полученные из растений синтетические фенольные соединения и растительные экстракты, эффективные при лечении и профилактике хламидийных инфекций

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики хламидийных инфекций, вызванных С. pneumoniae, отличающаяся тем, что композиция содержит полученное из растений фенольное соединение, выбранное из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, кверцитрина, рамнетина, изорамнетина, морина, дейдзеина, генистеина, кофейной кислоты, нарингина, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, ресвератрола, умбеллиферона, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, кумарина, или синтетическое соединение, выбранное из кумарина 106, кумарина 102, 2'-метокси--нафтофлавона, 6,2'-диметоксифлавона, 6-метилкумарина, -нафтофлавона, ротенона, кумарина 30, 3-бензоилбензо(F)кумарина и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина, или экстракт, или фракцию, или неполную фракцию, содержащую указанное соединение, или соответствующее синтетическое соединение, или смесь указанных соединений, и тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, равно или превышает 30% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения равно или превышает 90% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что композиция содержит соединение, выбранное из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, морина, рамнетина, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, кумарина 106, -нафтофлавона, ротенона и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина.

4. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт природного растения или экстракт пищевого растения.

5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт из Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Vaccinum myrtillus или Phloem flour.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что композиция содержит в пересчете на агликон от 25 до 3000 мг полученного из растения фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения в форме агликона или гликозидной форме, и необязательно композиция содержит серусодержащее соединение, получаемое из чеснока.

7. Композиция, полезная для здоровья, обладающая противохламидийным действием по отношению к С. pneumoniae, отличающаяся тем, что композиция содержит полученное из растений фенольное соединение, выбранное из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, кверцитрина, рамнетина, нарингина, изорамнетина, морина, дейдзеина, генистеина, кофейной кислоты, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, ресвератрола, умбеллиферона, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, кумарина, или синтетическое соединение, выбранное из кумарина 106, кумарина 102, 2'-метокси--нафтофлавона, 6,2'-диметоксифлавона, 6-метилкумарина, -нафтофлавона, ротенона, кумарина 30, 3-бензоилбензо(F)кумарина и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина, или экстракт, или фракцию, или неполную фракцию, содержащую указанное соединение, или соответствующее синтетическое соединение, или смесь указанных соединений.

8. Композиция, полезная для здоровья, по п.7, отличающаяся тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae, полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, равно или превышает 30% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

9. Композиция, полезная для здоровья, по п.7, отличающаяся тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, равно или превышает 90% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

10. Композиция, полезная для здоровья, по п.9, отличающаяся тем, что композиция содержит соединение, выбранное из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, морина, рамнетина, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, кумарина 106, -нафтофлавона, ротенона и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина.

11. Композиция, полезная для здоровья, по п.9, отличающаяся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт природного растения или экстракт пищевого растения.

12. Композиция, полезная для здоровья, по п.11, отличающаяся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт из Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Vaccinum myrtillus или Phloem flour.

13. Композиция, полезная для здоровья, по п.7, отличающаяся тем, что композиция содержит в пересчете на агликон от 25 до 3000 мг полученного из растения фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения в форме агликона или гликозидной форме, и необязательно композиция содержит серусодержащее соединение, получаемое из чеснока.

14. Применение композиции, полезной для здоровья, по п.7 в приготовлении продуктов питания или как таковых в качестве добавок к ежедневному питанию.

15. Применение полученного из растений фенольного соединения, выбранного из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, кверцитрина, рамнетина, изорамнетина, морина, дейдзеина, генистеина, кофейной кислоты, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, ресвератрола, умбеллиферона, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, нарингина, кумарина, или синтетического соединения, выбранного из кумарина 106, кумарина 102, 2'-метокси--нафтофлавона, 6,2'-диметоксифлавона, 6-метилкумарина, -нафтофлавона, ротенона, кумарина 30, 3-бензоилбензо(F)кумарина и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, или смеси указанных соединений, в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики хламидийных инфекций, вызванных С. pneumoniae.

16. Применение по п.15, отличающееся тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, равно или превышает 30% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

17. Применение по п.15, отличающееся тем, что противохламидийное действие на С. pneumoniae, полученного из растений фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения, равно или превышает 90% ингибирования образования включений, которое определено в примерах.

18. Применение по п.17, отличающееся тем, что композиция содержит соединение, выбранное из апигенина, лютеолина, флавона, кверцетина, морина, рамнетина, метилгаллата, пропилгаллата, октилгаллата, додецилгаллата, изопропилгаллата, скополетина, метоксипсоралена, ксантотоксина, кумарина 106, -нафтофлавона, ротенона и 7-диэтиламино-3-теноилкумарина.

19. Применение по п.17, отличающееся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт природного растения или экстракт пищевого растения.

20. Применение по п.19, отличающееся тем, что экстракт, или фракция, или неполная фракция представляет собой экстракт из Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum aspemm, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Vaccinum myrtillus или Phloem flour.

21. Применение по п.15, отличающееся тем, что композиция содержит в пересчете на агликон от 25 до 3000 мг полученного из растения фенольного соединения, или экстракта, или фракции, или неполной фракции, содержащей указанное соединение, или соответствующего синтетического соединения в форме агликона или гликозидной форме, и необязательно композиция содержит серусодержащее соединение, получаемое из чеснока.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к эффективным фенольным соединениям растительного происхождения и к соответствующим синтетическим соединениям и их производным и к растительным экстрактам, а также к содержащим их композициям, применимым при лечении и профилактике хламидийных инфекций, и к применению фенольных соединений растительного происхождения и соответствующих синтетических соединений и их производных и растительных экстрактов, а также содержащих их композиций, при лечении и профилактике хламидийных инфекций. Фенольные соединения растительного происхождения и соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты можно использовать для приготовления фармацевтических препаратов, композиций пищевых добавок и функциональных продуктов питания, полезных для здоровья.

