производные 2-(3,4-дигидроксифенил)-этиламина, проявляющие иммунотропную активность и обладающие способностью тормозить репликацию вируса

Формула изобретения

1. Производные 2-(3,4-дигидроксифенил)-этиламина общей формулы



где R₁ R₂ (C(O) C₆H₄NO₂, C(O)CH(CH₃)₂, C(O)CH/(C₃H₇)₂, C(O)C₆H₁₁, C(O)CH₂C₆H₁₁, C(O)CH₂C₅H₉, C(O)CH₂Cl, C(O) (CH₂)₃ Cl, C(O) (CH₂)₄Cl, SO₂C₆H₄CH₃, SO₂C₆H₄Cl,



или R₁ H, а R₂ имеет указанные значения,

проявляющие иммунотропную активность.

2. N-{ 2 [3,4-Бис(изобутирилокси)фенил]этил} изобутириламид, обладающий способностью тормозить репликацию вируса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к производным 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина, которые проявляют иммунотропную активность и обладают способностью тормозить репликацию вируса.

Известны структурные аналоги заявляемых соединений, обладающие другими видами активности. Так, препарат ибопамин, обладающий спазмолитическими свойствами, применяется в качестве сердечно-сосудистого средствам [1] а этиловый эфир 3,4-дикарбокси- -фенетилкарбаминовой кислоты проявляет антидепрессивную [2] и антипаркинсоническую [3] активность. Иммунотропная активность и способность тормозить репликацию вируса среди структурных аналогов заявляемых соединений неизвестны.

В настоящее время для лечения заболеваний, связанных с иммунными нарушениями, широко применяется препарат левамизол [4] недостатком которого является достаточно высокая токсичность (ЛД₅₀ составляет 50 мг/кг).

Целью изобретения являются производные 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина, проявляющие иммунотропную активность, способность тормозить репликацию вируса и обладающие низкой токсичностью.

Поставленная цель достигается производными 2-(3,4-дигидрокси)этиламина общей формулы

RCH₂CH₂NHR² где R¹=R² C(O)C₆H₄NO₂, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)C₆H₁₁, -C(O)CH₂C₆H₁₁, -C(O)CH₂C₅H₉, -C(O)(CH₂)₄Cl, -C(O)(CH₂)₃Cl, -C(O)CH₂Cl, -C(O)-CH(C₃H₇)₂, -SO₂C₆H₄CH₃, -SO₂C₆H₄Cl, или R¹=H, a R² принимает указанные значения.

Указанные соединения получают известным способом по методу Эйнгорна при взаимодействии гидрохлорида дофамина с хлорангидридами кислот в пиридине. Данные элементарного анализа, температуры плавления, выходы синтезированных соединений, параметры ИК-спектров представлены в табл.1.

П р и м е р 1. Получение N-{2-[3,4-бис-(4-нитробензоилокси) фенил]этил} -4-нитробензамида (соединение 1).

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником, загружают 3 г дофамина и 40 мл пиридина. Реакционную массу охлаждают в бане со льдом до температуры 52^оС. Затем при перемешивании добавляют 9 г хлорангидрида 4-нитробензойной кислоты. Реакционную массу перемешивают при 5-10^оС в течение 2 ч. Отфильтровывают образовавшийся гидрохлорид пиридина, маточный раствор выливают в охлажденную воду ( 100 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2-3 ч, выпавший продукт кристаллизуют 20 ч. Осадок N-{2-[3,4-бис-(4-нитробензоилокси)фенил] этил} -4-нитробензамида отфильтровывают, промывают подкисленной водой и спиртом, сушат на воздухе до постоянной массы. Получают 7,5 г белого с желтоватым оттенком кристаллического порошка. Т.пл. 205-208оС. Выход продукта составляет 79,1% на взятый в реакцию дофамина гидрохлорид. Очистку продукта осуществляют перекристаллизацией из диметилформамида или из ацетона. Структура соединения подтверждена элементным анализом, методами ИК- и ПМР-спектроскопии (см. табл.1).

Аналогично получены соединения 2-12.

П р и м е р 2. Получение N-{2-[4-хлорбутилкарбокси)-3-оксифенил] этил} -4-хлорбутилкарбоксамид (соединение 13).

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, капельной воронкой и обратным холодильником, загружают 3 г дофамина и 40 мл пиридина. Реакционную массу охлаждают до температуры 52^оСМ. Затем при перемешивании добавляют 5,0 г хлорангидрида -хлорвалериановой кислоты. Реакционную массу перемешивают при 5-10^оС в течение 2 ч. Отфильтровывают гидрохлорид пиридина, маточный раствор выливают в охлажденную воду ( 100 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Воду декантируют, оставшийся маслянистый осадок сушат в вакууме на масляном насосе до постоянной массы. Продукт очищают на хроматографической колонке (d 2 cм) с силикагелем. Элюент хлороформ. Контроль за составом фракции ведут методом ТСХ на пластинах Силуфол УФ-254. Объединяют фракции, имеющие одинаковый состав. Растворитель отгоняют. Получают 0,8 г соединения 7 в виде слегка желтоватого масла и 1,9 г соединения 13 в виде белого с кремоватым оттенком кристаллического порошкам. Выход продуктов составляет 10,0 и 30,3% соответственно (см. табл.1).

