комбинация apo2l/trail и ингибитора egfr для лечения рака, способ in vitro усиления апоптоза и применение комбинации для получения лекарственного средства для лечения рака

Формула изобретения

1. Комбинация, содержащая эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL и ингибитора EGFR для лечения рака за счет усиления апоптоза в одной или нескольких клетках млекопитающего, где указанный ингибитор EGFR представляет собой N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин, или его фармацевтически приемлемую соль или кислоту, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

2. Комбинация по п.1, где указанным Apo2L/TRAIL является фрагмент полипептида SEQ ID NO:1.

3. Комбинация по п.1, где указанный фрагмент Apo2L/TRAIL содержит внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:1.

4. Комбинация по п.1, где полипептид Apo2L/TRAIL представляет собой вариант полипептида Apo2L/TRAIL, который по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен аминокислотной последовательности внеклеточного домена SEQ ID NO:1.

5. Комбинация по п.4, где указанный вариант Apo2L/TRAIL по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности внеклеточного домена SEQ ID NO:1.

6. Комбинация по п.2, где указанный фрагмент содержит аминокислоты 114-281 последовательности SEQ ID NO:1.

7. Комбинация по п.6, где указанный фрагмент Apo2L/TRAIL, содержащий аминокислоты 114-281 последовательности SEQ ID NO:1, связан с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля (ПЭГ).

8. Комбинация по любому из пп.1-7, где указанный рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака ободочной кишки, колоректального рака и рака поджелудочной железы.

9. Комбинация по любому из пп.1-7, где указанным раком является рак ободочной кишки, колоректальный рак, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого.

10. Способ in vitro усиления апоптоза в одной или нескольких клетках млекопитающего, включающий обработку указанных клеток комбинацией по любому из пп.1-9.

11. Способ по п.10, где указанные клетки подвергают воздействию ингибитора EGFR перед воздействием на них полипептидом Apo2L/TRAIL.

12. Способ по п.10, где указанные клетки одновременно подвергают действию ингибитора EGFR и полипептида Apo2L/TRAIL.

13. Способ по любому из пп.10-12, дополнительно предусматривающий обработку раковых клеток одним или несколькими ингибирующими рост средствами.

14. Способ по любому из пп.10-12, дополнительно предусматривающий воздействие на указанные клетки облучением.

15. Применение комбинации по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства для лечения рака за счет усиления апоптоза в одной или нескольких клетках млекопитающего.

Описание изобретения к патенту

Родственные заявки

Эта заявка претендует на приоритет заявки США с регистрационным номером 11/061258, поданной 18 февраля 2005 года, содержание которой включено здесь в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам применения молекул агонистов рецептора гибели и ингибиторов EGFR. Более конкретно, это изобретение относится к способам применения молекул, таких как Аро-2 лиганд/TRAIL или антитела-агонисты DR4 или DR5 и ингибиторы EGFR, для лечения различных патологических нарушений, таких как рак.

Уровень техники

Считается, что контроль количества клеток у млекопитающего определяется отчасти равновесием между пролиферацией клеток и гибелью клеток. Одна форма гибели клеток, иногда называемая некротической гибелью клеток, обычно характеризуется как патологическая форма гибели клеток, происходящая в результате какой-либо травмы или какого-либо клеточного повреждения. В противоположность этому, имеется другая, «физиологическая» форма гибели клеток, которая обычно происходит регулярным или контролируемым образом. Эту регулярную или контролируемую форму гибели клеток часто называют «апоптозом» [см., например, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995)]. Апоптотическая гибель клеток природно встречается во многих физиологических процессах, включая эмбриональное развитие и клональную селекцию в иммунной системе [Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)].

Различные молекулы, такие как фактор-альфа некроза опухолей ( TNF-alpha ), фактор-бета некроза опухолей ( TNF-beta или лимфотоксин-альфа ), лимфотоксин-бета ( LT-beta ), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд ОХ-40, лиганд 4-1ВВ, лиганд Аро-1 (также называемый Fas-лигандом или CD95-лигандом), лиганд Аро-2 (также называемый Аро-2L или TRAIL), лиганд Аро-3 (также называемый TWEAK), APRIL, лиганд ORG (также называемый лигандом RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (также называемый BlyS, BAFF или THANK) были идентифицированы как члены семейства цитокинов фактора некроза опухолей ( TNF ) [См., например, Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 published January 16, 1997; WO 97/25428 published July 17, 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO98/28426 published July 2, 1998; WO98/46751 published October 22, 1998; WO/98/18921 published May 7, 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol. 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]. Сообщалось, что среди этих молекул TNF- , TNF- , лиганд CD30, лиганд 4-1ВВ, лиганд Аро-1, лиганд Аро-2 (Аро2L/TRAIL) и лиганд Аро-3 (TWEAK) участвуют в апоптотической гибели клеток.

Аро2L/TRAIL был идентифицирован несколько лет назад как член TNF-семейства цитокинов [см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); US Patent 6284236, issued September 4, 2001]. Полноразмерная нативная последовательность полипептида Аро2L/TRAIL человека является имеющим длину в 281 аминокислоту трансмембранным белком Типа II. Некоторые клетки могут продуцировать природную растворимую форму этого полипептида посредством ферментативного отщепления внеклеточного района этого полипептида [Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)]. Кристаллографические исследования растворимых форм Аро2L/TRAIL выявляют гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF и других родственных белков [Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)]. Однако было обнаружено, что Аро2L/TRAIL, в отличие от других членов TNF-семейства, имеет уникальный структурный признак, заключающийся в том, что три остатка цистеина (в положении 230 каждой субъединицы в гомотримере) вместе координируют атом цинка и что связывание цинка является важным для стабильности и биологической активности тримера. [Hymowitz et al., выше; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)].

В литературе сообщалось, что Аро2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, в том числе при аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит [см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffits et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Сообщалось также, что растворимые формы Аро2L/TRAIL индуцируют апоптоз в различных раковых клетках in vitro, в том числе в опухолях ободочной кишки, легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки, яичников и головного мозга, а также в меланоме, лейкозе и множественной миеломе [см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)]. Исследования in vivo в моделях опухоли мыши дополнительно предполагают, что Аро2L/TRAIL, один или в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией, может проявлять существенные противоопухолевые действия [см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnayan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)]. В противоположность многим типам раковых клеток, большинство нормальных типов клеток человека, по-видимому, является устойчивым к индукции апоптоза некоторыми рекомбинантными формами Аро2L/TRAIL [Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше]. Jo et al., сообщили, что меченная полигистидином растворимая форма Аро2L/TRAIL индуцировала апоптоз in vitro в нормальных выделенных гепатоцитах человека, но не индуцировала апоптоз в нормальных гепатоцитах не человека [Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)]. Считается, что некоторые рекомбинантные препараты Аро2L/TRAIL могут варьироваться в отношении биохимических свойств и биологических активностей на патологических клетках в сравнении с нормальными клетками, в зависимости, например, от присутствия или отсутствия молекулы-метки, содержания цинка и % содержания тримера [см. Lawrenxe et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)].

Лиганды TNF-семейства, идентифицированные к настоящему времени, за исключением лимфотоксина- , являются трансмембранными белками типа II, С-конец которых является внеклеточным. В противоположность этому, большинство рецепторов в семействе TNF-рецепторов (TNFR), идентифицированные к настоящему времени, являются трансмембранными белками типа I. Однако как в семействе TNF-лигандов, так и в семействе TNF-рецепторов гомология, идентифицированная между членами семейств, была обнаружена в основном во внеклеточном домене ( ECD ). Несколько цитокинов TNF-семейства, в том числе TNF- , лиганд Аро-1 и лиганд CD40, расщепляются протеолитически на поверхности клетки; полученный белок в каждом случае обычно образует гомотримерную молекулу, которая функционирует как растворимый цитокин. Белки семейства TNF-рецепторов также обычно расщепляются протеолитически с высвобождением растворимых ECD рецептора, которые могут функционировать в качестве ингибиторов родственных цитокинов.

Pan et al. описали член семейства TNF-рецепторов, названный DR4 [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]. Сообщалось, что этот DR4 содержит цитоплазматический домен гибели, способный участвовать в аппарате суицида клетки. Pan et al. сообщают, что они считают, что DR4 является рецептором для лиганда, известного как лиганд Аро-2 или TRAIL.

В Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) и Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) авторы описывают другую молекулу, которую они считают рецептором для Аро2L/TRAIL [см. также WO 98/51793, опубликованный 19 ноября 1998 года, WO 98/41629, опубликованный 24 сентября 1998 года]. Эта молекула названа DR5 (альтернативно, она была названа также Аро-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:53865387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованный 20 августа 1998 года; ЕР 870827, опубликованный 14 октября 1998 года; WO 98/46643, опубликованный 22 октября 1998 года; WO 99/02653, опубликованный 21 января 1999 года; WO 99/09165, опубликованный 25 февраля 1999 года; WO 99/11791, опубликованный 11 марта 1999 года]. Сообщалось, что подобно DR4, DR5 содержит цитоплазматический домен гибели и способен сигнализировать апоптоз. Кристаллическая структура комплекса, образуемого между Аро-2L/TRAIL и DR5, описана в Hymoweitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1000).

Следующую группу недавно идентифицированных членов TNFR-семейства называют «рецепторами-ловушками», которые, как считают, функционируют скорее как ингибиторы, а не как трансдукторы передачи сигналов. Эта группа включает в себя DCR1 (также называемый TRID, LIT или ТRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)] и DCR2 (также называемый TRUNDD или TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], оба являющиеся молекулами поверхности клетки, а также OPG [Simonet et al., выше] и DCR3 [Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)], оба из которых являются секретируемыми, растворимыми белками. Сообщалось, что Аро2L/TRAIL связывает рецепторы, названные DcR1, DcR2 и OPG.

Считается, что Аро2L/TRAIL действует через «рецепторы гибели» DR4 и DR5 поверхности клеток, активируя каспазы, или ферменты, которые проводят внутриклеточную программу гибели клетки [см., например, Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)]. После связывания лиганда как DR4, так и DR5 могут запускать апоптоз независимо рекрутингом и активацией инициатора апоптоза, каспазы-8, через содержащую домен гибели адапторную молекулу, называемую FADD/Mort1 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]. В противоположность DR4 и DR5, рецепторы DcR1 и DcR2 не передают сигнал апоптоза.

В литературе сообщалось о некоторых антителах, которые связываются с рецепторами DR4 и/или DR5. Например, анти-DR4-антитела, направленные на рецептор DR4 и имеющие агонистическую или апоптотическую активность в некоторых клетках млекопитающих, описаны, например, в WO 99/37684, опубликованном 29 июля 1999 года; WO 00/73349, опубликованном 12 июля 2000 года; WO 03/066661, опубликованном 14 августа 2003 года. См. также, например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033, опубликованный 2 декабря 2002 года; WO 03/042367, опубликованный 22 мая 2003 года; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003 года; WO 03/037913, опубликованный 8 мая 2003 года. Некоторые анти-DR5-антитела были также описаны, см., например, WO 98/51793, опубликованный 8 ноября 1998 года; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Supresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice , Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003 года; WO 03/037913, опубликованный 8 мая 2003 года. Кроме того, были описаны некоторые антитела, имеющие перекрестную реактивность как с рецептором DR4, так и с рецептором DR5 (см., например, Патент США 62252050, выданный 26 июня 2001 года).

В отношении обзора TNF-семейства цитокинов и их рецепторов см. Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Gruss and Dower, выше and Nagata, Cell, 88:355-365 (1997); Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Wallac h, TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families , Cytokine Research, Academic Press, pages 377-411 (2000).

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) является членом семейства тирозинкиназы типа 1 рецепторов фактора роста, которые играют решающую роль в клеточном росте, клеточной дифференцировке и клеточном выживании. Активация этих рецепторов обычно происходит посредством связывания специфического лиганда, что приводит к гетеро- или гомодимеризации между членами семейства рецепторов, с последующим автофосфорилированием домена тирозинкиназы. Эта активация запускает каскад внутриклеточных путей передачи сигналов, участвующих как в клеточной пролиферации (путь ras/raf/MAP-киназы), так и в выживании (путь PI3-киназы/Akt). Члены этого семейства, в том числе EGFR и HER2, как предполагалось, непосредственно причастны к клеточной трансформации.

Ряд злокачественных заболеваний человека ассоциированы с отклоняющейся от нормы экспрессией или сверхэкспрессией EGFR и/или сверхэкспрессией его специфических лигандов, например, трансформирующего рост фактора (Gullick, Br. Med. Bull 1991, 47:87-98; Modijtahedi and Dean, Int. J. Oncol. 1994, 4:277-96; Salomon et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 195; 19:183-232). Сверхэкспрессия EGFR была ассоциирована с неблагоприятным прогнозом в ряде раковых заболеваний человека, в том числе NSCLC. В некоторых случаях сверхэкспрессия EGFR опухоли коррелировала как с устойчивостью к химическому воздействию, так и с плохим прогнозом (Lei et al., Anticancer Res 1999; 19:221-8; Veale et al., Br J Cancer 1993; 68:162-5).

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы усиления апоптоза в клетках млекопитающих, предусматривающие контактирование указанных клеток с эффективным количеством агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR. Необязательно, агонистом рецептора гибели является полипептид Аро2L/TRAIL.

В других вариантах осуществления обеспечены способы лечения нарушений, таких как рак, у млекопитающего, предусматривающие введение указанному млекопитающему эффективного количества агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR.

В следующих вариантах осуществления обеспечены изделия и наборы, содержащие, например, полипептид Аро2L/TRAIL и ингибитор EGFR, применимые для лечения различных патологических нарушений.

В более конкретных вариантах осуществления, но без ограничения ими, обеспечены следующие примерные композиции и способы:

1. Способ усиления апоптоза в одной или нескольких клетках млекопитающего, предусматривающий подвергание указанных клеток действию эффективного количества агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR.

2. Способ по п.1, где указанные клетки последовательно подвергают действию агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR.

3. Способ по п.1, где указанные клетки подвергают действию ингибитора EGFR перед подверганием действию агониста рецептора гибели.

4. Способ по п.1, где указанный агонист рецептора гибели содержит полипептид Аро2L/TRAIL.

5. Способ по п.1, где указанные клетки одновременно подвергают действию ингибитора EGFR и агониста рецептора гибели.

6. Способ по п.1, где указанным агонистом рецептора гибели является антитело-агонист DR4 или антитело-агонист DR5.

7. Способ по п.1, где указанный ингибитор EGFR имеет общую формулу I

где:

Х означает галоген или гидрокси;

m равно 1, 2 или 3;

каждый R¹ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидрокси, гидроксиамино, карбокси, нитро, гуанидино, уреидо, циано, трифторметила и -(С₁-С ₄ алкилен)-W-(фенила), где W означает ординарную связь, O, S или NH; или каждый R¹ независимо выбран из R ⁹ и С₁-С₄ алкила, замещенного циано, где R⁹ выбран из группы, состоящей из R⁵ , -ОR⁶, -NR⁶R⁶, -С(О)R⁷ , -NHOR⁵, -ОС(О)R⁶, циано, А и -YR ⁵; R⁵ означает С₁-С₄ алкил; R⁶ означает независимо водород или R⁵; R⁷ означает R⁵, -ОR⁶ или -NR ⁶R⁶; А выбран из пиперидино, морфолино, пирролидино, 4-R⁶-пиперазин-1-ила, имидазол-1-ила, 4-пиридон-1-ила, -(С₁-С₄ алкилен)(СО2Н), фенокси, фенила, фенилсульфанила, С₂-С₄ алкенила и -(С ₁-С₄ алкилен)С(О)NR⁶R⁶ ; и Y означает S, SO или SO₂; где алкильные радикалы в R⁵, -ОR⁶ и -NR⁶R⁶ необязательно замещены одним-тремя галогеновыми заместителями и алкильные радикалы в R⁵, -ОR⁶ и -NR ⁶R⁶ необязательно замещены 1 или 2 группами R⁹, и где алкильные радикалы указанных необязательных заместителей необязательно замещены галогеном или R⁹ , при условии, что два гетероатома не присоединены к одному и тому же атому углерода;

или каждый R¹ независимо выбран из -NHSO₂R⁵, фталимидо-(С ₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ила, 2,5-диоксопирролидин-1-ила и R¹⁰-(С₂-С₄)алканоиламино, где R¹⁰ выбран из галогена, -ОR⁶, С ₂-С₄ алканоилокси, -С(О)R⁷ и -NR ⁶R⁶; и где указанные группы R¹-NHSO ₂R⁵, фталимидо-(С₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ил, 2,5-диоксопирролидин-1-ил и R¹⁰-(С₂-С ₄)алканоиламино необязательно замещены 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкила, циано, метансульфонила и С₁-С₄ алкокси;

или две группы R¹ взяты вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, с образованием 5-8-членного кольца, которое включает в себя 1 или 2 гетероатома, выбранных из О, S и N;

R² обозначает водород или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкокси, -NR⁶R⁶ и -SO₂R⁵;

n равно 1 или 2 и каждый R³ независимо выбран из водорода, галогена, гидрокси, С₁-С₆ алкила, -NR⁶ R⁶ и С₁-С₄ алкокси, где алкильные радикалы указанных групп R³ необязательно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁ -С₄ алкокси, -NR⁶R⁶ и -SO ₂R; и

R⁴ означает азидо или -(этинил)-R ¹¹, где R¹¹ означает водород или С₁ -С₆ алкил, необязательно замещенный гидрокси, -ОR ⁶ или -NR⁶R⁶.

8. Способ по п.7, где указанным ингибитором EGFR является N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин.

9. Способ по п.7, где указанным ингибитором EGFR является Tarceva .

10. Способ по п.1, где указанным Аро2L/TRAIL является фрагмент полипептида SEQ ID NO:1.

11. Способ по п.10, где указанный фрагмент Аро2L/TRAIL содержит внеклеточный домен полипептида SEQ ID NO:1.

12. Способ по п.1, где указанным агонистом рецептора гибели является вариант полипептида Аро2L/TRAIL, имеющий по меньшей мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности с внеклеточным доменом SEQ ID NO:1.

13. Способ по п.10, где указанный фрагмент содержит аминокислоты 114-281 SEQ ID NO:1.

14. Способ по п.12, где указанный вариант Аро2L/TRAIL имеет по меньшей мере приблизительно 95% идентичность аминокислотной последовательности с внеклеточным доменом SEQ ID NO:1.

15. Способ по п.13, где указанный фрагмент Аро2L/TRAIL, содержащий аминокислоты 114-281 SEQ ID NO:1, связан с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля (ПЭГ).

