содержащая флаваноны композиция для улучшения здоровья кожи, волос и шерсти животных

Формула изобретения

1. Применение, по меньшей мере, одного флаванонового соединения или его производных или их смеси в качестве активного ингредиента при изготовлении композиции для перорального введения, предназначенной для предупреждения, облегчения состояния или лечения заболеваний или повреждений кожи, волос и/или шерсти животных.

2. Применение по п.1, в которых флаваноновые соединения являются изосакуронетином, нарингином, гесперидином, эриодиктиолом, понцирином, неоэриоцитрином или производными, выбранными из их агликоновых форм, хальконовых, гликозилированных или метилированных форм или сульфатированных или глюкуронидированных форм, которые являются продуктами их метаболизма в крови.

3. Применение по п.1, в которых флаваноновое соединение экстрагируют из цедры или мякоти плодов цитрусовых, таких как апельсин, лимон, горький апельсин или грейпфрут.

4. Применение по п.1, в которых композиция является косметической, пищевой или фармацевтической композицией.

5. Применение по п.1, в которых флаваноновые соединения, их производные или их смесь присутствуют в количестве от 0,01 мг до 1 г, предпочтительно от 0,1 до 800 мг агликонового эквивалента флаванонового соединения.

6. Применение по любому из пп.1-5, в которых заболевания или повреждения кожи возникают в результате старения или стрессовой ситуации, такой как химический, биологический или физический стресс, воздействие оксидантов или канцерогенов, бактерий, вирусов, грибов, липидов, происходящих из окружающих клеток и/или микробов, или воздействие УФ-облучения.

7. Применение по любому из пп.1-5, в которых композиция предназначена для улучшения фотопротекции, увлажнения, сухости, плотности, эластичности, маслянистости, толщины, равномерной пигментации, барьерной функции, эластичности кожи для предотвращения окислительного состояния, риска заболевания раком, воспаления или для регулирования продукции и состава кожного сала, и/или уменьшения признаков старения.

8. Применение по любому из пп.1-5, в которых композиция предназначена для улучшения блеска волос или шерсти животных, густоты, цвета, маслянистости волос, для улучшения диаметра волокон, продукции кожного сала и для предупреждения потери волос и шерсти животных.

9. Применение, по меньшей мере, одного флаванонового соединения или его производных или их смеси в качестве активного ингредиента при изготовлении композиции, предназначенной для улучшения состояния кожи, волос и/или шерсти животных при приеме внутрь человеком или домашними животными.

10. Применение по п.9, в которых флаваноновые соединения являются изосакуронетином, нарингином, гесперидином, эриодиктиолом, понцирином, неоэриоцитрином или производными, выбранными из их агликоновых форм, хальконовых, гликозилированных или метилированных форм или сульфатированных или глюкуронидированных форм, которые являются продуктами их метаболизма в крови.

11. Применение по п.9, в которых флаваноновое соединение экстрагируют из цедры или мякоти плодов цитрусовых, таких как апельсин, лимон, горький апельсин или грейпфрут.

12. Применение по п.9, в которых композиция является косметической, пищевой или фармацевтической композицией.

13. Применение по п.9, в которых флаваноновые соединения, их производные или их смесь присутствуют в количестве от 0,01 мг до 1 г, предпочтительно от 0,1 до 800 мг агликонового эквивалента флаванонового соединения.

14. Применение по любому из пп.9-13, в которых заболевания или повреждения кожи возникают в результате старения или стрессовой ситуации, такой как химический, биологический или физический стресс, воздействие оксидантов или канцерогенов, бактерий, вирусов, грибов, липидов, происходящих из окружающих клеток и/или микробов, или воздействие УФ-облучения.

15. Применение по любому из пп.9-13, в которых композиция предназначена для улучшения фотопротекции, увлажнения, сухости, плотности, эластичности, маслянистости, толщины, равномерной пигментации, барьерной функции, эластичности кожи для предотвращения окислительного состояния, риска заболевания раком, воспаления или для регулирования продукции и состава кожного сала, и/или уменьшения признаков старения.

16. Применение по любому из пп.9-13, в которых композиция предназначена для улучшения блеска волос или шерсти животных, густоты, цвета, маслянистости волос, для улучшения диаметра волокон, продукции кожного сала и для предупреждения потери волос и шерсти животных.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции, предназначенной для предупреждения, ослабления симптомов и/или лечения заболеваний или повреждений кожи и волос/шерсти животных, которая эффективна при воспалительных реакциях, неблагоприятных факторах окружающей среды, старении и раке. В частности, настоящее изобретение относится к применению флаваноновых соединений или их производных в пищевых, косметических или фармацевтических композициях для улучшения состояния кожи человека или домашних животных и шерсти животных.

