комбинация, включающая фульвовую кислоту и антибиотики

Формула изобретения

1. Комбинация, предназначенная для применения в способе лечения или ингибирования бактериальной инфекции у субъекта, которым является животное или человек, содержащая фульвовую кислоту или ее соль и один или несколько антибиотиков, который выбран из группы, включающей оксациллин и гентамицин и их комбинацию.

2. Комбинация по п.1, в которой фульвовая кислота или ее соль имеет значение рН от кислотного до нейтрального.

3. Комбинация по п.1, в которой фульвовая кислота представляет собой полученную из углевода фульвовую кислоту.

4. Комбинация по п.1, приготовленная в виде фармацевтической лекарственной формы.

5. Комбинация по п.4, где фармацевтическая лекарственная форма представляет собой жидкость, таблетку, капсулу, крем, гель или т.п.

6. Комбинация по п.1, где бактерии представляют собой устойчивые к антибиотику бактерии.

7. Комбинация по п.1, где бактерии представляют собой устойчивые ко многим лекарственным средствам бактерии.

8. Комбинация по п.1, где комбинация вводится перорально или местно.

9. Комбинация по п.1, где у бактерий не развивается устойчивость к комбинации при воздействии на них комбинации в течение периода времени, составляющего вплоть до примерно 20 дней.

10. Способ лечения или ингибирования бактериальной инфекции у индивидуума, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, включающей комбинацию:

(а) фульвовой кислоты или ее соли, и

(б) одного или нескольких антибиотиков, которые выбраны из группы, включающей оксациллин и гентамицин и их комбинацию.

11. Способ по п.10, в котором бактерии представляют собой устойчивые к антибиотику бактерии.

12. Способ по п.11, в котором бактерии представляют собой устойчивые ко многим лекарственным средствам бактерии.

13. Способ по п.10, в котором введение представляет собой пероральное или местное введение.

14. Способ по п.10, в котором индивидуум является животным или человеком.

15. Способ по п.11, в котором у бактерий не развивается устойчивость к композиции, включающей комбинацию фульвовой кислоты или ее соли и оксациллина, при воздействии на них комбинации в течение периода времени, составляющего вплоть до примерно 20 дней.

16. Способ по п.10, в котором фульвовая кислота получена из углевода.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к комбинации, включающей фульвовую кислоту и один или несколько антибиотиков из классов пенициллинов и аминогликозидов, которая предназначена для применения при лечении различных состояний.

Гумусные субстанции образуются в результате разложения остатков растительного и животного происхождения в окружающей среде (MacCarthy и др., 1985). Указанные субстанции можно подразделять на гуминовую кислоту, фульвовую кислоту и гумин на основе их растворимости в воде в зависимости от значения pH. Фульвовая кислота представляет собой фракцию, которая растворима в воде во всем диапазоне значений pH, и в целом она характеризуется меньшими молекулярными размерами и массой и менее интенсивной окраской, чем гуминовые кислоты.

Фульвовая кислота в естественных условиях присутствует в почве и воде в низких концентрациях и ее трудно выделять. Большинство выполненных до настоящего времени исследований, касающихся медицинского применения фульвовой кислоты, были проведены с использованием продукта, который представлял собой фульвовую кислоту, полученную из битуминозного (жирного) угля с помощью контролируемого процесса влажного окисления (Bergh и др., 1997). Наиболее пригодный процесс получения фульвовых кислот из угля методом влажного окисления описан в US 4912256. Фульвовые кислоты, получаемые с помощью такого процесса, часто называют оксифульвовыми кислотами.

В публикации международной заявке на патент WO 00/19999 описано применение фульвовой кислоты при лечении воспаления, угрей, экземы и бактериальных, грибных и вирусных инфекций.

В US 4999202 и US 5204368 описаны композиции, содержащие фульвовую кислоту, ее соль или производное, которые обладают бактериостатическими или бактерицидными свойствами и которые можно применять в качестве дезинфицирующих средств.