Хламидии представляют собой небольшую группу грамотрицательных бактерий. Благодаря уникальному внутриклеточному репродуктивному циклу, при классификации их выделили в отдельный порядок Chlamydiales, включающий род Chlamydia. Род Chlamydia уже исходно делили на два вида: С. trachomatis и С. psittaci. Разделение было основано на биологических свойствах:

	С. trachomatis	С. psittaci
Накопление гликогена в хламидийных включениях (окрашивание йодом +)	+	-
Чувствительность к сульфаниламидным препаратам	+	-

С самого начала "С. trachomatis" считали гомогенной группой, а "С. psittaci" очень гетерогенной группой. Когда открыли хламидийный штамм (впоследствии С. pneumoniae), вызывающий респираторные инфекции в отсутствии контактов с птицами, его бесспорно посчитали относящимся к группе "С. psittaci", так как он удовлетворял указанным выше требованиям на основании биохимического анализа. С. trachomatis и С. pneumoniae отличаются по структуре поверхности. Основным компонентом структуры поверхности С. trachomatis является главный белок наружной мембраны (МОМР), который варьирует в четырех разных участках и в настоящее время составляет основу для деления С. trachomatis почти на 20 разных иммунотипов. У С. pneumoniae МОМР очень консервативен, и обнаружен только один иммунотип. Кроме того, клетки-мишени в тканях разные: эпителий половых органов и конъюнктива в случае С. trachomatis, и эпителий дыхательных путей в случае С. pneumoniae. Первый, за исключением необычного штамма, вызывающего венерическую лимфогранулему (LGV), не способен к размножению в фагоцитах и макрофагах, которые, в частности, являются клетками-мишенями последнего. При проникновении в клетки С. pneumoniae использует рецептор гепарина, который не используется хламидиями половых органов, за исключением LGV. Кроме того, пути передачи и получаемые в результате клинические картины отличаются: С. pneumoniae передается через дыхательные пути и может распространяться в моноцитах в системе циркуляции, тогда как С. trachomatis, главным образом, передается при половых контактах. Кроме того, различаются способы лечения: С. trachomatis обычно лечат однократной дозой, тогда как в случае С. pneumoniae рекомендуют даже трехнедельные курсы антибиотиков.

Ниже показан список заболеваний, вызываемых или связанных с указанными видами хламидий:

С. trachomatis:

- конъюнктивит

- цервицит

- уретрит

- воспаление тазовых органов (PID)

- инфекции новорожденных, например, пневмонит у детей

- перитонит

- перигепатит

- реактивный артрит

С. pneumoniae:

- инфекции верхних дыхательных путей

- бронхит

- пневмония

- хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ)

- астма

- васкулит

- атеросклероз с его осложнениями

- энцефалит

- некоторые виды множественного склероза

- часть поздно проявляющихся симптомов болезни Альцгеймера

Уже в 1989 году было показано, что хламидийный штамм, вызывающий респираторные инфекции в отсутствии контактов с птицами, генетически отличается как от С. trachomatis, так и от описанных видов С. psittaci, причем настолько очевидно, что его выделили в свой собственный вид С. pneumoniae. Гомология его нуклеиновой кислоты с C. trachomatis составляет менее 10%. С. trachomatis имеет внехромосомные плазмиды, не обнаруженные в штаммах С. pneumoniae человека. Геномы обоих видов секвенированы, и количество генов значительно выше (примерно 200) у С. pneumoniae, чем у С. trachomatis. В недавно заново проведенной классификации хламидий указанный штамм уже отнесли к совершенно другому роду Chlamydophila. Таким образом, имеется достаточное основание предполагать, что все, что известно относительно С. trachomatis, нельзя относить к С. pneumoniae.

Большинство широко распространенных видов хламидий у людей представляют собой С. pneumoniae и С. trachomatis, которые вызывают распространенные важные заболевания. С. psittaci широко распространен в царстве животных, но только иногда может также вызывать инфекции у человека. Кроме того, известно, что С. pecorum вызывает инфекции у жвачных животных. Ведется классификация новых родов и видов в порядке Chlamydiales.

С. pneumoniae является наиболее широко распространенной хламидией для человеческой популяции, и почти каждый инфицируется 2-3 раза в течение жизни. С. pneumoniae может легко проникать в ткань легкого и размножаться в макрофагах и эндотелии кровеносных сосудов. Клиническая картина респираторных инфекций, вызванных С. pneumoniae, в значительной степени варьирует от обычно умеренных инфекций верхних дыхательных путей у детей до серьезных пневмоний у взрослых. 5-10% всех пневмоний вызваны С. pneumoniae. С. pneumoniae распространяется как воздушная инфекция от человека к человеку. Очевидно, эффективными переносчиками являются некоторые индивидуумы, поскольку инфекции стали более широко распространенными только в школьном возрасте. В северных странах инфекции, вызванные С. pneumoniae, имеют место в виде от двух- до трехлетних эпидемий с интервалами примерно в шесть лет.

Хламидийные инфекции имеют эпизодическую и латентную природу, и очевидно, наибольшее значение имеют их хронические поздние осложнения. Эпидемиологические исследования показывают значимую связь между хроническими инфекциями С. pneumoniae и атеросклерозом: многие исследования также показали связь между хламидийными инфекциями и частотой встречаемости острого инфаркта миокарда (ОИМ). Кроме того, хроническая инфекция С. pneumoniae, очевидно, играет роль в развитии вспышки астмы, а также хронического обструктивного заболевания легких.