Предшествующий уровень техники

Наиболее значительной эпителиальной тканью у живых организмов является кожа, которая представляет собой самый большой орган организма. Система кожных покровов, которая включает эпидермис, дерму и роговой слой, связана с внутренними органами и одновременно взаимодействует с окружающей средой. Будучи поверхностью раздела между окружающей средой и самим организмом, кожа в большой степени находится под влиянием внешних факторов, а также под влиянием различных параметров внутренней системы организма. Поэтому регуляторные механизмы кожи должны пребывать в активном состоянии, чтобы индуцировать системные изменения, необходимые для поддержания обычных патологических событий, связанных с морфологией и активностью кожных покровов.

Множество процессов, обеспечивающих адекватное усвоение увеличивающегося притока энергетических и пластических веществ в соответствии с потребностями кожи, обеспечивают морфологическую и функциональную стабильность кожных покровов. Поэтому состояние кожных покровов определяет реализацию метаболических процессов, необходимых для жизнеспособности клеток кожи и активности, приводящей к наличию особенных свойств здоровой кожи, таких, как барьерная функция, эластичность, тургорные свойства, влажность, пигментация и т.д.

В течение жизни у живых организмов на коже или волосах появляются различные признаки, характерные для старения, с основными клиническими симптомами, которые представляют собой тонкие линии и глубокие морщины, которые увеличиваются или становятся более заметными с возрастом; потеря волос, уменьшение густоты волос, потеря блеска, цвета, жировой смазки, диаметра волокон и т.д.

Эти симптомы старения дополнительно активизируются под воздействием контакта кожи и волос с экзогенными факторами, такими как УФ-облучение, загрязнения окружающей среды, свободные радикалы или химические вещества.

В уровне области техники предлагалось несколько средств для предупреждения деструктивного влияния окружающей среды и старения эпителиальных клеток кожи. Например, средства для предупреждения ухудшения состояния кожи или старения содержат соединения-ловушки свободных радикалов. В соответствии с этим в патенте ЕР 0761214 раскрыты тушители синглетного кислорода, включающие производные анилина и производных дифурфуриламина, для которых было показано, что они снижают окислительный стресс в коже.

Хотя существует огромное разнообразие активных соединений для улучшения здоровья кожи и волос или шерсти животных, в этой области техники также существует необходимость в поиске активных соединений. В частности, целью настоящего изобретения является обеспечение композиций, которые могут применяться в течение длительного времени человеком или домашними животными и которые могут быть приготовлены в форме пищевой добавки, например в форме пищевой композиции.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой, косметической или фармацевтической композиции для человека или домашних животных, которая содержит в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, одно флаваноновое соединение или его производные или их смесь в количестве, достаточном для предупреждения, лечения или облегчения состояния при заболеваниях кожи, волос и/или шерсти животных и для улучшения здоровья кожи, волос и шерсти животных.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение, по меньшей мере, одного флаванона или его производных или их смеси в качестве активного ингредиента при изготовлении пищевой, косметической или фармацевтической композиции для человека или домашних животных, предназначенной для предупреждения или лечения заболеваний кожи, волос и/или шерсти животных, улучшающей таким образом состояние здоровья кожи у человека или домашних животных.

Композиция настоящего изобретения может быть изготовлена в форме пищевой композиции пищевой добавки для орального приема внутрь человеком или животным или фармацевтической композиции.

Прием внутрь человеком или домашним животным пищевой композиции, как описано выше, приводит к улучшению здоровья кожи, например к улучшению фотопротекции, увлажнения, сухости, плотности, эластичности, маслянистости, равномерной пигментации, иммунитета или здоровья волос и шерсти животных, например, к улучшению блеска волос и шерсти животных, густоты волос, маслянистости, улучшению диаметра волосяных волокон, продукции кожного сала, блеска волос и защите от потери волос и шерсти. Также композиция настоящего изобретения принимается внутрь человеком или животным для улучшения антиоксидантного статуса, барьерной функции, для предупреждения или регулирования окислительного статуса, продукции или состава кожного сала или для уменьшения признаков старения. Она также помогает снизить риск заболевания раком или риск воспаления.

