косметическое средство и способ его получения

Формула изобретения

1. Косметическое средство для повышения эластичности кожи, содержащее активный ингредиент и носитель, отличающееся тем, что оно представляет собой комплекс, включающий теломерную последовательность ДНК размером 100-300 п.н., синтезированную на основе геномной ДНК человека, и слитого пептида, состоящего из пептида, имеющего сигнал ядерной локализации, и пептида, содержащего домен белковой трансдукции, с последовательностью аминокислот, выбранной из группы:

GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV

RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV

GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV,

и способный проникать через плазматическую мембрану клетки.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что указанный комплекс дополнительно включает в себя липосому, в которую введены указанная теломерная последовательность ДНК и указанный пептид.

3. Способ получения косметического средства по п.1, отличающийся тем, что синтезируют теломерную последовательность ДНК человека размером 100-300 п.н. и

полученную теломерную последовательность ДНК соединяют с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, и пептидом, содержащим домен белковой трансдукции, с последовательностью аминокислот, выбранной из группы:

GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV

RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV

GALFLGFLGAAGSTMGAWSGPKSKRKV,

с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что при образовании указанного комплекса теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид вводят в липосому.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что берут образец крови или ткани у человека, к которому предполагается применить данное косметическое средство, получают из него тотальную геномную ДНК и на ее основе в качестве матрицы синтезируют указанную теломерную последовательность.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к области косметологии и касается средств для ухода за кожей.

Предшествующий уровень техники

Известны многочисленные косметические средства, улучшающие внешний вид кожи. В частности, известны косметические средства, применение которых позволяет накапливать и удерживать в коже воду, тем самым на некоторое время устраняя или предупреждая сухость и потерю эластичности кожи.

Известны косметические средства, содержащие антиоксиданты, которые связывают образующиеся в коже свободные радикалы или препятствуют образованию новых, тем самым предотвращая протекание реакций с их участием, неблагоприятно сказывающихся на нормальном функционировании клетки. Например, известны препараты, содержащие в качестве антиоксидантов аскорбиновую кислоту или витамин Е (Holck David Е.Е., John D. Ng. Facial skin rejuvenation. Curr Qpin in Ophthalmol 14:249).

Известны косметические средства, содержащие вещества (например, ретиноиды (Holck David E.E., John P. N. Facial skin rejuvenation, Curr Opin in Qphthalmol 14:248), которые стимулируют активность фибробластов и синтез новых коллагеновых волокон в дерме, а также митотическую активность и обновление клеток в эпидермисе, приводя к снижению толщины рогового слоя, увеличению толщины зернистого слоя кожи и улучшению структуры кожи.

Недостатком известных косметических средств является то, что они не влияют на процесс старения клеток кожи организма, давая лишь относительно небольшой эффект по улучшению ее функций и внешнего вида.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание косметического средства, способного препятствовать старению клеток кожи, тем самым более эффективно улучшая функции кожи и ее внешний вид.

Указанная задача решается тем, что предложено косметическое средство, содержащее активный ингредиент и носитель, в котором согласно изобретению активный ингредиент содержит комплекс, который включает теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид, имеющий сигнал ядерной локализации (NLS), и который способен проникать через плазматическую мембрану клетки.

При применении предложенного косметического средства содержащаяся в нем теломерная последовательность ДНК проникает в ядро клетки кожи, приводя к увеличению числа делений, которые способна осуществить клетка, т.е. замедляя процесс старения клетки, в результате чего кожа приобретает большое количество молодых клеток. Тем самым обеспечивается ускорение реэпителизации кожи, увеличение плотности ее клеток и противодействие утончению кожи в эпидермисе, а также повышение выработки эластиновых волокон фибробластами в дерме. В результате достигается более эффективное улучшение внешнего вида кожи, а также более эффективное ее функционирование.

Для образования комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, указанный пептид, содержащийся в косметическом средстве по изобретению, может включать домен белковой трансдукции (PTD). Такие пептиды могут содержать аминокислотные последовательности GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV, RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV или GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV.

Указанную способность проникать через плазматическую мембрану клетки можно также обеспечить путем использования комплекса, включающего в себя липосому, в которую введены указанная теломерная последовательность ДНК и указанный пептид.

Указанная задача решается также тем, что предложен способ получения косметического средства, включающий синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.

Для образования комплекса можно использовать пептид, содержащий домен белковой трансдукции. В соответствии с другой формой осуществления изобретения при образовании комплекса теломерную последовательность ДНК и связанный с ней пептид вводят в липосому.

