противотуберкулезное средство в виде раствора для инъекции

Формула изобретения

Противотуберкулезное средство в виде раствора для инъекции, включающее действующее начало, в качестве которого содержит 1-изоникотил-2-глюкозилгидразона дигидрат (изоглюкозил) в концентрации от 0,1 до 10% и приемлемый для фармацевтики носитель - воду для инъекции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к средствам, обладающим противотуберкулезным действием и используемым во фтизиатрии.

В нашей стране наблюдается увеличение случаев заболевания высококонтагинозной открытой (легочной) формой туберкулеза. Лечение туберкулеза осложняется способностью возбудителя туберкулеза изменяться в макроорганизме и в таком виде переживать неблагоприятные условия (возникновение Л-форм), что ведет к развитию лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам, а также к изменениям вирулентности с сохранением основного качества - патогенности. Для преодоления этой проблемы необходимо использовать во фтизиатрии новые противотуберкулезные препараты. В настоящее время препаратами 1 группы при лечении туберкулеза являются изониазид и рифампицин, обладающие высокой бактериостатической активностью в отношении микобактерий туберкулеза. Следует отметить, что несмотря на высокую активность этих препаратов по отношению к возбудителю туберкулеза они обладают рядом нежелательных побочных эффектов как аллергической, так и неаллергической природы. Так, для изониазида характерны такие побочные эффекты, как влияние на ЦНС (судороги, психические нарушения и др.), невриты, аллергические реакции. Для рифампицина можно выделить диспепсические нарушения, угнетение функции печени, аллергические реакции, а также развитие суперинфекции и быстрое развитие устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину. Данные побочные эффекты могут носить угрожающий характер и являются показанием к отмене препарата.

Известна фармацевтическая композиция (изониазид для инъекции), обладающая противотуберкулезным действием, включающая изониазид и приемлемый для фармацевтики носитель, в качестве которого может быть использован растворитель (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1988, с.315-316). Основным недостатком такой композиции является быстрое развитие лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, что снижает его эффективность.

Для повышения противотуберкулезной активности препаратов и снижения токсического действия изониазида предложено в композицию, включающую изониазид, в качестве приемлемого для фармацевтики носителя дополнительно включить фторурацил. Эта композиция может быть выполнена в виде раствора и введена как внутримышечно, так и внутривенно. В качестве носителя может быть использована вода, 0,9-5% растворы натрия хлорида и др. (патент RU № 2211035, МПК А61К 31/455, 2003).

Для улучшения биофармацевтических свойств изониазида, пролонгирования его действия и снижения токсичности предлагается использовать такие полимеры, как: этилцеллюлозу, -циклодекстрин, пектины и др. (Овчаренко Л.П. Исследование соединений включения веществ производных изоникотиновой кислоты с -циклодекстринами. Автореф. дис. канд. фармац. наук. - Пятигорск, 1991, с.21; Туркенбаева К.А., Шипунова О.В., Кривцова А.Е. и др. О возможности лечения туберкулеза полимерным изониазидом пролонгированного действия // Пробл. туберкулеза, 1990, № 3, с.32-35). Известна композиция для лечения туберкулеза на основе изониазида, химически связанного с декстраном, и подходящего водного растворителя (патент RU № 2087146, 2143900, МПК А61К 31/455, 1997, 2000). Существенным недостатком этой системы является ограниченность только одним лекарственным веществом.

Модифицированные противотуберкулезные препараты, синтезированные на полимерных матрицах и оказывающие пролонгирующее действие, часто приводят к нежелательным последствиям - образованию доброкачественных опухолей. Это связано с тем, что полимеры синтезированных препаратов на полимерных матрицах существенно снижают действие других лекарственных средств, применяемых в комплексе с производными изониазида [А.А.Приймак, Г.Б.Соколова, А.М.Белькинд, А.И.Сливкин и др. Лабораторно-экспериментальные исследования // Пробл. туберкулеза, 1987, № 1, с.53].

Известно новое действующее вещество - изоглюкозил, синтезированный на мономерной углеводной матрице с содержанием изониазида 46,5%. Исследования in vivo показали, что изоглюкозил проявляет высокую бактериостатическую активность в отношении штаммов микобактерий туберкулеза и характеризуется низкой токсичностью по сравнению с изониазидом [Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Сироткина Г.Г. и др. Полимерная форма гидразида изоникотиновой кислоты // Человек и лекарство: Тез. докл. IV Рос. нац. конгр. (8-12 апреля, 2002 г.). - М., 2002, с.698].

