесь, содержащую следующие концентрации реагентов, мг. %: испытуемая проба коллагеназы 5
0,2, окрашенный коллаген 500
20; трис 240
20; хлорид кальция 110
10; хлорид натрия 170
20; дистиллированная вода остальное; инкубируют при оптимальных значениях t и рН среды; после завершения реакции пробы разбавляют в 5 раз трис-буфером, фильтруют и определяют оптическую плотность окрашенных растворов при 510 нм. Коллагеназную активность рассчитывают по формуле: A = 377,8 [CE/at]0,56, где A - активность коллагеназы, КЕ/мг; E - оптическая плотность фильтрата в 5-кратном разведении; a - оптическая плотность фильтрата после полного растворения 1 мг окрашенного коллагена; C - концентрация белка в испытуемой пробе, мас.%, t - время реакции, мин. 3 табл.
Рисунок 1





Формула изобретения
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛЬНОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ, включающий инкубацию предварительно окрашенного коллагена с испытуемой пробой в трис-буфере в присутствии хлорида кальция, охлаждение, фильтрование и определение оптической плотности фильтрата, отличающийся тем, что коллаген окрашивают активным оранжевым ЖТ, в реакционную смесь добавляют хлорид натрия при следующем соотношении компонентов, мг. Испытуемая проба коллагеназы 5
Окрашенный коллаген 500

Гидроксиметиламинометан (трис) 240

Хлорид кальция 110

Хлорид натрия 170

Дистиллированная вода Остальное
а коллагеназную активность рассчитывают по формуле

где A активность коллагеназы, КЕ/мг;
E оптическая плотность фильтрата в 5-кратном разведении при 510 нм;
a оптическая плотность фильтрата при полном "переваривании" 1 мг коллагена;
C концентрация белка в испытуемой пробе, мас. t время реакции, мин.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к энзимологии, пищевой промышленности, а также медицине и может быть использовано для контроля препаратов коллагеназы. Известен способ определения активности коллагеназы путем инкубирования в течение 48 ч при 37оС ряда разведений испытуемой пробы в изотоническом растворе хлорида натрия с проколлагеновой пленкой диаметром 2 мм, содержащей 1,5 мг белка, в присутствии хлорида кальция с последующим выявлением максимального разведения пробы, обеспечивающего полный лизис пленки (Временная фармакопейная статья ВФС 42-1356-83). Этот способ нестандартный и неудобный для использования из-за трудоемкости предварительной процедуры приготовления проколлагеновой пленки из хвостов крыс. Его низкая точность обусловлена также шагом разведения испытуемой пробы. Известен также способ определения активности коллагеназы в фермент-субстратной реакции со стекловидным телом глаза в течение 30 мин при 37оС с последующей остановкой реакции прогреванием и учетом ее результата по времени высыхания реакционной смеси (авт.св. СССР N 1173317, кл. G 01 N 33/48, 1983). Этот способ также неудобен и неточен из-за используемого субстрата и визуальной оценки результата. Возможно также определение коллагеназной активности путем инкубирования анализируемой пробы с коллагеном и последующего учета реакции по концентрации оксипролина (Schalinatus E. Behnke U. Ruttloff H./Nahrung, 1978. Вd 22, s. 401-408). Данный способ трудоемкий, дорогой и требует дефицитных реактивов при проведении операции аминокислотного анализа. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности коллагеназы в реакции расщепления коллагена, предусматривающий инкубирование коллагена, предварительно окрашенного конго красным, с испытуемой пробой в трис-буфере в присутствии хлорида кальция с последующим охлаждением (для остановки реакции), фильтрованием и фотометрированием продукта реакции (Полонская Л.Б. Рассулин Ю.А. Цыганкова В.Н. и Раджабов Л.Р. Метод определения коллагенолитической активности с нерастворимым конго коллагеном. Лабораторное дело, 1974, N 4, с.213-216). Однако этот способ обладает низкой точностью. Целью изобретения является повышение точности способа. Установлено, что низкая точность прототипного способа обусловлена нестойкостью красителя (конго красного), который частично переходит в фотометрируемый раствор даже в отсутствии коллагеназы, тем самым искажая результат измерения. В предлагаемом способе произведена замена красителя на активный оранжевый ЖТ (выпускается согласно ТУ-6-14-625-85). При этом в реакционную смесь дополнительно вносят хлорид натрия и устанавливают в ней следующее соотношение ингредиентов, мг, Испытуемая проба коллагеназы 5