16. Способ лечения пролиферативного нарушения у млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему Аро2L/TRAIL и ингибитора EGFR.

17. Способ по п.16, где указанные Аро2L/TRAIL и ингибитор EGFR вводят одновременно.

18. Способ по п.16, где указанный Аро2L/TRAIL вводят перед указанным ингибитором EGFR.

19. Способ по п.16, где указанный ингибитор EGFR вводят перед указанным Аро2L/TRAIL.

20. Способ по п.1, где указанным пролиферативным нарушением является рак.

21. Способ по п.20, где указанный рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака ободочной кишки, колоректального рака и рака поджелудочной железы.

22. Способ по п.21, где указанным раком является рак ободочной кишки, колоректальный рак, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого.

23. Способ по п.16, где указанным ингибитором EGFR является соединение общей формулы I:

где:

Х означает галоген или гидрокси;

m равно 1, 2 или 3;

каждый R¹ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидрокси, гидроксиамино, карбокси, нитро, гуанидино, уреидо, циано, трифторметила и -(С₁-С ₄ алкилен)-W-(фенила), где W означает ординарную связь, O, S или NH;

или каждый R¹ независимо выбран из R⁹ и С₁-С₄ алкила, замещенного циано, где R⁹ выбран из группы, состоящей из R⁵, -ОR⁶, -NR⁶R⁶ , -С(О)R⁷, -NHOR⁵, -ОС(О)R⁶, циано, А и -YR⁵; R⁵ означает С₁ -С₄ алкил; R⁶ означает независимо водород или R⁵; R⁷ означает R⁵, -ОR ⁶ или -NR⁶R⁶; А выбран из пиперидино, морфолино, пирролидино, 4-R⁶-пиперазин-1-ила, имидазол-1-ила, 4-пиридон-1-ила, -(С₁-С₄ алкилен)(СО2Н), фенокси, фенила, фенилсульфанила, С₂-С₄ алкенила и -(С₁-С₄ алкилен)С(О)NR ⁶R⁶; и Y означает S, SO или SO₂; где алкильные радикалы в R⁵, -ОR⁶ и -NR ⁶R⁶ необязательно замещены одним-тремя галогеновыми заместителями и алкильные радикалы в R⁵, -ОR⁶ и -NR⁶R⁶ необязательно замещены 1 или 2 группами R⁹, и где алкильные радикалы указанных необязательных заместителей необязательно замещены галогеном или R⁹, при условии, что два гетероатома не присоединены к одному и тому же атому углерода;

или каждый R¹ независимо выбран из -NHSO₂R⁵ , фталимидо-(С₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ила, 2,5-диоксопирролидин-1-ила и R¹⁰-(С₂-С ₄)алканоиламино, где R¹⁰ выбран из галогена, -ОR⁶, С₂-С₄ алканоилокси, -С(О)R ⁷ и -NR⁶R⁶; и где указанные группы R¹-NHSO₂R⁵, фталимидо-(С ₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ил, 2,5-диоксопирролидин-1-ил и R¹⁰-(С₂-С₄)алканоиламино необязательно замещены 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкила, циано, метансульфонила и С₁-С₄ алкокси;

или две группы R¹ взяты вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, с образованием 5-8-членного кольца, которое включает в себя 1 или 2 гетероатома, выбранных из О, S и N;

R² означает водород или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкокси, -NR⁶R⁶ и -SO₂R⁵;

n равно 1 или 2 и каждый R³ независимо выбран из водорода, галогена, гидрокси, С₁-С₆ алкила, -NR⁶R⁶ и С₁-С₄ алкокси, где алкильные радикалы указанных групп R³ необязательно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкокси, -NR⁶ R⁶ и -SO₂R; и

R⁴ означает азидо или -(этинил)-R¹¹, где R¹¹ означает водород или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный гидрокси, -ОR⁶ или -NR⁶R ⁶.

24. Способ по п.16, где указанным ингибитором EGFR является N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин.

25. Способ по п.16, где указанным ингибитором EGFR является Tarceva .

26. Способ лечения раковых клеток, предусматривающий подвергание раковых клеток млекопитающего действию синергического эффективного количества агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR.

27. Способ по п.26, где указанным агонистом рецептора гибели является моноклональное антитело против рецептора DR5 или против рецептора DR4.

28. Способ по п.26, где указанным агонистом рецептора гибели является полипептид Аро2/TRAIL.

29. Способ по п.26, где указанные раковые клетки подвергают действию указанного синергического эффективного количества агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR in vivo.

30. Способ по п.27, где указанным антителом против рецептора гибели является химерное антитело или гуманизированное антитело.

31. Способ по п.27, где антителом против рецептора гибели является антитело человека.

32. Способ по п.26, где указанным агонистом рецептора гибели является антитело, которое перекрестно реагирует с более чем одним рецептором лиганда Аро-2.

33. Способ по п.26, где указанными раковыми клетками являются клетки рака ободочной кишки, клетки колоректального рака, клетки мелкоклеточного рака легкого или клетки немелкоклеточного рака легкого.

34. Способ по п.26, дополнительно предусматривающий подвергание раковых клеток действию одного или нескольких ингибирующих рост агентов.

35. Способ по п.26, дополнительно предусматривающий подвергание этих клеток действию облучения.

36. Способ по п.27, где указанное анти-DR5-антитело имеет аффинность связывания рецептора DR5 10⁸ М^-1 - 10 ¹² М^-1.

37. Способ по п.26, где указанный агонист рецептора гибели экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине, выбранной из группы, состоящей из клетки СНО, клетки дрожжей и E. coli.

38. Способ по п.26, где указанным ингибитором EGFR является Tarceva .

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает нуклеотидную последовательность кДНК лиганда Аро-2 человека (SEQ ID NO:2) и ее произведенную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:1). N в положении нуклеотида 447 используется для указания, что этим нуклеотидным основанием может быть T или G .

Фиг.2А и 2В показывают нуклеотидную последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) для полноразмерного DR4 человека и ее произведенную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DR5 человека сообщаются также в Pan et al., Science, 276:111 (1997).

Фиг.3А показывает аминокислотную последовательность из 411 аминокислоты DR5 человека (SEQ ID NO:5), опубликованную в WO 98/51793 19 ноября 1998 года. В данной области известен транскрипционный слайсинговый вариант DR5 человека. Этот сплайсинговый вариант DR5 кодирует аминокислотную последовательность из 440 аминокислот DR5 человека (SEQ ID NO:6), показанную на фиг.3В и 3С, опубликованную в WO 98/35986 20 августа 1998 года.

Фиг.4 показывает соответствующие уровни экспрессии рецепторов (DR4, DR5, EGFR) в клетках Н460 с предобработкой или без предобработки Tarceva или Taxol®.

Фиг.5А-5D иллюстрируют действия обработки лигандом Аро-2 и Tarceva на различных линиях раковых клеток in vitro.

Фиг.6 иллюстрирует действия обработки лигандом Аро-2 и Tarceva на раковых клетках Н460 in vivo.

Подробное описание предпочтительных вариантов

Если нет других определений, предполагается, что все термины данной области и другая научная терминология, используемая здесь, имеют значения, обычно подразумеваемое специалистами с квалификацией в области, к которой относится это изобретение. В некоторых случаях, термины с обычно подразумеваемыми значениями определены здесь для ясности и/или для быстрой ссылки и включение таких определений здесь не должно обязательно пониматься как представляющее существенное отличие от обычно понимаемого в данной области значения. Способы и процедуры, описанные или цитируемые здесь, являются обычно хорошо известными и обычно применяемыми с использованием общепринятой методологии квалифицированными в данной области специалистами, такие как, например, широко применяемые методологии молекулярного клонирования, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Соответственно, процедуры, включающие в себя применение коммерчески доступных наборов и реагентов, обычно проводят в соответствии с определенными изготовителями протоколами и/или параметрами, если нет других указаний.

Перед описанием данных способов, наборов и их использований должно быть понятно, что это изобретение не ограничивается этой конкретной методологией, этими описанными здесь протоколами, клеточными линиями, видами или родами животных, конструкциями и реагентами, так как они могут, конечно, варьироваться. Должно быть также понятно, что используемая здесь терминология предназначена для цели описания только конкретных вариантов и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который может быть ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Следует отметить, что в данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения единственные формы a , аn и the включают в себя и множественные формы, если контекст не диктует ясно другое понимание.

Все упоминаемые здесь публикации включены здесь в качестве ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми эти публикации цитируются. Цитируемые здесь публикации приводятся здесь в отношении их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ничто здесь не должно рассматриваться как признание того, что авторы этого изобретения не имеют права датировать задним числом эти публикации вследствие более ранней даты приоритета или первой по времени даты изобретения. Кроме того, действительные даты публикации могут отличаться от приведенных дат и требуют независимого подтверждения.

I. Определения

Термины лиганд Аро-2 , Apo-2L , Apo2L/TRAIL , лиганд Apo-2/TRAIL и TRAIL используются здесь взаимозаменяемо для означения полипептидной последовательности, которая включает в себя аминокислотные остатки 114-281, включительно, 95-281, включительно, остатки 92-2181, включительно, остатки 91-281, включительно, остатки 41-281, включительно, остатки 39-281, включительно, остатки 15-281, включительно, или остатки 1-281, включительно, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1 (SEQ ID NO:1), а также биологически активные фрагменты, делеционные, инсерционные или имеющие замены варианты вышеуказанных последовательностей. В одном варианте осуществления, эта полипептидная последовательность содержит остатки 114-281, фиг.1 Аро2L/. Необязательно, чтобы полипептидная последовательность содержала остатки 92-281 или остатки 91-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) Полипептиды Аро-2L могут кодироваться нативной нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг.1 (SEQ ID NO:2). Необязательно, кодон, который кодирует остаток Pro119 (фиг.1; SEQ ID NO:2), может быть кодоном CCT или CCG . Необязательно, эти фрагменты или варианты являются биологически активными и имеют по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности и, даже более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с любой из вышеуказанных последовательностей. Это определение включает в себя имеющие замены варианты лиганда Аро-2, в которых по меньшей мере одна из их нативных аминокислот заменена другой аминокислотой, например, остатком аланина. Необязательные варианты могут содержать аминокислотную последовательность, которая отличается от полипептидной последовательности лиганда Аро-2 с нативной последовательностью фиг.1 (SEQ ID NO:1) и имеет одну или несколько из следующих аминокислотных замен в положении (положениях) остатков на фиг.1 (SEQ ID NO:1): S96C; S101C; S111C; R170C; K179C. Это определение включает в себя также лиганд Аро-2 с нативной последовательностью, выделенный из источника лиганда Аро-2 или полученный рекомбинантными или синтетическими способами. Лиганд Аро-2 этого изобретения включает в себя полипептиды, называемые лигандом Аро-2 или TRAIL, описанные в WO 97/01633, опубликованном 16 января 1997 года, WO 97/25428, опубликованном 17 июля 1997 года, WO 99/36535, опубликованном 22 июля 1999 года, WO 01/00832, опубликованном 4 января 2001 года, WO 02/09755, опубликованном 7 февраля 2002 года, и WO 00/75191, опубликованном 14 декабря 2000 года. Эти термины используются для означения в общем форм лиганда Аро-2, которые включают в себя мономерные, димерные, тримерные, гексамерные или так называемые олигомерные формы этого полипептида. Все нумерации цитируемых аминокислотных остатков в последовательности Аро-2L используют нумерацию в соответствии с фиг.1 (SEQ ID NO:1), если нет конкретного другого указания. Например, D203 или Asp203 означают остаток аспарагиновой кислоты в последовательности, приведенной на фиг.1 (SEQ ID NO:1).

Термин селективный вариант лиганда Аро-2 относится в данном контексте к полипептиду лиганда Аро-2, который включает в себя одну или несколько мутаций аминокислот в последовательности нативного лиганда Аро-2 и имеет селективную аффинность связывания в отношении либо рецептора DR4, либо рецептора DR5. В одном варианте осуществления, этот вариант лиганда Аро-2 имеет селективную аффинность связывания в отношении рецептора DR4 и включает в себя одну или несколько замен аминокислот в любом из положений 189, 191, 193, 199, 201 или 209 последовательности нативного лиганда Аро-2. В другом варианте осуществления, этот вариант лиганда Аро-2 имеет селективную аффинность связывания в отношении рецептора DR5 и включает в себя одну или несколько замен аминокислот в любом из положений 189, 191, 193, 264, 266, 267 или 269 последовательности нативного лиганда Аро-2.

Предпочтительные селективные варианты лиганда Аро-2 включают в себя одну или несколько мутаций аминокислот и проявляют аффинность связывания в отношении рецептора DR4, которая равна или больше ( ) аффинности связывания лиганда Аро-2 с нативной последовательностью с рецептором DR4, и, даже более предпочтительно, эти варианты лиганда Аро-2 проявляют меньшую аффинность связывания (<) с рецептором DR5, чем аффинность связывания, проявляемая лигандом Аро-2 с нативной последовательностью в отношении DR5. Когда аффинность связывания такого варианта лиганда Аро-2 с рецептором DR4 является приблизительно равной (неизмененной) или большей (увеличенной), в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью, а аффинность связывания этого варианта Аро-2 с рецептором DR5 является меньшей, или почти элиминированной, в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью, аффинность связывания этого варианта лиганда Аро-2, для поставленных здесь целей, рассматривается как «селективная» в отношении рецептора DR4. Предпочтительные DR4-селективные варианты лиганда Аро-2 этого изобретения будет иметь по меньшей мере в 10 раз меньшую аффинность связывания в отношении рецептора DR5 (в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью) и, даже более предпочтительно, будет иметь по меньшей мере в 100 раз меньшую аффинность связывания в отношении рецептора DR5 (в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью). Соответствующая аффинность связывания варианта лиганда Аро-2 может быть определена и сравнена со свойствами связывания нативного Аро-2L (например, формы 114-281) при помощи анализов ELISA, RIA и/или BIAcore, известных в данной области. Предпочтительные DR4-селективные варианты лиганда Аро-2 этого изобретения будут индуцировать апоптоз по меньшей мере в одном типе клетки млекопитающего (предпочтительно раковой клетке), и такая апоптотическая активность может быть определена известными в данной области способами, такими как анализ с использованием красителей аламарового синего или кристаллического фиолетового. DR4-селективные варианты лиганда Аро-2 могут иметь или могут не иметь измененные аффинности связывания в отношении любого из рецепторов-ловушек для Аро-2L, причем эти рецепторы-ловушки называют в данной области DcR1, DcR2 и OPG.

Следующие предпочтительные селективные варианты лигандов Аро-2 включают в себя одну или несколько аминокислотных мутаций и проявляют аффинность связывания в отношении рецептора DR5, которая равна или больше ( ) аффинности связывания лиганда Аро-2 с нативной последовательностью с рецептором DR5, и, даже более предпочтительно, такие варианты лиганда Аро-2 проявляют меньшую аффинность связывания (<) с рецептором DR4, чем аффинность связывания, проявляемая лигандом Аро-2 с нативной последовательностью в отношении DR4. Когда аффинность связывания такого варианта лиганда Аро-2 с рецептором DR5 является приблизительно равной (неизмененной) или большей (увеличенной), в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью, а аффинность связывания этого варианта лиганда Аро-2 с рецептором DR4 является меньшей, или почти элиминированной, в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью, аффинность связывания этого варианта лиганда Аро-2, для поставленных здесь целей, рассматривается как «селективная» в отношении рецептора DR5. Предпочтительные DR5-селективные варианты лиганда Аро-2 этого изобретения будет иметь по меньшей мере в 10 раз меньшую аффинность связывания в отношении рецептора DR4 (в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью) и, даже более предпочтительно, будет иметь по меньшей мере в 100 раз меньшую аффинность связывания в отношении рецептора DR4 (в сравнении с лигандом Аро-2 с нативной последовательностью). Соответствующая аффинность связывания варианта лиганда Аро-2 может быть определена и сравнена со свойствами связывания нативного Аро-2L (например, формы 114-281) при помощи анализов ELISA, RIA и/или BIAcore, известных в данной области. Предпочтительные DR5-селективные варианты лиганда Аро-2 этого изобретения будут индуцировать апоптоз в по меньшей мере одном типе клетки млекопитающего (предпочтительно раковой клетке), и такая апоптотическая активность может быть определена известными в данной области способами, такими как анализ с использованием красителей аламарового синего или кристаллического фиолетового. DR5-селективные варианты лиганда Аро-2 могут иметь или могут не иметь измененные аффинности связывания в отношении любого из рецепторов-ловушек для Аро-2L, причем эти рецепторы-ловушки называют в данной области DcR1, DcR2 и OPG.

Для целей стенографического обозначения описанных здесь вариантов лигандов Аро-2, отмечается, что цифры относятся к положению аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности предположительного нативного лиганда Аро-2 (см. фиг.1).

Идентификация здесь аминокислот использует однобуквенный алфавит аминокислот, т.е.

Asp	D	Аспарагиновая кислота	Ile	I	Изолейцин
Thr	T	Треонин	Leu	L	Лейцин
Ser	S	Серин	Tyr	Y	Тирозин
Glu	E	Глутаминовая кислота	Phe	F	Фенилаланин
Pro	P	Пролин	His	H	Гистидин
Gly	G	Глицин	Lys	K	Лизин
Ala	A	Аланин	Arg	R	Аргинин
Cys	C	Цистеин	Trp	W	Триптофан
Val	V	Валин	Gln	Q	Глутамин
Met	M	Метионин	Asn	N	Аспарагин

Антитело рецептора гибели используют здесь для означения в общем антитела или антител, направленных на рецептор в суперсемействе рецепторов фактора некроза опухолей, содержащих домен гибели, способный передавать сигнал апоптоза, и такие антитела включают в себя анти-DR5-антитело и анти-DR4-антитело (DR5-антитело и DR4-антитело).

Антитело рецептора DR5 , DR5-антитело или анти-DR5-антитело используют в широком смысле для означения антител, которые связываются по меньшей мере с одной формой рецептора DR5 или его внеклеточным доменом. Необязательно DR5-антитело слито или связано с гетерологичной последовательностью или молекулой. Предпочтительно, эта гетерологичная последовательность позволяет или способствует антителу образовывать комплексы более высокого порядка или олигомерные комплексы. Необязательно, DR5-антитело связывается с рецептором DR5, но не связывается или не реагирует перекрестно с любым дополнительным рецептором Аро-2L (например, DR4, DcR1 или DcR2). Необязательно, это антитело является агонистом активности передачи сигнала DR5.