Атеросклероз является хроническим воспалительным состоянием, и частицы С. pneumonia можно выявить в пенистых клетках и клетках гладкой мускулатуры более, чем в половине атеросклеротических бляшек. У пациентов с ОИМ часто имеет место иммунный ответ на липополисахарид (ЛПС) хламидий, свидетельствующий об обострении инфекции. Также можно выявить хламидии в поврежденных сердечных клапанах, и они особенно многочисленны при аневризмах брюшной аорты. Кроме того, было обнаружено, что С. pneumoniae играет роль в инфарктах головного мозга и транзиторных приступах при ишемии головного мозга. До сих пор окончательно не ясно, какую роль играют хламидии,. выявленные в поврежденном месте, в развитии самого повреждения, но, так или иначе, одним из факторов медленного прогрессирования указанных заболеваний, по-видимому, является хроническая хламидийная инфекция. Однако в моделях на животных было показано, что С. pneumoniae инициирует и ускоряет развитие атеросклероза. Эпидемиологические и клинические исследования показали, что существует четкая связь между хронической инфекцией С. pneumoniae и атеросклерозом и ОИМ. В самых последних исследованиях также сделан вывод о том, что инфекция С. pneumoniae infection является фактором риска случаев заболеваний сердца. Инфекция С. pneumoniae часто связана с курением сигарет, которое, очевидно, предрасполагает к хронической хламидийной инфекции.

Замечено, что лечение антибиотиками снижает риск сердечных приступов, а также можно влиять на общий маркер воспаления CRP и уровни фибриногена в сыворотке, используя лечение антибиотиками. В большинстве промышленно развитых стран заболеваемость болезнями сердца начинала падать в тех случаях, когда применение очень эффективных против хламидии антибиотиков становилось общепринятым при лечении других инфекций.

С. trachomatis является наиболее важной причиной половых инфекций у женщин. Кроме того, часть инфекций мочевого пути, отрицательных в тесте бактериальных культур, у женщин репродуктивного возраста вызвана С. trachomatis. С. trachomatis является частой причиной хронического эндометриоза, и PID является наиболее частым осложнением инфекций С. trachomatis у женщин. Инфекция С. trachomatis может быть почти бессимптомной, и известно, что даже внематочная беременность, а также бесплодие являются осложнениями, связанными с образованием непроходимого рубца, вызванного случайной скрытой инфекцией. Около половины детей, родившихся у носителей хламидий, будут инфицированы при рождении, и примерно у половины инфицированных новорожденных детей будет развиваться конъюнктивит с включениями и, в качестве осложнения, пневмония С. trachomatis. С. trachomatis также вызывает половые инфекции у мужчин.

Хламидии чувствительны к тетрациклину и эритромицину; также эффективны рифампицин и некоторые новые фторхинолоны. С. trachomatis, в отличие, например, от С. pneumoniae, также чувствителен к сульфаниламидным препаратам. Несмотря на чувствительность к лечению, хламидийные инфекции часто являются рецидивирующими, и также существует риск, что они станут хроническими. Хламидии размножаются только внутри клетки, и поэтому новые макролидные антибиотики и азалиды, эффективно концентрирующиеся в клетках, являются в настоящее время альтернативой тетрациклину и эритромицину как основному лекарственному средству. В случае хламидийной инфекции с осложнениями лечение, вероятно, необходимо продолжать в течение длительного периода времени, и например, в случае болезни Рейтера, вызванной хламидиями, рекомендовано лечение в течение трех месяцев.

До настоящего времени нет вакцин для профилактики хламидийных инфекций. Природа иммунного ответа недостаточно известна, и с ним связывают тенденцию к гиперчувствительности.

В патенте ЕР 0377722 описан способ оценки риска инфаркта миокарда, способ диагностики заболеваний сердца и кровеносных сосудов, а также применение лекарственных средств, эффективных против хламидий. В указанной публикации в качестве подходящих лекарственных средств для лечения или профилактики хронического заболевания сердца, вызванного хламидиями, описаны тетрациклины, эритромицин, рифампициллин и фторхинолоны.

В WO 98/50074, в частности, для лечения инфекции, вызванной С. pneumoniae, описана комбинация противохламидийных агентов, в которой каждый из активных ингредиентов эффективен на определенной стадии жизненного цикла хламидий.

В патенте США 5830874 описан способ диагностики артериальной хламидийной гранулемы, вызванной С. pneumoniae, a также терапевтические композиции для лечения артериального хламидийного гранолематоза. В качестве соединений, оказывающих терапевтическое действие, указаны тетрациклины, эритромицины, кларитромицины, азитромицин и хинолоны и т.д., эффективные против хламидий.

В патенте Японии 10139686 описано применение 2-(3,4-диметоксициннамоил)аминобензойной кислоты в качестве терапевтически активного соединения в ежедневной дозе 100-1000 мг для лечения атеросклероза, вызванного С. pneumoniae.

Согласно приведенной выше информации существует очевидная необходимость в новых соединениях и композициях, которые можно использовать для лечения и профилактики хламидийных инфекций.

