6,9-дизамещенные 2-[транс-(-4-аминоциклогексил)амино]пурины

Формула изобретения

1. Соединение формулы



где R выбран из группы, состоящей из R2, R2NH- или H₂N-R3-, где R2 выбран из группы, состоящей из С₁-С₈алкила и



Z выбран из группы, состоящей из фенила, гетероцикла и циклоалкила,

каждый R4 независимо представляет собой водород или С₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

где каждый С₁-С₈алкил и Z необязательно замещены 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила;

R3 представляет собой С₁-С₈алкилен; и

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

2. Соединение по п. 1, где R представляет собой R2, где R2 является С₁-С₈алкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, OH и С₁-С₄алкила;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила, и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

3. Соединение по п. 2, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бутиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(октиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(5-гидрокси-1,5-диметил-гексил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[5-(гидрокси)пентиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-гидроксипропил)амино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пентиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(метиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(этиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбутил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[бутил)амино] -9-(2-пропил)пурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(гексиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пропиламино)-9-циклопентилпурина или дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифтор-этиламино]-9-циклопентилпурина.

4. Соединение по п.1, где R представляет собой R2, где R2 представляет собой



где Z является фенилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила, и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

5. Соединение по п.4, которое представляет собой дигидрохлорид (S)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(3-иодбензиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-хлор)бензиламино]-9-(2-пропил)пурина, дигидрохлорид (R) 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-хлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(фенил)пропиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(фенил)этиламино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-гидроксифенил) этиламино]-9-циклопентилпурина, тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[бензиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина или дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-иод-бензил)амино] -9-(2-пропил)пурина.

6. Соединение по п.1, где R представляет собой R2, где R2 представляет собой



где Z является гетероциклом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

7. Соединение по п. 6, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-индолил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-пиридил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-пиридил)метиламино] -9-циклопентилпурина, тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[3-(4-морфолинил)пропиламино] -9-циклопенпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(2-пиридил)этиламино] -9-циклопентилпурина, тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(4-морфолинил)этиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-амино-циклогексил)амино] -6-[(2-бензимидазолил)метиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(2-фуранметиламино]-9-циклопентилпурина, тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино] -9-(2-пропил) пурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(1-имидазолил)пропиламино] -9-циклопентилпурина или дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[3-(2-имидазолил)пропиламино]-9-циклопентилпурина.

8. Соединение по п.1, где R представляет собой R2, где R2 представляет собой



где Z является циклоалкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

9. Соединение по п. 8, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(циклогексил)метиламино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(циклопропил)метиламино] -9-(2-пропил)пурина или дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино]-9-циклопентилпурина.

10. Соединение по п. 1, где R представляет собой R2NH-, где R2 представляет собой С₁-С₈алкил, который необязательно замещен 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, OH и С₁-С₄алкила;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

11. Соединение по п. 10, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифторэтилгидразино] -9-циклопентилпурина, дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-гидроксиэтилгидразино]-9-циклопентилпурина.

12. Соединение по п.1, где R представляет собой R2NH-, где R2 представляет собой



где Z является фенилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, OH и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

13. Соединение по п. 12, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-фенетилгидразино] -9-циклопентилпурина.

14. Соединение по п.1, где R представляет собой R2NH-, где R2 представляет собой



где Z является гетероциклом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

15. Соединение по п.1, где R представляет собой R2NH-, где R2 представляет собой



где Z является циклоалкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и С₁-С₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-С₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

16. Соединение по п.15, где R представляет собой Н₂N-R3-, где R3 является С₁-С₈, алкиленом; и

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и его фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры.

17. Соединение по п. 16, которое представляет собой дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-аминобутил)амино] -9-циклопентилпурина или дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(8-аминооктил)амино]-9-циклопентилпурина.

18. Способ лечения гиперпролиферативного заболевания у пациента путем введения соединения по п.1.

19. Способ по п. 18, где гиперпролиферативным заболеванием является бластомное заболевание.

20. Способ по п. 18, где бластомное заболевание выбрано из лейкозы, карциномы, аденокарциномы, саркомы, меланомы или смешанного типа бластомы.

21. Способ по п.19, где лейкоз выбран из острого лимфобластного лейкоза, хронического лейкоза, острого миелобластного лейкоза и хронического миелоцитарного лейкоза.

22. Способ по п.19, где карцинома выбрана из карцином шеи, груди, простаты, пищевода, желудка, тонкого кишечника, ободочной кишки, яичников и легких.

23. Способ по п. 19, где аденокарцинома выбрана из аденокарцином шеи, груди, простаты, пищевода, желудка, тонкого кишечника, ободочной кишки, яичников и легких.

24. Способ по п.19, где саркома выбрана из эстеромы, остеосаркомы, липомы, липосаркомы, гемангиомы и гемангиосаркомы.

25. Способ по п.19, где меланома выбрана из амеланотической меланомы и меланотической меланомы.

26. Способ по п.19, где смешанный тип бластомы выбран из карциносаркомы, лимфоидного типа ткани, фолликулярного ретикулума, клеточной саркомы и болезни Ходжкина.

27. Способ предотвращения апоптоза нейронных клеток у пациента путем введения соединения по п.1.

28. Способ по п.21, где апоптоз вызван противоопухолевыми агентами.

29. Способ по п.21, где апоптоз вызван цереброваскулярным заболеванием.

30. Способ по п.21, где апоптоз вызван ударом или инфарктом.

31. Способ защиты нейронных клеток от апоптоза, включающий введение соединения по п.1.

32. Способ защиты нейронных клеток от повреждения, вызванного противоопухолевыми агентами, включающий введение соединения по п.1.

33. Композиция для защиты нейронных клеток от апоптоза или повреждения, вызванного действием противоопухолевого агента, включающая эффективное количество соединения по п. 1, находящегося в смеси или другом сочетании с инертным носителем.

34. Композиция для защиты нейронных клеток от апоптоза или повреждения, вызванного действием противоопухолевого агента по п.33, включающая эффективное для ингибирования cdk-2 количество соединения по п.1, находящегося в смеси или другом сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к 6,9-дизамещенным 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] пуринам и к способам применения их в качестве противоопухолевых (антибластомных) агентов или для лечения нервных повреждений и дегенерации.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Клеточное деление, как в нормальных, так и в опухолевых клетках, является строго контролируемым событием, которое происходит по определенным стадиям. Покоящиеся клетки, которые не подвергаются активному делению, находятся в фазе ₀, как клетки, терминально дифференцированные, или находящиеся в состоянии временного покоя. Первая фаза представляет собой первую гэп (пробел) (G₁) фазу, в течение которой клетки готовятся к синтезу ДНК. В поздней фазе G₁, которая обозначена как точка рестрикции, или точка R, происходит вступление клетки в фазу S, в течение которой происходит синтез ДНК. По завершении фазы S клетки вступают во вторую гэп-фазу (G₂), в течение которой клетки готовятся к делению, что сопровождается митозом, или фазой М.

Первоначальные эксперименты по регуляции клеточного цикла обнаружили существование белка, названного "фактор ускорения созревания" (MPF), гетеродимера, обладающего киназной активностью. Позднее сравнение идентифицированных впоследствии белков и лежащих в их основе генов привело к обнаружению семейства генов дрожжей, известных как гены контроля клеточного деления (cdc). Дальнейшие эксперименты продемонстрировали, что некоторые из генов cdc кодируют киназы, и были позднее названы циклин-зависимые киназы (cdks). В результате этой повторной классификации некоторые белки клеточного цикла имели двойное обозначение, как, например, cdk1, известный также как cdc2. Киназный компонент MPF теперь идентифицирован как p34^cdc2, а регуляторная субъединица MPF теперь называется циклин В. Циклины вначале были идентифицированы как белки, уровни которых колебались в течение клеточного цикла и особенно снижались во время митоза. К настоящему времени идентифицированы животные циклины A-I и cdks 1-8. Были идентифицированы подтипы циклинов и cdks, такие как циклины В1 и В2, что дополнительно усложнило номенклатуру.

Дальнейшие исследования клеточной регуляции показали, что стадии клеточного деления осуществляются частично посредством модуляции циклинов и циклин-зависимых киназ (cdks). Циклины последовательно регулируют cdks и характеризуются гомологичной областью из 100 аминокислот, называемой "циклиновый бокс", которая участвует в связывании партнера протеинкиназы. Cdks являются близкородственными по последовательности и размеру (35-40 кД) и определяются как протеинкиназы, активируемые посредством связывания циклиновых регуляторных единиц. Cdks содержат постоянную расселину активного центра приблизительно из 300 аминокислот, которая является характеристичной для всех эукариотических протеинкиназ. Таким образом, как циклины, так и cdks оказываются в высокой степени консервативными семействами белков.

Выделение индивидуальных циклинов и cdks сделало возможным дальнейшую идентификацию ролей и взаимодействий каждого компонента в сменах фаз клеточного цикла. Избыточные уровни cdks сохраняются на всем протяжении клеточного цикла. Активация cdks происходит по мере синтеза циклинов и их связывания с каталитической субъединицей cdk, в результате происходит стимуляция серин/треониновой киназной активности cdk. Полная активация cdk требует фосфорилирования консервативного остатка треонина, расположенного в Т-петле, посредством киназы, активирующей циклин-зависимую киназу (САК), которая представляет собой комплекс cdk/циклин, состоящий из циклина Н и cdk7, а также третьего белка, массой приблизительно в 32 кД.

Инактивация cdk-циклинового комплекса может происходить в результате фосфорилирования треонинового и/или тирозинового остатка в АТФ-связывающем центре cdk, или в результате связывания одного из ряда эндогенных ингибиторных белков.

В фазе G₁ циклины типа D связываются с несколькими различными cdks, включая cdk2, cdk4, cdk5 и cdk6, но наиболее часто связываются с cdk4 и cdk6. Считается, что циклины типа D действуют как сенсоры фактора роста, которые связывают последовательность событий клеточного цикла с внешними сигналами. Комплексы циклин E-cdk2 появляются в клеточном цикле млекопитающих после комплексов циклин типа D-cdk. Синтез циклинов Е строго регулируется и происходит на стадии G₁ и ранней стадии S. Комплекс циклин E-cdk2 необходим в клетке для начала репликации ДНК.

Циклины G₁, циклин D и циклин Е, являются скоротечно продуцируемыми белками с периодом полужизни, составляющим около 20 минут. Считается, что короткий период полужизни связан с РЕSТ-последовательностью С-концевых областей этих белков, деградация которых по-видимому опосредуется через убикитиновый путь.

Циклины G₁, циклин А и циклин В, являются стабильными на протяжении всей интерфазы и специфически разрушаются при митозе посредством убикитинового пути. По-видимому, и циклин А, и циклин В2 разрушаются только при образовании комплекса с их партнером cdk [циклин A-cdk2 и циклин A/B-cdk1 (cdk2)]. Однако разрушение циклина В1 связано с целостностью митотического аппарата в конце метафазы. Если веретено неправильно собрано, или хромосомы неправильно выстраиваются, то разрушения циклина В1 не происходит.

Ретинобластомный белок (Rb), ядерный фосфопротеин массой 105 кД, является субстратом комплексов циклин-cdk из cdks-2, 4 и 6 в фазе G₁ и функционирует как один из главных проверочных регуляторов клеточного цикла посредством тщательно организованного фосфорилирования и дефосфорилирования. На стадиях G₀/G₁ Rb существует в гипофосфорилированном состоянии. По мере развития клеточных событий на поздней стадии G₁ происходит гиперфосфорилирование Rb с помощью D-циклиновых комплексов, что инактивирует Rb и ведет клетку к фазе S, приводя к развитию цикла и клеточному делению. Состояние гиперфосфорилирования Rb остается на стадии G₂. В процессе поздней фазы М происходит дефосфорилирование Rb, что возвращает его в гипофосфорилированное состояние. Фосфорилирование белка Rb изменяет его связывающие характеристики; в гипофосфорилированном состоянии Rb связывает и изолирует специфические факторы транскрипции, так же как E2F, связывание которых препятствует выходу из фазы G₁. По мере гиперфосфорилирования Rb под действием cdks происходит высвобождение факторов транскрипции, которые затем могут активировать транскрипцию генов, необходимую для развития фазы S, например тимидинкиназы, myc, myb, дигидрофолатредуктазы и ДНК-полимеразы-.

Локализация комплексов циклин-CDK также позволяет делать предположения о роли, которую каждый комплекс играет в метаболизме. Ядерные циклины А и Е связываются с р107 и р130, возможно потому, что они находятся в ядре. Циклин млекопитающих В1 накапливается в цитоплазме в фазе G₂ и перемещается в ядро в начале митоза. Циклин В ассоциируется с системой (аппаратом) веретена, в частности с чашами веретена, и считается, что циклин B-cdc2 киназа может быть включена в формирование веретена через фосфорилирующие компоненты митотической системы. Кроме того, циклин В1 является частью механизма обратной связи, обеспечивающего правильную сборку метафазной митотической системы. Человеческий циклин В2 является связанным почти исключительно с мембранным компартментом и, особенно, с аппаратом Гольджи. Циклин B2-cdc2 включается в демонтаж аппарата Гольджи, когда клетки вступают в митоз.

Сdс2-циклин В киназа является ключевым митотическим фактором, который, по-видимому, является высокoконсервативным, и считается, что она включена в процесс смены клеточных циклов во всех эукариотических клетках. Гистон H1 является субстратом для сdс2-циклина В; во время митоза гистон H1 селективно фосфорилируется по специфическим положениям, считается, что это является важным для конденсации хроматина. Комплекс сdс2-циклин В также фосфорилирует ламин, этот процесс является ответственным за разрушение ядерной ламины. Ядерная ламина состоит из полимера из ламиновых субъединиц, которые при митозе находятся в гиперфосфорилированном состоянии, и это фосфорилирование отвечает за их демонтаж. Ламины являются частью семейства белков промежуточных микрофиламентов, и сdс2-циклин В фосфорилирует ряд положений, фосфорилированных при митозе на цитоплазматических субъединицах промежуточных микрофиламентов, виментина и десмина. Таким образом, комплекс сdс2-циклин В включен в реорганизацию клеточной архитектуры при митозе.

Кроме того, сdс2-циклин В включен в реорганизацию микрофиламентов через фосфорилирование немышечного кальдесмона, белка массой 83 кД, который связывается с актином и кальмодулином и ингибирует активность актомиозиновой АТФазы. При митозе кальдесмон фосфорилируется с помощью сdс2-циклина В, что ослабляет его сродство к актину и побуждает его отделяться от микрофиламентов.