Подробное описание изобретения

В соответствии с первой целью изобретение обеспечивает пищевую, косметическую или фармацевтическую композицию для орального приема внутрь человеком или домашними животными, которая содержит в качестве активного соединения, по меньшей мере, одно флаваноновое соединение или его производные или их смесь в количестве, достаточном для предупреждения, лечения или ослабления симптомов заболеваний или повреждений кожи, волос и/или шерсти животных, и которая, таким образом, улучшает здоровье кожи, волос и шерсти животных.

Флаваноновые соединения, представляющие интерес, являются природными гликозидами, которые можно обнаружить главным образом во фруктах рода Citrus, таких как, например, апельсин, лимон, горький апельсин, грейпфрут, или в меньшей степени в других овощах. Они присутствуют в основном в цедре фруктов, но также в больших количествах в мякоти и, следовательно, в соке цитрусовых. Соединения, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть, например, изосакуронетином, нарингином, гесперидином или эриодиктиолом, понцирином, неоэриоцитрином и их производными, выбранными из их агликоновых форм, хальконовых форм, гликозилированных форм и метилированных форм. Также, применяются их сульфатированные или глюкуронидированные формы, которые обнаруживаются в крови как продукты метаболизма.

В последнем аспекте настоящего изобретения производные могут быть получены с помощью нескольких способов, известных в этой области техники, таких как ферментативное превращение. Например, глюкозо-7-гесперитин получают с помощью рамнозидазы или обработкой гесперидиназой.

Флаваноновое соединение или производные в соответствии с настоящим изобретением могут быть включены в любую композицию, пригодную для приема внутрь соединения индивидуумом, в особенности в пищевую композицию, косметическую композицию или фармацевтическую композицию.

В предпочтительном воплощении получают пищевую композицию, предназначенную для употребления человеком. Эта композиция может быть пищевой композицией, молочным продуктом, напитком, стабильным при хранении при комнатной температуре или при охлаждении, супом, диетической добавкой, заменителем муки и пищевым или кондитерским изделием. Композиция может быть выбрана из группы, включающей молоко или продукты молочного брожения, такие как йогурт, творог, сыр, продукты кисломолочного брожения, мороженое, сухое молоко, детскую молочную смесь, зерновые продукты и продукты ферментации зерновых, напитки, минеральную воду, шоколад или корм для домашних животных, включающую, по меньшей мере, флаваноновое соединение или одно из его производных. Пищевая добавка для орального применения может быть изготовлена в виде капсул, мягких капсул, таблеток, паст или пастилок, смолы или питьевых растворов или эмульсий. Способы их приготовления общеизвестны.

Как описано выше, флаваноновые соединения естественно присутствуют в плодах цитрусовых, в частности в апельсинах, лимонах и грейпфрутах, в их цедре и мякоти. Поэтому в первом аспекте пищевая композиция может быть изготовлена в форме сока таких фруктов или в форме концентрата. Таким образом, пищевая композиция может быть изготовлена в форме любого пищевого продукта, в частности в виде любого напитка, цитрусового сока или любого другого экстракта цедры или мякоти плодов цитрусовых.

В другом воплощении обычный пищевой продукт может быть обогащен флаванонами, предпочтительно в форме цитрусовых экстрактов. Например, сброженное молоко, йогурт, свежий сыр, сычужное молоко, кондитерские изделия, зерновые хлопья для завтрака или зерновые продукты, напитки, сухое молоко, продукты на основе сои, сброженные немолочные продукты или пищевые добавки для клинического питания. Способ получения экстракта апельсина или лимона, обогащенного, например, флаванонами, в частности гесперидином, описан в патентах US № 02400693 и US 2442110, соответственно.

В соответствии со следующим аспектом флаваноновые соединения для включения в спецификацию могут быть получены путем синтеза.

Пищевая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать флаваноновые соединения, их производные или их смесь в приблизительных количествах, адаптированных к ежедневному оральному приему внутрь, составляющему от 0,01 мг до 1 г, предпочтительно от 0,1 мг до 800 мг, более предпочтительно от 10 мг до 800 мг агликонового эквивалента флаванонового соединения.