Шикиматы или соединения, которые образуются из шикимовой кислоты биосинтетическим путем, соединения, образуемые посредством пути биосинтеза ацетата-малоната, и соединения, образуемые при комбинации обоих путей, относятся к группе фенольных соединений растительного происхождения. К указанным соединениям относятся простые ароматические соединения, фенолы, кумарины, лигнаны, лигнины, а также флавоноиды и их производные. Простые ароматические соединения, главным образом, включают производные фенилпропана и производные фенилметана. В природе флавоноиды, которые по структуре являются фенольными соединениями, образуют широко распространенную группу растительных пигментов. Флавоноиды встречаются в царстве растений повсюду: у мохообразных, в семействе толстянковых и у других низших растений. Больше всего их обнаруживали у высших растений и сосудистых растений, и они встречаются во всех фруктах, овощах и, наряду с другим, в чае, а также винах, особенно, красных винах. В природе флавоноиды, главным образом, встречаются в гликозидной форме, но они также могут представлять собой свободные фенолы и сульфаты в так называемой форме агликона или соединения, связанные с полисахаридами и белками. В большинстве случаев флавоноиды по своей химической структуре являются полифенольными соединениями. Идентифицировано более 8000 флавоноидов растений, и они выполняют бесчисленные функции. Вследствие горького вкуса они защищают растения от вредных насекомых, а вследствие антибиотических свойств - защищают растения от вирусов и бактерий. Согласно современным взглядам флавоноиды не являются соединениями, важными с точки зрения питания, но, по-видимому, они обладают полезным для здоровья действием. Указанное действие, по-видимому, не зависит от витаминов и минералов, находящихся в растении. Вряд ли кто-либо может избежать приема внутрь флавоноидов, но возможности их действия, так или иначе, зависят от всасывающих свойств и биодоступности и, кроме того, от взаимодействия одновременно полученных флавоноидов.

Антиоксидантное действие природных фенольных соединений уже известно в течение достаточно длительного периода времени, и в нескольких исследованиях обсуждалось антиоксидантное действие, а также захват свободных радикалов. Согласно данным настоящего исследования способность флавоноидов предотвращать окисление ЛНП - холестерина - рассматривается как одно из их наиболее важных свойств. Окисление ЛНП - холестерина - в субэндотелии кровеносного сосуда является начальным фактором атерогенеза. Многие исследования свидетельствуют о том, что недостаточное поглощение флавоноидов из пищи может быть важнейшим фактором заболеваемости, вызываемой болезнями сердца и кровеносных сосудов. При исследованиях на человеке, касающихся флавоноидов, обнаружили только несколько наиболее важных флавоноидов, из которых кверцетин, как было показано, предотвращает окисление ЛНП - холестерина - и таким образом снижает риск коронарной болезни, так как окисленный ЛНП - холестерин - четко связан со стадиями атеросклероза.

Ежедневное потребление флавоноидов с пищей варьирует, например, согласно исследованию в Голландии, от 0 до 30 мг. В исследованиях, проведенных в Финляндии, отмечено, что флавоноиды проявляют умеренное защитное действие, направленное против заболеваемости болезнями сердца и кровеносных сосудов, но с другой стороны, различия в потреблении флавоноидов были довольно небольшими, общие количества составляли примерно 2-6 мг/сутки. В исследовании, проведенном в Голландии, отмечена обратная зависимость между получаемыми с пищей флавонолами и флаванолами и смертельными случаями, вызванными болезнями сердца и кровеносных сосудов. Также отмечена обратная зависимость между потреблением флавонолов и флавонов и риском инфаркта миокарда. Кроме того, известно, что флавоноиды оказывают влияние на воспалительные и иммунные ответы, а также на многие другие функции клетки. Некоторые флавоноиды и многие другие природные фенольные соединения могут препятствовать или усиливать поглощение кальция клеткой, что также показано в таблице 1, представленной далее.

Лекарственные средства, блокирующие кальциевые каналы, играют важную роль в лечении заболеваний сердца и кровеносных сосудов, - таких как боль в груди в результате аноксии сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз и гипертензия. Указанные лекарственные средства действуют на кальциевые каналы, препятствуя притоку кальция в клетку, и таким образом расширяют коронарную артерию, а также снижают периферическое сопротивление кровеносных сосудов, при этом снижается нагрузка на сердце. Крупномасштабное применение кальциевых блокаторов привело, например, к разработке программ скрининга для того, чтобы обнаружить блокирующее действие на кальциевые каналы соединений, выделенных из природных источников. В качестве среды для скрининга в исследованиях использовали, например, непрерывную линию клеток, происходящую из опухоли задней доли гипофиза крыс (GH₄ C₁), а также способ фиксации потенциала, при котором в данный момент времени можно оценивать отдельные кальциевые каналы одной клетки. В результате исследований соединений природного происхождения и экстрактов было найдено, какие соединения обладают блокирующим или активирующим действием на кальциевые каналы. Указанные соединения обнаружены среди полученных из растений простых фенолов, кумаринов, флавоноидов и экстрактов, богатых указанными соединениями. Некоторые из указанных соединений по своему блокирующему действию сравнимы с верапамилом, а некоторые соединения имеют тенденцию усиливать приток кальция в клетку.

Данное изобретение относится к эффективным фенольным соединениям, полученным из растений, и к соответствующим синтетическим соединениям и их производным и к растительным экстрактам, а также к содержащим их композициям, применимым при лечении и профилактике хламидийных инфекций, а также к применению полученных из растений фенольных соединений и соответствующих синтетических соединений и их производных и растительных экстрактов, а также содержащих их композиций при лечении и профилактике хламидийных инфекций.

Отличительные признаки полученных из растений фенольных соединений и соответствующих синтетических соединений и их производных и растительных экстрактов согласно изобретению, содержащих их композиций согласно изобретению, а также их применение при лечении и профилактике хламидийных инфекций представлены в формуле изобретения, так же, как их применение в производстве лекарственных средств или полезных для здоровья продуктов питания, пригодных при лечении и профилактике хламидийных инфекций.