Задачей изобретения является создание лекарственного средства на базе изоглюкозила, у которого токсическое побочное действие сведено к минимуму, что позволит расширить ассортимент противотуберкулезных препаратов.

Технический результат заключается в высокой терапевтической эффективности и низкой токсичности.

Технический результат достигается тем, что предложено использовать для лечения туберкулеза противотуберкулезное средство в виде раствора для инъекции, включающее действующее начало, в качестве которого содержит 1-изоникотил-2-глюкозилгидразона дигидрат (изоглюкозил) в концентрации от 0,1% до 10% и приемлемый для фармацевтики носитель - воду для инъекции.

Изоглюкозил - производное изониазида, синтезированное на основе мономерной матрицы углеводного типа, - является противотуберкулезным соединением, его активность in vitro не уступает активности изониазида. Токсичность изоглюкозила значительно ниже токсичности изониазида (в 24 раза по показателю ЛД₅₀). Изоглюкозил способен на 12 часов дольше, чем изониазид, сохраняться на бактериостатическом уровне.

Широта терапевтического действия изоглюкозила в 15 раз выше изониазида при отсутствии негативных явлений, таких как острая и хроническая токсичность, эмбриотоксичность, тератоксичность, гепатотоксичность, характерных для изониазида. Изоглюказил обладает пролонгированным свойством, в связи с чем кратность его введения может быть сокращена вдвое.

ДЕЙСТВУЮЩЕЕ ВЕЩЕСТВО - Изоглюкозил (1-изоникотил-2-глюкозилгидразона дигидрат) - белый с кремовым оттенком порошок без запаха, устойчив на воздухе. Растворим в воде, мало растворим в спирте 95% и спирте метиловом, практически нерастворим в хлороформе. C₁₂H₁₇ N₃O₆·2H₂O, мол.масса 335,3.

Структурная формула:

Вода для инъекций (ФС 42-2619-97)

Бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса, рН 5,0-6,8.

На фиг.1 изображен спектр поглощения 0,003% раствора изоглюкозила; на фиг.2 - общая технологическая схема изготовления раствора для инъекций; на фиг.3 - результаты определения стабильности 1%-ного раствора изоглюкозила для инъекций в процессе хранения при (20±2)°С; на фиг.4 - результаты определения стабильности 1% раствора методом "ускоренного старения" при (40±1)°С.

Для построения спектра поглощения и установления удельного показателя поглощения изоглюкозила готовили серии растворов с содержанием изоглюкозила 0,003%.

Точную навеску изоглюкозила (0,15 г) растворяли при нагревании на водяной бане в 100 мл воды очищенной (воды для инъекций). Из полученного раствора отбирали 2 мл, переносили в мерную колбу на 100 мл и доводили до метки водой очищенной.

Измеряли оптическую плотность спектрофотометрическим методом в УФ-области на спектрофотометре марки СФ-26, в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Проводили 7 параллельных опытов.

Оптическую плотность 0,003% раствора измеряли в интервале длин волн 220-350 нм. Спектр поглощения изоглюкозила представлен на фиг.1. Максимальную оптическую плотность наблюдали при длине волны 261±2 нм.

Удельный показатель поглощения рассчитывали по формуле:

где E_1см - удельный показатель поглощения;

D - оптическая плотность;

С - концентрация раствора изоглюкозила, %.

Спектр поглощения 0,003% раствора изоглюкозила показан на фиг.1.

Среднее значение удельного показателя поглощения изоглюкозила рассчитывали по формуле:

где E_cp.1см - удельный показатель поглощения;

n - количество измерений.

Полученное среднее значение показателя поглощения изоглюкозила составило 130.

Для количественного определения изоглюкозила в субстанции точную навеску (0,1 г) изоглюкозила помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в воде очищенной и доводили тем же растворителем до метки (раствор А).

Раствор А, объемом 1 мл, переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили водой очищенной до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре марки СФ-26 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны 261 нм.