Методом ПМР подтверждено строение вновь синтезированных триацильных (R₁= R₂= ацил; соед. 1-12) им диацильных (R₁=H, R₂=ацил; соед. 13 им 14) производных дофамина. Спектры ПМР сняты в ДМСО-d₆ на спектрометре ЯМР "Tesla" BS-587А (80 мГц); внутренний стандарт ТМС; температура образца 303 К. В спектрах ПМР гидрохлорида дофамина регистрируются следующие сигналы поглощения: широкий сигнал поглощения интенсивностью в две протонные единицы при 8,82 м. д. принадлежащий протонам гидроксильных групп; широкий сигнал поглощения протонов при четвертичном атоме азота интенсивностью в три протонные единицы при 8,02 м.д. сигналы поглощения ароматических протонов: Н-5, 6,69 м.д. I_5,6= 7,9 Гц; Н-2, 6,63 м.д. I_2,6 2,0 Гц; Н-6, 6,47 м.д. I_5,6 7,9 Гц.

В области 2,5-3,0 м.д. регистрируются неразрешенный мультиплет сигналов поглощения четырех алифатических протонов. В качестве примера рассмотрим спектры производных дофамина и хлорвалериановой кислоты (соед. 7 и 13).

В спектрах ПМР всех ацильных производных дофамина сигналы поглощения алифатических протонов ацильной части молекулы представляют собой сложные неразрешенные мультиплеты в области = 1,2-3,5 м.д. перекрывающиеся также с сигналами поглощения растворителя ДМСО и сигналом поглощения Н₂О (примесь в ДМСО). Поэтому, принимая во внимание данные спектра ПМР гидрохлорида дофамина, наиболее информативной областью спектров ПМР, полученных производных дофамина, представляется низкопольная часть этих спектров. В низкопольной части спектров триацильных производных зарегистрирован триплет сигнала поглощения амидного протона при 7,89 м.д. и I_NH1CH2 5,4 Гц и неразрешенный мультиплет трех ароматических протонов при 7,00-7,25 м.д. Для этих спектров характерно отсутствие сигналов поглощения гидроксильных протонов. В низкопольной части спектров ПМР диацильных производных дофамина зарегистрирован сигнал поглощения гидроксильного протона при 9,47 м.д. триплет сигнала поглощения амидного протона при 7,85 м.д. и I_NH1CH2 5,5 Гц, а также сигналы поглощения ароматических протонов:

Н-5, 6,88 м.д. I_5,6 8,1 Гц;

Н-2, 6,78 м.д. I_2,6 1,8 Гц;

Н-6, 6,60 м.д. I_6,2 1,8 Гц, I_5,68,1 Гц.

Таким образом, методом ПМР подтверждено наличие в молекуле производных дофамина трех и двух ацилов соответственно.

Наличие в спектре ПМР диацильного производного дофамина сигнала поглощения протона одной из гидроксильных групп позволяет установить с помощью специальных методик ПМР-спектроскопии положение свободной гидроксильной группы в ароматическом кольце молекулы.

При подавлении спин-спинового взаимодействия -метиленовых протонов молекулы дофамина с протонами ароматического кольца на частоте поглощения -метиленовых протонов наблюдается сужение сигналов поглощения протонов Н-2 и Н-6. Положение гидроксильной группы диацильного производного установлено на основании изменения интенсивности сигналов поглощения ароматических протонов при применении гомоядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). В экспериментах по ЯЭО при насыщении сигнала протона гидроксильной группы обнаружено заметное возрастание интенсивности сигнала поглощения протона Н-2. Это свидетельствует о пространственной близости последнего к гидроксильной группе диацильного производного, однозначно доказывающее, что гидроксильная группа находится в м-положении к группировке -СН₂СН₂NHR².

Иммунотропную активность оценивали по способности препаратов изменять:

образование антител к тест-антигенам (эритроциты барана);

реакцию гиперчувствительности замедленного типа;

реакцию "трансплантат против хозяина";

фагоцитарную активность нейтрофилов;

пролиферацию клеток костного мозга;

резистентность экспериментальных животных к инфекции,

В экспериментах использовались самцы мышей гибридов (СВАхС57В1)F1, и нелинейных мышей массой 20-25 г. Животные содержались при температуре 20-21оС при 12 ч режиме освещения, доступ к корму ad libitum.

Исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно или подкожно в виде суспензии в 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% Твин 80 (в отдельных экспериментах использовали 0,17% Твин 80). Контрольным животным вводили равный объем физиологического раствора, содержащего Твин 80. Инъекции проводили по схеме 0,1, 2 и -1, 0,1, где 0 день иммунизации. Для индукции антителообразования мышей иммунизировали эритроцитами барабан в дозе 107 клеток на мышь. Через 6 сут иммунизации мышей забивали и определяли титры гемагглютиминов и гемолитическую активность сыворотки спектрофотометрическим методом (А. А. Буркин, А.С.Лосев Хим. фарм. журнал. 1976, N 11, с. 41-45) в микромодификации. При использовании реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) мышей сенсибилизировали внутрибрюшинно клетками Staphylococcus albumen в дозе 510⁶ клеток на мышь. Через 5 сут в подушечку задней лапы вводили разрешающую дозу клеток Staphylococcus albumen 10⁷ клеток в 0,05 мл, через 24 ч измеряли разницу в массах контрольной и воспаленной лап.

В отдельных экспериментах в качестве тест-антигена использовали эритроциты барана, сенсибилизирующая доза 310⁷, разрешающая доза 10⁸клеток.

При определении влияния исследуемых соединений на фагоцитарную активность нейтрофилов через 24 ч после внутрибрюшинной инъекции препаратов отбирали кровь в раствор гепарина (конечная концентрация 10 ед/мл). Затем 0,1 мл крови смешивали с 0,05 мл суспензии клеток Staphylococcus albumen, инкубировали 30 мин при 37^оС, лизировали эритроциты с помощью 0,83% NH₄Cl, делали мазки и фиксировали спиртом. После окрашивания по Рамоновскому-Гимзе подсчитывали число фагоцирующих клеток из 200 нейтрофилов (активность фагоцитоза) и среднее число микробных клеток, поглощенных одним нейтрофилом (фогоцитирующий индекс). При оценке активности нейтрофилов по продукции супероксидного радикала кровь, полученную в указанных условиях, смешивали в соотношении 1: 1 с 0,2%-ным раствором нитросинего тетразолия (НСТ), инкубировали 30 мин при 37^оС и делали мазки. Мазки окрашивали сафранином и подсчитывали число нейтрофилов, содержащих гранулы восстановленного нитротетразолия из 200 клеток.

При исследовании влияния на пролиферацию клеток костного мозга мышей забивали цервикальной дислокацией через 24 ч после однократного внутрибрюшинного введения препаратов. Затем в стерильных условиях извлекали большие берцовые кости, из которых с помощью среды 199 вымывали клетки костного мозга. После центрифугирования и промывки клетки культивировали в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций в течение 16 ч при 37^оС во влажной атмосфере с 5% СО₂. В инкубационную среду добавляли 10% эмбриональный телячьей сыворотки и ³Н-тимидин (1 мкм на лунку). По истечении времени инкубирования клетки переносили на бумажные фильтры FN-8. Фильтры высушивали, отмывали 2 раза по 5 мин физиологическим раствором, затем 5% ТХУ 24 при 4^оС и еще 2 раза по 5 мин 5% ТХУ. После засушивания просчитывали радиоактивность проб в сцинцилляторе ЖС-8 на счетчике.

Реакцию "трансплантат против хозяина" определяли в подколенных лимфатических узлах при локальном введении полуаллогенных клеток. Мышам, гибридам (СВАхС57В1)FI, в подушку задней лапы вводили 2 10⁷ клеток, выделенных из лимфатических узлов (паховых, подколенных, подмышечных, шейных) родительского генотипа линии СВА. В контрлатеральную лапу вводили такое же количество сингенных клеток из лимфатических узлов. Животным опытной группы в течение трех дней вводили исследуемые вещества, начиная за 24 ч до переноса лимфоцитов. На восьмые сутки мышей забивали цервикальной дислокацией, извлекали подколонные лимфатические узлы в раствор Хенкса и определяли их массу.

Реакцию оценивали по индексу реакции -ИР:

ИР

При изучении влияния препарата на резистентность мышей к инфекции использовали суточную культуру Salmonella enteritidis. Животных заражали подкожной инъекцией 510⁸ клеток на мышь. Исследуемые препараты вводили в течение 4 дней, начиная за сутки до заражения. Эффект препарата оценивали по средней продолжительности жизни животных в группе. При определении острой токсичности подсчитывали количество погибших мышей после однократной внутрибрюшинной инъекции суспензии исследуемых веществ. В качестве вещества сравнения был выбран хорошо известный иммуномодулятор левамизол. Необходимо отметить, что данные о его фармакологической активности противоречивы, в зависимости от иммунного статуса, дозы и схемы введения левамизол стимулирует или угнетает иммунитет (B. Renoux, Drugs, 1980, т.19, с. 89-99). Однако сочли возможным использовать его в качестве вещества сравнения, так как иммуномодуляторы, близкие по структуре и типу действия, отсутствуют и, кроме того, это наиболее изученный препарат. В связи с тем, что левамизол не влиял на пролиферацию клеток костного мозга, в этом эксперименте в качестве вещества сравнения использовали известный препарат метилурацилстимулятор лейкопоэза. При изучении влияния препаратов на резистентность мышей к инфекциям для сравнения использовали препарат "Бронхомунал" (ЛЕК, Югославия), применяемый для лечения бронхолегочных инфекций.