Фульвовые кислоты, полученные путем окисления угля, содержат в высоких концентрациях тяжелые металлы, в том числе алюминий, ртуть, кадмий, хром и свинец, которые вредны для человека и которые не должны присутствовать в фармацевтических препаратах. В публикации международной заявки на патент WO 2007/125492 описана композиция, содержащая фульвовую кислоту, полученную из углеводородного сырья методом влажного окисления, которая имеет низкое содержание указанных вредных элементов, и метод получения такой композиции. Указано, что такую композицию можно применять в качестве фармацевтического средства.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним из объектов изобретения является комбинация, содержащая фульвовую кислоту, ее соль, эфир или производное и один или несколько антибиотиков из классов пенициллинов и аминогликозидов.

Предпочтительно антибиотик выбирают из группы, включающей оксациллин и гентамицин и их комбинацию.

Фульвовая кислота, ее соль, эфир или производное может иметь любое значение pH от кислотного до основного, как правило, значение pH находится в диапазоне от кислотного до нейтрального. Фульвовая кислота может находиться в форме раствора, забуференного до пригодного значения pH. Предпочтительно фульвовая кислота находится либо в форме кислоты, либо в форме соли, например, калиевой соли.

Предпочтительная фульвовая кислота представляет собой полученную из углевода фульвовую кислоту, такую, как кислота, описанная в WO 2007/125492. Фульвовая кислота, описанная в этой публикации, имеет молекулярную массу, не превышающую 20000 Да, и низкое содержание таких элементов, как алюминий, ртуть, кадмий, хром и свинец. Предпочтительно содержание этих элементов не превышает 20 част./млн. Фульвовую кислоту получают из углевода, такого как сахарид. Предпочтительным сахаридом является сахароза, глюкоза или фруктоза.

Комбинацию можно приготавливать в виде фармацевтической лекарственной формы, более конкретно, в форме жидкости, таблетки, капсулы, крема, геля или т.п.

Другой объект изобретения относится к комбинации, предлагаемой в изобретении, которая предназначена для применения в способе лечения или ингибирования заболевания или состояния у индивидуума, заключающемся в том, что индивидууму вводят комбинацию.

Следующий объект изобретения относится к применению комбинации, предлагаемой в изобретении, для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для применения в способе лечения или ингибирования заболевания или состояния у индивидуума, заключающемся в том, что индивидууму вводят комбинацию.

Еще один объект изобретения относится к комбинации, предлагаемой в изобретении, которая предназначена для применения в способе уничтожения бактерий, ингибирования или предупреждения их роста.

Еще один объект изобретения относится к способу уничтожения бактерий, ингибирования или предупреждения их роста, заключающемуся в том, что применяют комбинацию, предлагаемую в изобретении.

Еще один объект изобретения относится к способу лечения, ингибирования или предупреждения заболевания или состояния у индивидуума, заключающемуся в том, что индивидууму вводят в эффективном количестве комбинацию, предлагаемую в изобретении.

Заболевание или состояние может представлять собой бактериальную инфекцию, предпочтительно инфекцию, вызываемую бактериями, устойчивыми к антибиотикам, более конкретно, бактериями, которые представляют собой устойчивые ко многим лекарственным средствам бактерии, такие как MRSA (устойчивый ко многим лекарственным средствам золотистый стафилококк Staphylococcus aureus).

Бактерии могут обладать устойчивостью к одному или нескольким антибиотикам из классов пенициллинов и аминогликозидов. Предпочтительно антибиотики выбирают из группы, включающей оксациллин и гентамицин и их комбинацию.

Введение можно осуществлять путем орального, местного применения или любым другим пригодным путем введения.

Индивидуум может представлять собой животное или человека.

Применение или введение комбинации, предлагаемой в изобретении, может быть более эффективным, чем применение или введение индивидуально фульвовой кислоты, ее соли, эфира или производного или антибиотика.

При разработке одного из вариантов осуществления изобретения было установлено, что у бактерий может не развиваться устойчивость к комбинации, включающей фульвовую кислоту, ее соль, эфир или производное и оксациллин, при воздействии на бактерию указанной комбинации в течение периода времени, составляющего вплоть до примерно 5 дней, более предпочтительно при воздействии на бактерию указанной комбинации в течение периода времени, составляющего вплоть до примерно 10 дней, еще более предпочтительно при воздействии на бактерию указанной комбинации в течение периода времени, составляющего вплоть до примерно 20 дней.