Сdс2-циклин В вовлечен в актомиозиновую микрофиламентную регуляцию через фосфорилирование миозина в сократительном кольце, которое разделяет клетку на две (цитокинез). В метафазе легкая регуляторная цепь миозина II (MLC) фосфорилируется по двум основным положениям N-конца. Фосфорилирование миозина предотвращает его взаимодействие с актином. В анафазе происходит дефосфорилирование этих двух положений.

Сdс2-циклин В также играет роль в реорганизации мембранного компартмента при митозе. Например, сdс2-циклин В фосфорилирует rab1Aр и rab4p. При фосфорилировании rab4p под действием сdс2-циклина В происходит его отделение от мембранного компартмента.

При митозе ингибируется большая часть видов транскрипции. Опять же, сdс2-циклин В играет роль в ингибировании роl III-опосредованной транскрипции посредством фосфорилирования TFIIIB. Сообщалось, что в pol I, pol II и роl III-опосредованной транскрипции участвуют несколько обычных факторов, таких как ТАТА-связывающий белок (ТВА), что вероятно, потому что сdс2-циклин В включен в ингибирование всех форм транскрипции при митозе.

Из-за важности комплексов циклин/cdk в запуске цикла клеточного деления они находятся под действием строгих регуляторных механизмов. Со времени их первоначального открытия было продемонстрировано, что циклины и cdks воздействуют на другие факторы транскрипции и белки, включенные в широкий диапазон клеточных метаболических путей. Cdk7 был идентифицирован как компонент фактора транскрипции IIH (TFIIH), который содержит киназную активность, направленную на С-концевой домен (CTD) РНК-полимеразы II. Позже было обнаружено, что cdk8, который выступает в паре с циклином С, фосфорилирует CTD РНК-полимеразы II, но, по-видимому, не обладает активностью САК. Таким образом, ясно, что в дополнение к регуляции клеточного цикла cdks принимают участие в широком диапазоне клеточных функций. Белки, ингибирующие CDK (CDIs), являются небольшими белками, которые связывают и инактивируют специфические комплексы циклин-CDK или мономерные CDKs. Такие ингибиторы могут быть сгруппированы в два семейства на основе их последовательностных и функциональных подобий. Семейство INK4 включает p15^INK4B, p16^INK4, p18 и р19, которые специфически связывают cdk4 и cdk6, p16^INK4 и p15^INK4B содержат четыре анкириновых повтора и, кроме того, что они имеют значительную степень гомологии, они кодируются соседними генами локуса 9р12.

Высокие клеточные уровни р16 приводят к инактивации cdk4, так как р16 связывает комплексы циклин D-cdk4 и циклин D-cdk6. Ген р16^INK4 (MTS1) считается потенциальным геном-супрессором опухолей, как подвергнутый реаранжировке (перестройке), делеции или мутации у широкого ряда опухолевых клеточных линий, а также некоторых первичных опухолей. В одном исследовании наследственной меланомы приблизительно половина семей имела зародышевые мутации гена р16^INK4. Rb является репрессором р16^INK4. Инактивация клеточного Rb, либо в результате мутации, либо под действием вирусных антигенов, коррелирует с повышенными уровнями р16^INK4. p16^INK4, p15^INK4B и p18 ингибируют связывание циклина D с cdk4 и cdk6.

Вторым семейством CDI является семейство Kip/Cip, которое включает p21^Cip,WAF-1, p27^Kip1 и р57^Kip2. p27^Kip1присутствует в пролиферирующих клетках в латентной или замаскированной форме. При стимуляции p27^Kiplразмаскировывается и связывается с комплексами циклин-СDК4/6, ингибируя их. Семейство белков Kip/Cip имеет высокую степень гомологии в области N-конца, которая связывает комплексы циклин-cdk. Семейство белков Kip/Cip предпочтительно связывает и ингибирует комплексы циклин-cdk, участвующие в фазах G₁ и S, в большей степени, чем комплексы, участвующие в фазе М.

p21 (известный также как WAF1, Cip1 и Sdi1) индуцируется под действием р53 и образует тройной комплекс с ядерным антигеном пролиферирующей клетки (PCNA), субъединицей ДНК-полимеразы в некоторых комплексах циклин-СDК2, включая комплексы с циклинами A, D1 и Е. Экспрессия p21^WAF-1 в растущих покоящихся и стареющих клетках коррелирует с его ролью как отрицательного регулятора вступления в фазу S. Уровень мРНК р21^WAF-1 повышается, когда клетки становятся стареющими или покоящимися, и после сывороточной стимуляции покоящихся клеток, и понижается, когда клетки вступают в фазу S. р21 инактивирует комплексы циклин E-cdk2, циклин A-cdk2 и комплексы циклин D1-, D2- и D3-cdk4.

Генетические анализы многочисленных человеческих опухолей обнаружили непропорциональные измененные количества белков клеточного цикла, и считается, что именно это отклонение вызывает образование неправильного клеточного цикла. Например, циклин D1 является прото-онкогеном bcl-1/PRAD1, который чрезмерно экспрессируется, или регуляция которого нарушена в ряде человеческих опухолей. Ген циклина D1/CCND1, локализованный в хромосоме 11q13, амплифицируется в ряде раковых опухолей, в основном карциномах груди и немаленьких клетках легких. Это коррелирует с наблюдением, что чрезмерная экспрессия циклина D1 является характерной особенностью опухолей со специфическим ампликоном 11q13. В широком ряде клеточных опухолевых линий и в некоторых первичных опухолях ген р16 подвергается перестройке, делении или мутации. Мутации cdk4, особенно мутация Arg24Cys, были идентифицированы в двух семьях с наследственной меланомой, не состоящих в родстве. Эта мутация была обнаружена у 11/11 пациентов с меланомой, 2/17 незатронутых и 0/5 супругов (Zuo, L., et al., Nature Genetics 12 1996:97-99). Эта мутация специфически влияет на домен p16^INK4a, связывающий cdk4, но не влияет на способность связываться с циклином D и образовывать функциональную киназу. В результате этой мутации комплекс циклин D/cdk4 является устойчивым к нормальному физиологическому ингибированию под действием p16^INK4a. Другие исследования демонстрируют, что приблизительно половина родственников с семейной меланомой показывают признаки связи с областью хромосомы 9р21, которая содержит ген p16^INK4a. Идентифицированные типы мутаций p16^INK4a включают нонсенс-мутацию, сплайсинговую донорную мутацию, неидентифицированную мутацию, которая препятствует транскрипции p16^INK4a, и 3 миссенс-мутации, которые не способны связываться с cdk4 и cdk6. Чрезмерная экспрессия cdk4, являющаяся результатом амплификации гена, была идентифицирована в исследовании 32 глиомных клеточных линий (Не, J., et al., Cancer Res. 54:5804-5807, 1994). Это изменение наблюдалось в десяти случаях с интактными генами р16. В результате генетического анализа глиомных клеточных линий обнаружено, что 24 из 32 глиомных клеточных линий имеют одно из двух генетических изменений, каждое из которых показывает, что увеличение киназной активности cdk4 является важным для развития глиальной опухоли. Cdk4 располагается на длинном плече хромосомы 12, и его чрезмерная экспрессия обнаруживается в некоторых опухолях как результат его амплификации в качестве компонента ампликона, который включает другие относящиеся к делу гены, такие как SAS и MDM2. Все вышеупомянутые условия приводят к активации cdk4. Было также опубликовано, что наблюдается чрезмерная экспрессия циклинов В1 и Е в клеточных линиях лейкемических и солидных опухолей, а также измененные формы экспрессии циклина Е при раке груди.

Гиперпролиферация клеток встречается при ряде болезненных состояний. Наиболее распространенными гиперпролиферативными заболеваниями являются бластомы, которые обычно называются в соответствии с первичным источником гиперпролиферативной ткани. Бластомы определяются как новообразования животной или растительной ткани, которые более или менее походят на ткань, из которой они возникли, но не выполняют физиологические функции, и по характеру являются доброкачественными, потенциально злокачественными или злокачественными. Бластомы возникают в результате утраты нормальных контрольных механизмов, приводящей к нерегулируемому росту. Бластомные клетки могут утратить дифференцировку и приобрести способность поражать локальные ткани и метастазировать. Бластомы могут развиваться в любом типе ткани любого органа в любом возрасте. Частота возникновения бластом и степень смертности при бластомах обычно увеличиваются с возрастом, некоторые бластомы имеют максимальную частоту возникновения в возрасте между 60 и 80 годами (например, простаты, желудка и прямой кишки). Однако другие бластомы имеют максимальную частоту возникновения в возрасте от рождения до 10 лет (например, острая лимфобластическая лейкемия). Диета, действие канцерогенов, особенно применение табака, и наследственная предрасположенность также влияют на частоту возникновения отдельных бластом.

Бластомные клетки отличаются от нормальных клеток по ряду важных аспектов, включая утрату дифференцировки, повышенную агрессивность и пониженную чувствительность к лекарствам. Другим важным отличием является нерегулируемый рост клеток, который, как считается, является результатом утраты этими клетками нормальных механизмов клеточного контроля, которые либо дезактивируются, обходятся, либо другим образом игнорируются, оставляя бластомные клетки пролиферировать без нормальных контрольных механизмов. Бластома представляет собой ненормальную тканевую массу, рост которой превышает рост нормальной ткани и не согласовывается с ним, и остается таким же избыточным после прекращения действия стимулов, которые вызвали это изменение.

Бластомы классифицируются либо как доброкачественные, либо как злокачественные. Доброкачественные бластомы обнаруживают медленный локализованный рост, который обычно является ограниченным благодаря заключению в капсулу из волокнистой соединительной ткани. Тогда как доброкачественные бластомы редко вызывают гибель организма, нелеченные злокачественные бластомы с большой вероятностью способны убить организм. Злокачественные бластомы обычно не капсулируются и проявляют большую скорость роста. Злокачественные бластомы часто захватывают окружающие ткани и сосуды и распространяются до удаленных мест тела. Злокачественные бластомы обычно описываются как "рак" или "опухоль", последний термин означает набухание.

Миелопролиферативные заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся ненормальной пролиферацией одной или нескольких гемопоэтических клеточных линий или элементов соединительной ткани. К миелопролиферативным заболеваниям обычно относят четыре заболевания: polycythemia vera (первичная polycythemia; Vaquez" Disease), миелофиброз (агногенная миелоидная метаплазия), хроническая миелогенная лейкемия и первичная (существенная) тромбоцитемия. Острая лейкемия, особенно эритролейкемия, и пароксизмальная nocternal гемоглобинурия также классифицируются как миелопролиферативные заболевания. Каждое из этих заболеваний идентифицируется в соответствии с его преобладающими признаками или местом пролиферации. Хотя каждое заболевание возникает в результате пролиферации различных клеток, показано, что они вызываются клональной пролиферацией, возникающей на уровне плюрипотентных стволовых клеток, которая вызывает в различных степенях ненормальную пролиферацию эритроидных, миелоидных и мегакариотических предшественников в костном мозге. Все миелопролиферативные заболевания имеют тенденцию оканчиваться острой лейкемией.

Лейкемии представляют собой злокачественные бластомы кровообразующих тканей. По меньшей мере два вируса связаны с появлением лейкемии у человека. Вирус Эпштейна-Барра связан с лимфой Беркитта, а человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус, называемый также вирус острой лейкемии/лимфомы человека (HTLV-1), связан с некоторыми Т-клеточными лейкемиями и лимфомами. Воздействие, особенно продолжительное, химических агентов, таких как бензол и некоторые антинеопластики, или ионизирующей радиации, генетическая предрасположенность (например, синдром Дауна) и некоторые семейные болезни (например, анемия Фанкони) приводят в предрасположенности к лейкемиям.

Развитие лейкемий, по-видимому, происходит через единственный клеточный цикл через две или более стадии с последующей пролиферацией и клональной экспансией. Лейкемии в настоящее время классифицируются в соответствии с их клеточной зрелостью; острые лейкемии представляют собой преимущественно недифференцированные клеточные популяции, а хронические лейкемии представляют собой более зрелые клеточные формы. Острые лейкемии далее подразделяются на лимфобластный (ALL, известный также как острая лимфатическая лейкемия) и миелоидный (AML, известный также как острый миелоцитарный, миелогенный, миелобластный, миеломонобластный) типы. Они могут далее классифицироваться по морфологическим и цитохимическим проявлениям в соответствии с французско-американско-британской (FAB) классификацией, или в соответствии с типом и степенью дифференцировки. Хронические лейкемии классифицируются либо как лимфоцитарные (CLL), либо как миелоцитарные (CML). CLL характеризуется появлением зрелых лимфоцитов в крови, костном мозге и лимфоидных органах. CML характеризуется преобладанием гранулоцитарных клеток разных стадий дифференцировки в крови, костном мозге, печени, селезенке и других органах.

Миелопролиферативный синдром (MDS) характеризуется как клонально-пролиферативное заболевание, в котором нормальный или гиперцеллюлярный костный мозг связан с анемией и дисмиелопоэзом. Гемопоэтические клетки, которые могут пролиферировать, включают эритроидные, миелоидные и мегакариотические формы. MDS является относительно новым обозначением группы заболеваний, известных как прелейкемия, рефракторные анемии, Ph-хромосома - отрицательная хроническая миелоцитарная лейкемия, хроническая миеломоноцитарная лейкемия и агногенная миелоидная метаплазия. Система FAB предоставляет дополнительную классификацию миелофиброзов.

Лимфомы представляют собой разнородную группу бластом, возникающих в ретикулоэндотелиальной и лимфатической системах. Основные типы лимфом представлены заболеванием Ходжкина и не-ходжкинской лимфомой, а также реже лимфомой Беркитта и микозом грибовидным. Заболевание Ходжкина является хроническим заболеванием с лимфоретикулярной пролиферацией неизвестного происхождения, которое может быть в локализованной или распространенной форме, и дополнительно классифицируется в соответствии с четырьмя гистопатологическими профилями. Не-ходжкинские лимфомы представляют собой разнородную группу заболеваний, включающих бластомную пролиферацию лимфоидных клеток, которые обычно распространяются по всему телу. Первые термины, лимфосаркома и саркома ретикулярных клеток, теперь заменены терминами, отражающими происхождение клетки и биологию заболевания. Классификация Раппапорта основана на гистопатологии; на степени дифференциации опухоли; и на том, является ли растущая структура диффузной или узелковой. Классификация Лукеса и Коллинза основана на происхождении клетки, а именно, происходит ли клетка от Т-клеток или от В-клеток, имеет ли клетка гистоцитарное (или моноцитарное) происхождение или не классифицируется. Международная рабочая комиссия Национального Института Рака (International Panel Working Formulation of the National Cancer Institute) распределяет по категориям не-ходжкинские лимфомы, используя вышеупомянутые классификации.