Необязательно, DR5-антитело этого изобретения связывается с рецептором DR5 в диапазоне концентраций приблизительно 0,1 нМ - приблизительно 20 мМ, как измерено в анализе связывания BIAcore. Необязательно, DR5-антитела этого изобретения обнаруживают величину IC₅₀ приблизительно 0,6 нМ - приблизительно 18 мМ, как измерено в анализе связывания BIAcore.

Антитело рецептора DR4 , DR4-антитело или анти-DR4-антитело используют в широком смысле для обозначения антител, которые связываются по меньшей мере с одной формой рецептора DR4 или его внеклеточным доменом. Необязательно DR4-антитело слито или связано с гетерологичной последовательностью или молекулой. Предпочтительно, эта гетерологичная последовательность позволяет или способствует антителу образовывать комплексы более высокого порядка или олигомерные комплексы. Необязательно, DR4-антитело связывается с рецептором DR4, но не связывается или не реагирует перекрестно с любым дополнительным рецептором Аро-2L (например, DR4, DcR1 или DcR2). Необязательно, это антитело является агонистом активности передачи сигнала DR5.

Необязательно, DR4-антитело этого изобретения связывается с рецептором DR4 в диапазоне концентраций приблизительно 0,1 нМ - приблизительно 20 мМ, как измерено в анализе связывания BIAcore. Необязательно, DR4-антитела этого изобретения обнаруживают величину IC₅₀ приблизительно 0,6 нМ - приблизительно 18 мМ, как измерено в анализе связывания BIAcore.

Термин «агонист» используют в самом широком смысле, и он включает в себя любую молекулу, которая частично или полностью усиливает, стимулирует или активирует одну или несколько биологических активностей Аро2L/TRAIL, DR4 или DR5 in vitro, in situ или in vivo. Примеры таких биологических активностей связывания Аро2L/TRAIL с DR4 или DR5 включают в себя апоптоз, а также активности, дополнительно сообщенные в литературе. Агонист может действовать прямым или непрямым образом. Например, агонист может действовать, частично или полностью усиливая, стимулируя или активируя одну или несколько биологических активностей DR4 или DR5 in vitro, in situ или in vivo в результате его прямого связывания с DR4 или DR5, что вызывает активацию рецептора или трансдукцию сигнала. Агонист может также действовать опосредованно, частично или полностью усиливая, стимулируя или активируя одну или несколько биологических активностей DR4 или DR5 in vitro, in situ или in vivo в результате, например, стимуляции другой эффекторной молекулы, которая затем вызывает активацию DR4 или DR5 или трансдукцию сигнала. Предполагается, что агонист может действовать в качестве энхансерной молекулы, которая действует опосредованно, усиливая или увеличивая активацию или активность DR4 или DR5. Например, этот агонист может усиливать активность эндогенного Аро-2L у млекопитающего. Это могло бы осуществляться, например, предварительным образованием комплексов DR4 или DR5 или стабилизацией комплексов соответствующего лиганда с рецептором DR4 или DR5 (например, стабилизацией нативного комплекса, образуемого между Аро-2L и DR4 или DR5).

Термин DR4 и рецептор DR4 означает в этом контексте полноразмерные и растворимые формы внеклеточного домена этого рецептора, описанные в Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); WO 98/32856, опубликованном 30 июля 1998 года; Патенте США 6342363, выданном 29 января 2002 года и WO 99/37684, опубликованном 29 июля 1999 года. Полноразмерная аминокислотная последовательность рецептора DR4 приведена здесь на фиг.2.

Термин DR5 и рецептор DR5 означает в этом контексте полноразмерные и растворимые формы внеклеточного домена этого рецептора, описанные в Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Патенте США 6072047, опубликованном 6 июня 2000 года; Патенте США 6342369; WO 98/51793, опубликованном 19 ноября 1998 года; WO 98/41629, опубликованном 24 сентября 1998 года; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986, опубликованном 20 августа 1998 года; ЕР 870827, опубликованном 14 октября 1998 года; WO 98/46643, опубликованном 22 октября 1998 года; WO 99/02653, опубликованном 21 января 1999 года; WO 99/09165, опубликованном 25 февраля 1999 года; WO 99/11791, опубликованном 11 марта 1999 года. Рецептор DR5 назывался в данной области также Аро-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER. Термин рецептор DR5, используемый здесь, включает в себя полноразмерный состоящий из 441 аминокислоты полипептид, приведенный на фиг.3А, и полноразмерный состоящий из 440 аминокислот полипептид, приведенный на фиг.3В-С.

Термин «полиол» означает в данном контексте в широком смысле соединения многоатомных спиртов. Полиолы могут быть, например, любым водорастворимым полимером поли(алкиленоксида) и могут быть линейной или разветвленной цепью. Предпочтительные полиолы включают в себя полиолы, замещенные в одном или нескольких гидроксильных положениях химической группой, такой как алкильная группа, имеющая один-четыре атома углерода. Обычно, этим полиолом является поли(алкиленгликоль), предпочтительно поли(этиленгликоль) (ПЭГ). Однако специалистам известно, что и другие полиолы, такие, например как, сополимеры поли(пропиленгликоля) и полиэтиленполипропилен гликоля, могут быть применены с использованием способов конъюгации, описанных здесь для ПЭГ. Полиолы этого изобретения включают в себя полиолы, хорошо известные в данной области, и полиолы, доступные публично, например, из коммерчески доступных источников.

Термин «конъюгированные» используется здесь в его самом широком смысле и означает «соединенные или связанные вместе». Молекулы являются конъюгированными, когда они действуют или функционируют, если они соединены друг с другом.

Термин «внеклеточный домен» или ECD относится к форме лиганда или рецептора, которая по существу не содержит трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно, растворимый ECD будет иметь менее, чем 1% таких трансмембранного и цитоплазматического доменов, и, предпочтительно, будет иметь менее чем 0,5% таких доменов.

Термин «ион двухвалентного металла» относится к иону металла, имеющему два положительных заряда. Примеры ионов двухвалентных металлов для использования в этом изобретении включают в себя, но не ограничиваются ими, цинк, кобальт, никель, кадмий, магний и марганец. Конкретные формы таких металлов, которые могут быть использованы, включают в себя формы солей (например, формы фармацевтически приемлемых солей), таких как хлоридная, ацетатная, карбонатная, цитратная и сульфатная формы вышеуказанных ионов двухвалентных металлов. Предпочтительным ионом двухвалентного металла для использования в этом изобретении является цинк и, более предпочтительно, форма соли, сульфат цинка. Ионы двухвалентных металлов, описанные здесь, предпочтительно используют в концентрациях или количествах (например, эффективных количествах), которые являются достаточными, например, для (1) увеличения стабильности при хранении тримеров Аро-2L на протяжении желаемого периода времени, (2) увеличения продукции или выхода тримеров Аро-2L в культуре рекомбинантных клеток или способе очистки, (3) увеличения растворимости (или уменьшения агрегации) тримеров Аро-2L или (4) увеличения образования тримеров Аро-2L.

«Выделенные», при использовании для описания различных раскрываемых здесь белков, означает белок, который был идентифицирован и выделен и/или извлечен из компонентов его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются материалы, которые обычно препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям этого белка и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления, этот белок должен быть очищен (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-конца или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ при невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или, предпочтительно, содержащего серебро красителя. Выделенный белок включает в себя белок in situ в рекомбинантных клетках, так как в нем не будет присутствовать по меньшей мере один компонент природного окружения лиганда Аро-2L. Но обычно выделенный белок должен быть получен с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

«Выделенной» молекулой нуклеиновой кислоты является молекула нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике этой нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты лиганда Аро-2 является другой, чем молекула в форме или в окружении, в которых она обнаруживается в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты лиганда Аро-2 отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты лиганда Аро-2, которая существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты лиганда Аро-2 включает в себя молекулы нуклеиновых кислот лиганда Аро-2, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют лиганд Аро-2, где, например, эта молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомном окружении, отличающемся от окружения природных клеток.

«Процентная (%) идентичность аминокислотной последовательности» в отношении идентифицированных здесь последовательностей определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в последовательности лиганда Аро-2, после сопоставления этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Сопоставление для целей определения процентной идентичности последовательностей может достигаться различными путями, которые находятся в рамках квалификации в данной области, и может определять подходящие параметры для измерения сопоставления, в том числе применением алгоритмов, необходимых для достижения максимального сопоставления на протяжении полноразмерных сравниваемых последовательностей. Для целей этого изобретения, величины процентной идентичности аминокислот могут быть получены с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей, ALIGN-2, которая была создана Genentech, Inc. и код источника которой был подан с документацией пользователя в Бюро регистрации авторских прав США (US Copyright Office, Washington, DC, 20559), зарегистрирован под номером US Copyright Registration TXU510087. Эта программа ALIGN-2 доступна публично через Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Все параметры сравнения последовательностей установлены этой программой ALIGN-2 и не варьируются.

Термин «регуляторные последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, которые подходят, например, для прокариот, включают в себя промоторную, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она помещена в функциональную близость с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для пре-последовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пре-белка, который участвует в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчать трансляцию. Обычно, «функционально связаны» означает, что эти связываемые ДНК-последовательности являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, смежными и находящимися в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть обязательно смежными. Связывание выполняют лигированием в подходящих сайтах рестрикции. Если подобные сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Термины «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и ADCC относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги) узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис этой клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc RIII, тогда как моноциты экспрессируют Fc RI, Fc RII и Fc RIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на стр. 464 Ravetсh and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы может быть выполнен анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в Патенте США № 5500362 или № 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK-клетки). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, в модели животного, такой как модель, описанная в Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Эффекторные клетки человека» являются лейкоцитами, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, эти клетки экспрессируют по меньшей мере Fc RIII и выполнят эффекторную функцию ADСС. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADСС, включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK-клетки), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем предпочтительными являются PBMC и NK-клетки.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов Fc RI, Fc RII и Fc RIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы Fc RII включают в себя Fc RIIA («активирующий рецептор») и Fc RIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые различаются, прежде всего, в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор Fc RIIA содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор Fc RIIВ содержит иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в его цитоплазматическом домене (см. Daeron, Annu. Rev. Immunol 15:203-234 (1997). Обзорный материал по FcRs приведен в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, в том числе FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в приведенный здесь термин FcR . Этот термин включает в себя также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994). Описанные здесь FcR включают в себя полиморфизмы, такие как генетический диморфизм в гене, который кодирует Fc RIIIa, приводящий либо к фенилаланину (F), либо к валину (V) в положении аминокислоты 158, расположенный в районе рецептора, который связывается с IgG1. Было показано, что гомозиготный валин-Fc RIIIa (Fc RIIIa-158V) имеет более высокую аффинность в отношении IgG1 человека и опосредует увеличенную ADСС in vitro относительно гомозиготного фенилаланин-Fc RIIIa (Fc RIIIa-158V) или гетерозиготного (Fc RIIIa-F/V) рецепторов.

«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Этот путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (С1q) с молекулой (например, антителом), находящейся в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Термин «антитело» используется в этом контексте в самом широком смысле и конкретно включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающий или вариабельный район. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

«Нативные антитела» являются обычно гетеротетрамерными гликопротеинами приблизительно 150000 дальтон, составленными из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также разделенные регулярными интервалами межцепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на ее другом конце; константный домен легкой цепи выравнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выравнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что некоторые части вариабельных доменов в сильной степени различаются по последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако эта вариабельность не распределена равномерно по всем вариабельным доменам антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, названных гипервариабельными районами в вариабельных районах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называют каркасными районами (FR). Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей, каждый, содержат четыре FR, в значительной степени принимающих -складчатую конфигурацию, соединенные тремя гипервариабельными районами, которые образуют петли, соединяя и, в некоторых случаях, образуя часть этой -складчатой структуры. Эти гипервариабельные районы в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости этими FR и с гипервариабельными районами из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADСС).

Расщепление папаином антител дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых Fab -фрагментами, каждый из которых содержит единственный антигенсвязывающий сайт, и оставшийся Fc -фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')₂ -фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен к сшиванию антигена.

Fv является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный сайт узнавания антигена и сайт связывания антигена. Этот район состоит из димера вариабельного района одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в тесной, нековалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных района каждого вариабельного района взаимодействуют для создания антигенсвязывающего сайта на поверхности димера V_H-V_L. Сообща эти шесть гипервариабельных районов придают антигенсвязывающую специфичность этому антителу. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных района, специфических в отношении антигена) способен узнавать и связывать антиген, хотя и при более низкой аффинности, чем весь этот сайт связывания.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце СН1-домена тяжелой цепи, включающих в себя один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является здесь обозначением для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')₂-фрагменты антител получают сначала в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют цистеины шарнирной области между ними. Известны также другие химические сопряжения фрагментов антител.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух явно отличающихся типов, называемых каппа ( ) и лямбда ( ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к различным классам. Имеются пять основных классов интактных антител: IgА, IgD, IgE, IgG и IgМ, и несколько из них могут быть подразделены дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgА и IgА2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам антител, называют , , , и µ, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Одноцепочечные Fv -фрагменты или scFv -фрагменты антител содержат V_H- и V_L -домены антител, где эти домены присутствуют в виде одноцепочечной полипептидной цепи. Предпочтительно, Fv-полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H- и V_L -доменами, который позволяет этому scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В отношении обзора scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (V_L), в той же самой полипептидной цепи (V _H-V_L). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя этими доменами на одной и той же цепи, эти домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело» относится в этом контексте к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природно-встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, будучи направленными против единственного сайта антигена. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на данном антигене. Кроме их специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество, заключающееся в том, что они синтезируются гибридомной культурой, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Определение «моноклональные» указывает характер этого антитела, как полученного по существу из гомогенной популяции антител, и это определение не должно рассматриваться как требующее получения этого антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с этим изобретением, могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., например, Патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Описанные здесь моноклональные антитела включают в себя, конкретно, «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальные из этих цепей являются идентичными или гомологичными соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность (Патент США № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие здесь интерес, включают в себя «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные из примата не человека (например, низших узконосых обезьян, таких как павиан, макак-резус или собакоголовая обезьяна), и последовательности константного района человека (Патент США № 5693780).

«Гуманизированные» формы антител не человека (например, мышиных антител) являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина не человека. В наибольшей части, гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентными антителами), в которых остатки из гипервариабельного района этого реципиента заменены остатками из гипервариабельного района вида не человека (донорного антитела), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющими желаемую специфичность, аффинность и эффективность. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками не человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации получают для дополнительного улучшения эффективности антител. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного, обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина не человека, а все или по существу все из FR являются FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, необязательно, будет также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно часть константной области иммуноглобулина человека. В отношении дополнительных деталей, см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин «гипервариабельный район» относится в этом контексте к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный район содержит аминокислотные остатки из «определяющего комплементарность района» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) вариабельного домена тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или аминокислотные остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). «Каркасные» или FR -остатки являются остатками вариабельного домена другими, чем остатки гипервариабельного района, как определено здесь.

Антитело, «которое связывает» представляющий интерес антиген, например, рецептор гибели, такой как DR4 или DR5, является антителом, способным связывать этот антиген с достаточной аффинностью и/или авидностью, так что это антитело применимо в качестве терапевтического агента для нацеливания на клетку, экспрессирующую этот антиген.

Для целей этого изобретения, «иммунотерапия» будет означать способ лечения млекопитающего (предпочтительно пациента-человека) антителом, где это антитело может быть неконъюгированным или «голым» антителом или это антитело может быть конъюгировано или слито с гетерологичной молекулой (гетерологичными молекулами) или гетерологичным агентом (агентами), например, одним или несколькими цитотоксическими агентами, с образованием посредством этого «иммуноконъюгата».

«Выделенное» антитело является антителом, которое было идентифицировано и выделено и/или извлечено из компонентов его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются материалы, которые обычно препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям этого антитела и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления, это антитело должно быть очищено (1) до более чем 95 мас.% антитела, как определено с использованием способа Лоури, и наиболее предпочтительно, до более, чем 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-конца или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя Кумасси синего или, предпочтительно, содержащего серебро носителя. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, так как не будет присутствовать по меньшей мере один компонент природного окружения этого антитела. Но обычно выделенное антитело должно быть получено с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

Выражение «эффективное количество» относится к количеству комбинации агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR, которое является эффективным для предупреждения, уменьшения интенсивности симптомов или лечения рассматриваемого заболевания или состояния, независимо от того, вводят ли их одновременно или последовательно. В конкретных вариантах осуществления, эффективным количеством является количество комбинации агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR, достаточное для усиления или иным образом увеличения склонности (например, синергически) клетки к подверганию апоптозу, уменьшения объема опухоли или пролонгирования выживания млекопитающего, имеющего рак.

Термин «иммуносупрессивный агент» в контексте вспомогательной терапии означает вещества, которые действуют, подавляя или маскируя иммунную систему млекопитающего, подвергаемого лечению здесь. Этот термин мог бы включать вещества, которые подавляют продуцирование цитокинов, отрицательно регулируют или подавляют экспрессию аутоантигенов или маскируют антигены МНС. Примеры таких агентов включают в себя 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. Патент США № 4665077; нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID); азатиоприн; циклофосфамид; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаровый альдегид (который маскирует антигены МНС, как описано в Патенте США № 4120649); антиидиотипические антитела для антигенов МНС и фрагментов МНС; циклоспорин А; стероиды, такие как глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон, дексаметазон и гидрокортизон; метотрексат (пероральный или подкожный); гидроксихлорохин; сульфасалазин; лефлуномид; цитокин или антагонисты рецептора цитокинов, в том числе анти-интерферон- -, - или - -антитела, анти-фактор- некроза опухолей-антитела (инфликсимаб или адалимумаб), анти-TNF -иммуноадгезин (этанерцепт), анти-фактор- некроза опухолей-антитела, анти-интерлейкин-2-антитела и анти-IL-2-рецептор-антитела; анти-LFA-1-антитела, в том числе анти-CD11а- и анти-CD18-антитела; анти-L3T4-антитела; гетерологичный анти-лимфоцитарный глобулин; pan-T-антитела, предпочтительно анти-CD3- или анти-CD4/CD4а-антитела; растворимый пептид, содержащий LFA-3-связывющий домен (WO 90/08187, опубликованный 7/26/90); стрептокиназу; TGF- ; стрептодорназу; РНК или ДНК из хозяина; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин; рапамицин; Т-клеточный рецептор (Cohen et al., U.S. Pat. № 5114721); фрагменты Т-клеточного рецептора (Offner et al., Science, 251:430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341:482 (1989) и WO 91/01133; и антитела к Т-клеточному рецептору (ЕР 340109), такие как Т10В9.