Было установлено, что применение фульвовой кислоты, ее соли, эфира или производного повышает антибиотические свойства двух классов антибиотиков, прежде всего оксациллина и гентамицина или любой их комбинации.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - синергетическое действие фульвовой кислоты и оксациллина, проиллюстрированное на примере газона штамма S. aureus ATCC 12600;

на фиг.2 - синергетическое действие фульвовой кислоты и оксациллина, проиллюстрированное на примере газона устойчивого к метициллину штамма Staphylococcus aureus Р39380;

на фиг.3 - синергетическое действие фульвовой кислоты и гентамицина, проиллюстрированное на примере газона штамма P. aeruginosa ATCC 9027;

на фиг.4 - результаты окрашивания по Граму С. albicans, не обработанного фульвовой кислотой (а), и собранного из зоны ингибирования обусловленного действием фульвовой кислоты (б);

на фиг.5 - окончательные результаты определения величин MIC для CHD-FA (pH 3,0)+/- оксациллин;

на фиг.6 - окончательные результаты определения величин MIC для CHD-FA (рН 5,0)+/- оксациллин;

на фиг.7 - окончательные результаты определения величин MIC для CHD-FA (рН 7,0)+/- оксациллин.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Устойчивость к лекарственным средствам, прежде всего устойчивость ко многим лекарственным средствам (MDR), превратилась в одну из основных проблем при лечении различных заболеваний и состояний, прежде всего тех, которые вызываются бактериальными агентами. Таким образом, существует необходимость в разработке стратегии лечения, эффективной в отношении таких устойчивых штаммов.

Для оценки антибактериальных свойств фульвовой кислоты при ее применении индивидуально или в сочетании с антибиотиками из классов пенициллинов и аминогликозидов в отношении конкретных организмов, в частности бактерий, более конкретно определенных устойчивых к антибиотикам бактерий, были проведены два исследования. Исследования были выполнены с использованием фульвовой кислоты, которая была описана в WO 2007/125492 и получена методом, описанным в этой заявке, ниже в настоящем описании она обозначена как CHD-FA.

В первом исследовании оценивали антибактериальную эффективность фульвовой кислоты при ее применении индивидуально или в сочетании с оксациллином или гентамицином.

Во втором исследовании проводили оценку развития с течением времени устойчивости бактерий к фульвовой кислоте в сочетании с антибиотиком или без него.

Представленные ниже примеры даны только с целью иллюстрации и никоим образом не направлены на ограничение объема изобретения.

Пример 1: Антибактериальные характеристики фульвовой кислоты

Данное исследование проводили с целью определения антибактериальных характеристик фульвовой кислоты. Для оценки противомикробной активности рассматриваемого продукта применяли метод определения радиальных зон ингибирования роста микроорганизмов и метод серийных разведений в бульоне. Результаты продемонстрировали, что фульвовая кислота обладает противомикробной активностью в отношении Enterococcus faecalis (ATCC 51575), Salmonella enterica (ATCC 700565), Staphylococus aureus (ATCC 12600), устойчивого ко многим лекарственным средствам Staphylococcus aureus (MRSA) (ATCC) (Р3938), Escherichia coli (ATCC 1173) и Pseudomonas aeruginosa (ATCC 6027). Было продемонстрировано, что спектр противомикробной активности CHD-FA характеризуется наличием синергизма с гентамицином и оксациллином (метициллином) (фиг.1-3). Окрашивание по Граму С. albicans, выращенного в присутствии фульвовой кислоты, позволило выявить наличие округлых увеличенных не обладающих способностью к делению телец, что свидетельствует о том, что рассматриваемый продукт оказывает воздействие на клеточную мембрану микроорганизмов (фиг.4).

Методы

Тестируемый образец

Тестируемый образец представлял собой полученную из углевода фульвовую кислоту (CHD-FA). CHD-FA представляла собой жидкость коричневого цвета с содержанием 3,5% фульвовой кислоты при pH 2,14. Фульвовая кислота содержала такие элементы, как алюминий, ртуть, кадмий, хром и свинец, в концентрации менее 20 част./млн. и ее получали методом, описанным в WO 2007/125492.

