способ очистки дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстрактов биофлаваноидов, полученных в процессе переработки древесины

Формула изобретения

1. Способ получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстракта древесины лиственницы, содержащего биофлаваноиды, отличающийся тем, что в органическом растворителе растворяют лиофильно высушенный экстракт, далее полученный раствор наносят на колонку, заполненную сорбентом - мочевиной, предварительно уравновешенной этилацетатом; колонку элюируют сложным эфиром и/или кетоном с температурой кипения ниже 120°С; полученный элюат собирают, упаривают до начала кристаллизации и охлаждают, выпавшие кристаллы промывают и высушивают.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве органического растворителя используют этилацетат и ацетон в отношении 1:1.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве элюента используют этилацетат и ацетон в отношении 1:2.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что соотношение сорбента к образцу 100:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам выделения и очистки нативных биофлавоноидов - дигидрокверцетина и дигидрокемферола, из экстрактов, полученных в процессе переработки древесины, например, лиственницы. Древесина лиственницы является источником нативных природных полимеров, содержащим экстрактивные вещества - терпены, смоляные кислоты, ароматические соединения, растительные полифенолы, стерины, таннины, липиды, жирные кислоты азотсодержащие и неорганические соединения.

При переработке древесины лиственницы из нее получают биологически активные соединения - биофлавоноиды: дигидрокверцетин и дигидрокемферол, использующиеся как природные консерванты, а также находящие применение в качестве пищевой добавки.

Известен способ получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола с помощью переосаждения экстрактов в органических растворителях (см., например, патент РФ №2034559).

Способ основан на совмещении процессов дистилляции и жидкостной экстракции и позволяет отделить ДКВ от целого ряда сопутствующих веществ с одновременной регенерацией органического растворителя. Недостатками способа являются сравнительно низкая степень очистки дигидрокверцетина и дигидрокемферола (около 90%) и большая длительность процесса получения конечного продукта.

Наиболее близким к изобретению является способ получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстракта древесины лиственницы, содержащего биофлаваноиды, включающий в себя процедуру очистки с помощью препаративной хроматографии растворенного в спиртоэфирном растворителе лиофильно высушенного и содержащего биофлавоноиды экстракта. В качестве сорбента при хроматографической очистки биофлавоноидов используют активную окись алюминия, силикагель или полиамидные смолы (см., например, патент РФ №2135510, М.Кл. С13 К 1/02, 1998 г.).

Однако, как показывает хроматографическая практика, использование в качестве сорбента активной окиси алюминия, селикагеля или полиамидных смол возможно только при использовании экстрактов древесины, не содержащих примеси гуминовых, пектиновых кислот, высокомолекулярных смолистых соединений, а также веществ, обладающих выраженными поверхностно активными свойствами. В противном случае наблюдается очень быстрая потеря разделительной способности хроматографической колонки вследствие необратимой сорбции этих компонентов на хроматографическом носителе, что резко сокращает срок службы сорбента. При этом для регенерации колонки требуется большое время и большое количество дорогих и токсических соединений. В связи с этим вышеописанный способ требует для хроматографической доочистки дигидрокверцетина и дигидрокемферола использования экстрактов биофлавоноидов, не содержащих сколько-нибудь значительных количеств смолистых и других вышеописанных примесей. В противном случае требуется регулярная регенерация сорбента или перенабивка колонки новым сорбентом. Это приводит к удорожанию процедуры очистки, резкому увеличению времени производственного цикла, а в случае регулярной замены отработавшего хроматографического носителя на новый сорбент создаются экологические проблемы утилизации отработанного сорбента.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков и разработка способа хроматографической очистки дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстрактов биофлаваноидов, содержащих примеси гуминовых, пектиновых, высокомолекулярных смолистых соединений или обладающих поверхностно-активными свойствами, позволяющего значительно удешевить процесс получения чистого дигидрокварцетина и дигидрокемферола и решить вопрос об экологически чистой утилизации сорбента, что позволяет улучшить экологию окружающей среды.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстракта древесины лиственницы, содержащего биофлаваноиды, в органическом растворителе растворяют лиофильно высушенный экстракт, далее полученный раствор наносят на колонку, заполненную сорбентом - мочевиной, предварительно уравновешенной этилацетатом; колонку элюируют сложным эфиром и/или кетоном с температурой кипения ниже 120°С; полученный элюат собирают, упаривают до начала кристаллизации и охлаждают, выпавшие кристаллы промывают и высушивают. В качестве элюента возможно использовать этилацетат и ацетон в отношении 1:1. Также в качестве элюента возможно использоавть этилацетат и ацетон в отношении 1:2. Для предотвращения размывки пика биофлаваноида соотношение сорбента к образцу берут равным 100:1.