В соответствии с еще одной формой осуществления изобретения при получении косметического средства теломерную последовательность синтезируют на основе используемой в качестве матрицы тотальной геномной ДНК, которую получают из образца крови или ткани человека, к которому предполагается применить данное косметическое средство.

Предложенное косметическое средство содержит активный ингредиент и носитель. Активный ингредиент представляет собой комплекс, включающий теломерную последовательность ДНК и способный проникать через плазматическую мембрану клетки. Комплекс содержит также пептид, связанный с теломерной последовательностью b, имеющий сигнал ядерной локализации.

Теломерные участки, или теломеры, ДНК хромосом представляют собой специальные концевые районы линейной хромосомной ДНК, с которыми также связаны определенные белки. Считается, что теломеры, в частности, защищают хромосомы от деградации и слияния с другими хромосомами. Теломерная ДНК состоит из многократно повторяющихся коротких тандемных нуклеотидных последовательностей, где одна цепь ДНК обогащена гуанином (G), а комплементарная ей цепь обогащена цитидином (С). У человека, как и у большинства эукариот, G-богатая цепь теломерной ДНК построена из блоков TTAGGG, а С-богатая цепь содержит блоки СССТАА .

Предложенное косметическое средство предпочтительно включает в себя теломерные последовательности ДНК человека, содержащие от 100 до 300 п.н. Однако последовательности иной длины также могут быть использованы согласно настоящему изобретению.

Под сигналом ядерной локализации имеется ввиду аминокислотная последовательность, называемая также NLS (от англ. выражения «nuclear localization sequence»), узнаваемая определенными рецепторами ядерных мембран клеток, осуществляющими перенос содержащего ее пептида из цитоплазмы внутрь ядра. Последовательности NLS описаны, например, в Jans DA. et al. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? 2000. BioEssays 22:532-544. К NLS последовательностям относится, в частности, последовательность NLS Т-антигена (T-ag) вируса SV-40, состоящая из аминокислот PKKKRKV, которая узнается и связывается с рядом рецепторов ядерных мембран человеческих клеток, участвующих в транспорте пептидов внутрь ядра, и некоторые схожие с ним аминокислотные последовательности (Jans DA et al., Signals mediating nuclear targeting and their regulation: Application in drug delivery. Med Res Rev 1998; 18:189-223: Li S, Ku C-Y. Farmer AA, Cong Y-S, Chen C-F, Lee W-H. Identification of a novel cytoplasmic protein that specifically binds to nuclear localization signal motifs. J Biol Chem 1998: 273: 6183-6189).

Помимо последовательности NLS, пептиды, входящие в состав указанного комплекса, могут содержать и другие аминокислотные последовательности.

Получение комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки, может быть обеспечено путем включения в него любых придающих такое свойство компонентов. Так, например, могут быть использованы белковые последовательности, называемые доменами белковой трансдукции, известные также как PTD (от англ. выражения «protein transduction domain»), или «проникающие в клетку пептиды». Домен белковой трансдукции придает пептидам, имеющим такие домены, способность проникать через плазматическую мембрану клеток. Известен ряд аминокислотных последовательностей PTD (см., например, Kabouridis PS, Biological application of protein transduction technology, TRENDS in Biotechnology, vol.21. No.11. November 2003. 498-503). К таким последовательностям PTD, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, относится, в частности, пептид, соответствующий аминокислотам 48-60 белка ТАТ вируса иммунодефицита человека (HIV), имеющий последовательность аминокислот GRKKRRQRRRPPQ (Green, M and Lowenstein PM (1998) Autonomous functional domains of chemically synthetized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell 55, 1179-1188). Другой такой последовательностью PTD является пептид, соответствующий аминокислотам 43-58 белка семейства гомеобоксных белков Antennapedia (Antp), обнаруженного у Drosophila, и имеющего аминокислотную последовательность RQIKIWFQNRRMKWKK (Kabouridis, см. выше).

Такие аминокислотные последовательности PTD могут быть включены в состав пептида, связанного с теломерной последовательностью и несущего NLS. Так, пептидами, которые могут быть использованы в комплексе, содержащемся в косметическом средстве по изобретению, являются, например, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV, представляющий собой слитый белок, содержащий PTD, представляющий собой 13-аминокислотную последовательность ТАТ (48-60), и NLS, представляющий собой последовательность 7 аминокислот T-ag SV-40. Другим пептидом, который можно использовать для создания указанного комплекса, является RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV , представляющий собой слитый белок, содержащий 16-аминокислотный PTD Antp (43-58) и 7-аминокислотный NLS T-ag SV-40.