Применяемые штаммы микроорганизмов

Исследование проводили с использованием следующих штаммов:

Escherichia coli (ATCC 1173), P. aeruginosa (ATCC 6027), S. aureus (ATCC 12600), недавно выделенный отрицательный по коагулазе S. aureus, Staphylococcus epidermidis (недавно выделенный изолят) и Е. coli (ATCC 1173). Штаммы S. aureus, которые применяли для сравнительных исследований, проводимых с использованием предписываемых в настоящее время антибиотиков, представляли собой клинический изолят, обозначенный как 22225 (устойчивый к эритромицину) и два устойчивых к метициллину штамма S. aureus (MRSA), а именно 2606 (устойчивый к ампициллину, оксациллину (метициллину) и обладающий слабой чувствительностью к гентамицину) и Р3938 (MRSA-штамм, устойчивый к эритромицину, оксациллину (метициллину), клиндамицину и обладающий слабой чувствительностью к фуцидовой кислоте). Тестировали также два штамма С.albicans (ATCC 10231 и ATCC 9027) и пять других недавно выделенных штаммов С.albicans, которые в проводимом исследовании обозначали как 42, 43, 44, U1 и U7.

Оценка противомикробной активности путем определения ингибирования по методу радиальной диффузии

Радиальную зону ингибирования роста микроорганизмов в результате воздействия CHD-FA определяли, следуя в целом методу Кирби-Бауэра (Kirby-Bauer). В целом метод заключался в следующем. Для количественного анализа вносили по 50 мкл чистой CHD-FA в лунки диаметром 4,5 мм и глубиной 4 мм, сделанные в агаре Мюллера-Хинтона (Mueller Hinton) (фирма Mast Group Ltd, Мерсейсайд, Великобритания), на который высевали газон соответствующего микроорганизма, и затем инкубировали в течение 16 ч при 37°С.Газон создавали путем высевания на поверхность агаровой пластины 50 мкл стандартизованной суспензии микроорганизмов в соляном растворе. Использовали суспензию, для которой при измерении с помощью колориметра (типа Sherwood, 254), снабженного фильтром оптической плотности при длине волны 520 нм, показатель составлял 0,07, что соответствовало 35×10 ⁶ колониеобразующих единиц на 1 мл. Зону ингибирования измеряли дважды в двух взаимно перпендикулярных направлениях и регистрировали средние значения.

Антибиотики наносили на агаровые пластины с помощью пропитанных антибиотиком дисков (фирма Mast Group Ltd, Мерсейсайд, Великобритания) согласно стандартной процедуре, применяемой при получении лабораторных антибиограмм.

Оценка противомикробной активности методом серийных разведений в бульоне

Минимальную смертельную концентрацию (MLC) CHD-FA для различных организмов определяли с использованием двукратных серийных разведений 0,5 мл CHD-FA в соляном растворе с последующим добавлением 0,5 мл бульона Мюллера-Хинтона двойной крепости (2×) (фирма Mast Group Ltd, Мерсейсайд, Великобритания). Бульоны инокулировали, используя по 25 мкл описанной выше стандартизованной суспензии микроорганизмов, и инкубировали в течение 16 ч. Конечную точку определяли как разведение в последней пробирке, содержимое которой после нанесения в виде капель на агар Мюллера-Хинтона и инкубации в течение 16 ч характеризовалось отсутствием роста. В опыт включали соответствующие положительные и отрицательные контроли.

Оценка синергетического действия

Лунки, содержащие CHD-FA и диски антибиотика, размещали на различных расстояниях друг от друга на пластине с агаром Мюллера-Хинтона, на которую высевали соответствующий микроорганизм согласно описанной выше процедуре; картины ингибирования сравнивали с картинами, описанными ранее у Lorian (1991).

Все указанные выше исследования проводили в трех повторностях и результаты усредняли.

Морфологические исследования С. albicans

Микрофотографии получали с помощью микроскопа типа Reichert Jung, снабженного цифровой камерой (типа Motic Images Plus Version 2.0 ML), соединенной с окуляром микроскопа. Изображения получали в идентичных условиях работы микроскопа и подвергали обработке с использованием одного и того же программного обеспечения.