Неожиданно было обнаружено, что некоторые полученные из растений фенольные соединения, соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты и фракции и неполные фракции, содержащие указанные полученные из растений соединения, обладают сильным действием, подобным действию антибиотиков, направленным против хламидий. Согласно изобретению полученные из растений фенольные соединения представляют собой фенольные соединения, образованные из шикимовой кислоты биосинтетическим путем, фенольные соединения, образованные посредством ацетатно-малонатного пути, и фенольные соединения, образованные в результате комбинации обоих путей. Указанные соединения, такие как простые ароматические соединения, фенолы, кумарины, лигнаны, лигнины и флавоноиды, получают из продуктов царства растений, таких как фрукты и овощи, особенно цитрусовые, овощи, ягоды, лук, чай, красные вина и т.д.

Полученные из растений фенольные соединения, соответствующие синтетические соединения и их производные и экстракты, а также фракции и неполные фракции, содержащие указанные соединения, можно использовать как таковые или в виде их смесей, необязательно в комбинации с серными соединениями, содержащимися в чесноке, таких как аллицин или производные аллицина.

Предпочтительные полученные из растений природные фенольные соединения являются флавоноидами, а также производными фенилметана и фенилпропана, фенольными кислотами, тритерпенами, кумаринами и катецинами, и экстрактами и неполными фракциями, содержащими указанные соединения, а также фракциями, содержащими простые фенолы, флавоноиды, их производные, полифенолы, дитерпенфенолы и дитерпенхиноны, а также фракциями, из которых были удалены танин и дитерпен. Предпочтительными также являются соответствующие синтетические соединения и их производные и фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры и производные указанных выше соединений.

Предпочтительные соединения и их экстракты представляют собой соединения и экстракты с противохламидийным действием (ингибирование образования включений), равным или превышающим 30%, и особенно предпочтительными являются соединения и экстракты с противохламидийным действием, равным или превышающим 90% действия, определенного в примерах. Далее представлены группы предпочтительных соединений и экстрактов:

- Флавоны, такие как апигенин, лютеолин, флавон

- Флавонолы, такие как кверцетин, рамнетин, морин

- Флавононы, такие как нарингин

- Изофлавоны, такие как генистеин

- Соединения, производные фенилметана, такие как метилгаллат, пропилгаллат, октилгаллат, додецилгаллат, изопропилгаллат

- Соединения, производные фенилпропана, такие как:

Кумарины, подобные умбеллиферону, скополетину, метоксипсоралену, ксантотоксину и кумарину

Флаван-3-олы, подобные (-)-эпигаллокатехину, (-)-эпикатехину, (+)-катехину и (-)-эпикатехингаллату

- Синтетические соединения, такие как флавоноиды и кумарины, подобные кумарину 106, 2'-метокси- -нафтофлавону, 6,2'-диметоксифлавону, 6-метилкумарину, альфа-нафтофлавону, ротанону, 7-диэтиламино-3-теноилкумарину

- Природные растительные экстракты, такие как экстракты из Mentha longifolia, Mentha arvensis, Galeopsis speciosa, Salvia officinalis, Thymus vulgaris, Rumex acetocella, Rosa rugosa, Veronica longifolia, Symphytum asperum, Artemisia vulgaris, Convallaria majalis, Quercus robur, Daucus carota, Fragaria iinumae, Brassica oleracea, Brassica napus, Medicago sativa, Citrus sinensis, Phloem flour, Vaccinum myrtillus.

Полученные из растений фенольные соединения, содержащие их экстракты и неполные фракции, можно соответствующим образом получить из природных растений или их частей, используя стандартный способ экстракции и выделения веществ. Верхние части растения, корни или листья соответствующим образом дистиллируют с водой и мацерируют или только дистиллируют с водой для того, чтобы получить требуемый экстракт, который далее можно очистить с использованием любого стандартного способа очистки, известного специалисту в данной области. Соответствующие синтетические соединения и их производные обычно являются веществами, доступными из коммерческих источников, или их можно получить с использованием известных способов синтеза.

В следующей далее таблице 1 представлены некоторые предпочтительные полученные из растений фенольные соединения согласно данному изобретению, влияние соединений на приток кальция в клетку, антиоксидантное действие, а также химическая структура соединений.

Химические структуры соединений, представленных в таблице 1, приведены на следующих далее схемах А, В, С, D и Е. На схеме А приведены флавоны, флавонолы, на схеме В - флаваноны, на схеме С - изофлавоны, на схеме D - производные фенилметана, и на схеме Е - производные фенилпропана. Заместители R_1-7 относятся к соответствующим функциональным группам, приведенным в таблице 1.

Противохламидийное действие полученных из растений фенольных соединений кверцетина, морина, рамнетина и октилгалата на С. pneumoniae и С. trachomatis исследовали в примерах 1-4. Все указанные соединения ингибировали рост С. pneumoniae в концентрации 0,5-50 мкМ, и показано, что кверцетин, морин и рамнетин особенно эффективны по отношению к С. trachomatis в том случае, когда использовали предварительно обработанные клетки-хозяева. Таким образом, предпочтительными соединениями для лечения и профилактики инфекции, вызванной С. pneumoniae, являются, например, фенольные соединения кверцетин, морин, рамнетин и октилгаллат, выделенные из природных материалов, а для лечения и профилактики инфекции, вызванной С. trachomatis, в свою очередь, - кверцетин, морин и рамнетин и содержащие их экстракты и частичные фракции.

Противохламидийное действие других полученных из растений фенольных соединений, некоторых синтетических флавоноидов и кумаринов и смесей, полученных из растений фенольных соединений, с чесноком при использовании концентрации, равной 50 мкМ, также исследовали в примере 5, где показано заметное ингибирующее действие. Аналогичным образом исследовали противохламидийное действие аллицина, содержащегося в чесноке, на С. pneumoniae, получив сходные результаты.

Противохламидийное действие природных растительных экстрактов и экстрактов пищевых растений исследовали в примере 6, показав превосходное ингибирующее действие.