Еще одним таким пептидом является MPG, представляющий собой 27-аминокислотный пептид GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV, состоящий из гидрофобного PTD-домена, представляющего собой последовательность HIV-1 gp41 (аминокислоты 1-16), и гидрофильный домен (аминокислоты 20-27), представляющий собой T-ag SV-40 (см. также Morris МС, Chaloin L, Mery J Heitz, F and Divita G, A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier, 1999, Nucleic Acid Res., 27, 3510-3517).

Связь теломерных последовательностей с пептидом в содержащемся в косметическом средстве по изобретению комплексе может иметь разную природу. Пептиды, содержащие NLS и PTD, несут положительный заряд и могут прямо связываться с отрицательно заряженной ДНК. Химические связи между теломерными ДМК и пептидами могут быть образованы с участием химических группировок как уже присутствующих в этих молекулах, так и введенных в них путем известных модификаций, например с использованием системы биотин-стрептавидин.

Для обеспечения проникновения комплекса по изобретению в клетку можно использовать и другие вещества, помимо PTD. Так, в еще одном воплощении настоящего изобретения содержащийся в косметическом средстве по изобретению комплекс теломерной ДНК и пептида, имеющего NLS, дополнительно включает в себя липосому, в которую введены указанная теломерная ДНК и указанный пептид.

Липосомы представляют собой везикулы, имеющие мембраны, которые состоят из бислоев липидов, преимущественно фосфолипидов, и содержащие внутреннюю водную фазу. Липосомы широко применяются в медицине и косметологии для доставки заключенных в них веществ в клетки.

Косметическое средство по изобретению может содержать как однослойные, так и многослойные липосомы. Липосомы, полезные в таком косметическом средстве, могут содержать традиционные ингредиенты. Так, липиды представляют собой преимущественно фосфолипиды и их производные. К широко применяемым липидам относятся, в частности, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилглицерин, диолеилфосфатидилэтаноламин и другие. Водная фаза в липосомах, содержащихся в косметическом средстве по изобретению, помимо связанных с пептидами теломерных ДНК может также содержать вспомогательные ингредиенты, традиционные для липосом, например буферы, антиоксиданты (например, аскорбат натрия) и хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту).

Носители, которые могут быть использованы в составе предложенного косметического средства, представляют собой буферные растворы, основы для мазей и кремов и другие традиционные носители для косметических препаратов. В носителях могут содержаться буферные агенты, желирующие агенты, консерванты и другие используемые в данной области экципиенты.

Предложенный способ получения косметического средства включает синтез теломерной последовательности ДНК человека и соединение полученной теломерной последовательности ДНК с пептидом, имеющим сигнал ядерной локализации, с образованием комплекса, способного проникать через плазматическую мембрану клетки.

Теломерную последовательность ДНК человека можно получать и амплифицировать методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве затравки тотальной геномной ДНК, выделенной из тканей организма человека. Например, удобно получать ДНК из клеток крови человека. Тотальную геномную ДНК выделяют из полученной у человека ткани, в частности из лейкоцитов крови, известными способами, например методом фенол-хлороформной экстракции. Подбор условий для ПЦР является рутинной процедурой и проводится известными методами. Для наработки количества теломерной ДНК ПЦР-продукт можно подвергать повторной амплификации.

Из полученного в ПЦР пула теломерных последовательностей разной длины последовательности желаемой длины выделяют, например, с помощью гель-электрофореза с последующей экстракцией ДНК из геля, при этом подбор условий для проведения такого выделения также является рутинной процедурой для специалистов.

Клонирование в плазмидах также можно использовать для наработки дополнительного количества теломерных последовательностей ДНК и их хранения. К подходящим плазмидам относится, например, pCR 2.1. Клонирование удобно проводить с использованием наборов «TA-cloning kit» (Invitrogen).

Пептиды, содержащие NLS, а также пептиды, содержащие как NLS, так и PTD, например, такие, как описано выше, можно получить, например, химическим синтезом.

Образование комплекса теломерных последовательностей ДНК с пептидом, имеющим NLS, осуществляют, например, путем внесения обоих компонентов в носитель, представляющий собой буферный раствор, имеющий значение рН, близкое к 7,0. Предпочтительное молярное соотношение пептида и теломерных последовательностей составляет 100:1 и выше. Электрофорез в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и съемкой в УФ-свете позволяет детектировать задержку миграции фрагментов ДНК в геле, что свидетельствует об образовании комплекса.