Результаты

Синергетическая активность CHD-FA в отношении различных микроорганизмов

Синергетическая активность полученной из углевода фульвовой кислоты и оксациллина (метициллина) в отношении газона S. aureus (ATCC 12600) продемонстрирована на фиг.1. На фиг.2 представлены данные, характеризующие наличие синергетической активности CHD-FA и оксациллина (метициллина) в отношении газона MRSA-штамма (Р3938), а на фиг.3 - данные, характеризующие наличие синергетической активности фульвовой кислоты и гентамицина в отношении газона P. aeruginosa (ATCC 9027).

Воздействие CHD-FA на морфологию С. albicans

На фиг.46 представлены результаты окрашивания по Граму штамма С. albicans, собранного из зоны ингибирования, обусловленного действием CHD-FA, которые можно сравнить с представленными на фиг.4а результатами окрашивания по Граму штамма С. albicans, который не подвергали противомикробному воздействию CHD-FA.

Обсуждение

Результаты, полученные путем оценки ингибирования по методу радиальной диффузии и методом серийных двукратных разведений в бульоне, демонстрируют, что CHD-FA является противомикробным средством, обладающим широким спектром действия в отношении грамположительных кокков, грамотрицательных бацилл и дрожжей. Такой спектр ингибирования не характерен для обычных предписываемых в настоящее время антибиотиков. Было установлено также, что CHD-FA обладала эффективностью в отношении трех выделенных недавно штаммов S. aureus, два из которых относились к MRSA-штаммам. Три выделенных недавно штамма S. aureus постепенно приобретали устойчивость к эритромицину, ампициллину, оксациллину (метициллину), клиндамицину, гентамицину и обладали слабой чувствительностью к CHD-FA.

Фульвовая кислота обладает синергетическим действием при ее применении совместно с оксациллином (метициллином) и гентамицином, тем самым, повышая их противомикробную эффективность, возможно за счет того, что облегчает проникновение антибиотика в микроорганизм в результате неспецифического ославляющего воздействия на клеточные мембраны микроорганизмов, что проиллюстрировано на фиг.4.

Пример 2: Развитие устойчивости к CHD-FA

Физические характеристики CHD-FA, также известной под называнием фульвовая кислота CHD-FA, которую применяли в примере 2, восстанавливали в виде 4%-ного раствора. Растворы хранили при комнатной температуре в темноте. Все эксперименты, результаты которых представлены в настоящем описании, проводили с использованием третьей бутыли, которую получили в декабре 2008 г. непосредственно из Южной Африки.

4%-ный раствор CHD-FA представлял собой слегка вязкий раствор желтого/коричневого цвета, обладающий сильным запахом, и он имел значение pH 1,9 при 25°C. В данном исследовании значение pH CHD-FA регулировали с помощью 10 M гидроксида натрия, получая 4%-ный маточный раствор CHD-FA, забуференный до значения pH 3, 5 или 7.

Методы

Бактериальные изоляты

Тесты по оценке чувствительности проводили на бактериальном изоляте, представляющем собой устойчивый к метициллину штамм Staphylococcus aureus EMRSA16. Штамм EMRSA16 выделяли после продолжительного хранения на гранулах при -80°C и выращивали на агаровой среде Мюллера-Хинтона (фирма Oxoid) при 37°C в течение 24 ч.

Среды

Все эксперименты проводили с использованием бульона или агаровых препаратов на основе среды Мюллера-Хинтона (фирма Oxoid), восстановленной согласно инструкциям производителя.

Приготовление инокулята

а) Штамм EMRSA16 культивировали в обычных атмосферных условиях при 37°C на агаре Мюллера-Хинтона в течение 24 ч перед проведением тестирования.

б) Инокулят каждого штамма приготавливали путем отбора отдельных колоний с культуральных планшетов и их суспендирования в 2 мл бульона Мюллера-Хинтона. Затем концентрацию регулировали до достижения мутности согласно стандарту МакФарланда, до уровня, составляющего 0,5.

в) Инокулят полностью ресуспендировали путем интенсивного встряхивания на вихревом смесителе в течение 15 с.

г) Затем инокулят разводили в соотношении 1:100 в бульоне Мюллера-Хинтона для проведения тестов по оценке MIC.