Предпочтительными соединениями и экстрактами и фракциями являются такие, которые оказывают противохламидийное действие (ингибирование образования включений), равное или превышающее 30%, и особенно предпочтительными такие, которые оказывают противохламидийное действие, равное или превышающее 90% по сравнению с действием, определенным в примерах.

Соединение согласно данному изобретению, обычно эффективное против хламидий, дополнительно является антиоксидантом и оказывает влияние на поглощение Са²⁺ клеткой.

Октилгаллат также является соединением, широко используемым в качестве пищевой добавки.

В качестве активных ингредиентов полученные из растений фенольные соединения, соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты, фракции и их смеси можно дозировать так, чтобы ежедневное потребление в пересчете на агликон составляло от 25 мкг до 3000 мг. Полученные из растений фенольные соединения и соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты, фракции и их смеси согласно данному изобретению можно готовить в виде фармацевтических препаратов в форме капсул, таблеток, мазей, жидких препаратов или в других соответствующих формах, известных специалисту в данной области. Препараты содержат активный ингредиент так, чтобы ежедневное потребление составляло от 25 мкг до 3000 мг в пересчете на агликон в виде дозированных форм, предпочтительно, от 25 мкг до 500 мг.

Полученные из растений фенольные соединения и соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты, фракции и их смеси также можно как таковые добавлять к продуктам питания, и их можно готовить в виде композиций, подходящих для продуктов питания, таких как препараты из трав, специи, гранулы или тому подобное, которые можно использовать как таковые, как добавки к ежедневному питанию или как функциональные пищевые продукты, полезные для здоровья, также называемые продуктами для здоровья, такие как готовые к употреблению продукты питания, каши, салатные приправы, напитки, продукты на основе молока, пищевые жиры, замороженные продукты, лиофилизированные продукты питания, специализированные продукты питания, картофельные чипсы, пропитывающие соусы и т.д., в зависимости от продукции. Полученные из растений фенольные соединения и соответствующие синтетические соединения и их производные могут находиться в композициях согласно данному изобретению либо в форме агликона, либо в гликозидной форме.

Полученные из растений фенольные соединения и соответствующие синтетические соединения и их производные и растительные экстракты, фракции и их смеси согласно данному изобретению как соединения являются безвредными. Композиции и препараты согласно изобретению можно использовать как в виде курса лечения острой хламидийной инфекции, так и в виде дозированного приема композиции или препарата непрерывно и регулярно с ежедневным питанием для того, чтобы предотвратить хламидийную инфекцию. Так как хроническая коронарная болезнь сердца служит причиной смертельных исходов во многих случаях, таких как ОИМ, и с другой стороны, лечение заболеваний сердца и кровеносных сосудов является причиной высоких затрат для национальной экономики, то с использованием полученных из растений фенольных соединений и соответствующих синтетических соединений и их производных и растительных экстрактов, фракций и их смесей согласно данному изобретению и содержащих их новых композиций можно в значительной степени предотвратить и замедлить возникновение и массовое появление болезней сердца и кровеносных сосудов, особенно, в группах риска. Композиции и препараты согласно изобретению также можно использовать для лечения и профилактики острой инфекции С. trachomatis, а также для профилактики поздних осложнений, таких как бесплодие, внематочная беременность и рак шейки матки, а также для лечения и профилактики других связанных с хламидиями инфекций и осложнений.

Более подробно изобретение представлено в следующих примерах, но изобретение никоим образом не ограничено примерами. В примерах описано прямое противохламидийное действие соединений и растительных экстрактов согласно изобретению на С. pneumoniae и С. trachomatis, а также токсичность соединений и экстрактов по отношению к используемым клеткам-хозяевам (клетки HL, ткань легкого человека, стандартная линия диплоидных клеток).

Пример 1

Прямое противохламидийное действие полученных из растений фенольных соединений (ингибирование образования включений)/С. pneumoniae штамм К7 (клинический изолят)

Результаты/Концентрация 50 мкМ:
Соединения, Концентрация 50 мкМ	Ингибирование, % от контроля ДМСО	Ингибирование, % от контроля ДМСО (предварительно обработанные)*
Кверцетин	90	90
Морин	99	96
Рамнетин	99	59
Октилгаллат	100	100
ДМСО	0	0
* Клетки-хозяева перед инфицированием инкубировали в течение 1 дня с соединением, которое необходимо исследовать. В 24-луночные планшеты, содержащие клетки-хозяева, добавляли соединение, которое необходимо исследовать, в 1 мл поддерживающей среды в такой же концентрации, как и в самой процедуре тестирования.

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, где указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Результаты/Концентрация 0,5 мкМ:
Соединения, Концентрация 0,5 мкМ	Ингибирование, % от контроля ДМСО	Ингибирование, % от контроля ДМСО (предварительно обработанные)*
Кверцетин	68	77
Морин	80	62
Рамнетин	73	50
Октилгаллат	82	62
ДМСО	0	0
* Клетки-хозяева до инфицирования инкубировали в течение 1 дня с соединением, которое необходимо исследовать. В 24-луночные планшеты, содержащие клетки-хозяева, добавляли соединение, которое необходимо исследовать, в 1 мл поддерживающей среды в такой же концентрации, как и в самой процедуре тестирования.