Лимфома Беркитта является в высокой степени недифференцированной В-клеточной лимфомой, которая имеет тенденцию включать другие места, отличающиеся от лимфатических узлов и ретикулоэндотелиальной системы. Лимфома Беркитта, в отличие от других лимфом, имеет специфическое географическое распределение, что позволяет предположить наличие неидентифицированного вектора насекомых и инфекционного агента. Это может быть герпетический вирус, такой как вирус Энштейна-Барра.

Микоз грибовидный представляет собой нераспространенную хроническую лимфому Т-клеток, которая прежде всего поражает кожу и иногда внутренние органы.

Дискразии клеток плазмы (PCDs), или моноклональная гаммапатия, представляют собой заболевания, характеризующиеся непропорциональной пролиферацией одного клона клеток, в норме участвующего в синтезе иммуноглобулинов (Ig), или присутствием структурно и электрофоретически гомогенных IG или субъединицы полипептида в сыворотке или моче. Вначале эти заболевания могут не иметь симптомов прогрессирующей явной бластомы (например, множественная миелома). Это заболевание является результатом непропорциональной пролиферации одного клона, продуцирующего специфические Ig: IgG, IgM, IgA, IgD или IgE.

Множественная миелома, называемая также как миелома клеток плазмы, или миеломатоз, представляет собой прогрессирующее бластомное заболевание, характеризующееся опухолями плазматических клеток костного мозга и чрезмерной продукцией интактных моноклональных Ig (IgG, IgA, IgD или IgE) или белка Бен-Джонса, который представляет собой свободные моноклональные легкие цепи k или . Диффузный остеопороз или дискретные остеолитические повреждения появляются в результате перемещения распространяющихся плазматических опухолевых клеток или остеокласт-активирующего фактора, секретирующегося злокачественными плазматическими клетками.

Макроглобулинемия или первичная, или макроглобулинемия Валденстрома, представляет собой дискразию плазматических клеток, включая В-клетки, которые в норме синтезируют и секретируют IgM. Макроглобулинемия отличается от миеломы и других PCDs, но походит на лимфаматозное заболевание. Многие пациенты имеют симптомы гипервязкости, утомления, слабости, кожного и слизистого кровотечения и так далее.

Заболевания тяжелых цепей представляют собой дискразию бластомных плазменных клеток, характеризующуюся чрезмерной продукцией гомогенных , , и тяжелых цепей Ig. Эти заболевания приводят к появлению неполных моноклональных Igs. Клиническая картина более напоминает лимфому, чем множественную миелому.

Гиперспленизм представляет собой синдром, при котором циркуляционная цитопения связана с спленомегалией. Для лечения пациентов с гиперспленизмом необходимо терапевтическое лечение лежащего в основе заболевания, но не спленэктомия. Лимфопролиферативные и миелопролиферативные заболевания являются некоторыми, но не единственными, заболеваниями, вызывающими гиперспленизм. Миелопролиферативные заболевания, вызывающие гиперспленизм, включают истинную полицитемию, миелофиброз с миелоидной метаплазией, хроническую миелогенную лейкемию и эссенциальную тромбоцитемию. Хроническая лимфоцитарная лейкемия и лимфомы (включая болезнь Ходжкина) являются специфическими лимфопролиферативными заболеваниями, которые могут вызывать гиперспленизм.

Легочная ткань является местом нахождения как доброкачественных, так и злокачественных первичных опухолей, а также метастазов раковых опухолей многих других органов и тканей. Курение сигарет вызывает ошеломляющий процент раков легких, оцененный как выше девяноста процентов случаев среди мужчин и около семидесяти процентов случаев среди женщин. Воздействие профессиональных агентов, таких как асбест, радиация, мышьяк, хроматы, никель, хлорметиловые эфиры, отравляющий газ, выделения из кухонной печи, также связано с раком легких. Наиболее распространенные типы рака легких представляют сквамозные клетки, маленькие и большие клетки и аденокарцинома.

Приблизительно девяносто пять процентов раков желудка составляют карциномы; менее распространенными являются лимфомы и лейомиосаркомы. Карциномы желудка классифицируют в соответствии с плотностным проявлением; выступающие, проникающие (опухоль имеет форму, хорошо выраженную границу и может изъязвляться) и распространяющиеся или смешанные, которые имеют характеристики двух других типов.

Раки поджелудочной железы могут быть экзокринными опухолями, которые в основном представляют собой аденокарциномы, чаще возникающие из клеток протоков, чем из ацинарных клеток, или эндокринными опухолями, которые включают инсулинемию. Гастрин-продуцирующие опухоли, включающие клетки не--типа, или в стенке двенадцатиперстной кишки, могут вызывать возникновение синдрома Золлингера-Эллисона, синдрома, обозначаемого как гипергастринемия. Иногда другие эндокринные нарушения, особенно связанные с паращитовидной железой, или гипофизом и надпочечниками, вызывают полигландулярное заболевание, известное как множественная эндокринная неоплазия (MEN). Не--клеточные опухоли островков могут вызывать синдром, известный как синдром Випома, который характеризуется продолжительной, с большим выделением воды, диареей.

Бластомы кишечника включают опухоли тонкого кишечника, опухоли толстого кишечника и рак ободочной и прямой кишки. Доброкачественные опухоли тонкого кишечника могут возникать из бластом тощей и подвздошной кишки, включающих лейомиомы, липомы, нейрофибромы и фибромы. Злокачественные опухоли тонкого кишечника, такие как аденокарциномы, не являются распространенными и обычно возникают в проксимальной тощей кишке. Пациенты с болезнью Крона тонкого кишечника более склонны к таким аденокарциномам, чем пациенты с болезнью Крона ободочной кишки. У пациентов с болезнью Крона опухоли имеют тенденцию появляться на периферии в обводной или воспаленной петлях кишечника. Карциноидные опухоли обычно возникают в тонком кишечнике, особенно в подвздошной кишке, и приблизительно в половине случаев обнаруживаются множественные опухоли. Повреждения могут встречаться в любом месте ЖК тракта, но, как правило, они обнаруживаются в желудке, тонком кишечнике или в дистальной ободочной кишке.

Опухоли толстого кишечника включают полипы ободочной и прямой кишки. Полипы представляют собой тканевую массу, образующуюся из кишечной стенки и выступающую в просвет кишечника. Полипы классифицируются на основе их гистологии как трубчатые аденомы, трубчатоворсинчатые аденомы, ворсинчатые аденомы, гиперпластические полипы, гамартомы, юношеские полипы, полипоидные карциномы, псевдополипы, липомы, лейомиомы и даже более редкие опухоли.

Злокачественные опухоли могут также возникать в заднем проходе и прямой кишке. Они представляют собой эпидермоидную (сквамозные клетки) карциному заднего прохода и прямой кишки, которая включает приблизительно от трех до пяти процентов ректальных и анальных раков.

В западных странах рак ободочной и прямой кишки является второй проблемой после рака легких с учетом ежегодно зарегистрированных случаев. В США около 75000 человек умерло от этих раковых заболеваний в 1989 г.; около 70% было обнаружено в прямой и сигмоидной ободочной кишках, и 95% представляли собой аденокарциномы.

Бластомы печени включают доброкачественные бластомы, которые являются относительно распространенными, но часто не определяются, и злокачественные бластомы. Гепатоцеллюлярная аденома является наиболее значительной доброкачественной бластомой печени. Асимптоматические небольшие гемангиомы встречаются в 1-5 процентах случаев у взрослых. Аденомы желчного канала и другие мезенхимные бластомы также встречаются, но относительно редко. Злокачественные бластомы печени являются наиболее распространенной формой опухолей печени, и печень часто является местом метастазирования, распространяемого через кровоток, обычно из первичных опухолей легких, груди, ободочной кишки, поджелудочной железы и желудка. В Африке и Юго-Восточной Азии случаи возникновения гепатоцеллюлярной карциномы связаны с вирусом хронического гепатита В. В Северной Америке, Европе и других областях редкого распространения у большинства пациентов в основе этого заболевания лежит цирроз. Фиброламеллярная карцинома является отдаленным вариантом гепатоцеллюлярной карциномы с характерной морфологией злокачественных гепатоцитов, опутанных ламеллярной фиброзной тканью. Фиброламеллярная карцинома обычно поражает относительно молодых взрослых людей и не имеет связи с уже существующими циррозом, инфекцией вируса гепатита В или другими известными факторами риска. Другие первичные злокачественные заболевания печени включают холангиокарциному (опухоль, возникающая из внутрипеченочного билиарного эпителия), гепатобластому (которая является одним из самых распространенных раковых заболеваний у детей) и ангиосаркому (которая связана с воздействием промышленного винилхлорида). Лейкемия и родственные заболевания могут включать ткани печени, считаясь результатом инфильтрации ненормальных клеток.

Синдромы множественной эндокринной неоплазии (MEN) представляют собой группу генетически различающихся семейных заболеваний, включающих аденоматозную гиперплазию и образование злокачественных опухолей в некоторых эндокринных железах. Были идентифицированы три различных синдрома. Тип I (MEN-I) характеризуется опухолями паращитовидной железы, островков поджелудочной железы и гипофиза. Тип II (MEN-II) характеризуется медуллярной карциномой щитовидной железы, феохромоцитомой и гиперпаратиреоидизмом. Тип III (MEN-III) характеризуется множественной невромой слизистой оболочки, медуллярной карциномой щитовидной железы и феохромоцитомой.

Карциноидный синдром обычно вызывается метастазирующими карциноидными опухолями кишечника, которые выделяют избыточные количества вазоактивных веществ, включая серотонин, брадикинин, гистамин, простагландины и полипептидные гормоны. Ненормальные уровни этих веществ вызывают ряд симптомов, часто эпизодическое кожное покраснение, цианоз, брюшной спазм, диарею и вальвулярное сердечное заболевание.

Бластомы костей и суставов могут быть доброкачественными или злокачественными. Доброкачественные опухоли костей включают остеохондромы (костно-хрящевые экзостозы), которые являются наиболее распространенными доброкачественными опухолями костей у детей в возрасте от 10 до 20 лет, доброкачественные хондромы (которые локализованы внутри кости), которые наиболее часто встречаются у детей и молодых взрослых людей в возрасте от 10 до 30 лет, хондробластому (которая возникает в эпифизе), которая является редким заболеванием, но наиболее распространена у детей в возрасте от 10 до 20 лет, хондромиксоидные фибромы, остеоид-остеому, опухоли гигантских клеток и фиброматозные повреждения. Первичные злокачественные опухоли костей включают остеогенную саркому (остеосаркому), которая является второй наиболее распространенной первичной опухолью костей, фибросаркомы, злокачественную фиброзную гистоцитому, хондросаркомы, мезенхимную хондросаркому, опухоль Юинга (саркому Юинга), злокачественную лимфому кости, множественную миелому и злокачественную опухоль гигантских клеток.

Первичные раковые опухоли других тканей могут метастазировать в костную ткань, наиболее распространенными являются карциномы, возникающие в груди, легких, простате, почках и щитовидной железе.

Бластомы центральной нервной системы обычно классифицируют в соответствии с органом. Первичные внутричерепные бластомы подразделяются на шесть классов: опухоли (1) черепа; (2) мозговой оболочки; (3) черепных нервов; (4) нейроглии и эпендимы; (5) гипофиза или шишковидной железы; и (6) опухоли, появившиеся при рождении. Бластомы черепа включают остеому, гемангиому, гранулему, ксантому и деформирующий остит. Бластомы мозговой оболочки включают менингиому, саркому и гломатоз. Бластомы черепных нервов включают глиому зрительного нерва и шванному 8-го и 5-го черепных нервов. Бластомы нейроглии включают глиомы и эпендимомы. Бластомы гипофиза или шишковидного тела включают аденому и пинеалому гипофиза. Бластомы, возникающие при рождении, включают краниофарингиому, хордому, герминому, тератому, дермоидную кисту, агиому и гемангиобластому.

Бластомы спинного мозга представляют собой поражения, которые сдавливают спинной мозг или его отростки, возникают из паренхимы спинного мозга, его отростков, оболочек или позвонков. Первичные бластомы спинного мозга распространены в значительно меньшей степени, чем внутричерепные опухоли. Метастатические поражения являются распространенными и могут возникать из карцином легких, груди, простаты, почек, щитовидной железы или лимфомы.

Бластомы мочеполовых органов встречаются в любом возрасте у обоих полов; однако они встречаются приблизительно в 30% случаев рака у самцов и в 4% случаев рака у самок. Аденокарцинома простаты составляет значительную часть злокачественных заболеваний у мужчин старше 50. Аденокарцинома простаты считается гормональной опухолью, и ее патология обычно является железистой. Карцинома почек, аденокарцинома, составляет только приблизительно от одного до двух процентов раковых заболеваний у взрослых, но большая часть твердых опухолей почек являются злокачественными. Опухоли Вильмса, эмбриональные аденокарциномы почек, встречаются у плода и часто не диагностируются в течение нескольких лет. Бластомы почечной лоханки и уретры являются гистологически подобными. Бластомы мочевого пузыря могут быть вызваны известными мочевыми канцерогенами, такими как анилиновые красители, наиболее распространенной является карцинома переходных клеток, менее распространенной является карцинома сквамозных клеток. Более редкие бластомы мочеполовых органов включают карциному уретры и пениса. Бластомы семенников считаются основными твердыми злокачественными опухолями у мужчин до 30 лет. Наиболее злокачественные тестикулярные опухоли возникают из примордиальных зачаточных клеток и классифицируются в соответствии с участвующими в них типами клеток.

Рак груди является наиболее распространенным раковым заболеванием у женщин. В США совокупный риск развития рака груди у женщин всех возрастов составляет приблизительно 10%, но смертность от этого заболевания составляет только 3,6%. Однако риск увеличивается с возрастом, при наличии фамильной истории раков груди, при воздействии радиации и даже диета участвует в увеличении риска.