Термин «цитотоксический агент» относится в данном контексте к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин предназначен для включения в него радиоактивных изотопов (например, At²¹¹, I¹³¹, ¹²⁵ I, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm ¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивных изотопов Lu), химиотерапевтических агентов и токсинов, таких как токсины с малыми молекулами или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты.

«Синергическая активность» или «синергия», или «синергическое действие», или «синергически эффективное количество» для целей данного изобретения означает, что действие, наблюдаемое при использовании комбинации Аро2L/TRAIL или антитела к рецептору гибели и ингибитора EGFR, является (1) большим, чем действие, достигаемое при использовании Аро2L/TRAIL, антитела к рецептору гибели или ингибитора EGFR по отдельности (или индивидуально), и (2) большим, чем сумма действий (аддитивное действие) Аро2L/TRAIL или антитела к рецептору гибели и ингибитора EGFR. Такая синергия или такое синергическое действие может быть определено различными способами, известными специалистам в данной области. Например, синергическое действие Аро2L/TRAIL или антитела к рецептору гибели и ингибитора EGFR может наблюдаться в форматах анализов in vitro или in vivo с определением количества опухолевых клеток или массы опухоли.

Термины «апоптоз» и «апоптотическая активность» используются в данном контексте в широком смысле и относятся к регулярной или контролируемой форме гибели клеток у млекопитающих, которая обычно сопровождается одним или несколькими характерными клеточными изменениями, включающими в себя конденсацию цитоплазмы, потерю микроворсинок плазматической мембраны, сегментацию ядра, деградацию хромосомной ДНК или потерю митохондриальной функции. Эта активность может быть определена и измерена хорошо известными в данной области способами, например, анализами жизнеспособности клеток, FACS-анализом или электрофорезом ДНК, связывания аннексина V, фрагментации ДНК, сжатия (сморщивания) клеток, расширения эндоплазматического ретикулума, фрагментации клеток и/или образования мембранных пузырьков (везикул) (называемых апоптозными (апоптотическими) тельцами).

Термины «рак», «раковые» и «злокачественные» относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают в себя, но не ограничиваются ими, карциному, в том числе аденокарциному, лимфому, бластому, меланому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают в себя плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), желудочно-кишечный рак, лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, такой как печеночно-клеточный рак и гепатома, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак эндометрия, миелому (такую как множественная миелома), рак слюнных желез, рак почки, такой как почечно-клеточный рак и опухоли Вильмса, базально-клеточный рак, меланому, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, тестикулярный рак, рак пищевода и различные типы рака головы и шеи.

Термин «заболевание, связанное с иммунной системой» относится к заболеванию, в котором компонент иммунной системы млекопитающего вызывает, опосредует заболеваемость или иным образом способствует заболеваемости у млекопитающего. В этот термин включены также заболевания, в которых стимуляция или вмешательство иммунной реакции оказывает ослабляющее действие на прогрессирование этого заболевания. В этот термин включены аутоиммунные заболевания, иммуноопосредованные воспалительные заболевания, неиммуноопосредованные воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и связанные с иммунодефицитом заболевания. Примеры связанных с иммунной системой и воспалительных заболеваний, некоторые из которых являются иммуномедиированными или Т-клеточно-опосредованными, которые могут лечиться в соответствии с этим изобретением, включают в себя системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатии, системный склероз (склеродермию), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию (иммунную панцитопению, пароксизмальную ночную гемоглобинурию), аутоиммунную тромбоцитопению (идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммуномедиируемую тромбоцитопению), тиреоидит (болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммуномедиируемое заболевании почки (гломерулонефрит, канальцево-интерстициальный нефрит), демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия или синдром Гийена-Барре и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, гепато-билиарные заболевания, такие как инфекционный гепатит (гепатит А, В, С, D, Е и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, гранулематозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительные и фибротические заболевания легких, воспалительное заболевание кишечника (язвенный колит, болезнь Крона), глютеновую энтеропатию и болезнь Уиппла, аутоиммунные или иммуномедиированные кожные болезни, в том числе буллезные кожные заболевания, многоформную эритему и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания, такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая аллергия и крапивница, иммунологические заболевания легких, такие как эозинофильные пневмонии, идиопатический легочный фиброз и аллергический пневмонит, связанные с трансплантацией заболевания, в том числе отторжение трансплантата и заболевание трансплантат против хозяина. Инфекционные заболевания включают в себя СПИД (ВИЧ-инфекцию), гепатит А, В, С, D и Е, бактериальные инфекции, грибковые инфекции, протозойные инфекции и паразитарные инфекции.

«В-клеточная злокачественность» является злокачественностью, включающей в себя В-клетки. Примеры включают в себя болезнь Ходжкина, в том числе лимфоцитарную доминирующую болезнь Ходжкина (LPHD); не-ходжкинскую лимфому (NHL); лимфому клеток фолликулярного центра (FCC); острый лимфоцитарный лейкоз (ALL); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); ретикулоэндотелиоз; плазмацитоидную лимфоцитарную лимфому; лимфому клеток коры головного мозга; СПИД- или ВИЧ-связанную лимфому; множественную миелому; лимфому центральной нервной системы (ЦНС); посттрансплантационный пролиферативный синдром (PTLD); макроглобулинемию Вальденстрема (лимфоплазмацитарную лимфому); лимфому лимфоидной ткани слизистой оболочки (MALT) и лимфому/лейкоз маргинальной зоны.

Неходжкинская лимфома (NHL) включает в себя, но не ограничивается ими, фолликулярную NHL низкой степени злокачественности, рецидивирующую или стойкую NHL, NHL лобной линии низкой степени злокачественности, NHL Стадии III/IV, не поддающуюся химиотерапии NHL, NHL малых лимфоцитов (SL), фолликулярную NHL промежуточной стадии, диффузную NHL промежуточной стадии, диффузную крупноклеточную лимфому, агрессивную NHL (в том числе агрессивную NHL лобной линии и агрессивную рецидивирующую NHL), NHL, рецидивирующую после трансплантации аутологичных стволовых клеток или устойчивую к трансплантации аутологичных стволовых клеток, иммунобластную NHL высокой степени злокачественности, лимфобластную NHL высокой степени злокачественности, NHL малых не расщепленных клеток высокой степени злокачественности, NHL основного заболевания, и т.д.

«Аутоиммунное заболевание» означает здесь заболевание или нарушение, возникающее из собственных тканей индивидуума и направленное на собственные ткани индивидуума, или его ко-сегрегат или манифестацию, или полученное из них состояние. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают в себя, но не ограничиваются ими, артрит (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит), псориаз, дерматит, в том числе атопический дерматит; хроническую идиопатическую крапивницу, в том числе хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродермию и склероз, реакции, ассоциированные с воспалительным заболеванием кишечника (IBD) (болезнь Крона, язвенный колит) и IBD с ко-сегрегатом гангренозной пиодермии, нодозную эритему, первичный склерозирующий холангит и/или эписклерит), респираторный дистресс-синдром, в том числе респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, IgЕ-опосредованные заболевания, такие как анафилаксия и аллергический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена, увеит, колит, такой как микроскопический колит и коллагеновый колит, гломерулонефрит (GN), такой как мембранозный GN, идиопатический мембранозный GN, мембранозно-пролиферативный GN (MPGN), в том числе Типа I и Типа II, и быстро прогрессирующий GN, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включающие в себя инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, недостаточность адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), такую как кожная SLE, обыкновенная волчанка (включающая в себя нефрит, энцефалит, педиатрическую, непочечную, дискоидную алопецию), ювенильный диабет, рассеянный склероз (MS), такой как связанный со спинно-мозговыми зрительными нервами MS, аллергический энцефаломиелит, иммунные реакции, ассоциированные с острой аллергической реакцией и аллергической реакцией замедленного типа, опосредованные цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, в том числе гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (в том числе васкулит больших сосудов (в том числе ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит (Такаясу)), васкулит средних сосудов (в том числе болезнь Кавасаки и нодозный полиартериит), васкулит ЦНС и ANCA-ассоциированный васкулит, такой как васкулит или синдром Чарга-Страусса (CSS)), апластическую анемию, Кумбс-положительную анемию, Diamond Blackfan анемию, иммунную гемолитическую анемию, в том числе аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, эссенциальную апластическую анемию (PRCA), недостаточность фактора VIII, гемофилию А, аутоимунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, включающие в себя лейкоцитарный диапедез, воспалительные нарушения ЦНС, синдром повреждения множественных органов, тяжелую псевдопаралитическую миастению, опосредованные комплексом антиген-антитело заболевания, заболевание, обусловленное антителами против клубочковой базальной мембраны, синдром антифосфолипид-антитела, аллергический неврит, болезнь Бехчета, синдром Кастлемана, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Лэмберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата цельного органа (включающее в себя предобработку для высоких титров реактивных антител панели, отложение IgА в тканях и отторжение, возникающее в результате трансплантации почки, трансплантации печени, трансплантации кишечника, трансплантации сердца и т.д.), болезнь трансплантат против хозяина (GVHD), буллезный пемфигоид, пузырчатку (в том числе обыкновенную, листовидную пузырчатку и пемфигоид слизистой оболочки), аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь Рейтера, синдром ригидного человека, нефрит иммунного комплекса, IgМ-полиневропатии или IgМ-опосредованную невропатию, идиопатическую тромобоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), тромбоцитопению (например, развиваемую пациентами с инфарктом миокарда), в том числе аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичка и яичника, в том числе аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз; аутоиммунные эндокринные заболевания, в том числе аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоз, болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), диабет Типа I, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом (IDDM), в том числе педиатрический IDDM, и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (ВИЧ), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантат) vs NSIP, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgА-нефропатию), первичный билиарный цирроз, чревную спру (глютеновую энтеропатию), не поддающуюся лечению спру с ко-сегрегатом (компонентом) герпетиформного дерматита, криоглобулинемию, амиотрофический боковой склероз (ALS; болезнь Лу Герига), заболевание коронарной артерии, аутоиммунную болезнь внутреннего уха (AIED), аутоиммунную потерю слуха, синдром опсоклонуса-миоклонуса (OMS), полихондрит, такой как стойкий полихондрит, легочный альвеолярный спротеиноз, амилоидоз, гигантоклеточный гепатит, склерит, моноклональную гаммопатию неопределенного/неизвестного значения (MGUS), периферическую невропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные нарушения, глухота, слепота, периодический паралич и каналопатии ЦНС; аутизм, воспалительную миопатию и очаговый сегментарный гломерулосклероз (FSGS).

Термин «пролекарство» относится в данной заявке к форме предшественника или производного фармацевтически активного вещества, которая является менее цитотоксичной в отношении раковых клеток в сравнении с исходным лекарственным средством и способна ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy Biochemical Society Transactions, 14, p.375-382, 615 ^th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borcherdt et al., (ed.), p. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства называют также предшественниками или производными исходного фармацевтически активного вещества, которые имеют более высокую биодоступность, чем исходное вещество, и превращаются в исходное соединение in vivo. Например, пролекарство может иметь более высокую адсорбцию в кровоток после приема через рот в сравнении с исходным веществом. Пролекарства этого изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, модифицированные D-аминокислотой пролекарства, гликозилированные пролекарства, бета-лактамсодержащие пролекарства, необязательно замещенные феноксиамидсодержащие пролекарства или необязательно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, содержащие 5-фторцитозин и другие содержащие 5-фторуридин пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксичное свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксичных лекарственных средств для использования в этом изобретении включают в себя, но не ограничиваются ими, описанные ниже химиотерапевтические агенты.

Термин «цитотоксический агент» относится в этом контексте к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин включает в себя радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, ¹²⁵I, Y⁹⁰ , Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi ²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как токсины с малыми молекулами или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты.

«Химиотерапевтический агент» является химическим соединением, применимым в лечении рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают в себя алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1063 (в том числе его синтетические аналоги адоцелезин, карцелезин и бицелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа (иприта), такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, гидрохлорид оксида меклоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма 1I и калихеамицин омега I1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые ендииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, беторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN® (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролидинодоксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренали, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида глюкозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидайнин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазихон; 2,2',2 -трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ( Ara-C ); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE Cremophor-free, сконструированную с альбумином, состоящую из наночастиц композицию паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных химиотерапевтических агентов.

В это определение включены также антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как эстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), в том числе, например, тамоксифен (в том числе тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продуцирование эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместанин, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®, и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; а также троксацитабин (аналог цитозина 1,3-диоксоланнуклеозид); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, антисмысловые олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях трансдукции сигналов, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, такие как, например, РКС-альфа, Ralf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины генотерапии, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных агентов.

«Ингибирующий рост агент» означает в данном контексте соединение или композицию, которая ингибирует рост клетки, либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, ингибирующий рост агент является агентом, который существенно уменьшает процент клеток, сверхэкспрессирующих такие гены в S-фазе. Примеры ингибирующих рост агентов включают в себя агенты, которые блокируют прогрессирование клеточного цикла (в другом месте, чем S-фаза), такие как агенты, которые индуцируют остановку G1 и остановку М-фазы. Классические блокаторы М-фазы включают в себя винкаалкалоиды (винкристин и винбластин), таксол и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, которые останавливают G1, также переходят в остановку S-фазы, например, ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, меклоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и аra-C. Дополнительная информация может быть найдена в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic drugs by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в частности, стр.13.

Термин «цитокин» является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Среди этих цитокинов находятся гормон роста, например, гормон роста человека, N-метионил-гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреоидстимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; фактор роста фибробластов; пролактин; лактоген плаценты; фактор-альфа и фактор-бета некроза опухолей; Мюллерово ингибирующее вещество; гонадотропинассоциированный пептид мышей; ингибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF- и TGF- ; инсулин-подобный фактор-I и инсулин-подобный фактор-II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон- , - и - ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как CSF макрофагов (M-CSF); CSF гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF); и CSF гранулоцитов (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и kit-лиганд (KL). В данном контексте, термин цитокин включает в себя белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологические эквиваленты цитокинов с природной последовательностью.

Термины «лечение», «обработка» и «терапия» относятся в данном контексте к лечебной терапии, профилактической терапии и превентивной терапии.

Термин «млекопитающее» относится в данном контексте к любому млекопитающему, классифицируемому как млекопитающее, в том числе к людям, коровам, лошадям, собакам и кошкам. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения млекопитающим является человек.

Термин EGFR относится к полипептиду рецепторной тирозинкиназы, Рецептору Эпидермального Фактора Роста, который описан в Ullrich et al., Nature (1984) 309:418-425, альтернативно называемому Her-1 и продуктом гена c-erbВ, а также его вариантам, таким как EGFRvIII. Варианты EGFR включают в себя также делеционные, имеющие замены и инсерции варианты, например, варианты, описанные Lynch et al., (New England Journal of Medicine 2004, 350:2129), Paez et al., (Science 2044, 304:1497), Pao et al., (PNAS 2004, 101:13306).

Термин «ингибитор EGFR» относится к соединениям, которые связываются с EGFR или иным образом взаимодействуют непосредственно с EGFR и предотвращают или уменьшают его активность передачи сигнала, и EGFR альтернативно называют «антагонистом EGFR». Ингибиторы EGFR включают в себя антитела, такие как химерное антитело С225, также называемое цетуксимабом и Erbitux® (ImClone Systems Inc.), полный АВХ-EGFR (панитумумаб, Abgenix Inc.), а также полные антитела человека, известные как Е1.1, Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, Е2.11, Е6.3 и Е7.6, и описаны в US 6235883; MDX-447 (Medarex Inc.). Антагонисты EGFR включают в себя малые молекулы, такие как соединения, описанные в US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498. Конкретные антагонисты EGFR с малой молекулой включают в себя OSI-774 (CP-358774, эрлотиниб, OSI Pharmaceutucals); PD 183805 (CI-1033, 2-пропенамид, N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолинил)пропокси]-6-хиназолинил]-, дигидрохлорид, Pfizer Inc.); Iressa (ZD1839, гефитиниб, 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-амино-4-(3-метилфениламино)хиназолин, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-хлор-4-фторфенил)-N2-(1-метилпиперидин-4-ил)пиримидо[5,4-d]пиримидин-2,8-диамин, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-фенилэтил)амино]-1Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенол); (R)-6-(4-гидроксифенил)-4-[(1-фенилэтил)амино]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин); CL-387785 (N-[4-[(3-бромфенил)амино]-6-хиназолинил]-2-бутинамид); и EKB-569 (N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолинил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид).

В конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR имеет общую формулу I:

в соответствии с US 5757498, где:

Х означает галоген или гидрокси;

m равно 1, 2 или 3;

каждый R¹ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, гидрокси, гидроксиамино, карбокси, нитро, гуанидино, уреидо, циано, трифторметила и -(С₁-С₄ алкилен)-W-(фенила), где W означает ординарную связь, O, S или NH;

или каждый R ¹ независимо выбран из R⁹ и С₁-С ₄ алкила, замещенного циано, где R⁹ выбран из группы, состоящей из R⁵, -ОR⁶, -NR ⁶R⁶, -С(О)R⁷, -NHOR⁵, -ОС(О)R⁶, циано, А и -YR⁵; R⁵ означает С₁-С₄ алкил; R⁶ означает независимо водород или R⁵; R⁷ означает R⁵, -ОR⁶ или -NR⁶R⁶ ; А выбран из пиперидино, морфолино, пирролидино, 4-R⁶ -пиперазин-1-ила, имидазол-1-ила, 4-пиридон-1-ила, -(С₁ -С₄ алкилен)(СО2Н), фенокси, фенила, фенилсульфанила, С₂-С₄ алкенила и -(С₁-С ₄ алкилен)С(О)NR⁶R⁶; и Y означает S, SO или SO₂; где алкильные радикалы в R⁵ , -ОR⁶ и -NR⁶R⁶ необязательно замещены одним-тремя галогеновыми заместителями и алкильные радикалы в R⁵, -ОR⁶ и -NR⁶R⁶ необязательно замещены 1 или 2 группами R⁹, и где алкильные радикалы указанных необязательных заместителей необязательно замещены галогеном или R⁹, при условии, что два гетероатома не присоединены к одному и тому же атому углерода;

или каждый R¹ независимо выбран из -NHSO₂ R⁵, фталимидо-(С₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ила, 2,5-диоксопирролидин-1-ила и R¹⁰-(С₂-С ₄)алканоиламино, где R¹⁰ выбран из галогена, -ОR⁶, С₂-С₄ алканоилокси, -С(О)R ⁷ и -NR⁶R⁶; и где указанные группы R¹-HSO₂R⁵, фталимидо-(С ₁-С₄)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфониламино, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ил, 2,5-диоксопирролидин-1-ил и R¹⁰-(С₂-С₄)алканоиламино необязательно замещены 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкила, циано, метансульфонила и С₁-С₄ алкокси;

или две группы R¹ взяты вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, с образованием 5-8-членного кольца, которое включает в себя 1 или 2 гетероатома, выбранных из О, S и N;

R² означает водород или С₁ -С₆ алкил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкокси, -NR⁶R⁶ и -SO₂R ⁵;

n равно 1 или 2 и каждый R³ независимо выбран из водорода, галогена, гидрокси, С₁ -С₆ алкила, -NR⁶R⁶ и С₁ -С₄ алкокси, где алкильные радикалы указанных групп R³ необязательно замещены 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, С₁-С₄ алкокси, -NR⁶R⁶ и -SO₂R; и

R⁴ означает азидо или -(этинил)-R¹¹, где R¹¹ означает водород или С₁-С₆ алкил, необязательно замещенный гидрокси, -ОR⁶ или -NR⁶R⁶.

В конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR является соединением формулы I, выбранным из группы, включающей в себя:

(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-[3-(3'-гидроксипропин-1-ил)фениламин; [3-(2'-(аминометил)этинил)фенил]-6,7-диметоксихиназолин-4-ил)амин; (3-этинилфенил)-(6-нитрохиназолин-4-ил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-(4-этинилфенил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-2-метилфенил)амин; (6-аминохиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (3-этинилфенил)-(6-метансульфониламинохиназолин-4-ил)амин; (3-этинилфенил)-(6,7-метилендиоксихиназолин-4-ил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-6-метилфенил)амин; (3-этинилфенил)-(7-нитрохиназолин-4-ил)амин; (3-этинилфенил)-[6-(4'-толуолсульфониламино)хиназолин-4-ил]амин; (3-этинилфенил)-{6-[2'-фталимидоэт-1'-илсульфониламино]хиназолин-4-ил}амин; (3-этинилфенил)-(6-гуанидинохиназолин-4-ил)амин; (7-аминохиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (3-этинилфенил)-(7-метоксхиназолин-4-ил)амин; (6-карбометоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (7-карбометоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-((3-этинилфенил)амин; (3-азидофенил)-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)амин; (3-азидо-5-хлорфенил)-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)амин; (4-азидо-фенил)-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)амин; (3-этинилфенил)-(6-метансульфонилхиназолин-4-ил)амин; (6-этансульфанилхиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-4-фторфенил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-4-ил)-[3-(пропин-1'-ил)фенил]амин; [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(5-этинил-2-метилфенил)амин; [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинил-4-фторфенил)амин; [6,7-бис-(2-ацетоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; [6-(хлорэтокси)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил}-(3-этинилфенил)амин; [6,7-бис-(2- ацетоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; 2-{4-(3-этинилфениламино)-7-(2-гидроксиэтокси)хиназолин-6-илокси]этанол; [6-(2-ацетоксиэтокси)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; [7-(2-хлорэтокси)-6-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; [7-(2-ацетоксиэтокси)-6-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; 2-[4-(3-этинилфениламино)-6-(2-гидроксиэтокси)хиназолин-7-илокси]этанол; 2-[4-(3-этинилфениламино)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-6-илокси]этанол; 2-[4-(3-этинилфениламино)-6-(2-метоксиэтокси)хиназолин-7-илокси]этанол; [6-(2-ацетоксиэтокси)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амин; (3-этинилфенил)-{6-(2-метоксиэтокси)-7-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]хиназолин-4-ил}амин; (3-этинилфенил)-[7-(2-метоксиэтокси)-6-(2-морфолин-4-ил)этокси)хиназолин-4-ил]амин; (6,7-диэтоксихиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-дибутоксихиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диизопропоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диэтоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-2-метилфенил)амин; [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-1-ил]-(3-этинил-2-метилфенил)амин; (3-этинилфенил)-[6-(2-гидпрксиэтокси)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-1-ил]амин; [6,7-бис-(2-гидроксиэтокси)хиназолин-1-ил]-(3-этинилфенил)амин; 2-[4-(3-этинилфениламино)-6-(2-метоксиэтокси)хиназолин-7-илокси]этанол; (6,7-дипропоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диэтоксихиназолин-4-ил]-(3-этинил-5-фторфенил)амин; (6,7-диэтоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-4-фторфенил)амин; (6,7-диэтоксихиназолин-4-ил)-(5-этинил-2-метилфенил)амин; (6,7-диэтоксихиназолин-4-ил)-(3-этинил-4-метилфенил)амин; (6-аминометил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6-аминометил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6-аминокарбонилметил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6-аминокарбонилэтил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6-аминокарбонилметил-7-этоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6-аминокарбонилэтил-7-этоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил))амин; (6-аминокарбонилметил-7-изопропоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил))амин; (6-аминокарбонилметил-7-изопропоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил))амин; (6-аминокарбонилметил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил))амин; (6-аминокарбонилэтил-7-метоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил))амин; (6-аминокарбонилэтил-7-пропоксихиназолин-4-ил)-(3-этинилфенил)амин и (6,7-диэтоксихиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; (3-этинилфенил)-[6-(2-гидроксиэтокси)-7-(2-метоксиэтокси)хиназолин-1-ил]амин; [6,7-бис-(2-гидроксиэтокси)хиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; (6,7-диметоксихиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин; (3-этинилфенил)-(6-метансульфониламинохиназолин-1-ил)амин) и (6-аминохиназолин-1-ил)-(3-этинилфенил)амин.

В одном конкретном варианте осуществления, ингибитором EGFR формулы I является N-(3-этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин. В одном конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR N-(3-этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин является формой HCl-соли. В другом конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR N-(3-этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин является по существу гомогенной формой кристаллического полиморфа (описанного как полиморф В в WO 01/34574), который обнаруживает картину порошковой рентгенограммы, имеющую характерные пики в градусах 2-тета (2 ) при приблизительно 6,26, 12,48, 13,39, 16,96, 20,20, 21,10, 22,98, 24,46, 25,14 и 26,91. Такую полиморфную форму N-(3-этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамина называют Tarceva , а также OSI-774, CP-358774 и эрлотинибом.

Соединения формулы I, их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства (далее называемые активными соединениями) могут быть получены любым способом, о котором известно, что он применим к получению химически родственных соединений. Обычно, эти активные соединения могут быть получены из подходящим образом замещенного хиназолина с использованием подходящим образом замещенного амина, как показано в общей схеме I, описанной в US 5747498:

Схема I

Как показано на схеме I, подходящий 4-замещенный хиназолин 2, в котором Х означает подходящую вытесняемую уходящую группу, такую как галоген, арилокси, алкилсульфинил, алкилсульфонил, такие как трифторметансульфонилокси, арилсульфинил, арилсульфонил, силокси, циано, пиразоло, триазоло или тетразоло, предпочтительно 4-хлорхиназолин, взаимодействует с подходящим амином или гидрохлоридом амина 4 или 5, где R⁴ имеет описанное выше значение, и Y означает Br, I или трифторметансульфонилокси, в растворителе, таком как (С₁-С₆)-спирт, диметилформамид (ДМФ), N-метилпирролидин-2-он, хлороформ, ацетонитрил, тетрагидрофуран (ТГФ), 1,4-диоксан, пиридин или другой апротонный растворитель. Эта реакция может выполняться в присутствии основания, предпочтительно карбоната или гидрохлорида щелочного, или щелочноземельного металла, или основания третичного амина, такого как пиридин, 2,6-лутидин, коллидин, N-метилморфолин, триэтиламин, 4-диметиламинопиридин или N,N-диметиланилин. Эти основания называют далее подходящими основаниями. Реакционную смесь поддерживают при температуре от приблизительно температуры окружающей среды до приблизительно температуры дефлегмации растворителя, предпочтительно от приблизительно 35°С до приблизительно температуры дефлегмации, пока по существу не перестанет детектироваться оставшийся 4-галогенхиназолин, обычно приблизительно от 2 часов до 24 часов. Предпочтительно, эту реакцию выполняют в инертной атмосфере, такой как сухой азот.

Обычно реагирующие вещества объединяют стехиометрически. При использовании аминного основания для соединений, где используют соль (обычно HCl-соль) амина 4 или 5, предпочтительно использовать избыток аминного основания, обычно дополнительный эквивалент аминного основания. (Альтернативно, если не используют аминное основание, может быть использован избыток амина 4 или 5).

Для соединений, где используют стерически блокированный амин 4 (такой как 2-алкил-3-этиниланилин) или очень реакционноспособный 4-галогенхиназолин, предпочтительно использовать трет-бутиловый спирт или полярный апротонный растворитель, такой как ДМФ или N-метилпирролидин-2-он, в качестве растворителя.

Альтернативно, 4-замещенный хиназолин 2, где Х является гидроксилом или оксо (и азот 2 является гидрированным), взаимодействует с тетрахлоридом углерода и необязательно замещенным триарилфосфином, который необязательно находится на инертном полимере-носителе (например, трифенилфосфином на полимере-носителе, Aldrich Cat. № 36645-5, который является сшитым с 2% дивинилбензолом полистиролом, содержащим 3 ммоль фосфора на грамм смолы) в таком растворителе, как тетрахлорид углерода, хлороформ, дихлорэтан, тетрагидрофуран, ацетонитрил или другой апротонный растворитель или их смеси. Реакционную смесь поддерживают при температуре от приблизительно температуры окружающей среды до температуры дефлегмации, предпочтительно от приблизительно 35^о С до температуры дефлегмации, в течение 2-24 часов. Эта смесь взаимодействует с подходящим амином или гидрохлоридом амина 4 или 5 либо непосредственно, либо после удаления растворителя, например, упариванием в вакууме, и добавления подходящего альтернативного растворителя, такого как (С₁-С₆)спирт, ДМФ, N-метилпирролидин-2-он, пиридин или 1,4-диоксан. Затем эту реакционную смесь поддерживают при температуре от приблизительно температуры окружающей среды до температуры дефлегмации, пока не достигается по существу полное образование продукта, обычно от приблизительно 2 до приблизительно 24 часов. Предпочтительно, эту реакцию выполняют в инертной атмосфере, такой как сухой азот.

При использовании соединения 4, в котором Y означает Br, I или трифторметансульфонилокси, в качестве исходного материала в реакции с хиназолином 2, образуется соединение формулы 3, где R¹, R², R³ и Y имеют описанные выше значения. Соединение 3 превращают в соединение формулы 1, где R⁴ является этинилом R¹¹, и R¹¹ имеет определенные выше значения, реакцией с подходящим реагентом палладия, таким как тетракис(трифенилфосфин)палладий или дихлорид бис(трифенилфосфин)палладия, в присутствии подходящей кислоты Льюиса, такой как хлорид одновалентной меди, и подходящего алкина, такого как триметилсилилацетилен, пропаргиловый спирт или 3-(N,N-диметиламино)пропин, в растворителе, таком как диэтиламин или триэтиламин. Соединения 3, где Y является NH₂, могут быть превращены в соединения 1, где R⁴ является азидом, обработкой соединения 3 диазотирующим агентом, таким как кислота и нитрит (например, уксусная кислота и NaNO₂), с последующей обработкой полученного продукта азидом, таким как NaN₃.

Для получения соединений Формулы I, где R¹ является амино- или гидроксиаминогруппой, выполняют восстановление соответствующего соединения Формулы I, где R¹ является нитро.

Это восстановление может удобным образом проводиться любой из многих процедур, известных для подобных превращений. Это восстановление может проводиться, например, гидрированием нитросоединения в реакционно-инертном растворителе в присутствии подходящего металлического катализатора, такого как палладий, платина или никель. Дополнительным подходящим восстанавливающим агентом является, например, активированный металл, такой как активированное железо (полученное промыванием порошка железа разбавленным раствором кислоты, такой как хлористоводородная кислота). Так, например, восстановление может проводиться нагреванием смеси нитросоединения и активированного металла с концентрированной хлористоводородной кислотой в растворителе, таком как смесь воды и спирта, например, метанола или этанола, до температуры в диапазоне, например, 50^оС - 150°С, предпочтительно при или около 70°С. Другим подходящим классом восстанавливающих агентов являются дитиониты щелочных металлов, такие как дитионит натрия, которые могут быть использованы с (С₁-С ₄)алкановыми кислотами, (С₁-С₆)алканолами, водой или их смесями.

Для получения соединений формулы I, где R² или R³ включает в себя первичную или вторичную аминогруппу (другую, чем аминогруппа, предназначенная для реакции с хиназолином), такую свободную аминогруппу предпочтительно защищают перед описанной выше реакцией с последующим удалением этой защиты, после описанной выше реакции с 4-(замещенным)хиназолином 2.

Могут быть использованы несколько хорошо известных защитных групп азота. Такие группы включают в себя (С₁ -С₆)алкоксикарбонил, необязательно замещенный бензилоксикарбонил, арилоксикарбонил, тритил, винилоксикарбонил, О-нитрофенилсульфонил, дифенилфосфинил, п-толуолсульфонил и бензил. Добавление защитной группы азота может проводиться в хлорированном углеводородном растворителе, таком как метиленхлорид или 1,2-дихлорэтан, или простом эфирном растворителе, таком как диметиловый эфир этиленгликоля, диметиловый эфир диэтиленгликоля или ТГФ, в присутствии или в отсутствие третичного аминного основания, такого как триэтиламин, диизопропилэтиламин, пиридин, предпочтительно триэтиламин, при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 50°С, предпочтительно при температуре окружающей среды. Альтернативно, эти защитные группы удобным образом присоединяют с использованием условий Шоттена-Баумана.

После вышеописанной реакции сочетания соединений 2 и 5, защитная группа может быть удалена способами удаления защитных групп, известными квалифицированным в данной области специалистам, например, обработкой трифторуксусной кислотой в метиленхлориде для защищенных трет-бутоксикарбонилом продуктов.

В отношении описания защитных групп и их использования см. T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis Second Ed., John Wiley & Sons, New York, 1991.

Для получения соединений Формулы I, где R¹ или R² является гидрокси, предпочтительным является расщепление соединения формулы I, где R¹ или R ² являются (С₁-С₄)алкокси.

Эта реакция расщепления может удобным образом проводиться любой из многих процедур, известных для подобных превращений. Обработка защищенного производного формулы I расплавленным гидрохлоридом пиридина (20-30 экв.) при 150-175°С может быть использована для О-деалкилирований. Альтернативно, реакция расщепления может проводиться, например, обработкой защищенного производного хиназолина (С₁-С₄)алкилсульфидом щелочного металла, таким как этантиолат натрия, или обработкой диарилфосфидом щелочного металла, таким как дифенилфосфид лития. Эта реакция расщепления может также проводиться, предпочтительно, обработкой защищенного производного хиназолина тригалогенидом бора или алюминия, таким как трибромид бора. Такие реакции предпочтительно проводят в присутствии реакционно-инертного растворителя при подходящей температуре.

Соединения формулы I, где R ¹ или R² является (С₁-С₄ )алкилсульфинильной или (С₁-С₄)алкилсульфонильной группой, предпочтительно получают окислением соединения формулы I, где R¹ или R² является (С₁ -С₄)алкилсульфанильной группой. Подходящие окислительные агенты известны в данной области для окисления сульфанила в сульфинил и/или сульфонил, например, пероксид водорода, перкислота (такая как 3-хлорпероксибензойная или пероксиуксусная кислота), пероксисульфат щелочного металла (такой как пероксимоносульфат калия), триоксид хрома или газообразный кислород в присутствии платины. Это окисление обычно проводят по возможности при мягких условиях с использованием стехиометрического количества окислителя для уменьшения риска переокисления и повреждения других функциональных групп. Обычно, эту реакцию проводят в подходящем растворителе, таком как метиленхлорид, хлороформ, ацетон, тетрагидрофуран или простой трет-бутилметиловый эфир, и при температуре приблизительно от -25°С до 50°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды, т.е. в диапазоне 15°С - 35°С. Когда желательным является соединение, несущее сульфинильную группу, должны использоваться более мягкие окислители, такие как метапериодат натрия или калия, предпочтительно в полярном растворителе, таком как уксусная кислота или этанол. Соединения формулы I, содержащие (С₁-С₄)алкилсульфонильную группу, могут быть получены окислением соответствующего (С₁-С ₄)алкилсульфинильного соединения, а также соответствующего (С₁-С₄)алкилсульфанильного соединения.

Соединения формулы I, где R¹ является необязательно замещенным (С₂-С₄)алканоиламино, уреидо, 3-фенилуреидо, бензамидо или сульфонамидо, могут быть получены ацилированием или сульфонилированием соответствующего соединения, где R¹ является амино. Подходящие ацилирующие агенты являются любыми агентами, известными в данной области для ацилирования амино в ациламино, например, ацилгалогениды, например, (С_2-4)алканоилхлорид или -бромид или бензоилхлорид или -бромид, ангидриды алкановых кислот или смешанные ангидриды (например, уксусный ангидрид или смешанный ангидрид, образованный реакцией алкановой кислоты и (С₁-С₄)алкоксикарбонилгалогенида, например, (С₁-С₄)алкоксикарбонилхлорида, в присутствии подходящего основания. Для получения соединений формулы I, в которой R¹ является уреидо или 3-фенилуреидо, подходящим ацилирующим агентом является, например, цианат, например, цианат щелочного металла, такой как цианат натрия, или изоцианат, такой как фенилизоцианат. N-сульфонилирования могут проводиться с подходящими сульфонилгалогенидами или сульфонилангидридами в присутствии третичного аминового основания. Обычно ацилирование или сульфонилирование проводят в реакционно-инертном растворителе и при температуре в диапазоне приблизительно -30°С до приблизительно 120°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

Соединения Формулы I, где R¹ является (С₁-С₄ )алкокси или замещенным (С₁-С₄)алкокси или R¹ является (С₁-С₄)алкиламино или замещенным моно-N- или ди-N,N-(С₁-С₄ )алкиламино, получают алкилированием, предпочтительно в присутствии подходящего основания, соответствующего соединения, где R ¹ является гидрокси или амино, соответственно. Подходящие алкилирующие агенты включают в себя алкил- или замещенные алкилгалогениды, например, необязательно замещенный (С₁-С₄ )алкилхлорид, -бромид или -иодид, в присутствии подходящего основания в реакционно-инертном растворителе и при температуре в диапазоне приблизительно от 10°С до 140°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

Для получения соединений Формулы I, в которых R¹ является амино-, окси- или цианозамещенным (С₁-С₄)алкильным заместителем, соответствующее соединение, где R¹ является (С₁-С₄ )алкильным заместителем, несущим группу, которая вытесняется амино-, алкокси- или цианогруппой, подвергают реакции с подходящим амином, спиртом или цианидом, предпочтительно в присутствии подходящего основания. Эту реакцию предпочтительно проводят в реакционно-инертном растворителе или разбавителе и при температуре в диапазоне приблизительно от 10°С до 100°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

Соединения формулы I, где R¹ является карбоксизаместителем или заместителем, который включает в себя карбоксигруппу, получают гидролизом соответствующего соединения, в котором R¹ является (С₁-С₄)алкоксикарбонильным заместителем или заместителем, который включает в себя (С₁-С ₄)алкоксикарбонильную группу. Этот гидролиз может быть удобным образом проведен, например, при основных условиях, например, в присутствии гидроксида щелочного металла.