Содержание изоглюкозила рассчитывали по формуле:

,

где Х - содержание изоглюкозила, %;

D - оптическая плотность;

E_1см - удельный показатель поглощения, 130;

W ₁, W₂ - разведения, мл;

а - точная навеска изоглюкозила, г;

b - раствор Б, взятый для разведения W₂, мл.

Для количественного определения изоглюкозила в растворе 0,3 мл 1% раствора изоглюкозила помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли часть воды очищенной, перемешивали и этим же растворителем доводили до метки, перемешивали. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре марки СФ-26 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны 261 нм. Содержание изоглюкозила рассчитывали по формуле (3).

Хроматографию в тонком слое сорбента использовали при проведении теста идентификации изоглюкозила, а также подтверждения стабильности состава раствора в процессе хранения.

Хроматографирование выполняли на пластинах «Silufol UF-254» восходящим способом в трех системах растворителей: диметилформамид-метанол-хлороформ (0,25:1:9); хлороформ-метанол-водный раствор аммиака 25% (10:2,5:0,2); этанол-хлороформ-водный раствор аммиака 25% (5:5:1,5).

На дно хроматографической камеры помещали подвижную фазу для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру закрывали и выдерживали для насыщения парами растворителя 30 минут. На линию старта подготовленной хроматографической пластины наносили исследуемый водный раствор изоглюкозила и раствор стандартного образца в воде очищенной.

Подсушивали подготовленные хроматографические пластины на воздухе и вносили в хроматографическую камеру с разными системами растворителей. По окончании выдержки хроматографические пластины вынимали из камеры, высушивали на воздухе для удаления растворителей, детекцию зон адсорбции проводили в УФ-свете.

Изготовление раствора изоглюкозила для инъекций осуществляли, руководствуясь основными положениями статьи ГФ XI изд. (1989, вып.2).

Общая технологическая схема изготовления раствора для инъекций представлена на фиг.2.

Раствор для наполнения ампул готовят в асептических условиях. В стерильной мерной посуде в части свежеперегнанной воды для инъекций растворяли изоглюкозил. Этой же водой доводили раствор до метки. Раствор фильтровали через стерильный стеклянный фильтр и проверяли на отсутствие механических включений.

Ампулы одинаковой вместимостью (5 мл) вскрывали (с помощью бруска наносят насечку и отламывают кончик капилляра).

С помощью шприца осуществляли наружную и внутреннюю мойку ампул водой очищенной, имеющей температуру 50-60°С.

Для сушки и стерилизации ампул их помещали в сушильный шкаф с температурой 200°С.

Ампулы на 5 мл наполняли с помощью шприца раствором, учитывая при этом фактический объем наполнения - 5,5 мл раствора в каждой ампуле.

Запайку ампул осуществляли способом оттяжки капилляра.

Раствор в ампулах стерилизовали при (120±1)°С 8 мин.

Оценка качества инъекционного раствора в ампулах.

Органолептический контроль - прозрачность, цветность. На отсутствие механических включений ампулы просматривали на белом и черном фоне в свете рефлекторной лампы. Осуществляли качественный и количественный анализ раствора.

Для определения срока годности 1% раствор изоглюкозила для инъекций в ампулах хранили в условиях комнатной температуры и методом "ускоренного старения" при температуре (40±1)°С. Результаты изучения стабильности раствора представлены на фиг.3, 4.

Выводы: 1% раствор изоглюкозила для инъекций стабилен при температуре 20°С в течение одного года (срок наблюдения).

Экспериментальный срок стабильности при 40°С - 46 суток, в пересчете на 20°С - 2 года.

Оценку острого токсического действия препарата проводили согласно методическим указаниям по изучению острого токсического действия фармакологических веществ («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», М., 2000, с.18-24).

19 линейным гибридам мышам-самцам препарат вводили внутривенно в дозах 1,5-2-4-5 г/кг; 19 линейным мышам-самкам - в дозах 1,5-2-2,5-5 г/кг.

Показано, что мыши переносили препарат в указанных дозах без летального эффекта и даже без признаков интоксикации и каких-либо изменений поведенческих реакций.