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Пример 2

Ингибирование инфективности/С. pneumoniae

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Результаты/Концентрация 0,5 мкМ:
Соединения, Концентрация 0,5 мкМ	Ингибирование, % от контроля ДМСО	Ингибирование, % от контроля ДМСО (предварительно обработанные)*
Кверцетин	58	0
Морин	81	53
Рамнетин	100	75
Октилгаллат	59	42
ДМСО	0	0
* Клетки-хозяева до инфицирования инкубировали в течение 1 дня с соединением, которое необходимо исследовать. В 24-луночные планшеты, содержащие клетки-хозяева, добавляли соединение, которое необходимо исследовать, в 1 мл поддерживающей среды в такой же концентрации, как и в самой процедуре тестирования.

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Пример 3

Прямое противохламидийное действие на С. trachomatis

С. trachomatis, культивирование в клетках МсСоу. В остальном методика тестирования такая же, как для С. pneumoniae.

Результаты/Концентрация 50 мкМ:
Соединения, Концентрация 50 мкМ	Ингибирование, % от контроля ДМСО	Ингибирование, % от контроля ДМСО (предварительно обработанные)*
Кверцетин	0	100
Морин	0	100
Рамнетин	0	100
Октилгаллат	14	88
* Клетки-хозяева до инфицирования инкубировали в течение 1 дня с соединением, которое необходимо исследовать. В 24-луночные планшеты, содержащие клетки-хозяева, добавляли соединение, которое необходимо исследовать, в 1 мл поддерживающей среды в такой же концентрации, как и в самой процедуре тестирования.

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Результаты/Концентрация 0,5 мкМ:
Соединения, Концентрация 0,5 мкМ	Ингибирование, % от контроля ДМСО	Ингибирование, % от контроля ДМСО (предварительно обработанные)*
Кверцетин	0	20
Морин	0	100
Рамнетин	0	17
OG	0	0
* Клетки-хозяева до инфицирования инкубировали в течение 1 дня с соединением, которое необходимо исследовать. В 24-луночные планшеты, содержащие клетки-хозяева, добавляли соединение, которое необходимо исследовать, в 1 мл поддерживающей среды в такой же концентрации, как и в самой процедуре тестирования.

Целью данного исследования было изучение возможного действия соединения на сами клетки-хозяева, указанное действие может быть фактором, ингибирующим инфекцию. Процедуру тестирования продолжали способом, описанным в способе определения.

Пример 4

Определение токсичности некоторых исследованных образцов по отношению к клеткам-хозяевам

Определение проводили так же, как в предыдущих тестах, но в отсутствии какой-либо инфекции. Жизнеспособность определяли окрашиванием трипановым синим.

Образцы:

Q=кверцетин

М=морин

R=рамнетин

OG=октилгаллат

HL-C=клетки HL только в питательной среде

HL-CD=клетки HL с добавлением ДМСО

Пример 5

Прямое противохламидийное действие полученных из растений фенольных соединений, некоторых синтетических соединений и смесей на С. pneumoniae

Используемая концентрация составляла 50 мкМ.

Пример 6

Действие растительных экстрактов, направленное против С. pneumoniae

Проводили исходный скрининг 101 экстракта, полученного из 61 материала природных и пищевых растений, направленного против С. pneumoniae. Используемая концентрация составляла 40 мкг/лунку.

Далее представлены результаты для выбранных наиболее активных природных растительных экстрактов, направленных против С. pneumoniae, рассчитанные на основе 4 разных определений.

Растение	Семейство	Интабирование, %	Жизнеспособ ность
N48. Mentha longifoiia	Labiateae	100	норма
N53. Mentha arvensis	Labiateae	100	норма
N44. Galeopsis speciosa	Labiateae	100	норма
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	норма
N57. Salvia officinalis	Labiateae	100	норма
N58. Thymus vulgaris	Labiateae	100	норма
N34. Rumex acetocella	Polvgonaceae	100	понижена
N30. Rosa rugosa	Rosaceae	100	норма
N28. Veronica longifolia	Scrophulariaceae	100	понижена
N8. Symphytum asperum	Boraginaceae	100	понижена
N22. Artemisia vulgaris	Asteraceae	100	норма
N37. Convallaria majalis	Convallariaceae	100	-
Quercus robur	Eagaceae	100	-

Далее представлены результаты для выбранных наиболее активных экстрактов пищевых растений, которые показали 100% ингибирование С. pneumoniae, рассчитанные на основе 4 разных определений.

Растение	Семейство	Ингибирование, %	Жизнеспособ ность
D8. Daucus carota	Umbelliferae	100	-
D14. Fragaria iinumae	Rosaceae	100	понижена
D16. Brassica oleracea	Cruciferae	100	норма
D17. Brassica napus	Cruciferae	100	норма
D21. Medicago sativa	Leguminosae	100	норма
D23. Citrus sinensis	Rutaceae	100	понижена
D25. Phloem flour	Polygonaceae	100	норма
D30. Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	норма
D31. Vaccinum myrtillus	Ericaceae	100	норма

Не отмечено существенных различий в активности между органически выращиваемыми и обычно выращиваемыми растениями.

В данном исследовании экстракты растений, которые показали 100% ингибирование включений С. pneumoniae (n=4), считали активными. Обнаружено, что пять растений, которые относятся к семейству Labiateae, были особенно активными. Несмотря на способ экстракции, как дистиллированные с водой и мацерированные, так и только дистиллированные с водой экстракты Salvia officinalis, были активными против С. pneumoniae.

Далее приведено описание использованных микробиологических способов.

1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ПАССАЖИ КЛЕТОК HL

Пассажи культур клеток HL проводили с интервалами в 3 дня. Клетки-хозяева высевали за день до инфекции. Клетки промывали PBS 1× 10 мл и собирали трипсинизацией (1:10; 1,5-2,0 мл/флакон; примерно 5 мин в боксе с ламинарным потоком или 2 мин в СO₂ при +37° С). Суспензию клеток разбавляли до уровня примерно 350000 клеток/мл питательной среды (RN). Культивирование проводили при +37° С, СO ₂ (5,0%) и среду RN меняли 1-2 раза в неделю. Клетки HL можно замораживать в жидком азоте [1 мл 7,5% FCS (RN)+1 мл ДМСО].