Флаваноны в соответствии с настоящим изобретением могут применяться либо сами по себе, либо вместе с другими активными соединениями, например, такими как витамин С, витамин Е (токоферолы и токотриенолы), каротеноиды (каротины, ликопен, лутеин, зеаксантин, бета-криптоксантин и т.д.), убихиноны (например, CoQ₁₀), катехины (например, галлат эпигалокатехина), кофейные экстракты, содержащие полифенолы и/или дитерпены (например, кавеол или кафестол), экстракты цикория, экстракты гинкго, винограда или экстракты семян винограда, богатые проантоцианидинами, экстракты специй (например, розмарина), соевые экстракты, содержащие изофлавоны и соответственные фитоэстрогены и другие источники флавоноидов с антиоксидантной активностью, жирные кислоты, например жирные кислоты n-3, пребиотические волокна, пробиотические микроорганизмы, таурин, ресвератрол, аминокислоты, селен и предшественники глутатиона.

В другом воплощении фармацевтические композиции могут приниматься внутрь для профилактики и/или лечения. При терапевтическом применении композиции вводят пациенту, уже страдающему заболеванием, как описано ниже, в количествах, достаточных для того, чтобы излечить или, по меньшей мере, приостановить развитие болезни или ее осложнений. Количество, достаточное для достижения этих целей, определено здесь как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от тяжести заболевания, веса и обычного состояния пациента.

При профилактическом применении композиции настоящего изобретения вводят пациенту, восприимчивому к заболеванию или же при риске определенного заболевания. Такое количество определено здесь как «профилактически эффективная доза». При таком применении точные количества опять же зависят от состояния здоровья пациентов и их веса. Предпочтительно, для человека фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает флаваноновые соединения, их производные или их смеси в количестве, как описано выше, составляющим для ежедневного приема внутрь примерно от 0,01 мг до 500 мг. При ежедневном введении домашним животным композиция может включать от 1 мг до 500 мг агликонового эквивалента флаваноновых соединений.

Соединения настоящего изобретения предпочтительно вводятся с помощью фармакологически приемлемых носителей, природа носителя различается в зависимости от способа введения, например, парентерального, внутривенного, орального или местного (включающего офтальмологический) пути введения.

Особенно ценно будет то, что специалисты в этой области техники, основываясь на своих собственных знаниях, выберут подходящие компоненты и галеновую форму, чтобы целевым образом доставлять активное соединение в кожу или волосы, учитывая способ введения средства, который может быть осуществлен с помощью инъекции, местного нанесения, интраназального введения, введения с помощью имплантированной или трансдермальной системы замедленного высвобождения и т.п.

Целевое соединение может также быть изготовлено в виде косметического продукта, такого как лосьоны, шампуни, кремы, солнцезащитные кремы, кремы после загара, кремы, замедляющие старение и/или мази. Особенно ценно будет то, что настоящие косметические продукты будут содержать смесь различных ингредиентов, известных для специалистов и обеспечивающих быстрое проникновение целевого соединения в кожу и защищающих его от деградации во время хранения.

Будет понятно, что концепция настоящего изобретения может также применяться во вспомогательной терапии вместе с используемыми в настоящее время лекарственными средствами. Так как соединения настоящего изобретения могут быть легко введены вместе с пищевыми ингредиентами, могут применяться специальные клинические продукты, содержащие большое количество целевых соединений. Будет ясно, что после прочтения настоящего описания, а также прилагаемой формулы изобретения специалисты увидят разнообразные возможности, альтернативные специфическим воплощениям изобретения, указанным здесь.

В принципе, соединения настоящего изобретения могут применяться при лечении и/или предупреждении повреждений кожи, которые вызываются стрессовыми ситуациями, например, при химическом, биологическом или физическом стрессе, например, при воздействии оксидантов или канцерогенов, при контакте с микробами, вирусами, грибами, липидами, происходящими из окружающих клеток и/или микробов или при воздействии УФ-облучения.

Следовательно, соединения и/или композиции настоящего изобретения могут применяться для лечения и/или предупреждения повреждений кожи, в особенности актинических и возрастных повреждений кожи, таких как сухость, актинические кератозы, неравномерная пигментация (особенно включающая веснушки, лентигинез, каплевидный идиопатический гипомеланоз и устойчивую гиперпигментацию), морщинистость (в особенности включающую тонкие поверхностные линии и глубокие морщины), звездчатые псевдорубцы, эластоз, неэластичность, телеангиэктазия, венозный рисунок, багряница, угревая сыпь, гиперплазия сальных желез, акрохордон, вишневая ангиома, себоррейный кератоз, лентиго, карцинома базальных клеток и карцинома сквамозных клеток, ожог кожи и/или волдыри, эпидермальная гиперплазия, воспаление, подавление иммунитета и рак, например, немеланомный и меланомный рак кожи. Они также полезны волосам и шерсти животных, например, для улучшения густоты, плотности, цвета, маслянистости, блеска волос или шерсти животных, продукции кожного сала, и помогают предупредить потерю волос или шерсти.