Раковые опухоли груди обычно используют в качестве образцов для эстроген- и прогестерон-рецепторного анализа. Приблизительно две трети пациентов имеют рецептор эстрогена-положительные (ER+) опухоли груди. Считается, что прогестерон-положительные опухоли груди имеют функциональный рецептор эстрогена, и присутствие обоих рецепторов с большей вероятностью обеспечивает благоприятный ответ на эндокринное лечение, чем присутствие только одного рецептора. Эндокринная терапия, обычно тамоксифен, является предпочтительной для рецептор эстрогена-положительных опухолей. Эстрогены и андрогены также являются эффективными, но по сравнению с другими формами эндокринного лечения менее предпочтительными из-за их нежелательных побочных эффектов, вызываемых повышенными уровнями этих гормонов. Рак груди может метастазировать почти в любой орган тела, но наиболее распространенными местами метастазов являются легкие, печень, кости, лимфатические узлы и кожа.

Дольковая карцинома на месте (LCIS), или дольковая бластома, наиболее часто обнаруживается у женщин, находящихся в периоде, предшествующем менопаузе. Проточная карцинома на месте (DCIS) встречается у женщин как до, так и после менопаузы. DCIS образует пальпируемую массу. LCIS и DCIS составляют приблизительно 90% всех раковых заболеваний груди. Более редкие формы, медуллярные или трубчатые поражения, имеют несколько лучшие прогнозы.

Наиболее распространенные гинекологические бластомы представляют собой карциномы эндометрия, которые следуют четвертыми по частоте после раковых заболеваний груди, толстой кишки и легких у женщин. Карциномы эндометрия характеризуются клиническими стадиями, варьируя от состояния in situ на стадии 0, до метастазов в отдаленных органах на стадии IVB. Карциномы эндометрия обычно продуцируют эстроген и в настоящее время подходами к лечению являются хирургическое вмешательство и прогестероновая терапия.

Раковые заболевания яичников составляют приблизительно 18% всех гинекологических бластом. Приблизительно 80% злокачественных раковых заболеваний яичников возникает из эпителия яичников и классифицируется в соответствии с их гистологией. Опухоли могут также возникать из зачаточных клеток или стромы.

Карциномы вульвы составляют приблизительно 3-4% всех гинекологических бластом. Карциномы вульвы обычно встречаются после менопаузы, и приблизительно 90% из них являются карциномами сквамозных клеток. Приблизительно 4% являются карциномами базальных клеток, и остальные включают интраэпителиальные карциномы, аденокарциному бартолиновой железы, фибросаркому и меланому.

Вагинальная карцинома составляет приблизительно 1% гинекологических злокачественных заболеваний, с максимальной частотой заболевание возникает в возрасте от 45 до 65 лет. Приблизительно 95% вагинальных карцином представляют собой карциномы сквамозных клеток. Первичная карцинома фаллопиевых труб является редким заболеванием и обычно распространяется непосредственно или посредством лимфатической системы.

Трофобластное заболевание, или бластома трофобластного происхождения, может сопровождать внутри- или внематочную беременность. Дегенерирующая беременность приводит к возникновению пузырного заноса, 80% этого заболевания являются доброкачественными.

Бластомы могут возникать в ушном канале и влиять на слух. Также возникают церуминомы, которые являются злокачественными, несмотря на то что гистологическое проявление имеют доброкачественное, они лечатся путем хирургического удаления. Карциномы базальных и сквамозных клеток часто развиваются на наружном ухе в результате регулярного солнечного воздействия и тоже обычно лечатся путем хирургического удаления. Карциномы сквамозных клеток могут возникать в среднем ухе. Нехромаффинные параганглиомы могут возникать в височной кости.

Наиболее распространенной злокачественной опухолью носа и околоносовых пазух является карцинома сквамозных клеток; менее распространенными являются аденоидная кистозная и мукоэпидермоидная карциномы, злокачественные смешанные опухоли, аденокарциномы, лимфомы, фибросаркомы, остеосаркомы, хондросаркомы и меланомы.

Карцинома сквамозных клеток носоглотки более часто наблюдается у детей и молодых взрослых людей.

Наиболее распространенными злокачественными заболеваниями верхнего дыхательного тракта являются карциномы сквамозных клеток миндалин и гортани. Они обе более распространены среди мужчин и связаны с курением табака и потреблением этанола; приблизительно 85% пациентов с раковым заболеванием головы или шеи имеют историю потребления этанола или табака.

В голове и шее приблизительно 90% раковых заболеваний представляют собой карциному сквамозных клеток (эпидермоидную). Меланомы, лимфомы и саркомы являются относительно редкими формами первичных раковых заболеваний головы и шеи. Раковые заболеваний головы и шеи классифицируются в соответствии с размером и местом включения первичной бластомы; числом и размером метастазов в шейных лимфатических узелках; и наличием отдаленных метастазов.

Офтальмологические раковые заболевания могут возникать в коже век и могут быть доброкачественными или неопластическими. Распространенными доброкачественными опухолями являются ксантелазмы, которые образуют подкожно желто-белые плоские бляшки из липидных веществ. Более распространенными являются карциномы базальных клеток; лечение обычно представляет собой хирургическое удаление или радиационную терапию. Другими, менее распространенными, злокачественными опухолями являются карциномы сквамозных клеток или мейбомиевых желез и другие типы меланом. Наиболее распространенным злокачественным заболеванием глаз является злокачественная меланома собственно сосудистой оболочки глаза.

Опухоли также возникают в ткани кожи, они включают доброкачественные опухоли, такие как пигментный невус, липомы и т.п., а также злокачественные опухоли. Приблизительно 40-50% злокачественных меланом возникают из меланоцитов в пигментных невусах. Злокачественные раковые заболевания кожи представляют собой карциномы либо базальных, либо сквамозных клеток и часто возникают в областях кожи, подверженных воздействию солнца. Они являются наиболее распространенными злокачественными заболеваниями и заболеваемость ими растет. Менее распространенные злокачественные заболевания включают злокачественную меланому, болезнь Педжета сосков молочной железы или estramammary Patent"s, саркому Капоши (СК) и кожную Т-клеточную лимфому (грибовидный микоз). Заболеваемость СК растет в результате повышения заболеваемости СПИД. СК возникает приблизительно у одной трети пациентов, страдающих СПИД

Оральные раковые заболевания составляют приблизительно 5% раковых заболеваний у мужчин и 2% раковых заболеваний у женщин. Наиболее распространенной формой орального рака является карцинома сквамозных клеток. Заболеваемость увеличивается с возрастом и при наличии факторов риска, особенно потребления табака и алкоголя.

Хирургия является старейшей эффективной формой лечения бластом. Успех достигается в большой степени в тех случаях, когда бластома определяется на ранних стадиях и не метастазирует. Радиация также является важной формой терапии и является предпочтительной формой лечения многих бластом, таких как болезнь Ходжкина, ранние стадии не-ходжкинских лимфом и карциномы сквамозных клеток головы и шеи. Доказано, что радиация может с успехом применяться в дополнение к хирургии и противоопухолевым лекарственным препаратам.

Противоопухолевые лекарственные препараты также являются полезными для лечения бластом и классифицируются в соответствии с их механизмом действия. Доказано, что множественные комбинации, обычно противоопухолевых лекарственных препаратов с различными механизмами действия,

являются особенно эффективной терапией, допуская применение низких доз, и часто сводят к минимуму отрицательные побочные эффекты. Часто мишенью для противоопухолевых лекарственных препаратов являются фундаментальные клеточные процессы, необходимые для репликации или роста клеток.

Алкилирующие агенты, такие как мехлорэтамин и циклофосфамид, алкилируют ДНК и ограничивают ее репликацию.

Антиметаболиты, направленные на разрыв необходимых путей клеточного деления, включают:

Фолатные антагонисты связывают дегидрофолатредуктазу и препятствуют синтезу пиримидина. Фолатные антагонисты являются специфичными для фазы S. Метотрексат очень часто используется в качестве противоопухолевого фолатного антагониста.

Пуриновые антагонисты блокируют синтез пуринов de novo и являются специфичными для фазы S. Примером пуринового антагониста является 6-меркаптопурин.

Пиримидиновые антагонисты препятствуют деятельности тимидилатсинтазы, уменьшая продукцию тимидина, и являются специфичными для фазы S. Часто используемым пиримидиновым антагонистом является 5-фторурацил.

Цитарабин ингибирует ДНК-полимеразу и является специфичным для фазы S.

Растительные алкалоиды включают алкалоиды барвинка, такие как винбластин и винкристин, и подофиллотоксины, такие как этопозид. Растительные алкалоиды эффективны в метафазе и ингибируют митоз через ряд механизмов, включающих изменение белков микротрубочек.

Антибиотики включают доксорубицин и дауномицин, которые интеркалируют между цепями ДНК, что способствует ингибированию деспирализации ДНК; блеомицин, который вызывает разрезы в цепях ДНК; и митомицин, который ингибирует синтез ДНК, действуя как бифункциональный алкилирующий агент.

Нитрозомочевины включают кармустин и ломустин, они алкилируют ДНК или вызывают образование карбамоильных производных аминокислот в белках.

Неорганические ионы, такие как цисплатин, встраиваются между цепями ДНК и внутри цепей ДНК, ингибируя деспирализацию ДНК.

Модификаторы биологического ответа, такие как интерфероны, обладают антипролиферативным действием, но их специфическая роль неизвестна. Интерфероны включают (лейкоцитарный)интерферон, (фибробластный)интерферон и (лимфоцитарный)интерферон.

Ферменты, такие как аспарагиназа, также используются для воздействия на метаболические пути, играющие важную роль в раковых клетках. Аспарагиназа вызывает в клетках истощение аспарагина, от которого зависят лейкемические клетки.

Гормоны и их аналоги, такие как тамоксифен, флутамид и прогестерон, имеют неспецифические эффекты, но являются полезными для лечения некоторых бластом, которые, как известно, отвечают на гормоны, особенно бластом груди, яичников и простаты. Тамоксифен, часто использующийся для лечения бластом груди, переводит клетки в состояние покоя и связывается с рецептором эстрогена. Флутамид, часто использующийся для лечения бластом простаты, связывается с рецептором андрогена.

Цитокинины представляют собой природные и искусственные растительные регуляторы роста. Природные цитокинины имеют тенденцию быть неспецифическими ингибиторами различных протеинкиназ. Молекулярные механизмы, посредством которых цитокинины регулируют рост и деление клеток, еще определяются. Исследования показали, что цитокинины могут увеличивать доступность матрицы ДНК, активировать РНК-полимеразы, влиять на полиаденилирование и вторичную структуру мРНК и стимулировать образование и активность полирибосом. Считается, что цитокинины оказывают воздействие на клеточное деление путем взаимодействия с регуляторными белками клеточного цикла. И цитокинины, и циклин-зависимые киназы (cdks) действуют в многочисленных и подобных точках клеточного цикла, например, при сменах циклов G₁/S и G₂/M и в фазах S и М.

Оломоуцин, 6-(бензиламино)-2-[(2-гидроксиэтил)амино]-9-метилпурин, впервые был открыт как гербицид. Позже было обнаружено, что оломоуцин является искусственным цитокинином, который в микромолярных концентрациях специфично ингибирует некоторые cdks, включая киназу p34^cdc2/циклин В, но не влияет на другие основные протеинкиназы, такие как цАМФ- и цГМФ-зависимые киназы и протеинкиназу С. Недавно было показано, что оломоуцин имеет высокую селективность по отношению к CDC-циклинпротеинкиназам, но только умеренную ингибиторную активность с IC₅₀, равным приблизительно 7 мкМ. (Vesely, J., et al., Eur. J. Biochem., 1994, 224, 771-786). 2,4 ангстрем кристаллическая структура оломоуцина, кристаллизованная вместе с cdk2, показывает, что пуриновый фрагмент оломоуцина связывается в консервативном АТФ-связывающем кармане, тогда как бензиламиногруппа попадает в область активного центра, уникального для cdk2 киназ.

Росковитин, 2-(1-этил-2-гидроксиэтиламино)-6-бензиламино-9-изопропилпурин, является недавно синтезированным пурином, который, как было показано, обладает селективностью по отношению к некоторым циклин-зависимым киназам и является в 10 раз более активным, чем оломоуцин по отношению к cdk2 и cdc2 (Meijer, L., et al., Eur. J. Biochem., 243:527-536, 1997 и PCT/FR96/01905). Meijer et al. сообщают, что большинство киназ не ингибируется в значительной степени под действием росковитина. Однако сdc2-циклин В, cdk2-циклин A, cdk2-циклин Е и cdk5-p35 существенно ингибируются со значениями IC₅₀, составляющими 0,65, 0,7, 0,7 и 0,2 мкМ соответственно. Росковитин же показывает значения IC₅₀, превышающие 100 мкМ для cdk4-циклин D1 и cdk6-циклин D2.

Halvicek, L., et al., J. Med. Chem. (1997) 40:408-412 сообщают, что росковитин и родственные аналоги, замещенные по 2, 6 и/или 9 положениям, ингибирует p34^cdc2-циклин В киназы. Ни один из аналогов не имеет значений IC₅₀, превосходящих (R) энантиомер росковитина, который имеет значение IC₅₀, равное 0,2 мкМ. (S) энантиомер имеет значение IC₅₀, равное 0,8 мкМ; рацемическая смесь (R/S) имеет значение IC₅₀, равное 0,65 мкМ. Авторы делают вывод, что N⁶-бензиловый заместитель росковитина является более предпочтительным, чем изопентенильные или циклогексилметильные заместители.

Национальный Институт Рака (NCI) является в США правительственной организацией, направленной на открытие и развитие новых терапевтических продуктов для онкологии. В 1985 г. NCI установил новую стратегию скрининга раковых заболеваний, включающую клеточные линии человеческих опухолей и in vitro анализ в качестве первичного скрининга раковых опухолей. Всего шестьдесят клеточных линий человеческих опухолей, полученных из семи типов раков (легкого, ободочной кишки, меланомы, почек, яичников, мозга и лейкемии) были выбраны для включения в банк данных NCI (Grever, M.R., et al., Seminars in Oncology, 19: 1992:622-638). Методики используемых анализов также опубликованы в литературе. Американская коллекция типов тканей (АТСС) действует как хранилище для данных и других клеточных линий опухолей. Используемые клеточные линии человеческих опухолей включают следующие:

MCF7: гормон-зависимая аденокарцинома груди человека;

MDA-MB-231: гормон-независимая аденокарцинома груди человека;

НТ-29: аденокарцинома ободочной кишки человека, умеренно дифференцированная стадия II;

НСТ-15: аденокарцинома ободочной кишки человека;

А549: карцинома не-маленьких клеток легкого человека;

DMS-114: карцинома маленьких клеток легкого человека;

РС-3: гормон-независимая аденокарцинома простаты человека;

DU 145: гормон-независимая карцинома простаты человека.