Условия анализа

Применяли стерильные пластиковые одноразовые титрационные 96-луночные плоскодонные микропланшеты.

Стадия 1. Добавление CHD-FA

Маточный раствор CHD-FA содержал 4% нативного соединения. Для каждого тестируемого штамма в каждую из лунок 2-12 добавляли по 100 мкл среды. Затем в лунки, находящиеся в колонке 1, добавляли по 200 мкл 4%-ной CHD-FA. Из лунок в колонке 1 брали по 100 мкл и разводили в два раза путем переноса в лунки колонки 2 с помощью многоканальной пипетки (коэффициент вариации ±2%). Затем из лунок в колонке 2 брали образцы по 100 мкл и переносили в лунки колонки 3, и т.д. вплоть до колонки 10. Последние 100 мкл лекарственной субстанции отбрасывали. Колонка 11 представляла собой положительный контроль, не содержащий CHD-FA, а колонка 12 представляла собой отрицательный контроль, содержащий только разбавитель.

Стадия 2. Добавление оксациллина

Приготавливали маточный раствор оксациллина с концентрацией 1600 мг/л путем добавления 5 мл стерильной дистиллированной воды к 8 мг оксациллина. Затем приготавливали разведение маточного раствора в соотношении 1:100, после чего осуществляли серийные разведения в соотношении 1:2 с получением разведений оксациллина в диапазоне от 16 до 0,06 мг/л. После этого добавляли 50 мкл разведенного оксациллина к разведенной CHD-FA для тех вариантов, когда это требовалось, получая конечные концентрации оксациллина, составляющие от 4 до 0,015 мг/л.

Стадия 3. Добавление штамма EMRSA16

В соответствующие лунки добавляли разведенную суспензию инокулята в бульоне Мюллера-Хинтона в объеме, составляющем либо 100 мкл, либо 50 мкл, для оценки эффективности либо CHD-FA, либо комбинации CHD-FA+оксациллин соответственно. В результате конечный объем в лунке составлял 200 мкл (он включал 100 мкл разведенной CHD-FA или разбавителей и 100 мкл инокулята в соответствующем бульоне для штамма или только бульона).

Стадия 4. Инкубация планшетов

Все планшеты инкубировали на воздухе при температуре 37°C и затемненном термостате в течение 48 ч.

Стадия 5. Анализ планшетов

Осуществляли визуальный анализ планшетов, конечная цель которого заключалась в том, чтобы определить наименьшую концентрацию лекарственного средства, вызывающую ингибирование роста на 50% по сравнению с ростом в контрольной среде, не содержащей лекарственное средство.

Стадия 6. Устойчивость, приобретаемая в результате пассажей

Для оценки влияния устойчивости, приобретаемой в результате пассажей, на ингибирующее воздействие комбинации CHD-FA+/-оксациллин на EMRSA16, осуществляли инокуляцию 100 мкл содержащейся в последней лунке культуры, которая была выращена на планшете с MIC (минимальная ингибирующая концентрация), на половину планшета с агаровой средой Мюллера-Хинтона и инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Затем продукт, полученный на этом планшете, использовали в качестве свежей суспензии для осуществления следующего пассажа. Эту процедуру повторяли, осуществляя в общей сложности 10 пассажей, при этом после каждого пассажа проводили оценку эффективности комбинации CHD-FA+/-оксациллин в отношении EMRSA16.

Результаты

MIC для комбинации CHD-FA+/-оксациллин

Результаты оценки MIC продемонстрировали, что эффективность комбинации CHD-FA+/-оксациллин оставалась стабильной при осуществлении вплоть до 10 пассажей. Подробные данные о величинах MIC для комбинации CHD-FA+/-оксациллин представлены в таблице 1.