Влияние добавленных в пищу флаваноновых соединений или их производных в соответствии с настоящим изобретением на кожу человека или домашних животных можно оценить с помощью общеизвестных методов, включающих минимальную эритемную дозу (MED), колориметрию, трансэпидермальную потерю воды, репарацию ДНК (например, по гену р53), измерение продукции интерлейкинов и протеогликанов или активности коллагеназы, барьерную функцию или восстановление клеток.

Следующие примеры детально иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объема. Примерам предшествует краткое описание чертежей.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: Клетки HaCat инкубировали с 10 мкМ гесперитином (hp, красные колонки) или 10 мкМ гесперитин-7-О-глюкуронидом (hp-7-O-gluc, желтые колонки) или эквимолярным количеством ДМСО в качестве контроля (синие колонки) и дополнительно инкубировали с или без менадиона. Супернатант анализировали на присутствие лактатдегидрогеназной активности (LDH) и результаты выражали в относительных единицах, сравнивая с клетками, лизированными перед анализом с помощью тритона Х-100 (100%-ная смертность клеток).

Фиг.2: Диаграмма, представляющая собой схему эксперимента по анализу роста на гесперидиновой диете.

Фиг.3: Гистопатологический анализ кожи крыс после обработки гесперидином. Парафиновые срезы толщиной 6 мкм депарафинизировали, окрашивали с помощью гематоксилина/эозина и монтировали препарат для микроскопии. Типичные изображения при двух увеличениях представлены для контрольной группы (А и D) и для групп, выкормленных на диете с гесперидином (0,1%: В и Е, 0,5%: С и F).

Фиг.4: Анализ суммарной РНК, выделенной из кожи крыс, выкормленных с помощью контрольной диеты (ctrl) или с помощью диеты, дополненной гесперидином (0,1% Hp, 0,5% Hp), проведенный с помощью ПЦР в реальном времени для экспрессии CD1d1 и интерлейкина 6 (IL-6). Образцы анализировали в 3 пулах, каждый из которых содержал по 4 крысы, и полученные значения Ct показаны для CD1d1 (А) и IL-6 (В). Точки представляют средние значения, относящиеся к трем повторам, поперечные линии относятся к среднему значению для группы. Кратность изменения экспрессии при дополненной диете по отношению к контрольной диете и по отношению к конститутивному гену показаны на панели С. Значения для контрольной диеты приняты за единицу и представлены толстой линией. Доверительные интервалы рассчитаны с помощью программы ANOVA.

Пример 1. Минеральная вода, обогащенная флаваноном

Минеральную воду получали, добавляя гесперитин-7-глюкозу в количестве от 0,01 мг до 200 мг на 1 л из расчета среднего потребления воды около 1 л в день.

Пример 2. Косметическое средство для орального применения

Композиция в форме твеолой капсулы имела следующий состав:

Соединение	мг на капсулу
Гесперидин (эквивалент гесперитина)	250
Наполнитель для основы
Микрокристаллическая целлюлоза	70
Encompress ТМ	60
Стеарат магния	3
Безводный коллоидный кремнезем	1
Материал для оболочки
Гуммилак	5
Тальк	61
Сахароза	250
Поливидон	6
Диоксид титана	0,3
Краситель	5

Композицию можно принимать в количестве от 2 до 3 капсул ежедневно.

Пример 3. Консервы для домашних животных и пищевые добавки

Смесь готовят из 73% тушки домашней птицы, свиных легких и говяжьей печени (измельченной), 16% пшеничной муки, 7% воды, 2% красителей, вкусовых ароматизаторов, витаминов и неорганических солей. Эту смесь эмульгировали при 12°С и прессовали в форму пудинга и затем готовили при температуре 90°С. Пудинг охлаждали до 30°С и разрезали на большие куски. 45% кусков смешивали с 55% соуса, приготовленного из 98% воды, 1% красителя и 1% гуаровой смолы. Заполняли жестяные банки и стерилизовали при 125°С в течение 40 минут.