Skehan, P. , et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990 создали подходящие методики применения таких опухолевых клеточных линий для скрининга противоопухолевых лекарственных препаратов.

Meijer, et al., упомянутыми выше, сообщалось, что росковитин ингибирует in vitro пролиферацию скрининга NCI рекомендованных заболеваний, т.е. 60 клеточных линий человеческих опухолей, включающих девять типов опухолей (лейкемию, рак не-маленьких клеток легкого, рак ободочной кишки, рак центральной нервной системы, меланому, рак яичников, рак почек, рак простаты, рак груди) со средним значением IC₅₀, равным 16 мкМ. Результаты по индивидуальным клеточным линиям не были опубликованы.

Два различных ингибитора cdk, флавопиридол и оломоуцин, подавляют гибель нейронных клеток РС12 и симпатических нейронов в двух модельных системах нейронов (Park et al., J. Biol. Chem. 271(14):8161-8169, 1996). Концентрация каждого из них, требующаяся для обеспечения выживания, коррелирует с количеством, необходимым для ингибирования пролиферации. Нейронный апоптоз является как важным аспектом развития нервной системы, так и компонентом нейронного повреждения и заболевания.

Клеточную линию РС12 первоначально получают из медуллярной феохромоцитомы надпочечника крысы. При выращивании в среде, содержащей сыворотку, клетки РС12 делятся и напоминают предшественников клеток мозгового слоя надпочечников и симпатических нейронов. При добавлении фактора роста нервной ткани (NGF) клетки РС12 приобретают фенотипические свойства симпатических нейронов. При удалении или сыворотки, или сыворотки и NGF, как наивные, так и дифференцированные в нейроны клетки РС12 впадают в апоптоз, что является ответом, аналогичным ответу симпатических нейронов.

Роль регуляции клеточного цикла в апоптозе может быть продемонстрирована путем удаления NGF или сыворотки, что приводит у клеток PC12 к некоординированному развитию клеточного цикла и гибели клеток. Ингибиторы cdk не предотвращают гибели этих пролиферирующих компетентных наивных РС12 клеток после удаления трофических добавок. Предполагают, что пост-митотически дифференцированные или симпатические нейроны после удаления NGF делают попытку несоответствующего повторного входа в клеточный цикл, что приводит к гибели клетки. Однако воздействие флавопиридола или оломицина, которые ингибируют cdks, предотвращает апоптоз в этих клетках.

Изменения в активности cdks и циклинов наблюдаются в процессе апоптоза многих различных типов клеток. Камптотецин- или араС-индуцированный апоптоз клеток HL60 связан с повышением активности cdc2 и циклин Е-ассоциированной киназной активности. Камптотецин-индуцированный апоптоз клеток RKO связан с увеличением экспрессии циклина D1.

Камптотецин вызывает апоптотическую гибель нейронов коры головного мозга крысы. Morris and Geller, J. Cell Biol. 134:757-770 (1996). Обработанные камптотецином непролиферирующие дифференцированные в нейроны клетки РС12 умирают в течение 6 дней после обработки, а культуральные симпатические нейроны крысы погибают в течение 5 дней после обработки, даже в присутствии NGF. Park et al., J. Neurosci. 17(4):1256-1270 (1997). Однако введение или обоих, или индивидуально оломоуцина и флавопиридола в присутствии или отсутствии камптотецина приводит к приблизительно 30% гибели клеток в течение 6 дней. Максимальная защита от гибели клеток РС12 или крысиных симпатических нейронов, наблюдается в присутствии 1 мкМ флавопиридола и 200 мкМ оломоуцина, что является минимальными концентрациями, которые полностью ингибируют синтез ДНК в пролиферирующих клетках РС12. Введение изо-оломоуцина, неактивного аналога оломоуцина, ослабляет защиту обработанных камптотецином нейронных клеток от гибели.

Было также показано, что флавопиридол и оломоуцин защищают корковые нейроны от камптотецин-индуцированной гибели. Park et al., J. Neurosci. 17(4): 1256-1270 (1997). Значения IC₅₀ флавопиридола и оломоуцина составляют соответственно 0,1 мкМ и 100 мкМ. Введение изо-оломоуцина ослабляет предотвращение клеточной гибели обработанных камптотецином нейронных клеток.

Существует несколько применений вышеприведенных наблюдений. Хорошо известно, что пациенты, подвергающиеся лечению облучением или противоопухолевыми агентами, испытывают нежелательные побочные эффекты, включающие развитие новых бластом или нежелательный клеточный апоптоз. Например, у некоторых пациентов с резистентным лейкозом, которых лечили высокими дозами араС, развивается синдром мозжечковой токсичности, характеризующийся утратой нейронов (Purkinje. Winkelman and Hinges, Ann Neurol. 14:520-527 (1983) и Vogel and Horouipian, Cancer 71:1303-1308 (1993)). Было опубликовано, что у некоторых пациентов, подвергающихся лечению цис-платиной, развиваются периферические невропатии. (Wallach, et al., J. Fla. Med. Assoc. 79:821-822 (1992) и Mansfield and Castillo, AJNR Am. J. Neuroradiol. 15:1178-1180 (1994)). С точки зрения этих наблюдений, при лечении бластом совместное или индивидуальное введение соединений настоящего изобретения будет уменьшать или предотвращать клеточный апоптоз, особенно повреждение нейронов, вызванный лечением противоопухолевыми агентами или радиацией.

Цереброваскулярное заболевание является самым распространенным случаем неврологической недееспособности в Западных странах. Основным специфическим типом цереброваскулярного заболевания является церебральная недостаточность, возникающая в результате временных нарушений тока крови, надлома, кровотечения, и артериовенозного порока развития. Под термином "удар" обычно подразумевают ишемические повреждения. При цереброваскулярном заболевании наблюдается нежелательный нейронный апоптоз. Лечение с помощью ингибиторов cdks может быть в таких случаях подходом к предотвращению повреждений и дегенерации нейронов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет новые соединения формулы (I)



где R выбран из группы, состоящей из R2, R2NH- или H₂N-R3-, где R2 выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила и



где Z выбран из группы, состоящей из фенила, гетероцикла и циклоалкила, каждый R4 независимо представляет собой водород или C₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

где каждый C₁-C₈алкил и Z необязательно замещены 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными и которые выбраны из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила;

R3 представляет собой C₁-C₈алкилен; и

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Настоящее изобретение представляет способ ингибирования развития клеточного цикла. Более конкретно, настоящее изобретение представляет способ ингибирования cdk2.

Настоящее изобретение также представляет способ предотвращения апоптоза нейронных клеток. Особенно предпочтительным способом настоящего изобретения является предотвращение апоптоза нейронных клеток, индуцируемого противоопухолевыми агентами или возникающего в результате цереброваскулярного заболевания. Другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения является способ предотвращения апоптоза, вызванного истощением кислорода. Более предпочтительное воплощение изобретения представляет способ предотвращения апоптоза, вызванного цереброваскулярным заболеванием. Другое предпочтительное воплощение изобретения представляет способ предотвращения апоптоза, вызванного ударом или инфарктом.

Настоящее изобретение представляет способ ингибирования развития бластом. Настоящее изобретение представляет способ лечения пациентов, страдающих от бластомного болезненного состояния, включающий введение соединения представленной формулы. Предпочтительно, чтобы вводимое количество являлось терапевтически эффективным количеством соединения данной формулы. В предпочтительном способе настоящего изобретения вводят одно соединение представленной формулы. Альтернативно, в предпочтительном способе настоящего изобретения вводят количество соединения данной формулы в сочетании с другими противоопухолевыми агентами.

Кроме того, настоящее изобретение представляет композицию, включающую анализируемое количество соединения формулы (I) в смеси или другом сочетании с инертным носителем. Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию, включающую эффективное ингибирующее количество соединения формулы (I) в смеси или другом сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет новые соединения формулы (I)



где R выбран из группы, состоящей из R2, R2NH- или H₂N-R3-,

где R2 выбран из группы, состоящей из C₁-C₈алкила и



где Z выбран из группы, состоящей из фенила, гетероцикла и циклоалкила, каждый R4 независимо представляет собой водород или C₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

где каждый C₁-C₈алкил и Z необязательно замещены 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила;

R3 представляет собой C₁-C₈алкилен; и

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Iа)



в которой R представляет собой R2, где

R2 представляет собой C₁-C₈алкил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Ib)



в которой R представляет собой R2,

R2 представляет собой



где Z является фенилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Iс)



в которой R представляет собой R2,

R2 представляет собой



где Z является гетероциклом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Id)



в которой R представляет собой R2,

R2 представляет собой



где Z является циклоалкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Ia")



в которой R представляет собой R2NH-,

R2 является C₁-C₈алкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Ib")



в которой R представляет собой R2NH-,

R2 представляет собой



где Z является фенилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (1с")



в которой R представляет собой R2NH-,

R2 представляет собой



где Z является гетероциклом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Id")



в которой R представляет собой R2NH-,

R2 представляет собой



где Z является циклоалкилом, необязательно замещенным 1-3 заместителями, которые могут быть одинаковыми или различными, выбранными из группы, состоящей из Hal, ОН и C₁-C₄алкила; каждый R4 независимо представляет собой водород или ₁-C₄алкил, а n является целым числом, равным 1-8;

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Кроме того, в объем формулы (I) попадают новые соединения формулы (Iе)



в которой R представляет собой H₂N-R3-, где

R3 представляет собой C₁-C₈алкилен; и

R1 выбран из группы, состоящей из циклопентила и изопропила,

и их фармацевтически приемлемые соли, оптические изомеры и гидраты.

Используемый в данном описании термин "гетероцикл" обозначает любой фрагмент замкнутого кольца, в котором один или несколько атомов кольца являются элементами, отличающимися от углерода, и включает, не ограничиваясь ими, следующие: пиперидинил, пиридинил, изоксазолил, тетрагидрофуранил, пирролидинил, морфолинил, пиперазинил, бензимидазолил, тиазолил, тиофенил, фуранил, индолил, 1,3-бензодиоксолил, тетрагидропиранил, имидазолил, тетрагидротиофенил, пиранил, диоксанил, пирролил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, оксазолил, пуринил, хинолинил и изохинолинил.

Используемый в данном описании термин "C₁-C₄алкил" относится к углеводородному радикалу с насыщенной или ненасыщенной, прямой или разветвленной цепью, состоящей из 1-4 атомов углерода, и включает, не ограничиваясь ими, следующие радикалы: метил, этил, пропил, изопропил, 1-пропенил, 2-пропенил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил и т.п.

Используемый в данном описании термин "C₁-C₈алкил" относится к углеводородному радикалу с насыщенной или ненасыщенной, прямой или разветвленной цепью, состоящей из 1-8 атомов углерода, и включает, не ограничиваясь ими, следующие радикалы: метил, этил, пропил, изопропил, 1-пропенил, 2-пропенил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, втор-бутил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, пентил, неопентил, гексил, гептил, октил и т.п.

Используемый в данном описании термин "C₁-C₈алкилен" относится к углеводородному радикалу с насыщенной или ненасыщенной, прямой или разветвленной цепью, состоящей из 1-8 атомов углерода, и включает, не ограничиваясь ими, следующие радикалы: метилен, этилен, пропилен, изопропилен, 1-пропенилен, 2-пропенилен, н-бутилен, изобутилен, трет-бутилен, втор-бутилен, 1-бутенилен, 2-бутенилен, 3-бутенилен, пентилен, неопентилен, гексилен, гептилен, октилен и т.п.

Используемый в данном описании термин "циклоалкил" относится к насыщенному или ненасыщенному алициклическому фрагменту, содержащему от трех до восьми атомов углерода, и включает, не ограничиваясь ими, следующие радикалы: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил и т.п.

Используемый в данном описании термин "Hal" относится к галогену и включает фтор, хлор, бром и иод.

Используемый в данном описании термин "оптический изомер" или "оптические изомеры" относится к любой из различных стереоизомерных конфигураций, которые могут существовать для данного соединения формулы (I).

Используемый в данном описании термин "гидрат" или "гидраты" относится к продукту взаимодействия одной или нескольких молекул воды с соединением формулы (I), в котором связь Н-ОН не расщепляется, и включает как моногидраты, так и мультигидраты.

Используемый в данном описании термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к продукту взаимодействия одной или нескольких молекул любой нетоксичной органической или неорганической кислоты с соединениями формулы (I). Иллюстративные неорганические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают хлористоводородную, бромистоводородную, серную и фосфорную кислоты и кислые соли металлов, такие как моногидрофосфат натрия и гидросульфат калия. Иллюстративные органические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают моно-, ди- и трикарбоновые кислоты. Примерами таких кислот являются, например, уксусная кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, фумаровая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, бензойная кислота, гидроксибензойная кислота, фенилуксусная кислота, коричная кислота, салициловая кислота, 2-феноксибензойная кислота и сульфоновые кислоты, такие как метансульфоновая кислота, трифторметансульфоновая кислота и 2-гидроксиэтансульфоновая кислота.

Соединения формулы (I) могут быть получены путем использования процедур и методик, хорошо известных и понятных рядовому специалисту в данной области. Общая синтетическая схема получения указанных соединений приведена в конце описания на схеме А, где все заместители, если не указано иначе, являются такими, как определено выше.

На схеме А, стадия а, 2,6-дихлорпурин подвергают взаимодействию с соответствующим спиртом структуры с образованием соответствующего 9-замещенного-2,6-дихлорпуринового соединения структуры используя методики и процедуры, хорошо известные рядовому специалисту в данной области.

Например, 2,6-дихлорпурин может взаимодействовать с соответствующим спиртом структуры в присутствии трифенилфосфина и диэтилазодикарбоксилата в подходящем безводном апротонном растворителе, таком как тетрагидрофуран. Реагенты обычно перемешивают вместе при комнатной температуре в течение периода времени от 5 часов до 5 дней. Полученный 9-замещенный-2,6-дихлорпурин структуры может быть выделен из зоны реакции экстракционными методами, известными в данной области, или, чаще, полученный 9-замещенный-2,6-дихлорпурин структуры выделяют путем удаления растворителя с последующей загрузкой непосредственно на колонку с силикагелем и элюированием подходящим растворителем, таким как метиленхлорид, или смесью растворителей, такой как смесь гексан и этилацетат. Неочищенный 9-замешенный-2,6-дихлорпурин структуры может быть затем очищен хроматографией или может быть использован на следующей стадии без очистки.