Соединения формулы I, где R¹ является амино, (С₁-С ₄)алкиламино, ди-[(С₁-С₄)алкил]амино, пирролидин-1-илом, пиперидино, морфолино, пиперазин-1-илом, 4-(С ₁-С₄)алкилпиперазин-1-илом или (С₁ -С₄)алкилсульфанилом, может быть получено реакцией, в присутствии подходящего основания, соответствующего соединения, в котором R¹ является амино- или тиоловой вытесняемой группой, с соответствующим амином или тиолом. Эту реакцию проводят в реакционно-инертном растворителе или разбавителе и при температуре в диапазоне приблизительно от 10°С до 180°С, предпочтительно при температуре в диапазоне 100°С - 150°С.

Соединения формулы I, где R¹ является оксопирролидин-1-илом или 2-оксопиперидин-1-илом, получают циклизацией, в присутствии подходящего основания, соответствующего соединения, в котором R¹ является галоген-(С₂-С₄)алканоиламиногруппой. Эту реакцию проводят в реакционно-инертном растворителе или разбавителе и при температуре в диапазоне приблизительно от 10°С до 180°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

Для получения соединений формулы I, где R¹ является карбамоилом, замещенным карбамоилом, алканоилокси или замещенным алканоилокси, подходящим является карбамоилирование или ацилирование соответствующего соединения, в котором R¹ является гидрокси.

Подходящие ацилирующие агенты, известные в данной области для ацилирования гидроксиарильных групп до алканоилоксиарильных групп, включают в себя, например, (С₂-С₄)алканоилгалогениды, (С₂-С₄)алканоилангидриды и смешанные ангидриды, описанные выше, и могут быть использованы их подходящие замещенные производные, обычно в присутствии подходящего основания. Альтернативно, (С₂-С₄)алкановые кислоты или их подходящим образом замещенные производные могут быть связаны с соединением формулы I, в котором R¹ является гидрокси, с использованием конденсирующего агента, такого как карбодиимид. Для получения соединений формулы I, в которой R¹ является карбамоилом или замещенным карбамоилом, подходящими карбамоилирующими агентами являются, например, цианаты или алкил- или арилизоцианаты, обычно в присутствии подходящего основания. Альтернативно, могут быть получены подходящие промежуточные продукты, такие как хлорформиат или карбонилимидазолилпроизводное соединение формулы I, в котором R¹ является гидрокси, например, обработкой указанного производного фосгеном (или эквивалентом фосгена) или карбонилдиимидазолом. Полученный промежуточный продукт может затем взаимодействовать с подходящим амином или замещенным амином с образованием желательных карбамоилпроизводных.

Соединения формулы I, где R¹ является аминокарбонилом или замещенным аминокарбонилом, может быть получено аминолизом подходящего промежуточного продукта, в котором R¹ является карбокси.

Активация и сочетание соединений формулы I, где R¹ является карбокси, может выполняться различными способами, известными квалифицированным в данной области специалистам. Подходящие способы включают в себя активацию карбоксила в виде галогенангидрида кислоты, азида, симметричного или смешанного ангидрида или активного сложного эфира с подходящей реактивностью в отношении связывания с желаемым амином. Примеры таких типов промежуточных продуктов и их получения и использования в связывании с аминами, может быть найдено в обширной литературе, например, M. Bodansky and A. Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis , Springer-Varlag, New York, 1984. Полученные соединения формулы I могут быть выделены и очищены стандартными способами, такими как удаление растворителя и перекристаллизация или хроматография.

Исходные материалы для описанной схемы реакций I (например, амины, хиназолины и аминозащитные группы) являются легко доступными или могут быть легко синтезированы квалифицированными в данной области специалистами с использованием общепринятых способов органического синтеза. Например, получение производных 2,3-дигидро-1,4-бензоксазина описано в R.C. Elderfield, W.H. Todd, S. Gerber, Ch. 12 in Heterocyclic Compounds , Vol.6, R.C. Elderfield ed., John Wiley and Sons, Inc., N.Y. 1957. Замещенные 2,3-дигидробензотиазинилсоединения описаны R.C. Elderfield and E.E. Harris in Ch. 13, Vol.6 of Elderfield Heterocyclic Compounds book.

В другом конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR имеет общую формулу II, описанную в US 5457105:

где:

m равно 1, 2 или 3 и

каждый R¹ означает независимо 6-гидрокси, 7-гидрокси, амино, карбокси, карбамоил, уреидо, (1-4С)алкоксикарбонил, N-(1-4С)алкилкарбамоил, N,N-ди-[(1-4С)алкил]карбамоил, гидроксиамино, (1-4С)алкоксиамино, (2-4С)алканоилоксиамино, трифторметокси, (1-4С)алкил, 6-(1-4С)алкокси, 7-(1-4С)алкокси, (1-3С)алкилендиокси, (1-4С)алкиламино, ди-1[(1-4С)алкил]амино, пирролидин-1-ил, пиперидино, морфолино, пиперазин-1-ил, 4-(1-4С)алкилпиперазин-1-ил, (1-4С)алкилтио, (1-4С)алкилсульфинил, (1-4С)алкилсульфонил, бромметил, дибромметил, гидрокси-(1-4С)алкил, (2-4С)алканоилокси-(1-4С)алкил, (1-4С)алкокси-(1-4С)алкил, карбокси-(1-4С)алкил, (1-4С)алкоксикарбонил-(1-4С)алкил, карбамоил-(1-4С)алкил, N-(1-4С)алкилкарбамоил-(1-4С)алкил, N,N-ди-[(1-4С)алкил]карбамоил-(1-4С)алкил, амино-(1-4С)алкил, (1-4С)алкиламино-(1-4С)алкил, ди-[(1-4С)алкил]амино-(1-4С)алкил, пиперидино-(1-4С)алкил, морфолино-(1-4С)алкил, пиперазин-1-ил-(1-4С)алкил, 4-(1-4С)алкилпиперазин-1-ил-(1-4С)алкил, гидрокси-(2-4С)алкокси-(1-4С)алкил, (1-4С)алкокси-(2-4С)алкокси-(1-4С)алкил, гидрокси-(2-4С)алкиламино-(1-4С)алкил, (1-4С)алкокси-(2-4С)алкиламино-(1-4С)алкил, (1-4С)алкилтио-(1-4С)алкил, гидрокси-(2-4С)алкилтио-(1-4С)алкил, (1-4С)алкокси-(2-4С)алкилтио-(1-4С)алкил, фенокси-(1-4С)алкил, анилино-(1-4С)алкил, фенилтио-(1-4С)алкил, циано-(1-4С)алкил, галоген-(2-4С)алкокси, гидрокси-(2-4С)алкокси, (2-4С)-алканоилокси-(2-4С)алкокси, (1-4С)алкокси-(2-4С)алкокси, карбокси-(1-4С)алкокси, (1-4С)алкоксикарбонил-(1-4С)алкокси, карбамоил-(1-4С)алкокси, N-(1-4С)алкилкарбамоил-(1-4С)алкокси, N,N-ди-[(1-4С)алкил]карбамоил-(1-4С)алкокси, амино-(2-4С)алкокси, (1-4С)алкиламино-(2-4С)алкокси, ди-[(1-4С)алкил]амино-(2-4С)алкокси, (2-4С)алканоилокси, гидрокси-(2-4С)алканоилокси, (1-4С)алкокси-(2-4С)алканоилокси, фенил-(1-4С)алкокси, фенокси-(2-4С)алкокси, анилино-(2-4С)алкокси, фенилтио-(2-4С)алкокси, пиперидино-(2-4С)алкокси, морфолино-(2-4С)алкокси, пиперазин-1-ил-(2-4С)алкокси, 4-(1-4С)алкилпиперазин-1-ил-(2-4С)алкокси, галоген-(2-4С)алкиламино, гидрокси-(2-4С)алкиламино, (2-4С)алканоилокси-(2-4С)алкиламино, (1-4С)алкокси-(2-4С)алкиламино, карбокси-(1-4С)алкиламино, (1-4С)алкоксикарбонил-(1-4С)алкиламино, карбамоил-(1-4С)алкиламино, N-(1-4С)алкилкарбамоил-(1-4С)алкиламино, N,N-ди-[(1-4С)алкил]карбамоил-(1-4С)алкиламино, амино-(2-4С)алкиламино, (1-4С)алкиламино-(2-4С)алкиламино, ди-[(1-4С)алкил]амино-(2-4С)алкиламино, фенил-(1-4С)алкиламино, фенокси-(2-4С)алкиламино, анилино-(2-4С)алкиламино, фенилтио-(2-4С)алкиламино, (2-4С)алканоиламино, (1-4С)алкоксикарбониламино, (1-4С)алкилсульфониламино, бензамидо, бензолсульфонамидо, 3-фенилуреидо, 2-оксопирролидин-1-ил, 2,5-диоксопирролидин-1-ил, галоген-(2-4С)алканоиламино, гидрокси(2-4С)алканоиламино, (1-4С)алкокси-(2-4С)алканоиламино, карбокси(2-4С)алканоиламино, (1-4С)алкоксикарбонил-(2-4С)алканоиламино, карбамоил-(2-4С)алканоиламино, N-(1-4С)алкилкарбамоил-(2-4С)алканоиламино, N,N-ди[(1-4С)алкил]карбамоил-(2-4С)алканоиламино, амино-(2-4С)алканоиламино, (1-4С)алкиламино-(2-4С)алканоиламино или ди-[(1-4С)алкил]амино-(2-4С)алканоиламино, и где указанные заместители бензамидо или бензолсульфонамидо или любая группа из анилино, фенокси или фенила в заместителе R¹ может необязательно нести один или два заместителя из галогена, (1-4С)алкила или (1-4С)алкокси;

n равно 1 или 2 и

каждый R² означает независимо водород, гидрокси, галоген, трифторметил, амино, нитро, циано, (1-4С)алкил, (1-4С)алкокси, (1-4С)алкиламино, ди-[(1-4С)алкил]амино, (1-4С)алкилтио, (1-4С)алкилсульфинил или (1-4С)алкилсульфонил; или фармацевтически приемлемую соль этого соединения; за исключением того, что исключены 4-(4'-гидроксианилино)-6-метоксихиназолин, 4-(4'-гидроксианилино)-6,7-метилендиоксихиназолин, 6-амино-4-(4'-аминоанилино)хиназолин, 4-анилино-6-метилхиназолин или его гидрохлоридная соль и 4-анилино-6,7-диметоксихиназолин или его гидрохлоридная соль.

В конкретном варианте осуществления, ингибитор EGFR является соединением в соответствии с формулой II, выбранным из группы, включающей в себя:

4-(3'хлор-4'-фторанилино)-6,7-диметоксихиназолин; 4-(3',4'-дихлоранилино)-6,7-диметоксихиназолин; 6,7-диметокси-4-(3'-нитроанилино)хиназолин; 6,7-диэтокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 4-(3'-хлоранилино)-6-метоксихиназолин; 6,7-этилендиокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-амино-7-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 4-(3'-метиланилино)-6-уреидохиназолин; 6-(2-метоксиэтоксиметил)-4-(3'-метиланилино)хиназолин; (6,7-ди-(2-метоксиэтокси)-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-диметиламино-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-бензамидо-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6,7-диметокси-4-(3'-трифторметиланилино)хиназолин; 6-гидрокси-7-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 7-гидрокси-6-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 7-амино-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-амино-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-амино-4-(3'-хлоранилино)хиназолин; 6-ацетамидо-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-(2-метоксиэтиламино)-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 7-(2-метоксиацетамидо)-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 7-(2-гидроксиэтокси)-6-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 7-(2-метоксиэтокси)-6-метокси-4-(3'-метиланилино)хиназолин; 6-амино-4-(3'-метиланилино)хиназолин.

Производное хиназолина формулы II или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены любым способом, о котором известно, что он является применимым для получения химически родственных соединений. Подходящий способ иллюстрирован, например, в US 4322420. Необходимые исходные материалы могут быть коммерчески доступными или полученными стандартными процедурами органической химии.

(а) Реакция, предпочтительно в присутствии подходящего основания, хиназолина (i), где Z означает вытесняемую группу, с анилином (ii).

Подходящей вытесняемой группой Z является, например, галоген, алкокси, арилокси или сульфонилоксигруппа, например, хлор, бром, метокси, фенокси, метансульфонилокси или толуол-п-сульфонилоксигруппа.

Подходящим основанием является, например, органическое аминное основание, такое как, например, пиридин, 2,6-лутидин, коллидин, 4-диметиламинопиридин, триэтиламин, морфолин, N-метилморфолин или диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен, или, например, карбонат или гидроксид щелочного или щелочно-земельного металла, например, карбонат натрия, карбонат калия, карбонат кальция, гидроксид натрия или гидроксид калия.

Эту реакцию предпочтительно проводят в присутствии подходящего инертного растворителя или разбавителя, например, алканола или сложного эфира, таких как метанол, этанол, изопропанол или этилацетат, галогенированного растворителя, такого как метиленхлорид, хлороформ или тетрахлорид углерода, простого эфира, такого как тетрагидрофуран или 1,4-диоксан, ароматического растворителя, такого как толуол, или диполярного апротонного растворителя, такого как N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидин-2-он или диметилсульфоксид. Эту реакцию предпочтительно проводят при температуре в диапазоне, например, 10°С - 150°С, предпочтительно в диапазоне 20°С - 80°С.

Производное хиназолина формулы II может быть получено из этого способа в форме свободного основания, или, альтернативно, оно может быть получено в форме соли с кислотой формулы Н-Z, где Z имеет определенные выше значения. Когда желательно получить свободное основание из этой соли, эта соль может быть обработана подходящим основанием, определенным здесь выше, с использованием общепринятой процедуры.

(b) Для получения соединений формулы II, где R¹ или R² является гидрокси, расщепление производного хиназолина формулы II, где R¹ или R² является (1-4С)алкокси.

Эту реакцию расщепления можно удобным образом проводить любой из многих процедур, известных для такого превращения. Эту реакцию можно проводить, например, обработкой производного хиназолина (1-4С)алкилсульфидом щелочного металла, таким как этантиолат натрия, или, например, обработкой диарилфосфидом щелочного металла, таким как дифенилфосфид лития. Альтернативно, эта реакция расщепления может удобным образом проводиться, например, обработкой производного хиназолина тригалогенидом бора или алюминия, например, трибромидом бора. Такие реакции предпочтительно проводят в присутствии подходящего инертного растворителя или разбавителя, определенного здесь выше, и при подходящей температуре.

(с) Для получения соединений формулы II, где R¹ или R² является (1-4С)алкилсульфинильной или (1-4С)алкилсульфонильной группой, окисление производного хиназолина формулы II, где R¹ или R² является (1-4С)алкилтиогруппой.

Подходящим окислителем является, например, любой агент, известный в данной области для окисления тио до сульфинила и/или сульфонила, например, пероксид водорода, перкислота (такая как 3-хлорпероксибензойная или пероксиуксусная кислота), пероксисульфат щелочного металла (такой как пероксимоносульфат калия), триоксид хрома или газообразный кислород в присутствии платины. Это окисление обычно проводят при по возможности мягких условиях и с требуемым стехиометрическим количеством окислителя для уменьшения риска переокисления и повреждения других функциональных групп. Обычно эту реакцию проводят в подходящем растворителе или разбавителе, таком как метиленхлорид, хлороформ, ацетон, тетрагидрофуран или трет-бутилметиловый эфир, и при температуре, например, от -25°С до 50°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды, которая находится в диапазоне 15°С - 35°С. Когда желательным является соединение, несущее сульфинильную группу, должны использоваться более мягкие окислители, такие как метапериодат натрия или калия, предпочтительно в полярном растворителе, таком как уксусная кислота или этанол. Будет понятно, что, когда требуется соединение формулы II, содержащее (1-4С)алкилсульфонильную группу, оно может быть получено окислением соответствующего (1-4С)алкилсульфинильного соединения, а также соответствующего (1-4С)алкилтиосоединения.

(d) Для получения соединений формулы II, где R ¹ является амино, восстановление производного хиназолина формулы I, где R¹ является нитро.

Это восстановление может удобным образом проводиться любой из многих процедур, известных для такого превращения. Это восстановление может проводиться, например, гидрированием раствора нитросоединения в инертном растворителе или разбавителе, как описано здесь выше, в присутствии подходящего металлического катализатора, такого как палладий или платина. Дополнительным подходящим восстанавливающим агентом является, например, активированный металл, такой как активированное железо (полученное промыванием порошка железа разбавленным раствором кислоты, такой как хлористоводородная кислота). Так, например, восстановление может проводиться нагреванием смеси нитросоединения и активированного металла в подходящем растворителе или разбавителе, таком как смесь воды и спирта, например, метанола или этанола, до температуры в диапазоне, например, 50°С - 150°С, предпочтительно при или около 70°С.

(е) Для получения соединений формулы II, где R ¹ является (2-4С)алканоиламино или замещенным (2-4С)алканоиламино, уреидо, 3-фенилуреидо или бензамидо, или R² является ацетамидо или бензамидо, ацилирование производного хиназолина формулы II, где R¹ или R² является амино.

Подходящий ацилирующий агент является, например, любым агентом, известным в данной области для ацилирования амино в ациламино, например, ацилгалогенид, например, (2-4С)алканоилхлорид или -бромид или бензоилхлорид или -бромид, предпочтительно в присутствии подходящего основания, как описано здесь выше, ангидрид алкановой кислоты или смешанный ангидрид, например, уксусный ангидрид или смешанный ангидрид (2-4С)алкановой кислоты, образованный реакцией алкановой кислоты и (1-4С)алкоксикарбонилгалогенида, например, (1-4С)алкоксикарбонилхлорида, в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше. Для получения соединений формулы II, в которой R¹ является уреидо или 3-фенилуреидо, подходящим ацилирующим агентом является, например, цианат, например, цианат щелочного металла, такой как цианат натрия, или, например, изоцианат, такой как фенилизоцианат. Обычно ацилирование проводят в реакционно-инертном растворителе или разбавителе и при температуре в диапазоне приблизительно от -30°С до 120°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

(f) Для получения соединений формулы II, где R¹ является (1-4С)алкокси или замещенным (1-4С)алкокси или R¹ является (1-4С)алкиламино или замещенным (1-4С)алкиламино, алкилирование предпочтительно в присутствии подходящего основания, описанного здесь выше, производного хиназолина формулы II, где R¹ является гидрокси или амино, соответственно.

