способ определения микроколичеств авермектинов в продуктах животного и растительного происхождения
Классы МПК: | G01N21/64 флуоресценция; фосфоресценция C12P1/06 актиномицетов |
Автор(ы): | Кругляк Е.Б., Кокоз Ю.М., Тер-Симонян В.Г., Авчук С.В., Зиганшин Р.У., Ашин В.В., Мосин В.А., Дриняев В.А. |
Патентообладатель(и): | Мосин Владимир Александрович, Дриняев Виктор Антонович |
Приоритеты: |
подача заявки:
2001-11-01 публикация патента:
27.06.2003 |
Изобретение предназначено для использования в области санитарно-гигиенической оценки пищевых продуктов и касается определения микроколичеств соединений авермектинового ряда в продуктах растительного и животного происхождения, после применения препаратов, содержащих авермектины и используемых для защиты животных и растений от экто- и эндопаразитов. Способ определения микроколичеств авермектинов в продуктах животного и растительного происхождения включает отбор пробы, ее гомогенизацию, экстракцию из пробы авермектинов, их очистку, получение флуоресцирующих производных авермектинов и последующее их определение ВЭЖХ-флуоресцентным методом. Получение флуоресцирующих производных проводят в уксусном ангидриде в присутствии N-метилимидазола при нагревании. Очистку авермектинов проводят методом скоростной хроматографии сначала на катионообменном, а затем на анионообменном сорбенте. В качестве катионообменного сорбента используют модифицированный силикагель с привитыми октильными группами, а в качестве анионообменного сорбента используют модифицированный силикагель с привитыми NH-группами. При получении флуоресцирующих производных реакционную смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение часа. Перед выдержкой на водяной бане реакционную смесь в течение 20-40 с можно обработать ультразвуком. Изобретение позволяет определить в микроколичествах все компоненты авермектинового комплекса. 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10
Формула изобретения
1. Способ определения микроколичеств авермектинов в продуктах животного и растительного происхождения, включающий отбор пробы, ее гомогенизацию, экстракцию из пробы авермектинов, их очистку, получение флуоресцирующих производных авермектинов и последующее их определение ВЭЖХ-флуоресцентным методом, отличающийся тем, что получение флуоресцирующих производных проводят в уксусном ангидриде в присутствии N-метилмидазола при нагревании. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку авермектинов проводят методом скоростной хроматографии сначала на катионообменном сорбенте, а затем на анионообменном сорбенте. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве катионообменного сорбента используют модифицированный силикагель с привитыми октильными группами, а в качестве анионообменного сорбента используют модифицированный силикагель с привитыми NH-группами. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение уксусного ангидрида и N-метилимидазола составляет 2:1. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении флуоресцирующих производных реакционную смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение часа. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что перед выдержкой на водяной бане реакционную смесь в течение 20-40 с подвергают воздействию ультразвука.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области санитарно-гигиенической оценки пищевых продуктов и касается определения микроколичеств соединений авермектинового ряда в продуктах растительного и животного происхождения после применения препаратов, содержащих авермектииовый комплекс - аверсектин С, таких как аверсект-2, универм, фитоверм и др., и используемых для защиты животных и растений от экто- и эндопаразитов. Предшествующий уровень техникиАвермектины - соединения, обладающие широким спектром инсектоакаронематоцидного действия, широко используются для профилактики и лечения паразитарных заболеваний животных и для защиты сельскохозяйственных культур от вредителей (В.А.Дриняев и др., Аверсектин С: физико-химические и биологические свойства. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, том 35, 2, с.199-205). По характеру воздействия авермектины относятся к нейротоксинам и используются в практике в микродозах. Содержание авермектинов в продуктах питания строго ограничено соответствующими нормативными документами и не должно превышать 0,005 мг на кг продукта, в связи с чем необходимы высокочувствительные методы определения. По своему химическому строению все авермектины являются 16-членными макролидными лактонами, содержащими по два остатка олеандрозы. Основные авермектины имеют обозначения 1 A2; В1 и В2. Авермектины группы А и группы В отличаются между собой заместителем у 5-го углеродного атома макролидного кольца. Известен высокочувствительный способ определения микроколичеств авермектина B1 - абамектина и его дигидропроизводного ивермектина, основанный на получении их флуоресцирующих производных при воздействии трифторуксусным ангидридом в присутствии N-метилимидазола в ацетонитриле с последующим определением методом флуоресцентной жидкостной хроматографии: детектирование ведут при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно. Чувствительность метода составляет 0,004-0,005 мг в кг продукции. Описанный метод рекомендован для определения абамектина и ивермектина в продуктах питания как растительного, так и животного происхождения после применения таких препаратов, как вертимек, ивомек и др. (Sunil V. Prabhu et al. Rapid and Sensitive High-Performance Liquid Chromatographic Method for the Quantitation of Abamectin and Its Delta 8,9-Isomer, J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 622-625). Описан также способ получения флуоресцирующего производного авермектина 2 с использованием трифторуксусного ангидрида в присутствии N-метилимидазола (А. В.Викторов и др., ВЭЖХ-флуоресцентный метод определения микроколичеств аверсектина С в растительных объектах. Биотехнология, 1996, 6, с.55-62). Недостаток известных способов состоит в том, что он дает возможность получать производные только авермектинов группы В, имеющих в своей молекуле гидроксильную группу у пятого углеродного атома. Авермектины группы А в этом положении имеют группу ОСН3. Метальный радикал в С5 положении препятствует получению флуоресцентных производных авермектинов группы А. Другим недостатком известных способов является высокая лабильность получаемых производных. Они сохраняют флуоресценцию в течение всего нескольких часов при хранении их при пониженной температуре, что ограничивает возможности анализа. Сущность изобретения