В качестве добавки для смешивания с кормом для домашних животных перед приемом пищи заготавливали дополнительную упаковку цитрусового экстракта в форме пакетика-саше с 50 мг гесперитинового эквивалента. Этот пакетик поставлялся как пищевая добавка, отдельно прикрепленная к консевной банке вместе с инструкцией по кормлению.

Пример 4. Функциональное питание

Пищевую добавку готовили смешиванием или гомогенизированием фруктоолигосахарида с инулином в весовых пропорциях, составляющих примерно 70% фруктоолигосахарида и 30% инулина, с добавкой 500 мг гесперитинового эквивалента. Полученную пребиотическую смесь можно добавлять или гомогенизировать с любым подходящим носителем, например сброженным молоком, йогуртом, свежим сыром, сычужным молоком, кондитерскими изделиями, хлопьями для завтрака или крупяными изделиями, напитком, сухим молоком, соевым продуктом, немолочным сброженным продуктом или пищевой добавкой для клинического питания.

Пример 5. Материалы и Методы

Измерение цитотоксичности

Иммортализованные кератинопиты человека (НаСаТ) инкубировали с 10 мкМ гесперитином, 10 мкМ гесперитин-7-О-глюкуронидом или эквивалентными количествами ДМСО в качестве отрицательного контроля в течение 16 часов и 1 час перед воздействием. Затем клетки обрабатывали 100 мкМ менадионом, ксенобиотиком, который внутриклеточно продуцирует активные формы кислорода. В качестве положительного контроля применяли клетки, необработанные менадионом. Через 5 часов супернатант анализировали на лактатдегидрогеназную активность (LDH), измеряя клеточную смертность с помощью нерадиоактивного цитотоксического теста CytoTox 96 non-raioactive cytotoxicity assay (Promega, USA).

Образцы кожи

Биопсию кожи крыс получали в экспериментах по изучению роста на гесперидиновой диете (Фигура 2). Вырезали кожу со спины, одну часть фиксировали в 4%-ном параформальдегиде (PFA) и погружали в парафин, другую часть хранили в замороженном состоянии, а третью часть сразу же замораживали в жидком азоте.

Гистология

Парафиновые срезы

Кожу крыс разрезали и фиксировали в течение 4 дней в 4%-ном параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7,4) при 4°С и погружали в парафин с помощью прибора Leica Microsysteme embedding apparatus. Ткань промывали в PBS-буфере и солевом растворе (0,9%-ный NaCl) и обезвоживали последовательным промыванием, начиная с солевых растворов, увеличивающимися концентрациями этанола: по 30 мин в 30%-, 50%-, 70%-, 90%-, 99%-, 100%-ном растворе этанола и дополнительно 1 час в 100%-ном этаноле. Образцы ткани инкубировали дважды по 30 мин в ксилоле с последующими инкубациями в течение 2-3 час и 3 час в твердом парафине при 60°С. Парафиновые срезы толщиной 6 мкм нарезали с помощью микротома Leica. Срезы депарафинизировали 5 мин в ксилоле и регидратировали, последовательно пропуская их через серию растворов с уменьшающимися концентрациями этанола: по 1 мин в 100%-, 96%-, 90%-, 80%-, 70%- и 50%-ном растворе этанола. В конечном итоге срезы переносили в дистиллированную воду и окрашивали.

Окрашивание гематоксилином/эозином

Регидратированные срезы окрашивали в течение 45 сек в гематоксилиновом растворе Майера, ополаскивали по 1 мин каждым из растворов следующей серии: дистиллированная вода, водопроводная вода, дистиллированная вода и 70%-ный этанол. После 10 сек окрашивания в растворе эозина (1 весовой % в 90%-ном этаноле) срезы ополаскивали в 90%-ном и 100%-ном этаноле. После двух 10-минутных инкубаций в ксилоле с помощью эпоксисмолы Eukit монтировали покровные стекла и высушивали их на воздухе в течение 2 час при комнатной температуре.

РНК-методы

Основные направления работы с РНК

Для экспрессии РНК применяли стерильные пластиковые или прокаленные стеклянные сосуды (180°С в течение, по меньшей мере, 8 часов). Все поверхности перед использованием очищали с помощью RNase ZAP, включая дозатор, и устойчивые к аэрозолям наконечники использовали только однократно.