Подходящий алкилирующий агент является, например, любым агентом, известным в данной области для алкилирования гидрокси до алкокси или замещенного алкокси или для алкилирования амино до алкиламиноили замещенного алкиламино, например, алкил- или замещенный алкилгалогенид, например, (1-4С)алкилхлорид, -бромид или -иодид, или замещенный (1-4С)алкилхлорид, -бромид или -иодид, в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше, в подходящем инертном растворителе или разбавителе, определенном здесь выше, и при температуре в диапазоне приблизительно от 10°С до 140°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

(g) Для получения соединений формулы II, где R¹ является карбоксизаместителем, который включает в себя карбоксигруппу, гидролиз производного хиназолина формулы II, где R¹ является заместителем (1-4С)алкоксикарбонилом или заместителем, который включает в себя (1-4С)алкоксикарбонильную группу.

Этот гидролиз может удобным образом проводиться, например, при основных условиях.

(h) Для получения соединений формулы II, где R ¹ является амино-, окси-, тио- или цианозамещенным (1-4С)алкильным заместителем, реакция, предпочтительно в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше, производного хиназолина формулы II, где R¹ является (1-4С)алкильным заместителем, несущим вытесняемую группу, определенную здесь выше, с подходящим амином, спиртом, тиолом или цианидом.

Эту реакцию предпочтительно проводят в подходящем растворителе или разбавителе, определенном здесь выше, и при температуре в диапазоне, например, 10°С - 100°С, предпочтительно при температуре окружающей среды или около температуры окружающей среды.

Когда требуется фармацевтически приемлемая соль производного хиназолина формулы II, она может быть получена, например, реакцией указанного соединения, например, с подходящей кислотой с использованием общепринятой процедуры.

В одном конкретном варианте осуществления, ингибитором EGFR является соединение в соответствии с формулой II', описанное в US 5770599:

где n равно 1, 2 или 3;

каждый R² означает независимо галоген или трифторметил;

R³ означает (1-4С)алкокси; и

R¹ означает ди-[(1-4С)алкил]амино-(2-4С)алкокси, пирролидин-1-ил-(2-4С)алкокси, пиперидино-(2-4С)алкокси, морфолино-(2-4С)алкокси, пиперазин-1-ил-(2-4С)алкокси, 4-(1-4С)алкилпиперазин-1-ил-(2-4С)алкокси, имидазол-1-ил-(2-4С)алкокси, ди-[(1-4С)алкокси-(2-4С)алкил]амино-(2-4С)алкокси, тиаморфолино-(2-4С)алкокси, 1-оксотиаморфолино-(2-4С)алкокси или 1,1-диоксотиаморфолино-(2-4С)алкокси, и где любой из вышеупомянутых заместителей R¹, содержащих СН₂ (метилен)-группу, которая не присоединена к атому N или О, необязательно несет на указанной СН₂-группе заместитель гидрокси; или его фармацевтически приемлемая соль.

В одном конкретном варианте осуществления, ингибитором EGFR является соединение в соответствии с формулой II', выбранное из группы, включающей в себя:

4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(2-пирролидин-1-илэтокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(2-морфолиноэтокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(3-диэтиламинопропокси)-7-метоксихиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(3-диметиламинопропокси)-7-метоксихиназолин; 4-(3',4'-дифторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-пиперидинопропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(2-диметиламиноэтокси)-7-метоксихиназолин; 4-(2',4'-дифторанилино)-6-(3-диметиламинопропокси)-7-метоксихиназолин; 4-(2',4'-дифторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(2-имидазол-1-илэтокси)-7-метоксихиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(3-имидазол-1-илпропокси)-7-метоксихиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино) -6-(2-диметиламиноэтокси)-7-метоксихиназолин; 4-(2',4'-дифторанилино)-6-(3-диметиламинопропокси)-7-метоксихиназолин; 4-(2',4'-дифторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин; 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(2-имидазол-1-илэтокси)-7-метоксихиназолин и 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-6-(3-имидазол-1-илпропокси)-7-метоксихиназолин.

В одном конкретном варианте осуществления, ингибитором EGFR является соединение в соответствии с формулой II', которое является 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолином, альтернативно называемым ZD 1839, гефитинибом и Iressa .

Производное хиназолина формулы II' или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены любым способом, о котором известно, что он применим к получению химически родственных соединений. Подходящие способы включают в себя, например, способы, иллюстрированные в US 5616582, US 5580870, US 5476001 и US 5569658. Если нет иных указаний, n, R², R ³ и R¹ имеют любое из определенных здесь выше значений для производного хиназолина формулы II'. Необходимые исходные материалы могут быть коммерчески доступными или полученными стандартными процедурами органической химии.

(а) Реакция, предпочтительно в присутствии подходящего основания, хиназолина (iii), где Z означает вытесняемую группу, с анилином (iv).

Подходящей вытесняемой группой Z является, например, галоген, алкокси, арилокси или сульфонилоксигруппа, например, хлор, бром, метокси, фенокси, метансульфонилокси или толуол-4-сульфонилоксигруппа.

Подходящим основанием является, например, органическое аминное основание, такое как, например, пиридин, 2,6-лутидин, коллидин, 4-диметиламинопиридин, триэтиламин, морфолин, N-метилморфолин или диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен, или, например, карбонат или гидроксид щелочного или щелочноземельного металла, например, карбонат натрия, карбонат калия, карбонат кальция, гидроксид натрия или гидроксид калия. Альтернативно, подходящим основанием является, например, амид щелочного металла или щелочноземельного металла, например, амид натрия или бис(триметилсилил)амид натрия.

Эту реакцию предпочтительно проводят в присутствии подходящего инертного растворителя или разбавителя, например, алканола или сложного эфира, таких как метанол, этанол, изопропанол или этилацетат, галогенированного растворителя, такого как метиленхлорид, хлороформ или тетрахлорид углерода, простого эфира, такого как тетрагидрофуран или 1,4-диоксан, ароматического растворителя, такого как толуол, или диполярного апротонного растворителя, такого как N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидин-2-он или диметилсульфоксид. Эту реакцию предпочтительно проводят при температуре в диапазоне, например, 10°С - 150°С, предпочтительно в диапазоне 20°С - 80°С.

Производное хиназолина формулы II' может быть получено из этого способа в форме свободного основания, или, альтернативно, оно может быть получено в форме соли с кислотой формулы Н-Z, где Z имеет определенные выше значения. Когда желательно получить свободное основание из этой соли, эта соль может быть обработана подходящим основанием, определенным здесь выше, с использованием общепринятой процедуры.

(b) Для получения соединений формулы II', где R¹ является аминозамещенной (2-4С)алкоксигруппой, алкилирование, предпочтительно в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше, производного хиназолина формулы II', где R¹ является гидроксигруппой.

Подходящим алкилирующим агентом является, например, любой агент, известный в данной области для алкилирования гидрокси до аминозамещенного алкокси, например, аминозамещенный алкилгалогенид, например, аминозамещенный(2-4С)алкилхлорид, -бромид или -иодид, в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше, в подходящем инертном растворителе или разбавителе, определенном здесь выше, и при температуре в диапазоне приблизительно 10°С - приблизительно 140°С, предпочтительно при или около 80°С.

(с) Для получения соединений формулы II', где R¹ является аминозамещенной (2-4С)алкоксигруппой, реакция, предпочтительно в присутствии подходящего основания, определенного здесь выше, соединения формулы II', где R¹ является гидрокси-(2-4С)алкоксигруппой, или его реакционноспособного производного, с подходящим амином.

Подходящим реакционноспособным производным соединения формулы II', где R¹ является гидрокси-(2-4С)алкоксигруппой, является, например, галоген- или сульфонилокси-(2-4С)алкоксигруппа, такая как бром- или метансульфонилокси-(2-4С)алкоксигруппа.

Эту реакцию обычно проводят в присутствии подходящего инертного растворителя или разбавителя, определенного здесь выше, и при температуре в диапазоне, например, 10°С - 150°С, предпочтительно при или около 50°С.

(d) Для получения соединений формулы II', где R¹ является гидроксиамино-(2-4С)алкоксигруппой, реакция соединения формулы II', где R¹ является 2,3-эпоксипропокси или 3,4-эпоксибутоксигруппой, с подходящим амином.

Эту реакцию предпочтительно проводят в присутствии подходящего инертного растворителя или разбавителя, определенного здесь выше, и при температуре в диапазоне, например, 10°С - 150°С, предпочтительно при или около 70°С.

Когда требуется фармацевтически приемлемая соль производного хиназолина формулы II', например, моно- или ди-кислотно-аддитивная соль производного хиназолина формулы II', она может быть получена, например, реакцией указанного соединения, например, с подходящей кислотой с использованием общепринятой процедуры.

II. Композиции и способы этого изобретения

Был описан цитокин, родственный семейству TNF-лигандов, цитокин, идентифицированный здесь как «Аро-2-лиганд» или TRAIL . Предсказанная зрелая аминокислотная последовательность нативного Аро-2-лиганда человека содержит 281 аминокислоту и имеет рассчитанную молекулярную массу приблизительно 32,5 кДа. Отсутствие сингальной последовательности и присутствие внутреннего гидрофобного района предполагает, что Аро-2-лиганд является трансмембранным белком типа II. Были также описаны растворимые полипептиды внеклеточного домена Аро-2-лиганда. См., например, WO97/25428, опубликованную 17 июля 1997 года. Дополнительно были описаны варианты с заменами Аро-2L. Для идентификации различных вариантных молекул с заменами, имеющих биологическую активность, использовали аланинсканирующие способы. Конкретные варианты с заменами Аро-2-лиганда включают в себя варианты, в которых по меньшей мере одна аминокислота заменена другими аминокислотами, такими как остаток аланина. Эти варианты с заменами идентифицируют, например, как D203A , D218A и D269A . Эту номенклатуру используют для идентификации вариантов Аро-2-лигандов, в которых остатки аспарагиновой кислоты в положениях 203, 218 и/или 269 (с использованием нумерации, показанной на фиг.1) заменены остатками аланина. Необязательно, варианты Аро-2L данного изобретения могут содержать одну или несколько замен аминокислот. Необязательно, такие варианты Аро-2L данного изобретения могут быть селективными вариантами рецепторов DR4 или DR5.

Приведенное ниже описание относится к способам получения Аро-2-лиганда, в том числе вариантов Аро-2-лиганда, культивированием клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим кодирующую Аро-2-лиганд нуклеиновую кислоту, и извлечением этого полипептида из культуры клеток.

ДНК, кодирующая Аро-2-лиганд, может быть получена из любой кДНК-библиотеки, полученной из ткани, которая, как считается, имеет мРНК Аро-2-лиганда и экспрессирует ее при детектируемом уровне. Таким образом, ДНК Аро-2-лиганда человека может быть подходящим образом получена из кДНК-библиотеки, полученной из тканей человека, такой как библиотека на основе бактериофага кДНК плаценты человека, описанная в WO97/25428. Ген, кодирующий Аро-2-лиганд, может быть также получен из геномной библиотеки или олигонуклеотидным синтезом.

Библиотеки, могут быть подвергнуты скринингу с использованием зондов (таких как антитела к Аро-2-лиганду или олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере приблизительно 20-80 оснований), сконструированных для идентификации представляющего интерес гена или белка, кодируемого им. Скрининг кДНК-библиотеки или геномной библиотеки выбранным зондом может проводиться с использованием стандартных процедур, таких как процедуры, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Альтернативным способом для выделения гена, кодирующего Аро-2-лиганд, является использование ПЦР-методологии [Sambrook et al., выше; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Mannual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Фрагменты аминокислотной последовательности или варианты Аро-2-лиганда могут быть получены введением подходящих нуклеотидных изменений в ДНК Аро-2-лиганда или синтезом желаемого полипептида Аро-2-лиганда. Такие фрагменты или варианты представляют собой инсерции, замены и/или делеции остатков внутри или в одном или обоих концах внутриклеточного района, трансмембранного района или внеклеточного района, или аминокислотной последовательности, показанной для полноразмерного Аро-2-лиганда на фиг.1. Любая комбинация инсерции, замены и/или делеции может быть произведена для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает, например, желаемой биологической активностью, такой как апоптотическая активность, как определено здесь. В предпочтительном варианте осуществления, эти фрагменты или варианты имеют по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 90% идентичность последовательности и, даже более предпочтительно, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с последовательностями, идентифицированными здесь, для внутриклеточного, трансмембранного или внеклеточного доменов Аро-2-лиганда или полноразмерной последовательности Аро-2-лиганда. Замены аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы Аро-2-лиганда, например, изменяя количество или положение сайтов гликозилирования или изменяя якорные свойства в отношении мембраны.

Вариации в последовательности Аро-2-лиганда, описанные выше, могут быть произведены с использованием любого из способов и руководств для консервативных и неконсервативных мутаций, приведенных в Патенте США с номером 5364934. Они включают в себя олигонуклеотид-опосредуемый (сайт-направленный) мутагенез, аланин-сканирование и ПЦР-мутагенез.

Сканирующий аминокислотный анализ может быть использован для идентификации одной или нескольких аминокислот вдоль непрерывной последовательности смежных аминокислот. Среди предпочтительных сканирующих аминокислот находятся относительно малые, нейтральные аминокислоты. Такие аминокислоты включают в себя аланин, глицин, серин и цистеин. Аланин является обычно предпочтительной сканирующей аминокислотой среди этой группы, так как он элиминирует боковую цепь после бета-углерода, и менее вероятно, что он изменяет конформацию основной цепи этого варианта. [Cunningham et al., Science, 244:1081 (1989). Аланин является обычно предпочтительным, так как он является наиболее часто встречающейся аминокислотой. Кроме того, его часто обнаруживают как в скрытом, так и в экспонированном положениях [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., NY); Chotia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)].

Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии со сходством в свойствах их боковых цепей (в A.L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., p.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) кислотные: Asp (D), Glu (E)

(4) основные: Lys (K), Arg (R), His (H).

Альтернативно, природно-встречающиеся остатки могут быть подразделены на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Вариации в последовательности Аро-2-лиганда также включены в объем этого изобретения в связи с амино-концевыми производными или модифицированными формами. Такие последовательности Аро-2-лиганда включают в себя любые из описанных здесь полипептидов Аро-2-лигандов, имеющие метионин или модифицированный метионин (например, формилметионил или другие блокированные метионильные молекулы) на N-конце этой полипептидной последовательности.

Нуклеиновая кислота (например, кДНК или геномная ДНК), кодирующая нативный или вариантный Аро-2-лиганд, может быть встроена в реплицируемый вектор для дополнительного клонирования (амплификации этой ДНК) или для экспрессии. Различные векторы являются публично доступными. Компоненты векторов включают в себя обычно, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих компонентов: сигнальную последовательность, сайт инициации репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции, каждый из которых описан ниже. Необязательные сигнальные последовательности, сайты инициации репликации, маркерные гены, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции, которые должны быть использованы, известны в данной области и описаны более подробно в WO97/25428.

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который узнается организмом-хозяином и функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты Аро-2-лиганда. Промоторы являются нетранслируемыми последовательностями, расположенными слева (5') относительно стартового кодона структурного гена (обычно в пределах приблизительно 100-100 п.н.), и эти промоторы регулируют транскрипцию и трансляцию конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, такую как последовательность нуклеиновой кислоты Аро-2-лиганда, с которой они функционально связаны. Такие промоторы обычно делятся на два класса, индуцируемые и конститутивные. Индуцируемые промоторы являются промоторами, которые инициируют увеличенные уровни транскрипции из ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение в условиях культивирования, например, присутствие или отсутствие нутриента или изменение температуры. В настоящее время известно большое количество промоторов, узнаваемых различными потенциальными хозяевами. Эти промоторы функционально связывают с кодирующей Аро-2-лиганд ДНК выделением этого промотора из источника ДНК расщеплением рестриктазой и встраиванием этой выделенной последовательности промотора в данный вектор. Как промоторная последовательность нативного Аро-2-лиганда, так и многие гетерологичные промоторы могут быть использованы для управления амплификацией и/или экспрессией ДНК Аро-2-лиганда.

Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами, известны в данной области и описаны более подробно в WO97/25428.

Предпочтительный способ получения растворимого Аро-2L в E. coli использует индуцируемый промотор для регуляции экспрессии продукта. Применение контролируемого, индуцируемого промотора делает возможным рост культуры до желаемой плотности клеток перед индукцией экспрессии продукта и накоплением значительных количеств продукта, которые могут плохо переноситься хозяином.

Заявители оценивали несколько индуцируемых промоторных систем (полимеразу Т7, trp и щелочной фосфатазы (АР)) для экспрессии Аро-2L (формы 114-281). Применение каждого из этих трех промоторов приводило к значительным количествам растворимого, биологически активного тримера Аро-2L, извлекающегося из собранной пасты клеток. Промотор АР является предпочтительным среди этих трех испытанных индуцируемых промоторных систем, так как в этой собранной клеточной пасте достигались более тесный промоторный контроль и более высокие плотность и титры клеток.

Конструирование подходящих векторов, содержащих один или несколько перечисленных выше компонентов, использует стандартные способы лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, приспосабливают подходящим образом и повторно лигируют в форме, желаемой для генерирования требуемых плазмид.

Для анализа с целью подтверждения правильных последовательностей в сконструированных плазмидах, смеси лигирования могут быть использованы для трансформации штамма 294 E. coli К12 (АТСС 31446) отбора успешных трансформантов по устойчивости к ампициллину или тетрациклину, когда это требуется. Из этих трансформантов получают плазмиды, анализируют их расщеплением рестрикционными эндонуклеазами и/или секвенируют с использованием стандартных способов, известных в данной области [См., например, Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)].