Для получения возможности определять все авермектины, входящие в состав аверсектина С, разработан прием предварительного деметилирования метальных групп, в том числе в положении С5-ОСН3 сайта в структуре авермектинов группы А, что обеспечивает дальнейшее получение флуоресцирующих производных. Авермектины группы В при этом также образуют флуоресцирующие производные. Способ определения микроколичеств авермектинов в продуктах животного и растительного происхождения включает отбор пробы, ее гомогенизацию, экстракцию из пробы авермектинов, их очистку, получение флуоресцирующих производных авермектинов и последующее их определение ВЭЖХ-флуоресцентным методом (ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография). Экстрагентами авермектинов могут служить изооктан, этилацетат, метанол и др. Очистку авермектинов проводят методом скоростной хроматографии сначала на катионообменном, а затем на анионообменном сорбенте. В качестве катионообменного сорбента преимущественно используют модифицированный силикагель с привитыми октальными группами (патрон С-8 с обращенной фазой), а в качестве анионообменного сорбента - модифицированный силикагель с привитыми NH2- группами (патрон с прямой фазой). Получение флуоресцирующих производных проводят в уксусном ангидриде в присутствии N-метилимидазола при нагревании. Оптимальное соотношение уксусного ангидрида и N-метилимидазола составляет 2:1. При получении флуоресцирующих производных реакционную смесь обычно выдерживают на кипящей водяной бане в течение часа. Возможно также перед выдержкой на водяной бане озвучить реакционную смесь в течение 20-40 секунд в ультразвуковой бане. Хроматографический анализ производных на колонке диасорб С-16 в изократическом режиме в системе метиловый спирт:вода в соотношении 98:2 показал, что все они могут быть обнаружены с помощью флуоресцентного детектора при длинах волн возбуждения и эмиссии 370 и 465 нм соответственно. При этом производное авермектина А1 элюируется с временем удерживания между 9 и 10 мин, что совпадает с временем удерживания производного авермектина B1. Производное авермектина А2 элюируется с временем удерживания между 7-й и 8-й мин, что совпадает с временем удерживания производного авермектина В2. На хроматограмме производного, полученного для комплексного авермектинового препарата - аверсектина С - обнаруживаются два основных пика, соответствующих авермектинам серии 1 и 2 (фиг.1). На всех хроматограммах обнаруживается пик со временем удерживания между 6-й и 7-й минутами, относящийся к продукту взаимодействия уксусного ангидрида и N-метилимидазола (контрольная проба: уксусный ангидрид + N-метилимидазол - условия реакции те же). Отклонение от оптимального соотношения уксусного ангидрида и N-метилимидазола (2:1) приводит к снижению выхода реакции деметилирования. Реактивы - уксусный ангидрид и N-метилимидазол берут в избыточном количестве, достаточном для определения 4 мкг авермектинов, что значительно превышает содержание остаточных количеств авермектинов в исследуемых объектах. Подобранный объем реакционной смеси для проведения дериватизации - 15 мкл является оптимальным. Его увеличение приводит к снижению выхода производных и резкому увеличению образования побочных продуктов. Уменьшение выхода продуктов дериватизации наблюдается при снижении температуры проведения процесса. Установлена корреляционная зависимость интенсивности флуоресценции от количества авермектинов, участвующих в реакции. Производные авермектинов, получаемые предлагаемым методом, устойчивы. Уровень флуоресценции продуктов реакции сохраняется в течение длительного времени (сроки наблюдения - 14 дней), хранение при -20o и +20oС, что облегчает проведение серийных анализов при осуществлении контроля за содержанием авермектинов в исследуемых объектах. Примеры осуществления предлагаемого изобретения
Пример 1. Установление зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации авермектина A1. Проведение реакции дериватизации. В стеклянные пробирки внесли по 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 нг авермектина A1 в метанольном растворе. Растворы упарили в вакуум-сушильном шкафу досуха. В каждую пробирку внесли по 10 мкл свежеперегнанного уксусного ангидрида и по 5 мкл N-метилимидазола. Пробирки плотно закрыли и поместили в кипящую баню на 1 час, после чего образцы охладили и довели объем каждой пробы до 500 мкл ацетонитрилом. Проведение хроматографического анализа. На хроматографическую колонку, заполненную обращенной фазой Диасорб С-16, нанесли 50 мкл подготовленного образца. В качестве подвижной системы использовали смесь метилового спирта с водой в соотношении 98:2 соответственно. Скорость потока 0,8 мл/мин. Давление 120-160 атм. Детектирование вели при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм. На хроматограммах отмечали время удерживания производного. Интенсивность флуоресценции характеризовали площадью пика, выраженной в виде сигнала mV


Класс G01N21/64 флуоресценция; фосфоресценция