Для получения косметического средства в соответствии с изобретением при образовании указанного комплекса теломерную последовательность ДНК и пептид можно вводить в липосому. Образование липосом, содержащих ДНК, связанную с пептидом, осуществляют по стандартным методикам. Липосомы, содержащие указанные активные вещества, получают, например, диспергированием липидов и комплексов ДНК/пептид в водной среде с последующим механическим перемешиванием, обработкой ультразвуком и/или экструзией через фильтры с определенным размером пор. Липосомы также можно получать солюбилизацией липидов и активных веществ в органических растворителях или детергентах, смешиванием с водной средой и последующим удалением растворителя, а также другими известными методами.

Пример

Тотальную ДНК выделяли из лейкоцитов крови человека (0,5 мл цельной крови), стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Выход ДНК после экстракции составлял 40-50 мкг.

Амплификацию ДНК-повторов теломер осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCL (рН 8.8), 16.6 мМ (NH₄) ₂SO₄, 0.1% Triton X-100, 2.0 мМ MgCL₂ , 0.5% диметилсульфоксид (DMSO), 4% формамид, 3 мкл 25 мМ dNTP, 3 ед Taq ДНК полимеразы, 2 мкг выделенной геномной ДНК, 30 пкмоль прямого (Forward) праймера (TTAGGG)₅, 20 пкмоль обратного (Reverse) праймера (ААТССС)₅. Оба праймера были получены согласно методике, предложенной в работе Lorite et al., J. of Heredity 2002:93(4). ПЦР проводили на термоциклере, используя hot-start. После первоначальной денатурации при 94°С в течение 3 мин с праймером Forward, вносили Taq полимеразу и инкубировали дополнительно 7 мин при этой же температуре. Далее проводили 10 циклов амплификации в следующем режиме: плавление 94°С в течение 1 мин, отжиг 70°С в течение 1 мин, синтез 72°С в течение 1 мин. После завершения 10 циклов устанавливали паузу 90°С - 10 мин, вносили праймер Reverse. Затем проводили 35 циклов амплификации в таком же температурно-временном режиме, как для предыдущих 10 циклов. После завершения 35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при 72°С в течение 7 мин.

Отбирали 1 мкл полученного ПЦР продукта, разводили водой в соотношении 1/100 и добавляли 1 мкл полученного раствора в реакционную смесь для новой ПЦР, которую осуществляли в условиях и режиме, описанных выше.

20 мкг ПЦР-продукта, полученного после реамплификации реакционной смеси, подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем ТАЕ (Трис-ацетатный буфер, 40 мМ Tris-base, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ EDTA) при градиенте 8V/см. После окончания электрофореза гель окрашивали этидийбромидом и фотографировали в УФ-свете. В качестве маркеров молекулярного веса использовали наборы фирмы Stratagen (США).

Полоски агарозного геля, соответствующие фрагментам теломерной ДНК 100-300 п.н., вырезали из геля и выделение из них ДНК проводили с использованием набора Qiagen (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Получали 20 мкл раствора, содержащего 100 нг теломерных последовательностей ДНК.

Далее образовывали комплекс теломерных ДНК с пептидом GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (описан выше), производства Института особо чистых препаратов (Санкт-Петербург), путем внесения в 25 мкл 0,05М фосфатного буфера (рН 7.0), используемого в качестве носителя, 20 нг полученных теломерных последовательностей ДНК и указанного пептида в молярном соотношении пептид:ДНК 100:1 и выше. Детектирование комплекса ДНК-пептид проводили при электрофорезе в 1% агарозном геле окрашиванием бромистым этидием и последующей съемкой в УФ-свете. Задержка (ретардация) миграции фрагмента ДНК в геле свидетельствовала об образовании комплекса.

Применение косметического средства можно осуществлять разными путями. Указанное косметическое средство может быть представлено, например, в форме кремов, мазей, гелей и т.п., предназначенных для нанесения на кожу, либо растворов, предназначенных как для нанесения на кожу (например, с помощью пластырей), так и для подкожного введения, полезного для воздействия на клетки дермы, например на фибробласты.