Оборудование

Секвенатор ABI prism® 7000HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)

Программное обеспечение ABI prism® 7000 RT-PCR (Applied Biosystems, USA)

ПЦР-циклер, например, программируемый терморегулятор РТС-100 (MJ Research Inc., USA)

Биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, USA)

Флуоресцентный планшетный ридер, например. Spectra Fluor Plus F 129005 (Tecan, USA)

Центрифуга Multifuge 3S, Heraeus со специальным бакет-ротором для ультрацентрифугирования (Kendro Laboratory Products, Switzerland)

Центрифуга с охлаждением, например Centrifuge 54178 (Eppendorf, Germany)

Реагенты

Набор Totally RNA Kit (Кат. № 1910) (Ambion, USA)

Lysing Matrix D (Кат. № 6913-100), Q BIOgene, France

RNA 6000 Nano Assay (Кат. № 5065-4475 и 5065-4476) (Agilent Technologies, USA)

Наборы для анализа по требованию (20-кратные растворы. Applied Biosystems, USA)

RNase ZAP (Кат. № 9780) (Ambion, USA)

Вода, очищенная от нуклеаз (ddH₂O, Кат. № 9939) (Ambion, USA)

Вода, пропущенная через Milli-Q (0,22 ммк, ddH₂O)

Этанол, чистый для анализа (Кат. № 02860) (Fluka)

Фосфатно-солевой раствор Дюльбекко (PBS, Кат. № D8537) (Sigma)

-меркаптоэтанол (Кат. № М7522) (Sigma, USA)

Набор RiboGreen RNA Quantitation Kit (Кат. № R-11490) (Molecular Probes, USA)

SUPERase-In RNase Inhibitor (20 Ед/мкл, Кат. № 2694) (Ambion, USA)

Superscript II RNase H^- reverse transcriptase (200 Ед/мкл Кат. № 18064-014) (Invitrogen, USA)

Буфер для синтеза первой цепи ДНК (5-кратный): 250 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,1%-ный (в/в) NP-40, 50%-ный (в/в) глицерин, включенный в реагент Superscript II RNase H^- reverse transcriptase

Дитиотреитол (ДТТ, 1 мМ), включенный в реагент Superscript II RNase H^- reverse transcriptase

2 -Дезоксиаденозин-5'-трифосфат (dATP, 100 мМ, Кат. № 272050) (Amersham Biosciences, England)

2 -Дезоксицитидин-5 -трифосфат (dCTP, 100 мМ, Кат. № 272060) (Amersham Biosciences, England)

2 -Дезоксигуанозин-5 -трифосфат (dGTP, 100 мМ, Кат. № 272070) (Amersham Biosciences, England)

2 -Дезокситимидин-5 -трифосфат (dTTP, 100 мМ, Кат. № 272080) (Amersham Biosciences, England)

pd(N)₆ Random hexamer (Кат. № 27-2166-01) (Amersham Biosciences, England)

TagMan Universal PCR Master Mix (Кат. № PN4304437) (Applied Biosystems, USA)

Таблица 1:
Примененные наборы для анализа по требованию (название анализа),включая названия генов, обозначения генов и ссылки на последовательности
Название гена	Обозначение гена	Отсылка на последовательность	Название анализа
Интерлейкин-6	I16	NM_012589	Rn00561420_ml
Антиген CD1d1	CD1d1	NM_017079	Rn_00567162 ml
Пролиферативный клеточный ядерный антиген	Pcna	NM_022381	Rn00574296_gl
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа	Gapd	NM_017008	Rn99999916_sl

Экстракция РНК

Образцы кожи гомогенизировали в Lysing Matrix D, суммарную РНК экстрагировали с помощью набора Totally RNA Kit в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. РНК элюировали с помощью 40 мкл воды, свободной от нуклеаз.

Количественное определение РНК

Количественное определение проводили на 96-луночных планшетах с помощью набора Ribogreen® RNA quantitation Kit и флуоресцентного планшетного ридера в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Измерения проводили в двух повторах. Образцы разводили или 1:680, или 1:3400 в конечном объеме 100 мкл в однократном ТЕ-буфере. В качестве стандартов применяли разведения рибосомальной РНК с концентрациями 1, 0,5, 0,1, 0,02, 0 мкг/мл. Целостность РНК контролировали с помощью анализа RNA 6000 Nano Assay.