На стадии b 6-хлор-функциональная группа 9-замещенного-2,6-дихлорпурина структуры подвергают взаимодействию с соответствующим амином структуры с образованием соответствующего 9-замещенного-6-амино-2-хлорпуринового соединения структуры

Например, 9-замещенный-2,6-дихлорпурин структуры может взаимодействовать с соответствующим амином структуры в подходящем безводном полярном растворителе, таком как метанол. Реагенты обычно перемешивают вместе при температуре кипения с обратным холодильником в течение интервала времени от 30 минут до 3 дней. Полученный 9-замещенный-6-амино-2-хлорпурин структуры выделяют из зоны реакции экстракционными методами, известными в данной области, или, если 9-замещенный-6-амино-2-хлорпурин структуры осаждается из раствора, его можно выделить фильтрованием.

На стадии с 2-хлор-функциональная группа 9-замещенного-6-амино-2-хлорпурина структуры подвергают взаимодействию с 1,4-циклогександиамином с образованием соответствующего соединения формулы I.

Например, соответствующий 9-замещенный-6-амино-2-хлорпурин структуры может взаимодействовать с молярным избытком 1,4-циклогександиамина Реагенты обычно помещают в пробирку, выдерживающую давление, герметично закрывают и нагревают при температуре приблизительно от 80^oС до 150^oС в течение периода времени от 30 минут до 3 дней. Полученное соединение формулы I выделяют из зоны реакции экстракционными методами, известными в данной области, и оно может быть очищено хроматографией.

Исходные вещества для использования в общих синтетических процедурах, изображенных на схеме А, являются легко доступными для рядового специалиста в данной области.

Следующие примеры представляют типичные синтезы, описанные схемой А. Указанные примеры должны пониматься только как иллюстративные и не имеется в виду, что они каким-либо образом ограничивают объем настоящего изобретения. В данном описании следующие термины имеют определенные значения: "г" относится к граммам; "ммоль" относится к миллимолям; "мл" относится к миллилитрам; "тк" относится к точке кипения; "^oС" относится к градусам Цельсия; "мм Нg" относится к миллиметрам ртутного столба; "мкл" относится к микролитрам; "мкг" относится к микрограммам; и "мкМ" относится к микромолям.

Пример 1

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(3-иодбензиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия а: 2,6-дихлор-9-циклопентилпурин

Циклопентанол (260 мг, 3,02 ммоль), 2,6-дихлорпурин (680 мг, 3,60 ммоль) и трифенилфосфин (950 мг, 3,60 ммоль) растворяют в сухом ТГФ (20 мл) и охлаждают до 0^oС. По каплям добавляют диэтилазодикарбоксилат (570 мкл, 3,60 ммоль) в течение 15 минут в атмосфере азота. Полученный раствор перемешивают в течение 60 часов при комнатной температуре. Растворитель выпаривают в вакууме, загружают непосредственно на колонку с силикагелем и элюируют метиленхлоридом, получая указанное в заголовке соединение в виде неочищенной смеси.

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(3-иодбензил)амино-9-циклопентилпурин

2,6-Дихлор-9-циклопентилпурин (620 мг, неочищенный), гидрохлорид 3-иодбензиламина (810 мг, 3,00 ммоль) и триэтиламин (835 мкл, 6,00 ммоль) растворяют в сухом этаноле (20 мл). Нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 15 часов, охлаждают и отфильтровывают твердое вещество, получая указанное в заголовке соединение в виде твердого вещества белого цвета (680 мг).

¹Н-ЯМР (Me₂SO-d₆+D₂O, ): 8,27 (с, 1Н, пурин Н-8), 7,74 (С, 1Н), 7,61 (д, 1Н), 7,39 (д, 1Н), 7,16 (т, 1Н), 4,78 (м, 1Н), 4,62 (шир.с, 2Н), 2,15 (м, 2Н), 1,90 (м, 4Н), 1,70 (м, 2Н);

CIMS (NН₃) 454 (МН⁺), 328.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(3-иодбензиламино)-9-циклопентилпурина

2-Хлор-6-(3-иодбензил)амино-9-циклопентилпурин (130 мг, 0,287 ммоль) и 1,4-циклогександиамин (2,00 г, избыток) смешивают в пробирке, выдерживающей давление, герметично закрывают и нагревают при 140^oС в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждают, добавляют СН₂Сl₂ (40 мл) и промывают Н₂О (2 x 20 мл). Сушат (МgSO₄), растворитель выпаривают в вакууме и очищают хроматографией на силикагеле (10:1:капли CH₂Cl₂/MeOH/NH₄OH), получая указанное в заголовке соединение (140 мг, 92%). Превращают в соль хлористоводородной кислоты.

¹H-ЯМР (Me₂SO-d₆+D₂O, ): 7,83 (д, 1H), 7,71 (с, 1Н, пурин Н-8), 7,60 (с, 1H), 7,38 (д, 1H), 7,14 (т, 1H), 4,63 (м, 3Н), 3,62 (м, 1H), 2,99 (м, 1H), 1,50-2,20 (м, 14Н), 1,10-1,50 (м, 2Н);

CIMS (NН₃) 532 (МН⁺).

Пример 2

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-индолил)- 2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-индолил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-индолил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, триптамина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-индолил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-индолил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-индолил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 459 (МH⁺); R_f (мин.)=3,47.

Пример 3

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бутиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(бутиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(бутиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, н-бутиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(бутиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бутиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(бутиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 466 (МН⁺); R_f (мин.)=3,45.

Пример 4

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3,4-метилендиоксифенетиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-(3,4-метилендиоксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 464 (МН⁺); R_f (мин.)=2,28.

Пример 5

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-аминобутил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-аминобутил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-аминобутил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 1,4-диаминобутана и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-аминобутил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-аминобутил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-аминобутил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 387 (МН⁺); R_f (мин.)=3,10.

Пример 6

Дигидрохлорид (S)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, (S)--метилбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид (S)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид (S)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 420 (МH⁺); R_f (мин.)=0,42.

Пример 7

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-пиридил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-(этиламино)пиридина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-пиридил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 421 (МН⁺); R_f (мин.)=3,13.

Пример 8

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-аминометилпиридина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-пиридил)метиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 407 (МН⁺); R_f (мин.)=3,13.

Пример 9

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(4-морфолинил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[3-(4-морфолинил)пропиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[3-(4-морфолинил)пропиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-аминопропилморфолина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[3-(4-морфолинил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(4-морфолинил)пропиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[3-(4-морфолинил)пропиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 443 (МН⁺); R_f (мин.)=3,11.

Пример 10

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3,4-дихлорбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 474 (МН⁺); R_f (мин.)=2,34.

Пример 11

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-метилбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(3-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 420 (МН⁺); R_f (мин.)=2,29.

Пример 12

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(2-пиридил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-(2-пиридил)этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-(2-пиридил)этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-(этиламино)пиридина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-(2-пиридил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(2-пиридил)этиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-(2-пиридил)этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 421 (МН⁺); R_f (мин.)=3,13.

Пример 13

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(4-морфолинил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-(4-морфолинил)этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-(4-морфолинил)этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-аминоэтилморфолина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино] -6-[2-(4-морфолинил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-(4-морфолинил)этиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-(4-морфолинил)этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 429 (МН⁺); R_f (мин.)=3,08.

Пример 14

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-гидроксиэтилгидразино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-гидроксиэтилгидразино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-гидроксиэтилгидразино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-гидроксиэтилгидразина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2-гидроксиэтилгидразино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2-гидроксиэтилгидразино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-гидроксиэтилгидразино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 375 (МН⁺); R_f (мин.)=3,15.

Пример 15

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-хлор)бензиламино]-9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия а: 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурин

2,6-Дихлор-9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлорпурина и изопропанола по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия а, но заменяя циклопентанол изопропанолом.

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-хлор)бензиламино]-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-[(3-хлор)бензиламино] -9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина, 3-хлорбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-хлор)бензиламино]-9-(2-пропил)пурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-хлор)бензиламино]-9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-[(3-хлор)бензиламино] -9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 414 (МН⁺); R_f (мин.)=3,44.

Пример 16

Дигидрохлорид (R)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(-метилбензил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, (R)--метилбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид (R)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид (R)-2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(-метилбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 420 (МН⁺); R_f (мин.)=2,27.

Пример 17

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-тиофенметиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(2-тиофенметиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 412 (МН⁺); R_f (мин.)=3,43.

Пример 18

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(2-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(2-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-хлорбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(2-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-хлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(2-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 440 (МН⁺); R_f (мин.)=2,28.

Пример 19

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-бензимидазолил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(2-бензимидазолил)метиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(2-бензимидазолил)метиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-(метиламино)бензимидазола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(2-бензимидазолил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-бензимидазолил)метиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(2-бензимидазолил)метиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 372 (МН⁺); R_f (мин.)=3,4.

Пример 20

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(октиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-Хлор-6-(октиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(октиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, н-октиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(октиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(октиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(октиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 428 (МН⁺); R_f (мин.)=4,23.

Пример 21

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-фенилбутиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(4-фенилбутиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 448 (МН⁺); R_f (мин.)=4,09.

Пример 22

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклогексил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(циклогексил)метиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(циклогексил)метиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, аминометилциклогексана и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклогексил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклогексил)метиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(циклогексил)метиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 412 (МН⁺); R_f (мин.)=2,33.

Пример 23

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил) амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-(2-гидроксиметил)бутиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-(3-метил-4-гидрокси)бутил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 404 (МН⁺); R_f (мин.)=3,15.

Пример 24

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[3-(фенил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[3-(фенил)пропиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[3-(фенил)пропиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-аминопропилбензола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[3-(фенил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[3-(фенил)пропиламино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[3-(фенил)пропиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 434 (МН⁺); R_f (мин.)=0,49.

Пример 25

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[5-(гидрокси)пентиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[5-(гидрокси)пентиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[5-(гидрокси)пентиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 5-гидроксипентиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[5-(гидрокси)пентиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[5-(гидрокси)пентиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[5-(гидрокси)пентиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 402 (МН⁺); R_f (мин.)=3,25.

Пример 26

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пентиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(пентиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(пентиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, пентиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(пентиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пентиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(пентиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 386 (МН⁺); R_f (мин.)=3,52.

Пример 27

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-хлорбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(4-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 440 (МН⁺); R_f (мин.)=2,29.

Пример 28

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(метиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(метиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(метиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, гидрохлорида метиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(метиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(метиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(метиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 330 (МН⁺); R_f (мин.)=3,15.

Пример 29

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-хлорбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-хлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-хлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 440 (МН⁺); R_f (мин.)=2,30.

Пример 30

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино]-9-циклопентилпури

2-Хлор-6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-аминометилтетрагидропирана и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(2-тетрагидропиранил)метиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 414 (МН⁺); R_f (мин.)=3,39.

Пример 31

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-пиридил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-(этиламино)пиридина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(4-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-пиридил)-2-этиламино]-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-пиридил)-2-этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 421 (МН⁺); R_f (мин.)=3,13.

Пример 32

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино]-9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(циклопропил)метиламино]-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-[(циклопропил)метиламино]-9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина (см. получение в примере 15), циклопропилметиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино]-9-(2-пропил)пурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино] -9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-[(циклопропил)метиламино] -9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 344 (МН⁺); R_f (мин.)=3,25.

Пример 33

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(этиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(этиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(этиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, гидрохлорида этиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(этиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(этиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(этиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 472 (МН⁺); R_f (мин.)=3,46.

Пример 34

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(циклопропил)метиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(циклопропил)метиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, аминометилциклопропана и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(циклопропил)метиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(циклопропил)метиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 370 (МН⁺); R_f (мин.)=2,21.

Пример 35

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-фенетилгидразино] -9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-фенетилгидразино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-фенетилгидразино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-фенилэтилгидразина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2-фенетилгидразино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-фенетилгидразино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-фенетилгидразино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 435 (МН⁺); R_f (мин.)=3,54.

Пример 36

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбутил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема A, стадия b: 2-хлор-6-[(3-метилбутил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-метилбутил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-метилбутиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(3-метилбутил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-метилбутил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-метилбутил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 386 (МН⁺); R_f (мин.)=3,53.

Пример 37

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(бутил)амино]-9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(бутил)амино]-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-[(бутил)амино] -9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина (см. получение в примере 15), бутиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(бутил)амино]-9-(2-пропил)пурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(бутил)амино]-9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-[(бутил)амино]-9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 346 (МН⁺); R_f (мин.)=3,33.

Пример 38

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, фурфуриламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(2-фуранметиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 396 (МН⁺); R_f (мин.)=3,38.

Пример 39

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино1-9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино]-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино] -9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина (см. получение в примере 19), 3-(2-имидазолил)пропиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино]-9-(2-пропил)пурина

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино] -9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-[(3-(2-имидазолил)пропил)амино] -9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 398 (МН⁺); R_f (мин.)=3,01.

Пример 40

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-хлор-2-фторбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-хлор-2-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 458 (МН⁺); R_f (мин.)=2,31.

Пример 41

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(гексиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(гексиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(гексиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, н-гексиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-(гексиламино)-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(гексиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(гексиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 400 (МН⁺); R_f (мин.)=4,03.

Пример 42

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-фторбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(2-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 424 (МН⁺); R_f (мин.)=2,22.

Пример 43

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-(фенил)этиламино] -9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2-(фенил)этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2-(фенил)этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2-аминоэтилбензола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2-(фенил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[2-(фенил)этиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2-(фенил)этиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 420 (МН⁺); R_f (мин.)=0,43.

Пример 44

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пропиламино)-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(пропиламино)-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-(пропиламино)-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, н-пропиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-(пропиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(пропиламино)-9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-(пропиламино)-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 358 (МН⁺); R_f (мин.)=3,31.

Пример 45

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина (см. получение в примере 15), бензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино] -6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурина

Тригидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-(бензиламино)-9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 380 (МН⁺); R_f (мин.)=3,34.

Пример 46

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(1-имидазолил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[3-(1-имидазолил)пропиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[3-(1-имидазолил)пропиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 1-(3-аминопропил)имидазола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[3-(1-имидазолил)пропиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[3-(1-имидазолил)пропиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[3-(1-имидазолил)пропиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 424 (МН⁺); R_f (мин.)=3,13.

Пример 47

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[бензиламино] -9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[бензиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[бензиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, бензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[бензиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[бензиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[бензиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 406 (МН⁺); R_f (мин.)=2,23.