Результаты исследований иммунотропной активности заявляемых соединений представлены в табл.2-5.

Установлено, что производные 2-(3,4-диоксифенил)этиламина способны изменять активность иммунной системы (табл.2, 3). Выраженность и направленность эффекта зависят от заместителя. Большинство из испытанных веществ стимулировало иммунологические реакции, вместе с тем соединение 14 угнетало клеточный иммунитет. Из исследованных соединений наибольшая иммуностимулирующая активность наблюдалась у соединений 1 и 2. Оба вещества выражено стимулируют образование антител к тест-антигену (табл.2), а препарат 1 в некоторой степени реакцию ГЗТ (табл.2). Кроме того, эти вещества нормализуют сниженную реакцию "трансплантат против хозяина" и пролиферацию клеток костного мозга (табл.4,5).

Исследование новых производных 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина на способность тормозить репликацию вируса проводили следующим образом.

СЕМ-SS клетки выращены в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки плода коровы, 2 мкМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина. Изолят ВИЧ-1 BRU был размножен путем инфицирования клеток CEM-SS. Начиная с 3 дня инфицирования среду собирали ежедневно и фильтровали на клетках СЕМ-SS. Штаммы вируса по порциям хранили при температуре -80^оС. Размножение ВИЧ-1 BRU в клетках СЕМ-SS измеряли путем подсчета синциций, продуцированных в течение 4 дней после инфицирования. Клетки СЕМ-SS были инфицированы 100-200 синциций образующих единиц ВИЧ на 400.000 клеток. После 30-минутной абсорбции отделяли остаточный свободный вирус. Инфицированные клетки ресуспендировали в среде RPMI, содержащей 10% сыворотки плода коровы, и вносили по 0,9 мл (400.000 клеток) в лунки 24-луночных планшетов. Затем добавляли по 0,1 мл различных растворов антивирусных препаратов и культивировали при 37^оС. Через 4 сут проводили подсчет синциций методом световой микроскопии. Ингибирование размножения вируса было подтверждено посредством сравнения активности обратной транскриптазы, связанной с частицей вируса, выделенной через 4 дня после инфицирования в присутствии или отсутствии препарата. Цитотоксичность определялась измерением уменьшения жизнеспособности неинфицированных клеток в присутствии препарата с помощью метода восстановления МТТ.

При испытаниях противовирусной активности использовали серии возрастающих концентраций препаратов. Приведенная в табл.6 величина соответствует максимальной концентрации исследуемого вещества, используемой в эксперименте. Активность препарата выражалась как минимальная концентрация, вызывающая торможение репликации вируса. В качестве вещества сравнения использовали азидотимидин.

Как видно из данных табл.6, азидотимидин подавляет репликацию вирусов в концентрации 0,01 мкМ, тогда как соединение 2 в концентрации 0,1 мкМ. Однако азидотимидин значительно токсичнее: в концентрации 0,1 мкМ наблюдается гибель 20% клеток, а соединение 2 даже в концентрации 10 мкМ не проявляет токсичности. Поэтому, учитывая оба эти фактора (активность и токсичность), следует считать эффекты заявляемого соединения 2 и азидотимидина сравнимыми. Исследования производных 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина на анти-ВИЧ-1 анализ свидетельствуют о том, что соединение 2 способно тормозить репликацию вируса.

В результате приведенных исследованных установлено, что производные 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина значительно менее токсичны, чем препарат левамизол. По иммуномодулирующей активности они не уступают препаратам сравнения, а по некоторым показателям превосходят их. Спектр иммунотропной активности этих соединений отличается от спектра активности левамизола. Левамизол, как известно, в основном активирует клеточные реакции, тогда как, например, соединения 1 и 2 более выражено стимулируют гуморальные реакции.

Указанные обстоятельства позволяют рекомендовать производные 2-(3,4-дигидроксифенил)этиламина в качестве потенциальных иммуностимулирующих лекарственных средств для терапии заболеваний, связанных с нарушением функции иммунной системы, а также в качестве средств для снижения побочных иммуносупрессивных влияний других лекарственных препаратов, например цитостатиков, и в качестве противовирусных средств.