Обратная транскрипция

Все процедуры проводили на льду. К 2 мкг РНК в воде, свободной от нуклеаз, в конечном объеме 12 мкл добавляли 2 мкл случайных гексамерных праймеров pd(N)6 и 1 мкл dNTP (10 мМ). После 5 минутной инкубации при 65°С образцы сразу же помещали на лед и быстро центрифугировали. Затем добавляли 4 мкл 5-кратного буфера для синтеза первой цепи ДНК, 2 мкл дитиотреитола, 1 мкл ингибитора РНКаз и 1 мкл обратной транскриптазы Superscript II RNase H^- (конечный объем 20 мкл). Реакцию обратной транскрипции проводили в ПЦР-термоциклере, применяя следующий температурный режим: активация фермента - 10 мин при 25°С; реакция обратной транскрипции - 60 мин при 42°С; ингибирование фермента - 20 мин при 70°С. Образец затем хранили в замороженном состоянии при - 20°С до первого использования.

Полимеразная цепная реакция в реальном режиме времени

ПНР в реальном режиме времени проводили в соответствии с методом TaqMan® в 96-луночных планшетах (96WP) с помощью праймера и зондов наборов по требованию. Анализ проводили в трех повторах с помощью реагента МастерМикс (3,5-кратного), который содержал 43,7 мкл ПЦР-реагента TaqMan® 2x Universal PCR master mix, 4,4 мкл праймеров и зондов наборов по требованию, 21,9 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 17,5 мкл кДНК (87,5 нг =25 нг на реплику). Тройные повторы МастерМикса объемом 25 мкл помещали в 96-луночный реакционный планшет ABI prism, планшет закрывали оптически прозрачной адгезивной крышкой и центрифугировали три раза при 2000 об/мин в течение 1 мин или до тех пор, пока не пропадали все пузырьки воздуха. Затем на приборе ABI prism® 7000HT Sequence Detection System проводили ПЦР, применяя следующий температурный режим: активация фермента - 2 мин при 50°С; денатурация - 10 мин при 95°С и 40 циклов целевой амплификации - 15 сек отжига при 95°С и 1 мин наращивания при 60°С. Анализ амплификационных кривых проводили с помощью программного обеспечения ABI prism® 7000 RT-PCR, регулировку базовой линии проводили индивидуально (116: 15-2;5, Cd1d1: 10-20; Pcna: 15-25; Gapd: 6-15), тогда как пороговые величины устанавливали вручную при 0,2 для всех праймеров. Полученные значения Ct экспортировали в Microsoft Excel для дальнейшего анализа.

Статистический анализ

Результаты анализировали с помощью программы ANOVA.

Результаты и Обсуждение

Эксперименты in vitro с использованием иммортализованных кератиноцитов (HaCat) показали, что обработка гесперитином (hp) и гесперитин-7-О-глюкуронидом (hp-7-O-gluc) снижает клеточную смертность в нормальных условиях культивирования. Защитный эффект hp и hp-7-O-gluc был даже более выраженным в клетках, подвергнутых воздействию менадионом, ксенобиотиком, который увеличивает внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК). Кроме того, оказалось, что hp-7-O-gluc, основной метаболит гесперидина в крови, является более мощным протектором по сравнению с агликоном hp (Фиг.1).

Затем защитный эффект гесперидина был исследован в интервенционных испытаниях на животных с использованием растущих самок-крыс линии Wistar. После того, как крыс лишили грудного вскармливания, их случайным образом разделили на 3 группы, в каждой по 12 животных, и держали или на контрольной диете, или на диете, дополненной двумя эффективными дозами гесперидина (0,1% и 0,5%). В возрасте 12 недель крыс забивали и кожные ткани использовали для гистологии и анализа мРНК (Фиг.2). Гистопатологический анализ кожи выявил уменьшение количества воспалительных клеток у животных, выкормленных на гесперидиновой диете. Типичные образцы показаны на Фигуре 3 (3А+D(контроль) против 3В+Е (0,1% гесперидина) и 3C+F (0,5% гесперидина)). Эти гистологические наблюдения можно было подтвердить в экспериментах по измерению уровня мРНК. Крысы, получавшие 0,5% гесперидина, демонстрировали значительно сниженный уровень IL-6, воспалительного питокина (Фиг.4 А+С). Кроме того, уровни мРНК для CD1d1 значительно снижались в обеих группах, выкормленных на диете с добавлением гесперидина (Фиг.4 В+С).

Эти результаты отчетливо демонстрируют цитопротекторное и противовоспалительное действие орально принимаемого гесперидина, проявляющиеся на коже.