Пример 48

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(2,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(2,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2,4-дихлорбензил-амина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(2,4-дихлорбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(2,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(2,4-дихлорбензил)амино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 474 (МН⁺); R_f (мин.)=2,34.

Пример 49

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифторэтиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2,2,2-трифторэтиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2,2,2-трифторэтиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, гидрохлорида 2,2,2-трифторэтиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2,2,2-трифторэтиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифторэтиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2,2,2-трифторэтиламино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 398 (МН⁺); R_f (мин.)=3,33.

Пример 50

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 4-фторбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(4-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-фторбензил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-фторбензил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 424 (МН⁺); R_f (мин.)=2,24.

Пример 51

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-иодбензил)амино] -9-(2-пропил)пурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-иодбензил)амино]-9-(2-пропил)пурин

2-Хлор-6-[(3-иодбензил)амино] -9-(2-пропил)пурин получают из 2,6-дихлор-9-(2-пропил)пурина (см. получение в примере 15), 3-иодбензиламина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-иодбензил)амино]-9-(2-пропил)пурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-иодбензил)амино] -9-(2-пропил)пурина получают из 2-хлор-6-[(3-иодбензил)амино] -9-(2-пропил)пурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 506 (МН⁺); R_f (мин.)=3,53.

Пример 52

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифторэтилгидразино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[2,2,2-трифторэтилгидразино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[2,2,2-трифторэтилгидразино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 2,2,2-трифтор-этилгидразина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[2,2,2-трифторэтилгидразино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[2,2,2-трифторэтилгидразино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[2,2,2-трифторэтилгидразино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 413 (МН⁺); R_f (мин.)=3,28.

Пример 53

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-гидроксипропил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(3-гидроксипропил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(3-гидроксипропил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 3-амино-1-пропанола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с; дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(3-гидроксипропил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(3-гидроксипропил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(3-гидроксипропил)амино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 374 (МН⁺); R_f (мин.)=3,17.

Пример 54

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, гидрохлорида 6-амино-2-метил-2-гептанола и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 444 (МН⁺); R_f (мин.)=3,37.

Пример 55

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-гидроксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(4-гидроксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(4-гидроксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, гидрохлорида тирамина и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил) амино]-6-[(4-гидроксифенил)этиламино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(4-гидроксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(4-гидроксифенил)этиламино] -9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NH₃) 436 (МН⁺); R_f (мин.)=3,38.

Пример 56

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(8-аминооктил)амино]-9-циклопентилпурина

Схема А, стадия b: 2-хлор-6-[(8-аминооктил)амино]-9-циклопентилпурин

2-Хлор-6-[(8-аминооктил)амино] -9-циклопентилпурин получают из 2,6-дихлор-9-циклопентилпурина, 1,8-диаминооктана и триэтиламина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия b.

Схема А, стадия с: дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино]-6-[(8-аминооктил)амино]-9-циклопентилпурина

Дигидрохлорид 2-[транс-(4-аминоциклогексил)амино] -6-[(8-аминооктил)амино] -9-циклопентилпурина получают из 2-хлор-6-[(8-аминооктил)амино]-9-циклопентилпурина по существу так, как описано выше в примере 1, схема А, стадия с.

CIMS (NН₃) 443 (МН⁺); R_f (мин.)=3,30.

Термин "бластомное заболевание" в данном описании относится к ненормальному состоянию, которое характеризуется неконтролируемой пролиферацией. Бластомные заболевания включают лейкозы, карциномы и аденокарциномы, саркомы, меланомы и смешанные типы бластом.

Лейкозы включают, не ограничиваясь ими, острый лимфобластный, хронический лимфоцитарный, острый миелобластный и хронический миелоидный лейкозы.

Карциномы и аденокарциномы включают, не ограничиваясь ими, карциномы и аденокарциномы шеи, груди, простаты, пищевода, желудка, тонкого кишечника, ободочной кишки, яичников и легких.

Саркомы включают, не ограничиваясь ими, остеромы, остеосаркомы, липомы, липосаркомы, гемангиомы и гемангиосаркомы.

Меланомы включают, не ограничиваясь ими, амеланотические и меланотические меланомы.

Смешанные типы бластом включают, не ограничиваясь ими, карциносаркому, лимфоидной ткани, фолликулярного ретикулума, клеточную саркому и болезнь Ходжкина.

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения формулы (I) относится к количеству, которое при однократном или многократном введении дозы пациенту эффективно подавляет рост бластомы или метастазов бластомы или предотвращает апоптоз. Терапевтически эффективное количестве соединения данной формулы зависит от возраста, веса, типа бластомы, подлежащей лечению, комбинации других противоопухолевых агентов и других критериев, хорошо известных специалистам в данной области, использующим стандартные клинические и лабораторные тесты и методики. Терапевтически эффективное количество соединения данной формулы варьируется в соответствии с типом клеток, чувствительных к апоптозу, локализацией инфаркта, а также с возрастом и другими критериями, хорошо известными специалистам в данной области.

Термин "подавление роста" бластом относится к замедлению, препятствованию, задержке или остановке роста бластомы или метастазов бластомы. Термин "подавление роста" бластом также относится к умерщвлению бластомы или метастазов бластомы.

Эффективным количеством соединения данной формулы является такое количество, которое при однократном или многократном введении дозы пациенту эффективно обеспечивает противоопухолевый эффект или предотвращает апоптоз. "Противоопухолевый эффект" относится к замедлению,

препятствованию, предотвращению или нарушению дальнейшего роста опухолевых клеток.

Эффективное противоопухолевое количество соединения данной формулы может быть легко определено практикующим диагностом, как специалистом в данной области, с помощью известных методов и путем наблюдения результатов, полученных в аналогичных ситуациях. При определении эффективного количества практикующим диагностом рассматривается ряд факторов, включающих, не ограничиваясь ими, вид млекопитающего; его величину, возраст и общее состояние здоровья; конкретное вовлеченное заболевание; степень вовлечения или тяжести заболевания; ответ отдельного пациента; конкретное вводимое соединение данной формулы; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранный дозировочный режим; применение сопутствующего медикаментозного лечения; и другие относящиеся к делу обстоятельства.

Следующее воплощение настоящего изобретения включает способ профилактического лечения пациента с риском развития бластомного заболевания, включающий введение профилактически эффективного противоопухолевого количества соединения данной формулы. Термин "пациент с риском развития бластомного заболевания" относится к пациенту, который, из-за идентифицированной генетической предрасположенности к образованию бластом, имел или в настоящее время имеет бластомы, подвергается воздействию канцерогенных агентов, диеты, возраста или имеет другие факторы риска, связанные с развитием бластомных заболеваний. Предпочтительно пациенты с риском развития бластомного заболевания включают пациентов, которые являются положительными для онкогенных вирусов, находятся в состоянии ремиссии после предыдущего лечения бластом(ы), используют табачные продукты или ранее подвергались воздействию канцерогенных агентов, таких как асбест, или являются положительными для различных опухолевых генных маркеров.

Онкогенными вирусами являются вирусы, связанные с раковыми заболеваниями. Например, вирусы саркомы Рауса (Rous) цыплят, папилломы Шоупа (Shope) кроликов, лейкоза мышей являются вирусами животных, известных как вирусы, играющие роль в развитии различных раковых заболеваний. Человеческий вирус папилломы связан с раковыми заболеваниями половых органов. Вирус контагиозного моллюска связан с опухолями контагиозного моллюска. Вирус JC, человеческий паповирус, связан с заболеваниями эндотелиальной системы, такими как лейкоз и лимфома. Человеческие ретровирусы, такие как Т-клеточные лимфотрофические вирусы (HTLV) 1 и 2 типа, связаны с некоторыми лейкозами и лимфомами человека. Человеческие вирусы иммунодефицита (HIV) 1 и 2 типа являются случаями СПИД. Вирус Эпштейна-Барра связан с различными злокачественными заболеваниями, включающими карциному носоглотки, африканскую лимфому Беркитта и лимфомы в иммуносупрессированных реципиентах трансплантируемых органов.

Генетические маркеры, такие как мутации, перестановки и т.п. в BRCA 1, bcl-1/PRAD1, циклине D1/CCND1, р16, cdk4, особенно мутация Arg24 Cys, р16^INK4a. Генетические маркеры связаны с предрасположенностью к различным бластомам. Например, изменения в гене BRCA 1 связаны с повышенным риском раковых заболеваний груди и яичников. Другие генетические маркеры включают изменения в гене MMSC1, который взаимодействует с геном рака мозга и простаты ММСА1; в гене CtIP, который при раке груди и яичников связан с геном BRACA1, связан с геном BRCA1 и связан с метаболическим путем онкогена Е1А; и в гене МККЗ, который является геном контроля клеточного цикла, действующем как опухолевый супрессор при раке легких через активацию апоптоза. Пациенты с риском развития бластомного заболевания также включают пациентов с чрезмерной экспрессией различных белков клеточного цикла, включающих cdk4, циклины В1 и Е. Пациенты с риском развития бластомного заболевания также включают пациентов с повышенными уровнями опухолевых маркеров. Известные опухолевые маркеры включают специфический антиген простаты (PSA) и плазменный инсулинподобный фактор роста-1 (IGF-1), которые являются маркерами рака простаты. Белки ядерного матрикса (NMPs) связаны с наличием раковых заболеваний, особенно, мочевого пузыря и ободочной кишки.

Эффективное количество соединения данной формулы предположительно варьирует приблизительно от 25 нанограмм на килограмм веса тела в день (нг/кг/день) до 500 мг/кг/день. Предпочтительно эффективное количество соединения данной формулы составляет приблизительно от 1 мг/кг/день до 500 мг/кг/день. Более предпочтительно эффективное количество соединения данной формулы составляет приблизительно от 1 мг/кг/день до 50 мг/кг/день.

Соединение данной формулы может быть введено в любой форме или любым образом, который делает соединение биодоступным в эффективных количествах. Соединения данной формулы могут быть введены пероральным или парентеральным путем. Соединения данной формулы могут быть введены перорально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, чрескожно, интраназально, ректально, через глаза и т.п. Предпочтительно пероральное введение. Специалист в области получения фармацевтических композиций может легко установить подходящие формы соединения данной формулы путем определения отдельных характеристик соединения, заболевания, подлежащего лечению, стадии заболевания, ответа других пациентов и других относящихся к делу обстоятельств.

Соединение данной формулы может быть объединено с носителями, эксципиентами или другими соединениями для получения композиций соединений данной формулы. Композиция включает соединение данной формулы в смеси или другом сочетании с одним или несколькими инертными носителями. Композиции данной формулы являются полезными, например, в качестве подходящих средств изготовления загрузочных масс или для хранения соединения данной формулы. Инертный носитель представляет собой вещество, которое не вызывает деградацию соединения данной формулы или другим образом ковалентно не реагирует с соединением данной формулы. Инертный носитель может быть твердым, полутвердым или жидким веществом. Предпочтительными носителями являются вода, водные буферы, органические растворители и фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Предпочтительные водные буферы обеспечивают буферный интервал, в котором не происходит деградации соединения данной формулы. Предпочтительные буферные интервалы составляют приблизительно от рН 4 до рН 9. Предпочтительными органическими растворителями являются ацетонитрил, этилацетат, гексан.

Фармацевтическая композиция соединения данной формулы включает соединение данной формулы в смеси или другом сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами. Фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент может быть твердым, полутвердым или жидким веществом, которое может служить средой для соединения данной формулы. Подходящие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области.

Фармацевтическая композиция соединения данной формулы может быть адаптирована к способу введения. При пероральном, парентеральном или местном введении фармацевтическая композиция соединения данной формулы предпочтительно может быть представлена в виде таблетки, лепешки, капсулы, эликсира, сиропа, облатки, жевательной резинки, суппозитория, раствора или суспензии.

Предпочтительно фармацевтическая композиция соединения данной формулы для перорального введения включает соединение данной формулы с инертным разбавителем или съедобным носителем. Предпочтительными формами фармацевтической композиции соединения данной формулы для перорального введения являются таблетки, лепешки, капсулы, эликсиры, сиропы, облатки, жевательные резинки, растворы или суспензии.

Предпочтительно фармацевтические композиции соединения данной формулы содержат приблизительно от 4 до 80% данного соединения. Предпочтительно фармацевтические композиции содержат количество соединения данной формулы, составляющее приблизительно от 50 нг до 500 мкг; более предпочтительно фармацевтическая композиция содержит количество соединения данной формулы, составляющее приблизительно от 1 мкг до 200 мкг.

Соединение данной формулы может быть введено само по себе или в виде фармацевтической композиции в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.

В данном описании используются следующие аббревиатуры: мг - миллиграмм; нг - нанограмм; TEA - триэтиламин; ммоль - миллимоль; мл - миллилитр; С - Цельсий; ч - час; ТСХ - тонкослойная хроматография; CH₂Cl₂ - метиленхлорид; МеОН - метанол; EtOH - этанол; N - нормальная концентрация; НСl - хлористый водород; ТФУ - трифторуксусная кислота; DIEA - диизопропилэтиламин; RT PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой; HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; МgСl₂ - хлорид магния; EGTA - этиленгликоль-бис(-аминоэтиловый эфир)-N, N, N", N"-тетрауксусная кислота; EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота; DTT - дитиотреитол; MOI - множественность инфекции; NaF - фторид натрия; БСА - бычий сывороточный альбумин; п. о. - пероральный (перорально); в.в. - внутривенный (внутривенно); п.к. - подкожный (подкожно).

Пример 57

Анализ циклин-зависимой киназы 4

Значения IC₅₀ для ингибирования cdk4 были получены следующим методом:

Субстрат:

Глутатион S-трансфераза-ретинобластомный гибридный белок (GST-Rb) (Kaelin, W. G. , Jr. , et al., Cell. 64:521-532, 1991) был получен от Dr. William Kaelin. GST-Rb получали путем трансформации Е. coli плазмидой pGEX-Rb (379-928). Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи до насыщения, затем разводили средой YT и инкубировали при 37^oС в течение 2 ч. Продукцию белка индуцировали инкубацией с 0,1 мМ изопропилтиогликозидом в течение 3 ч. Затем осаждали центрифугированием, клетки лизировали обработкой ультразвуком в буфере STE (0,1 мМ NaCl, 10 мМ Tris, pH 8,0, 1 мМ EDTA), содержащем 10% саркозил. Корпускулярное вещество удаляли центрифугированием и лизат инкубировали с глутатион-сефарозой при 4^oС. Шарики промывали киназным буфером и затем проводили количественное определение окрашенных красителем Кумасси синим белков, разделенных с помощью SDS-PAGE, с использованием известных концентраций стандартных белков.