Известно, что нормальные соматические клетки человека способны делиться лишь ограниченное число раз (так называемый «лимит Хейфлика»). Доказано, что с каждым делением соматической клетки в результате так называемой проблемы «концевой недорепликации» длина теломерной ДНК сокращается (Greider С. М., 1996, Annual Rev. Biochem., 65, 337-365); при укорачивании теломер до определенной длины клетка перестает делится, переходя в состояние одряхления, или сенесенса, после чего она перестает нормально функционировать и гибнет.

При введении в кожу предложенного косметического средства теломерная ДНК и связанный с ней пептид проникают в клетки благодаря наличию в пептиде компонента, такого как PTD, придающего комплексу, содержащему ДНК и пептид, способность проникать через мембрану клетки, или благодаря липосоме, в которую введены ДНК и пептид и которая способна транспортировать ее содержимое через клеточную мембрану. Наличие в составе пептида сигнала ядерной локализации позволяет комплексу пептид-теломерная ДНК проникать через ядерную мембрану в ядро клетки. Проникнувшая в ядро клетки теломерная последовательность ДНК с помощью ферментных систем, присутствующих в клетке, присоединяется к концам хромосом, надстраивая их. В результате удлинения теломерных участков хромосом клетка «омолаживается», т.е. становится способной осуществлять большее число делений.

Таким образом, кожа, в которую введено косметическое средство, производит большее количество молодых клеток. В результате ускоряется процесс реэпителизации эпидермиса, что обеспечивает поверхность кожи более молодыми и плотно расположенными клетками. Кроме того, благодаря производству большого количества молодых клеток обеспечивается эффективное поддержание толщины эпидермиса. Наконец, проникновение комплекса теломерная ДНК-пептид, содержащегося в косметическом средстве, в фибробласты, находящиеся в дерме, обеспечивает производство в ней большего количества молодых фибробластов, которые, в отличие от старых, вырабатывают больше эластиновых волокон, что придает коже большую эластичность. Обеспечение поверхности кожи молодыми и плотно расположенными клетками, поддержание толщины эпидермиса и повышение эластичности кожи обеспечивают эффективное улучшение функций и внешнего вида кожи.

По сравнению с часто применяемым переносом молекул ДНК векторами на основе вирусов транспортировка теломерной последовательности ДНК в клетку, осуществляемая при использовании предложенного косметического средства, позволяет избежать нежелательных иммунологических реакций, токсического ответа и возможных мутаций.

Схема эксперимента.

1 часть

Две группы по семь крыс. Первая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия внутридермально в область шеи, вторая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия, содержащего комплексы транспортный пептид (последовательность аминокислот GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV) - фрагмент теломерной ДНК внутридермально. Производили по одной инъекции в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.5 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 3 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после инъекций с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.

2 часть

Две группы по семь крыс. Первой группе наносили на поверхность кожи в области шеи смесь липосом и ланолина, второй группе наносили на поверхность кожи в области шеи смесь липосом в соединении с комплексами транспортный пептид (последовательность аминокислот RQIKIWFQNRRMKWKKPKKKRKV) - фрагмент теломерной ДНК и ланолина. Производили по одной аппликации в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.5 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 1.5 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после нанесения смеси на поверхность кожи с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.

3 часть

Две группы по семь крыс. Первая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия внутридермально в область шеи, вторая группа получала инъекции физиологического р-ра хлорида натрия, содержащего комплексы транспортный пептид (последовательность аминокислот GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV) - фрагмент теломерной ДНК внутридермально. Производили по одной инъекции в день (1 мл препарата) в течение месяца. После чего производилось изъятие данных участков кожи с последующим гистологическим исследованием у пяти из семи особей в каждой группе. При этом во второй группе наблюдалось утолщение слоя дермы в 1.6 раза и увеличение количества эластиновых волокон примерно в 2.8 раза, что можно характеризовать как увеличение эластичности кожи. У оставшихся крыс (по две в каждой группе) производилось изъятие данных участков кожи через 6 месяцев после инъекций с последующим гистологическим исследованием на предмет онкотрансформации.

Явлений онкотрансформации клеток кожи и подкожной клетчатки в областях инъекций и аппликаций у крыс через 6 месяцев не обнаружено.

Сходство результатов эксперимента в группах 1 и 3 (идентичность во всем, кроме последовательностей аминокислот транспортного пептида) говорит о том, что основным фактором, влияющим на повышение эластичности кожи, являются фрагменты теломерной ДНК.

Промышленная применимость

Данное изобретение может быть использовано в различных средствах ухода за кожей, применяемых в косметологии для улучшения внешнего вида кожи человека.