Таблица 1
Величины MIC для комбинации CHD-FA+/- оксациллин
Номер пассажа	pH	MIC (%)	MIC (%)
		CHD-FA	CHD-FA+оксациллин
1	3	0,06	0,06
1	5	0,25	0,125
1	7	1,00	0,25

Номер пассажа	pH	MIC (%)	MIC (%)
		CHD-FA	CHD-FA+оксациллин
2	3	0,03	0,06
2	5	0,25	0,25
2	7	1,00	1,00
3	3	0,06	0,06
3	5	0,25	0,25
3	7	1,00	1,00
4	3	0,06	0,06
4	5	0,25	0,25
4	7	1,00	1,00
5	3	0,06	0,06
5	5	0,25	0,125
5	7	1,00	0,50
6	3	0,06	0,06
6	5	0,25	0,125
6	7	1,00	0,50
7	3	0,06	0,06
7	5	0,25	0,25
7	7	1,00	1,00
8	3	0,06	0,06
8	5	0,25	0,25
8	7	1,00	1,00
9	3	0,06	0,06
9	5	0,25	0,25
9	7	1,00	1,00
10	3	0,125	0,06
10	5	0,25	0,25
10	7	1,00	1,00

Окончательные величины MIC для CHD-FA при pH 3,0.

Окончательные величины MIC свидетельствуют о том, что эффективность комбинации CHD-FA (pH 3,0)+/-оксациллин оставалась стабильной при осуществлении вплоть до 10 пассажей, т.е. результаты оценок MIC при каждом пассаже отличались не более чем в одной лунке по сравнению с результатами первоначальной оценки MIC (пассаж 1). Подробные данные о полученных в результате исследования величинах MIC для комбинации CHD-FA (pH 3,0)+/-оксациллин представлены на фиг.5.

Окончательные величины MIC для CHD-FA при pH 5,0.

Окончательные величины MIC свидетельствуют о том, что эффективность комбинации CHD-FA (pH 5,0)+/-оксациллин оставалась на близком уровне при осуществлении вплоть до 10 пассажей, т.е. результаты оценок MIC при каждом пассаже отличались не более чем в одной лунке по сравнению с результатами первоначальной оценки MIC (пассаж 1). Подробные данные о полученных в результате исследования величинах MIC для комбинации CHD-FA (pH 5,0)+/-оксациллин представлены на фиг.6.

Окончательные величины MIC для CHD-FA при pH 7,0.

Окончательные величины MIC свидетельствуют о том, что эффективность комбинации CHD-FA (pH 7,0)+/-оксациллин оставалась стабильной при осуществлении вплоть до 10 пассажей, т.е. результаты оценок MIC при каждом пассаже отличались не более чем в одной лунке по сравнению с результатами первоначальной оценки MIC (пассаж 1). Подробные данные о полученных в результате исследования величинах MIC для комбинации CHD-FA (pH 7,0)+/-оксациллин представлены на фиг.7.

Выводы:

- CHD-FA обладает эффективностью в отношении EMRSA16 по данным анализа in vitro при забуферивании до pH 3,0, 5,0 или 7,0.

- Комбинация CHD-FA плюс оксациллин обладает эффективностью в отношении EMRSA16 по данным анализа in vitro при забуферивании до pH 3,0, 5,0 или 7.0.

- Последовательно осуществляемые пассажи EMRSA16 в присутствии лишь субингибирующих уровней CDH-FA не оказывали влияния на величину MIC.

- Последовательно осуществляемые пассажи EMRSA16 в присутствии лишь субингибирующих уровней комбинации CDH-FA плюс оксациллин не оказывали влияния на величину MIC комбинации.

- Величины MIC CHD-FA в отношении EMRSA16 оставались стабильными после воздействия соединения при осуществлении серийных пассажей в течение периода >20 дней.

- Не было выявлено заметного развития устойчивости как в случае применения монотерапии с использованием CHD-FA, так и при использовании CHD-FA в комбинации с оксациллином, в отношении MRSA16.

Библиография

Bergh J.J., Cronje I.J., Dekker J., Dekker T.G., Gerritsma L.M. и Mienie L.J., Non-catalytic oxidation of water-slurried coal with oxygen: identification of фульвовую кислоту and acute toxicity. Fuel 76, 1997, cc. 149-154.

Lorian V., Antibiotics in Laboratory Medicine, 3-е изд., 1991, с.44 и с.447.

MacCarthy Р, Clapp СЕ, Malcolm RL, Bloom PR., Humic substances in soil and crop sciences: selected readings. Proceedings of a symposium by International Humic Substances Society, Soil Science Society of America, American Society of Agronomy and Crop Science Society of America, Chigaco, Illinois, 2 декабря 1985 г.