Экспрессия СDК4/ЦИКЛИН D1 в клетках насекомых:

Человеческую циклин-зависимую киназу 4 (cdk4) клонировали методом RT PCR, используя вырожденные праймеры на основе опубликованной аминокислотной последовательности (Matsushime, H, et al., Cell, 71:323-334, 1992). кДНК циклина человека D1 клонировали методом RT PCR, используя геномную ДНК клеток MCF-7. Последовательность совпадала с опубликованной последовательностью (Xiong, Y. , et al., Cell, 65:691-699, 1991). кДНК как для cdk4, так и для циклина D1 клонировали в pFastBac (Life Technologies), и рекомбинантную Bacmid ДНК, содержащую кДНК, продуцировали путем сайт-специфической транспозиции с использованием экспрессионной системы Bac-to-Bac Baculovirus, полученной от Life Technologies (каталог # 10359-016). Bacmid ДНК использовали для трансфекции клеток насекомых Sf9 для обеспечения продукции рекомбинантного вируса. После бляшковой очистки вируса вирусные препараты амплифицировали до получения высоких значений титров базовых препаратов. Было определено, что оптимальная совместная экспрессия рекомбинантных белков достигается с MOI, равным 0,1 как для cdk4, так и для циклина D1, через 72 ч после инфицирования.

Лизаты получали путем лизиса клеток Sf9, инфицированных одновременно cdk4 и циклином D1, в 50 мМ HEPES, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 5 мкг/мл апротин и 5 мк/мл лейпептин, используя баллон PARR под давлением азота 500 psi (фунтов/кв. дюйм) в течение 5 мин при 4^oС. Нерастворимый материал осаждали при 10000 х g в течение 20 мин при 4^oС. К супернатанту добавляли глицерин до получения концентрации 10% и хранили в аликвотах при -80^oС.

Анализ киназы:

96-Луночные фильтровальные планшеты (0,65 мкм фильтры Durapore) Millipore Multiscreen предварительно увлажняли с помощью 200 мкл киназного буфера (50 мМ HEPES, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA). GST-Rb (0,5 мкг), связанный с гранулами глутатион-сефарозы, добавляли в 50 мкл лунку и раствор удаляли с помощью вакуума. Аналитический раствор содержал 50 мM HEPES, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 1 мМ EGTA, 10 мМ -глицерофосфат, 0,1 мМ ортованадат натрия, 0,1 мМ NaF, 0,25% БСА, 10 мкМ АТФ и 0,25 мкКи [³³P]-ATФ. Для инициации анализа добавляли 0,1 мкг сdk4/циклин D1 (лизат клеток насекомых). Инкубировали 30 мин при 37^oС. Реакцию завершали фильтрацией на Millipore Vacuum Manifold. Промывали четыре раза TNEN (20 мМ Tris, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,5% нонидет Р-40). Затем планшеты сушили при комнатной температуре, фильтровальные планшеты помещали в адаптерные планшеты (Packard) и к каждой лунке добавляли 40 мкл Microscint-O (Packard). Перед счетом в сцинтилляционном счетчике Top Count планшеты закрывали пленкой Top Seal A. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 58

Исследования ингибирования cdk2

Значения IC₅₀ для ингибирования CDK2 определяли следующим методом:

Анализ циклин-зависимой киназы 2

Субстрат:

GST-Rb как описано выше для cdk4/циклин D1

Экспрессия СDК2/ЦИКЛИН Е в клетках насекомых:

Рекомбинантные бакуловирусы для человеческих cdk2 и циклина Е были получены от Dr. David Morgan at UC, Berkeley (Desai, D. et al., Molec. Biol. Cell, 3: 571-582, 1992). Оптимальная совместная экспрессия в клетках насекомых была получена со значениями MOI, равными 0,1 и 1,0 для cdk2 и циклина Е соответственно через 72 ч после инфицирования.

Анализ киназы:

Условия анализа сdk2/циклин Е были идентичны условиям анализа сdk4/циклин D1, включая субстрат. Концентрация рекомбинантного сdk2/циклин Е в анализе составляла 0,1 мкг на 100 мкл аналитического раствора. Инкубировали 30 мин при 30^oС. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 59

Методика анализа сdk7/циклин Н

Субстрат:

Пептидный субстрат H₂N-RRR(YSPTSPS)₄-COOH на основании последовательности CTD РНК-полимеразы II.

Экспрессия СDК7/ЦИКЛИН Н в клетках насекомых:

cdk7 Человека клонировали методом PCR с обратной транскриптазой. Последовательность совпадала с последовательностью, опубликованной Tassan, J.P., et al., J. Cell Biol. 127:467-478, 1994 и Darbon, J. M. et al., Oncogene, 9: 3127-3138, 1994. кДНК циклина Н клонировали методом PCR с обратной транскриптазой, последовательность совпадала с опубликованной Fisher & Morgan, Cell, 78: 713-724, 1994. Рекомбинантная Bacmid ДНК и вирусные базовые препараты получали как описано выше для cdk4 и циклина D1. Оптимальную совместную экспрессию достигали при MOI, равными 1 и 2 для cdk7 и циклина Н соответственно через 48 ч после инфицирования.

Анализ киназы:

В этом анализе определяли фосфорилирование пептидного субстрата (на основе С-концевого домена РНК-полимеразы II) под действием циклин-зависимой киназы 7, которая активируется циклином Н. С помощью фермента [³³P]-фосфат переносится от [³³P]-ATФ к пептидному субстрату. Этот анализ проводили в 96-луночных планшетах с V-образным дном лунок, затем, после окончания реакции содержимое переносили в 96-луночные фосфоцеллюлозные фильтровальные планшеты Millipore Multiscreen. Пептид остается на фосфоцеллюлозной мембране после промывания раствором фосфорной кислоты.

Метод:

Ферментативный анализ проводили в 96-луночных планшетах с V-образным дном лунок в общем объеме 100 мкл.

Аналитический раствор содержал 15 мкМ АТФ, 0,5 мкКи [³³P]-ATФ, 50 мМ Hepes, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 10 мМ -глицерофосфата, 0,1 мМ ортованадата натрия, 0,1 мМ NaF, 10 мкМ пептидного субстрата. Для инициации анализа добавляли 0,125 нг cdk7 и циклина Н (лизат клеток насекомых).

Инкубировали 5 мин при 24^oС. Реакцию прекращали добавлением к каждому образцу 40 мкл холодного 300 мМ раствора фосфорной кислоты. Затем содержимое лунок с V-образным дном переносили в 96-луночный фосфоцеллюлозный фильтровальный планшет Millipore. После выдерживания в течение 15 минут при комнатной температуре фильтровальный планшет подвергали воздействию вакуума и лунки промывали 4 х 100 мкл холодного 75 мМ раствора фосфорной кислоты. После удаления дренажной массы фильтры полностью высушивали, помещали в адаптеры для микропланшетов Multiscreen и к каждой лунке добавляли 40 мкл Micro-Scint О. Планшеты покрывали пленкой Top-Seal и считали 1,5 мин с помощью сцинтилляционного счетчика Packard Top Count.

Результаты представлены в табл. 1.

Пример 60

Методика анализа CDK1/циклин В [³³P]SPA

Субстрат:

В этом анализе использовали биотинилированный пептидный субстрат (биотин-PKTPKKAKKL), полученный in vitro из сайта p34^cdc2 фосфорилирования гистона H1.

Экспрессия Cdk1/циклин В1 в клетках насекомых:

cdk1 Человека клонировали методом PCR с обратной транскриптазой. Последовательность совпадала с последовательностью, опубликованной Lee, M.G. and Nurse, P. Nature, 327:31-33, 1987. кДНК циклина Н также клонировали методом RT PCR, последовательность совпадала с последовательностью, опубликованной Pines, J. and Hunter, Т., Cell, 58:833-846, 1989. Рекомбинантная Bacmid ДНК и вирусные базовые препараты получали как описано выше для cdk4 и циклина D1. Оптимальную совместную экспрессию достигали при MOI, равных 0,1 как для cdkl, так и для циклина В1, через 48 ч после инфицирования.

Анализ киназы:

Набор для ферментативного анализа p34^cdc2 SPA [³³P] киназы был получен от Amersham Life Science (каталог # PRNQ0170), анализ проводили в 96-луночном формате, как предложено производителем. Каждый аналитический раствор содержал 50 мМ Tris НСl, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 0,1 мМ Nа₃VO₄ (ортованадат натрия), 0,5 мкМ АТФ, 0,2 мкКи ³³Р-АТФ, 2 мкМ DTT и 0,75 мкМ биотинилированного пептида и 3 мкг cdkl/циклин В лизата клеток насекомых в общем объеме 100 мкл. Инкубировали 30 мин при 30^oС. Реакцию прекращали добавлением 200 мкл останавливающего буфера (50 мкМ АТФ, 5 мМ EDTA, 0,1% (об./об.) тритон Х-100 в фосфатном буферном солевом растворе), покрытые стрептавидином гранулы SPA (2,5 мг/мл). Планшет оставляли при комнатной температуре на ночь, затем покрывали Packard TopSeal и считали в Packard Top Count. Значение IC₅₀ определяли путем приведения данных к сигмоидной кривой, используя программное обеспечение GraphPad Prism.

Пример 61

Ингибирование опухоли in vitro

Анализ пролиферации in vitro

Пролиферацию опухолевых клеток измеряли, используя анализ сульфородамина В, как описано в Skehan, P., et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112, 1990. Опухолевые клетки собирали с помощью трипсин-EDTA, клетки, исключенные с помощью трипанового синего, считали, добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37^oС. К лункам добавляли лекарственный препарат, после чего разбавляли культуральной средой. Через три дня среду удаляли и снова вносили среду, содержащую свежий лекарственный препарат, и инкубировали еще 4 дня. Затем клетки фиксировали 0,1 мл 10%-ной трифторуксусной кислоты в течение 60 мин при 4^oС. Планшеты ополаскивали пять раз водопроводной водой, сушили на воздухе, окрашивали в течение 30 мин 0,4%-ным раствором сульфородамина В в 1%-ной уксусной кислоте и сушили на воздухе. Связанный краситель солюбилизировали в 0,1 мл 10 мМ Tris (pH 10,5) в течение 5 мин и абсорбцию измеряли при 490 нм с помощью считывателя планшетов Titertek Multiscan MCC/340.

Альтернативно для количественного определения клеточной пролиферации использовали анализ пролиферации клеток CyQUANT.

Анализ пролиферации клеток CyQUANT:

Альтернативно для количественного определения пролиферации опухолевых клеток использовали анализ пролиферации клеток CyQUANT. Опухолевые клетки собирали с помощью трипсин-EDTA, клетки, исключенные с помощью трипанового синего, считали, добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37^oС. К лункам добавляли лекарственный препарат, после чего разбавляли культуральной средой. Через три дня среду удаляли и планшеты замораживали при -80^oС в течение как минимум 30 мин. После оттаивания планшетов к каждой лунке добавляли 200 мкл CyQUANT-GR в буфере для клеточного лизиса (Molecular Probes # C-7026) и инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре. Флуоресценцию CyQUANT-GR измеряли на флуоресцентном считывателе для микропланшетов Molecular Devices F^max (возбуждение 485 нм, эмиссия 530 нм).

Клеточные линии:

MCF7 представляет собой гормон-зависимую аденокарциному груди человека (НТВ 22);

MDA-MB-231 представляет собой гормон-независимую аденокарциному груди человека (НТВ 26);

НТ-29 представляет собой аденокарциному ободочной кишки человека, умеренно дифференцированную стадию II (НТВ 38);

НСТ-15 представляет собой аденокарциному ободочной кишки человека (CCL 225);

А549 представляет собой карциному не-маленьких клеток легкого человека (CCL 185);

PC-3 представляет собой гормон-независимую аденокарциному простаты человека (CRL 1435); и

DU 145 представляет собой гормон-независимую карциному простаты человека (НТВ 81).

Все клеточные линии были получены из американской коллекции типов тканей (American Type Tissue Collection), депозитный номер АТСС приведен в скобках.

Клетки MCF7, MDA-MB-435 и MDA-MB-231 выращивали в улучшенной минимизированной питательной среде (Biofluids) без фенолового красного, с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 0,01 мг/мл гентамицина и 3 мМ L-глутамина. Все остальные клеточные линии выращивали в среде RPMI 1640 (Life Technologies), с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 0,01 мг/мл гентамицина и 3 мМ L-глутамина. Результаты представлены в табл. 1.

Пример 62

Анализы in vivo

Метод анализа околопочечной капсулы:

Голых мышей помещали в клетки с микроизоляцией при положительном давлении воздуха. Хирургические процедуры и дозировки проводили в камере с ламинарным потоком. Анализ околопочечной капсулы проводили, как описано в Bogden, А.Е., Kelton, D.E., Cobb, W.R. and Esber, H.J. Способ быстрого скрининга для тестирования хемотерапевтических агентов против трансплантантов опухолей человека. В: D.P. Houchens and A.A. Ovejera (eds.), Proceedings of the Symposium on the Use of Athymic (Nude) Mice in Cancer Research, pp 231-250. New. York: Gustav Fisher New York, Inc. 1978. Короче говоря, опухоли размером в 400-500 мм³, полученные из установочных мышей, разрезали на кусочки величиной 1 мм³, размеры определяли с помощью окулярного микрометра и аналитического микроскопа. После выделения почек кусочки опухолей имплантировали под капсулу почек самцов голых мышей (возрастом 6-8 недель), используя трочар (trochar) 13 Ga. После имплантации измеряли самые большие и самые маленькие диаметры кусочков опухолей, используя окулярный микрометр и аналитический микроскоп. Почки возвращали обратно в полость тела, разрез стенки тела закрывали шелковыми швами и разрез кожи закрывали зажимами для ран. Обработку лекарственными препаратами начинали на следующий день после имплантации и продолжали в течение 12 дней, после чего почки снова выделяли и измеряли размер опухоли как описано выше. Размер опухоли рассчитывали по формуле V= длинаширина²/2, как описано в Houchens, D.P., Ovejera, А.А., and Barker, A. D. Лечение опухолей человека у атемических (голых) мышей см. в D.P. Houchnes and A.A. Ovejera (eds.). Proceedings of the Symposium on the Use of Athymic (Nude) Mice in Cancer Research, pp. 267-280. New. York: Gustav Fisher New York, Inc. 1978. Результаты приведены в табл. 2.