2. ОЧИСТКА ХЛАМИДИЙ

ЭТ (элементарное тельце)=инфекционная внутриклеточная форма хламидии. В предшествующий день размораживают необходимое количество суспензии клеток HL, инфицированных хламидиями. Клетки тщательно суспендируют и выдерживают в ультразвуковой ванне всего в течение 2 минут [20 секунд сонификации (амплитуда 24-25) и 10 секунд охлаждения × 6]. Клетки разрушаются, а хламидии остаются неповрежденными.

Суспензию центрифугируют в течение 10 минут при 1600 об/мин (550хg), при этом хламидии находятся в надосадке (остатки клеток HL отбрасывают). Надосадок отсасывают и добавляют 5 мл PBS, суспендируют и обрабатывают ультразвуком в течение 1 минуты (10 секунд сонификации - 5 секунд охлаждения × 6).

Хламидии можно хранить замороженными при -70° С.

3. МЕТОДИКА ТЕСТИРОВАНИЯ ХЛАМИДИИ

Культивируемые клетки HL инфицируют ЭТ С. pneumoniae. ЭТ, которые проникают в клетку, превращаются в метаболически активные ретикулярные тельца (РТ), которые подвергаются бинарному делению в вакуоле-эндосоме или включении. Через определенный период времени (примерно 72 часа) РТ С. pneumoniae опять конденсируются в ЭТ, после чего включения разрушаются, клетки-хозяева разрушаются и ЭТ высвобождаются. В данном способе цель состоит в том, чтобы выявить включения до разрушения клеток-хозяев.

В качестве клетки-хозяина С. pneumoniae в условиях in vitro используют клетки HL. В качестве клеток-хозяев С. trachomatis в условиях in vitro часто используют клетки МсСоу.

Инфекция клеток HL и клеток МсСоу

В день, предшествующий инфекции, клетки-хозяева высевают в 24-луночный планшет: клетки собирают трипсинизацией, их суспендируют примерно в 5 мл питательной жидкости и подсчитывают в камере Баркера. Каждую лунку засевают, используя концентрацию 250000-400000 клеток/лунку для культивирования. Перед добавлением клеток в лунку при необходимости кладут круглое покровное стекло (диаметром 13 мм) для окрашивания. Добавляют питательную жидкость так, чтобы объем составлял 1 мл/лунку. На следующий день клетки инфицируют требуемой бактерией.

Весь раствор, используемый для инфекции и содержащий частицы хламидий, перемешивают. Старую питательную жидкость отсасывают. При инфицировании посевной материал, который хранили при -70° С, разбавляют до концентрации IFU, приблизительно равной 10 ³, так, чтобы объем раствора составлял, по меньшей мере, 200 мкл/лунку в 24-луночном планшете. Клетки инфицируют при центрифугировании 1600 об/мин (550× g)/1 час. Питательную среду отсасывают и заменяют поддерживающей средой, содержащей циклогексамид, а также содержащей исследуемое соединение (концентрация ДМСО 0,2%), 1 мл/лунку. Клетки инкубируют в атмосфере 5% СO₂ при +35° С. Клетки, инфицированные С. pneumoniae, инкубируют в течение 3 дней. Через 2-3 дня поддерживающую среду удаляют и клетки промывают 1× 1 мл PBS. В лунки добавляют 200 мкл SPG для дальнейшей инфекции, собирают наконечником пипетки и переносят в пробирки. Полученную смесь используют для инфицирования новых клеток таким же способом, как описано выше, чтобы тестировать ингибирование инфективности (хламидиостатического действия).

Окрашивание хламидий

Питательную среду, которую оставляют поверх покровного стекла для окрашивания, отсасывают. Инфицированные клетки фиксируют на покровном стекле метанолом в течение 10 мин. Покровное стекло извлекают из лунки и переносят на подходящее конъюгированное с флуоресцеином моноклональное антитело на парафильме во влажной камере стороной, содержащей клетки, вниз. Покровное стекло инкубируют в течение 30 мин при +37° С и дважды промывают PBS и один раз водой. Наконец стекло сушат. Покровное стекло кладут вниз стороной, содержащей клетки, на предметное стекло, содержащее фиксатор (например, среду Mounting). При просмотре во флуоресцентном микроскопе образцы культуры клеток, не поврежденные хламидиями, проявляют характерную флуоресценцию включений цвета зеленого яблока в отличие от красного противоположно окрашенного фона.

Химические вещества и реагенты

RN=питательная среда с FCS: 100 мл RPMI 1640 (Sigma), в которую добавлено 3,5% L-глутамина и 10 мг стрептомицина (конечная концентрация 20 мкг/мл), 7,5 мл FCS. Готовые растворы хранят при +8° С.

Поддерживающая среда: 100 мл питательной среды с FCS с добавлением 50 мкг циклогексимида в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Готовые растворы хранят при +8° С.

PBS (фосфатно-солевой буфер по Дульбекко, Gibco), pH 7,4.

SPG=сахароза 0,2 М (37,5 г), КН₂РO ₄ 3,8 мМ (0,26 г), Na₂HPO₄× 2H₂O 6,7 мМ (0,61 г), глутаминовая кислота (C₅H₉NO₄) 5 мМ (0,36 г), которые смешивали с 500 мл воды milli-Q. После стерилизации хранят при -20° С.

FCS, фетальную сыворотку теленка (Gibco, Scotland), инактивируют при 56° С, 30 мин, фильтруют и хранят при -70° С.