В данном составе реакционной смеси принципиально весовое соотношение фермента и субстрата, которое равно 1:100 (5:500=1:100). Это соотношение обеспечивает динамический режим реакции, заложенный в формулу учета ее результата. Для учета реакции дополнительно определяют концентрацию белка в пробе и оптическую плотность фильтрата при полном растворении коллагена, что осуществляют ее постановкой при избытке фермента, либо при соответствующем увеличении длительности инкубирования реакционной смеси. О результате анализа судят по формуле:
A=377,8

Е оптическая плотность фильтрата в пятикратном разведении при длине волны 510 нм;
а оптическая плотность фильтрата при полном растворении 1 мг коллагена;
С концентрация белка в испытуемой пробе, мас. t время реакции, мин. Формула (1) получена с помощью нелинейного регрессионного анализа результатов определения активности 9 серий препаратов коллагеназы (по 3 измерения для каждой серии) предлагаемым способом и референс-методом, регламентированным ВФ 42-1356-83 (описан выше). П р и м е р 1. Навеску 10 г коллагена из дермы крупного рогатого скота (пр-во "Олайне") обрабатывают 0,5%-ным раствором красителя активного оранжевого ЖТ (ТУ 6-14-625-85) при рН=8,0 в течение 2 ч при 40оС, затем промывают водой от избытка красителя и высушивают при комнатной температуре. Отношение краситель/коллаген от 20 до 200 мас. В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 3,5 мас. белка. В 6 пробирок вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан(трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду, при следующих концентрациях реагентов, мг, Испытуемая проба коллагеназы 5 Коллаген 500 Гидроксиметил- аминометан (трис) 240 Хлорид кальция 110 Хлорид натрия 170 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов. Смеси инкубируют при 37оС и оптимальном значении рН, причем 3 пробирки инкубируют в течение 40 мин, а другие 3 пробирки в течение 48 ч. В последних трех пробирках экспозиция обеспечивает полное растворение коллагена; их инкубируют один раз для каждой партии коллагена. По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфера, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е 0,135


A=377,8




П р и м е р 2. В качестве субстрата используют окрашенный оранжевый ЖТ коллаген, полученный в примере 1. В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 2,7 мас. белка. В 3 пробирки вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан (трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующих концентрациях реагентов, мг Испытуемая проба коллагеназы 4,8 Коллаген 520 Гидроксиметил- аминометан (трис) 220 Хлорид кальция 100 Хлорид натрия 150 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов. Смесь инкубируют при 37оС в течение 80 мин. Реакцию до полного растворения коллагена не ставят, так как используют ту же партию коллагена, что и в примере 1. По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфера, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е=0,163



A=377,8




П р и м е р 3. В качестве субстрата используют окрашенный оранжевый ЖТ коллаген, полученный в примере 1. В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 3,2 мас. белка. В 3 пробирки вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан (трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующих концентрациях реагентов, мг Испытуемая проба коллагеназы 5,2 Коллаген 480 Гидроксиметил- аминометан (трис) 260 Хлорид кальция 120 Хлорид натрия 190 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов. Смеси инкубируют при 37оС в течение 100 мин. Реакцию до полного растворения коллагена не ставят, так как используют ту же партию коллагена, что и в примере 1. По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфере, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е0,182



A=377,8




П р и м е р 4. Шесть выемок одной и той же пробы препарата коллагеназы с содержанием белка С 4,1 мас. анализируют при различном соотношении ингредиентов реакционной смеси, указанном в табл.1. Для анализа используют окрашенный как описано в примере 1, оранжевым ЖТ коллаген с оптической плотностью 1 мг полного перевара а 0,132. Анализ проводят как в примере 2 при длительности инкубирования проб t 50 мин. Оптические плотности фильтратов и соответствующие им значения коллагеназной активности, рассчитанные по формуле (1), приведены в табл.1. Как видно из табл. 1 при предлагаемом соотношении ингредиентов погрешность измерений не превышает 5% (104,7-100,0=4,7%). В запредельных режимах вариация измерений составляет: 108,8-95,213,6%
При пятикратном анализе той же пробы методом лизиса проколлагеновой пленки (референс-метод) установлена ее активность, равная 102

Класс C12Q1/34 использующие гидролазу
Класс C12N9/52 получаемые из бактерий
Класс C12N9/64 получаемые из животной ткани, например реннин