На чертеже изображен график зависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ед. О.П.) от времени (Т, мин) проведения хроматографии. Обозначения на чертеже:

1 - хроматографический пик выхода несвязавшихся с сорбентом соединений после нанесения образца,

2 - хроматографический пик выхода очищенного дигидрокверцетина и дигидрокемферола,

3 - время нанесения образца,

4 - время начала выхода пика несвязавшихся с сорбентом соединений после нанесения образца,

5 - время окончания выхода примесей, начала элюции смесью этилацетат - ацетон и сбора хроматографически очищенного дигидрокверцетина и дигидрокемферола,

6 - время окончания выхода пика и сбора хроматографически очищенного дигидрокверцетина и дигидрокемферола.

Условия хроматографии

Образец - коммерческий биофлавоноидный комплекс Сибел для пищевых и парфюмерных изделий, растворенный в смеси этилацетат - ацетон в соотношении 1:1 в концентрации 600 мг/мл.

Колонка размером: длина=12 см; диаметр=0,8 см.

Сорбент - мочевина, уравновешенная в растворе этилацетата. Соотношение сорбента и образца - 100:1. Скорость нанесения и элюции образца - 1 мл/мин. Элюент - смесь этилацетата и ацетона в соотношении (1:2).

Для проведения технологического процесса использовали коммерческий биофлавоноидный комплекс Сибел для пищевых и парфюмерных изделий, полученный по технологии, описанной в патенте РФ №2186097 от 6 июля 2001 года (производитель 000 «Сибларекс») и представляющий собой сухой экстракт биофлавоноидов, содержащих дигидрокверцетин и дигидрокемферол.

Биофлавоноидный комплекс Сибел, представляющий собой сухой порошок, растворяли в смеси этилацетат - ацетон (соотношение этилацетат - ацетон равно 1:1) в концентрации 600 мг/мл. При этом соотношение веществ в растворе оставалось аналогичным соотношению в сухом экстракте биофлаваноидов. Полученный раствор наносили (точка 3) со скоростью 1 мл/мин на стеклянную колонку (длина - 12 см; диаметр - 0,8 см) общим объемом 6 мл, набитую мочевиной, предварительно уравновешенной в этилацетате.

Колонку промывали раствором этилацетата со скоростью 1 мл/мин в течение 5 мин (время между точками 3 и 5) до полного выхода не связавшихся на колонке соединений (см., пик 1, длина волны 280 нм).

Затем колонку элюировали (точка 5) смесью этилацетат - ацетон (соотношение 1:2) со скоростью 1 мл/мин в течение 7 мин (время между точками 5 и 6) до полного выхода первого пика элюата (пик 2), содержавшего дигидрокверцетин и дигидрокемферол. Полученный элюат собирали и упаривали до начала кристаллизации в токе азота при комнатной температуре, а затем охлаждали до - 20°С. Выпавшие кристаллы собирали, промывали деионизованной водой и высушивали для использования. Оставшийся раствор, содержащий не выпавшие в осадок биофлавоноиды и другие примеси, также высушивали и полученный осадок включали в исходное сырье для следующего использования.

Колонку перед последующим использованием опорожняли от использованного сорбента и заполняли свежей порцией мочевины, приготовленной, как описано выше, всю процедуру очистки дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстрактов биофлаваноидов повторяли вновь.

Анализ чистоты конечной смеси дигидрокверцетина и дигидрокемферола проводили с помощью тонкослойной хроматографии, ЯМР-спектроскопии и высокоэффективной хроматографии. Анализ показал, что в полученных после очистки кристаллах содержание дигидрокварцетина и дигидрокемферола составляет не менее 98%. Выход дигидрокварцетина и дигидрокемферола из исходного препарата колеблется между 70% и 80%. Анализ также показал, что в полученных кристаллах не содержится смолистых и других полимерообразных примесей.

Таким образом, предлагаемый способ очистки позволяет:

- проводить одностадийный процесс отделения дигидрокверцетина и дигидрокемферола от примесных смол и других полимерообразных соединений,

- значительно удешевить процесс получения чистого дигидрокверцетина и дигидрокемферола вследствие очень низкой стоимости мочевины,

- уменьшить объем использованных высокочистых растворителей (ацетона и этилацетата) из-за отсутствия процедуры очищения сорбента после хроматографии от связавшихся примесей и последующего его уравновешивания в стартовом растворе,

- использовать отработанную и высушенную мочевину в качестве удобрения, что решает вопрос об экологически чистой утилизации сорбента и позволяет улучшить экологию окружающей среды.

Все описанное выше позволяет сделать вывод о практической применимости способа.