Внутрибрюшинное введение мышам и крысам препарата в дозах до 3 г/кг гибели не вызывало. Одиночная гибель отмечалась у животных, получавших препарат при дозах 3,5 г/кг и выше. Картина отравления животных при внутрибрюшинном введении существенно не отличалась. Гибель наступала у мышей через 1,5-2,5 ч, у крыс - через 2,0-2,5 ч. При вскрытии выживших животных через 10 суток после однократного введения препарата никаких патологических изменений во внутренних органах обнаружено не было.

Для сравнения токсичности проводили аналогичные опыты с изониазидом. Гибель от изониазида наступала через 40-90 минут.

Средние смертельные дозы препарата для мышей и крыс при внутрибрюшном введении равнялись 6200 мг/кг и 6000 мг/кг соответственно.

Таким образом, средняя смертельная доза препарата для мышей в 32 раза, а для крыс в 16 раз выше таковой изониазида.

Изучение хронической токсичности проводилось на белых беспородных крысах (123 самца и самок) с начальной массой 250-270 г. Животные были разделены на три группы: 1-я группа - контрольная, 2-я и 3-я - опытные. В каждой группе было по 41 крысе. Препарат вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в объеме 1 мл на 100 г массы тела 7 дней в неделю в течение 6 месяцев. Дозы: 80 мг/кг (предполагаемая терапевтическая доза) и 1000 мг/кг массы тела (1/3 максимально нелетальной дозы препарата). Контрольным - в равном объеме физиологический раствор.

Для оценки токсических свойств препарата использовали физиологические, гематологические, биохимические, морфологические методы исследования, характеризующие функции различных органов и систем организма. Анализ функционального состояния органов и систем по рекомендованным методам проводили до введения препарата (фон), затем через 1, 2, 4, 6 месяцев после начала введения и спустя 1 месяц после отмены препарата. Кровь брали из подъязычной вены.

Было установлено: клинические характеристики (поведение, общее состояние, результаты гематологических и биохимических исследований) не отличались от таковых у контрольной группы; макроскопических и гистологических изменений внутренних органов не обнаружено.

Эффективность противотуберкулезного препарата оценивали в опыте на морских свинках массой тела 350-400 г. Животных (80 голов) заражали 2-недельной культурой МБТ штамма H37Rv подкожно, в правую паховую область в дозе 0,01 мг.

Зараженных животных разделили на 6 групп: 1-я и 2-я группы получали изониазид в дозах 25 и 75 мг/кг. Животные 3-й, 4-й и 5-й групп получали препарат в дозах 50, 150 и 100 мг/кг, вводимый ежедневно внутримышечно, в физиологическом растворе. Контрольная (6-я группа) препаратов не получала.

Гибель животных контрольной группы началась через 6 недель после заражения. Животные опытных групп, получивших препарат, хорошо прибавляли в весе, язв на месте заражения у них не наблюдали. У животных, получавших изониазид, отмечена повышенная возбудимость.

После введения препарата в течение 2 месяцев в дозе 50 мг/кг во внутренних органах и регионарных лимфатических узлах зараженных туберкулезом морских свинок не обнаруживается возбудителей заболевания.

Для обоснования эффективности лечебного эффекта и безопасности применения проведено определение его концентраций в биологических жидкостях и тканях организма морских свинок. Параллельные исследования проведены с изониазидом.

Опыты проведены на 24 интактных морских свинках массой 200-300 г. Препарат и изониазид вводили однократно в мышцу бедра животных в дозах 50 и 25 мг/кг соответственно. Через 1, 6, 14 и 24 ч после введения препарата животных забивали и брали на исследование кровь и ткани органов. В качестве тест-культуры использовали музейный штамм МБТ H37Rv. Полученные данные свидетельствуют, что препарат хорошо всасывается (через 24 часа после введения препарата его концентрация соответствует 0,47 мкг/мл, а изониазида не достигает уровня МПК). В ткани легкого через 6, 14 и 24 ч после введения препарат обнаруживается в значительно более высоких концентрациях, чем изониазид. Препарат способен на 12 ч дольше, чем изониазид, сохраняться в крови морских свинок на бактериостатическом уровне. Отмечается более высокая его концентрация в ткани легкого в течение 24 ч. Динамика его содержания в тканях печени и мозга обеспечивает более низкую нейро- и гепатотоксичность по сравнению с изониазидом.