Могут быть использованы экспрессирующие векторы, которые обеспечивают транзиторную (временную) экспрессию в клетках млекопитающих ДНК, кодирующей лиганд Аро-2. Обычно, транзиторная экспрессия включает в себя использование экспрессирующего вектора, который способен эффективно реплицироваться в клетке-хозяине, так что эта клетка-хозяин накапливает много копий этого экспрессирующего вектора и, в свою очередь, синтезирует высокие уровни желаемого полипептида, кодируемого этим экспрессирующим вектором [Sambrook et al., выше]. Транзиторные системы экспрессии, содержащие подходящий экспрессирующий вектор и клетку-хозяина, делают возможной удобную положительную идентификацию полипептидов, кодируемых клонированными ДНК, а также быстрый скрининг таких полипептидов на желаемые биологические или физиологические свойства. Таким образом, системы транзиторной экспрессии особенно применимы в этом изобретении для целей идентификации (обнаружения) аналогов и вариантов лиганда Аро-2, которые являются активным лигандом Аро-2.

Другие способы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу лиганда Аро-2 в культуре рекомбинантных клеток позвоночных, описаны в Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantel et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117060 и ЕР 117058.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии этой ДНК в описанных здесь векторах включают в себя прокариоты, дрожжи или высшие эукариотические клетки. Подходящие прокариоты для этой цели включают в себя, но не ограничиваются ими, эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, такие как Enterobacteriaceae, например, Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigellla, а также Bacilli, такие как Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (например, Bacillus licheniformis 41Р, описанный в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 года), Pseudomonas, такой как Р. аeruginosa, и Streptomyces. Предпочтительно, эта клетка-хозяин должна секретировать минимальные количества протеолитических ферментов.

Кроме прокариот, эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для кодирующих лиганд Аро-2 векторов. Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного лиганда Аро-2 получают из многоклеточных организмов. Примеры всех таких клеток-хозяев, в том числе клетки СНО, описаны дополнительно в WO97/25428.

Клетки-хозяева трансфицируют и предпочтительно трансформируют вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами для лиганда Аро-2 и культивируют в питательных средах, модифицированных, если необходимо, для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.

Трансфекцией называют поглощение экспрессирующего вектора клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются или не экспрессируются фактически какие-либо кодирующие последовательности. Специалисту с обычной квалификацией в данной области известны многочисленные способы трансфекции, например, использующие CaPO₄ и электропорацию. Успешную трансфекцию обычно распознают, когда в клетке-хозяине имеет место любое указание на функционирование этого вектора.

Трансформация означает введение ДНК в организм таким образом, что эта ДНК является реплицируемой, либо в виде внехромосомного элемента, либо в виде составляющего элемента хромосомы (хромосомного интегранта). В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию выполняют с использованием стандартных способов, подходящих для таких клеток. Обработку кальцием с использованием хлорида кальция, описанную в Sambrook et al., выше, или электропорацию используют обычно для прокариот или других клеток, которые содержат существенные барьеры в виде клеточных стенок. Инфицирование Agrobacterium tumefaciens используют для трансформации некоторых клеток растений, как описано Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) и в WO 89/05859, опубликованной 29 июня 1989 года. Кроме того, растения могут быть трансфицированы с использованием обработки ультразвуком, как описано в WO 91/00358, опубликованной 10 января 1991 года.

Для клеток млекопитающих без таких клеточных стенок может быть использован способ осаждения фосфатом кальция Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Общие аспекты трансформаций систем клеток-хозяев млекопитающих были описаны в Патенте США № 4399216. Трансформации в дрожжи обычно проводят в соответствии со способом Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Однако могут также использоваться другие способы введения ДНК в клетки, такие как ядерная микроинъекция, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками, или поликатионы, например, полибрен, полиорнитин. В отношении различных способов для трансформации клеток млекопитающих см. Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Прокариотические клетки, используемые для получения лиганда Аро-2, могут культивироваться в подходящих культуральных средах, как описано в общем виде в Sambrook et al., выше. Конкретные формы культуральных сред, которые могут быть использованы для культивирования E. coli, описаны дополнительно в примерах ниже. Клетки-хозяева млекопитающих, используемые для получения лиганда Аро-2, могут культивироваться в различных культуральных средах.

Примеры коммерчески доступных культуральных сред включают в себя Ham's F10 (Sigma), минимальную эссенциальную среду ( MEM , Sigma), среду RPMI-1640 (Sigma) и модифицированную по способу Дульбекко среду Игла ( DMEM , Sigma). Любая такая среда может быть дополнена, если необходимо, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид или фосфат натрия, кальция, магния), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как лекарственное средство Гентамицин ), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки могут быть также включены в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Культуральные условия, как температура, рН и пр., соответствуют условиям, использованным ранее при культивировании клеток-хозяев выбранных для экспрессии, и также известны специалистам.

В общем, принципы, протоколы и практические способы для максимизации продуктивности культур клеток млекопитающих могут быть найдены в Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Согласно одному аспекту данного изобретения один или несколько ионов двухвалентных металлов обычно добавляют или включают в культуральную среду для культивирования или ферментирования клеток-хозяев. Эти ионы двухвалентных металлов предпочтительно присутствуют или добавляются к культуральной среде при уровне концентраций, достаточном для повышения стабильности при хранении, повышения растворимости или облегчения образования тримеров Apo-2L, координированных одним или несколькими ионами цинка. Количество ионов двухвалентных металлов, которое может быть добавлено, будет зависеть, отчасти, от плотности клеток-хозяев в этой культуре или потенциальной чувствительности клеток-хозяев к таким ионам двухвалентных металлов. При более высоких плотностях клеток-хозяев в культуре может быть полезным увеличение концентрации ионов двухвалентных металлов. Если ионы двухвалентных металлов добавляют во время или после экспрессии продукта клетками-хозяевами, могут быть желательными коррекция или увеличение концентрации ионов двухвалентных металлов, когда экспрессия клетками-хозяевами увеличивается. Обычно считается, что следовые уровни ионов двухвалентных металлов, которые могут присутствовать в обычных общедоступных средах для культивирования клеток, могут быть недостаточными для образования стабильного тримера. Таким образом, добавление дополнительных количеств ионов двухвалентных металлов, описанное здесь, является предпочтительным.

Ионы двухвалентных металлов предпочтительно добавляют в культуральную среду в концентрациях, которые не оказывают вредного или отрицательного влияния на рост клеток-хозяев, если ионы двухвалентных металлов добавляют во время фазы роста клеток-хозяев в культуре. В культурах во встряхиваемых колбах наблюдали, что ZnSO₄, добавленный при концентрациях, больших, чем 1 мМ, может приводить к меньшей плотности клеток-хозяев. Специалистам с квалификацией в данной области понятно, что бактериальные клетки могут эффективно изолировать ионы металлов образованием комплексов ионов металлов с клеточными матриксами. Таким образом, в культурах клеток предпочтительно добавлять выбранные ионы двухвалентных металлов после фазы роста (после достижения желаемой плотности клеток-хозяев) или непосредственно перед экспрессией продукта этими клетками-хозяевами. Для гарантии того, что присутствуют достаточные количества ионов двухвалентных металлов, дополнительные ионы двухвалентных металлов могут добавляться или подаваться в культуральную среду клеток во время фазы экспрессии продукта.

Концентрация ионов двухвалентных металлов в культуральной среде не должна превышать концентрацию, которая может быть вредной или токсичной для клеток-хозяев. В способах этого изобретения, использующих в качестве клетки-хозяина E. coli, предпочтительно, чтобы концентрация ионов двухвалентных металлов в культуральной среде не превышала приблизительно 1 мМ (предпочтительно 1 мМ). Даже более предпочтительно, концентрация ионов двухвалентных металлов равна приблизительно 50 мкМ - приблизительно 250 мкМ. Наиболее предпочтительно, ионом двухвалентного металла, используемым в таких способах, является ион сульфата цинка. Желательно добавлять ионы двухвалентных металлов в культуру клеток в количестве, при котором эти ионы металла и тример лиганда Аро-2 могут присутствовать в молярном отношении 1:1.

Ионы двухвалентных металлов могут быть добавлены к клеточной культуре в любой приемлемой форме. Например, может быть приготовлен раствор иона металла с использованием воды, и этот раствор ионов двухвалентных металлов может затем добавляться или подаваться в культуральную среду.

Экспрессия Аро-2L может быть измерена в пробе непосредственно, например, общепринятым блоттингом по Саузерну, Нозерн-блоттингом для количественного определения транскрипции мРНК [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], дот-блоттингом (анализом ДНК) или гибридизацией in situ, с использованием подходящим образом меченого зонда, на основе обеспеченных здесь последовательностей. Могут быть использованы различные метки, наиболее часто радиоизотопы, и, в частности, ³²Р. Однако могут быть также использованы другие способы, такие как применение биотин-модифицированных нуклеотидов для введения в полинуклеотид. Затем биотин служит в качестве сайта для связывания с авидином или антителами, которые могут быть помечены большим разнообразием меток, таких как радионуклеотиды, флуоресцирующие молекулы или ферменты. Альтернативно, могут быть использованы антитела, которые могут узнавать специфические дуплексы, в том числе ДНК-дуплексы, РНК-дуплексы и гибридные ДНК-РНК-дуплексы или ДНК-белок-дуплексы. Эти антитела, в свою очередь, могут быть мечеными, и этот анализ может проводиться, когда этот дуплекс связан с поверхностью, так что после образования дуплекса на этой поверхности может быть детектировано присутствие антитела, связанного с этим дуплексом. Альтернативно, экспрессия гена может быть измерена иммунологическими способами, такими как иммуногистохимическое окрашивание срезов клеток или ткани и анализ культуры клеток или жидкостей тела для непосредственного количественного определения экспрессии продукта гена. В случае способов иммуногистохимического окрашивания готовят пробу клеток, обычно дегидратацией и фиксацией, с последующей реакцией с мечеными антителами, специфическими в отношении связанного продукта гена, где эти метки обычно могут детектироваться визуально, такие как ферментные метки, флуоресцентные метки, люминесцентные метки и т.п.

Антитела, применимые для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа проб жидкостей, могут быть либо моноклональными, либо поликлональными и могут быть получены у любого животного. Предпочтительно, эти антитела могут быть получены против полипептида природного лиганда Аро-2 или против синтетического пептида на основе ДНК-последовательностей, обеспеченных здесь, или против экзогенной последовательности, слитой с ДНК лиганда Аро-2 и кодирующей специфический эпитоп антитела.

Лиганд Аро-2 предпочтительно извлекают из культуральной среды в виде секретированного полипептида, хотя он может быть также извлечен из лизатов клеток-хозяев при получении непосредственно без секреторного сигнала. Если лиганд Аро-2 является мембраносвязанным, он может быть высвобожден из этой мембраны с использованием раствора подходящего детергента (например, Тритона Х-100), или его внеклеточный район может быть высвобожден ферментативным расщеплением.

При продуцировании лиганда Аро-2 в рекомбинантной клетке, другой, чем клетка, происходящая из человека, лиганд Аро-2 не содержит белков или полипептидов, происходящих из человека. Однако обычно необходимо извлечь или очистить лиганд Аро-2 из белков или полипептидов рекомбинантной клетки для получения препаратов, которые являются по существу гомогенными в отношении лиганда Аро-2. В качестве первой стадии, культуральная среда или лизат могут быть центрифугированы для удаления состоящего из частиц клеточного дебриса (остатков клеток). После этого лиганд Аро-2 очищают от примесных растворимых белков и полипептидов с использованием следующих процедур, являющихся примерами подходящих процедур очистки: фракционированием на ионообменной колонке; осаждением этанолом; обращенно-фазовой ВЖХ; хроматографией на диоксиде кремния или на катионообменной колонке, такой как ДЭАЭ или СМ; хроматофокусированием; электрофорезом в ДСН-ПААГ; осаждением сульфатом аммония; гель-фильтрацией с использованием, например, Сефадекса G-75; диафильтрации и колонок протеин А-Сефарозы для удаления загрязняющих веществ, таких как IgG.

В предпочтительном варианте осуществления, лиганд Аро-2 может быть выделен аффинной хроматографией. Фрагменты или варианты лиганда Аро-2, в которых остатки были делетированы, инсертированы или заменены, извлекают таким же образом, что и нативный лиганд Аро-2, с учетом любых существенных изменений в свойствах, вызванных этой вариацией. Например, получение лиганда Аро-2, слитого с другим белком или полипептидом, например, бактериальным или вирусным антигеном, облегчает очистку; для адсорбции этого слитого полипептида может быть использована иммуноаффинная колонка, содержащая антитело к этому антигену.

Ингибитор протеаз, такой как фенилметилсульфонилфторид (PMSF), также может быть применим для ингибирования протеолитической деградации во время очистки, и антитела могут быть включены для предупреждения роста случайных примесей. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что способы очистки, подходящие для нативного лиганда Аро-2, могут требовать модификации с учетом изменений в природе лиганда Аро-2 или его вариантов после экспрессии в культуре рекомбинантных клеток.

Во время любой из таких стадий очистки может быть желательным подвергание извлеченного Аро-2L действию раствора, содержащего ион двухвалентного металла, или действию материала очистки (такого как хроматографическая среда или хроматографический носитель), содержащего ионы одного или нескольких двухвалентных металлов. В предпочтительном варианте осуществления ионы двухвалентных металлов и/или восстанавливающий агент используют во время извлечения или очистки Аро-2L. Необязательно, как ионы двухвалентных металлов, так и восстанавливающий агент, такой как DDT или BME, могут быть использованы во время извлечения или очистки Аро-2L. Считается, что использование ионов двухвалентных металлов во время извлечения или очистки будет обеспечивать стабильность тримера Аро-2L, образуемого во время стадии культивирования клеток.

Приведенное ниже описание также относится к способам получения лиганда Аро-2, ковалентно присоединенного (далее «конъюгированного») к одной или нескольким химическим группам. Химические группы, подходящие для использования в конъюгате Аро-2L данного изобретения, предпочтительно не являются значимо токсичными или иммуногенными. Эту химическую группу необязательно выбирают для получения конъюгата Аро-2L, который может храниться и использоваться в условиях, подходящих для хранения. Разнообразные примерные химические группы, которые могут быть конъюгированы с полипептидами, известны в данной области и включают в себя, например, углеводы, такие как углеводы, которые природно встречаются на гликопротеинах, полиглутамат и небелковые полимеры, такие как полиолы (см., например, патент США № 6245901).

Полиол, например, может быть конъюгирован с полипептидами, такими как Аро-2L, при одном или нескольких аминокислотных остатках, в том числе остатках лизина, как описано в WO 93/00109, выше. Используемым полиолом может быть любой водорастворимый поли(алкиленоксидный) полимер, и он может иметь линейную или разветвленную цепь. Подходящие полиолы включают в себя полиолы, замещенные в одном или нескольких положениях гидроксила химической группой, такой как алкильная группа, имеющая один-четыре атома углерода. Обычно этим полиолом является поли(алкиленгликоль), такой как поли(этиленгликоль) (ПЭГ), и, следовательно, для облегчения описания, остальное обсуждение относится к примерному варианту, в котором используемым полиолом является ПЭГ, и процесс конъюгирования полиола с полипептидом называется «пэгилированием». Однако специалистам с квалификацией в данной области понятно, что и другие полиолы, такие как, например, поли(пропиленгликоль) и сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленголиколя, могут быть использованы с использованием способов конъюгации, описанных здесь для ПЭГ.

Средняя молекулярная масса ПЭГ, используемого в пэгилировании Аро-2L, может варьироваться и обычно может находиться в диапазоне приблизительно 500 - приблизительно 30000 дальтон (Да). Предпочтительно, средняя молекулярная масса этого ПЭГ равна приблизительно 1000 - приблизительно 25000 Да и, более предпочтительно, приблизительно 1000 - приблизительно 5000 Да. В одном варианте осуществления, пэгилирование проводят с ПЭГ, имеющим среднюю молекулярную массу приблизительно 1000 Да. Необязательно, этот гомополимер ПЭГ является незамещенным, но может быть также замещен на одном конце алкильной группой. Предпочтительно, эта алкильная группа является (С₁ -С₄)алкильной группой и, более предпочтительно, метильной группой. Препараты ПЭГ являются коммерчески доступными и обычно препараты ПЭГ, подходящие для использования этого изобретения, являются негомогенными препаратами, продаваемыми в соответствии со средней молекулярной массой. Например, коммерчески доступные препараты ПЭГ(5000) обычно содержат молекулы, которые слегка варьируются по молекулярной массе, обычно ±500 Да.

Лиганд Аро-2 этого изобретения может находиться в различных формах, например, в мономерной форме или тримерной форме (содержащей три мономера). Необязательно, тример Аро-2 будет пэгилирован таким образом, что молекула ПЭГ связана или конъюгирована с одним, двумя или с каждым из трех мономеров, которые составляют тримерный Аро-2L. В таком варианте осуществления, предпочтительно, чтобы используемый ПЭГ имел среднюю молекулярную массу приблизительно 1000 - приблизительно 5000 Да. Предполагается также, что тримеры Аро-2L могут быть «частично» пэгилированными, т.е. только один или два из трех мономеров, которые составляют этот тример, связаны или конъюгированы с ПЭГ.

Различные способы пэгилирования белков известны в данной области. Конкретные способы получения белков, конъюгированных с ПЭГ, включают в себя способы, описанные в Патенте США № 4179337, Патенте США № 4935465 и Патенте США № 5849535. Обычно этот белок ковалентно связан через один или несколько аминокислотных остатков этого белка с концевой реакционноспособной группой на полимере, в зависимости в основном от условий реакции, молекулярной массы этого полимера и т.д. Полимер с реакционноспособной группой (реакционноспособными группами) называют здесь активированным полимером. Эта реакционноспособная группа селективно взаимодействует со свободными амино- или другими реакционноспособными группами на этом белке. Полимер ПЭГ может быть связан с амино- или другой реакционноспособной группой на этом белке либо случайным образом, либо сайт-специфическим образом. Однако должно быть понятно, что тип и количество выбранной реакционноспособной группы, а также тип используемого полимера для получения оптимальных результатов будет зависеть от конкретного используемого белка или варианта белка, чтобы избежать реакции этой реакционноспособной группы со слишком многими особенно активными группами на этом белке. Поскольку может быть невозможным полностью избежать этого, обычно рекомендуется использовать приблизительно 0,1-1000 моль, предпочтительно 2-200 моль активированного полимера на моль белка, в зависимости от концентрации белка. Конечное количество активированного полимера на моль белка балансирует, чтобы поддерживать оптимальную активность при одновременной оптимизации, если это возможно, полупериода существования в кровотоке этого белка.

Кроме того, предполагается, что описанный здесь Аро-2L может быть также связан или слит с последовательностями «лейциновой молнии» с использованием способов, известных в данной области.

Здесь описаны также способы генерирования антител против рецептора гибели клеток. Антигеном для использования для получения антитела или для скрининга на антитело может быть, например, растворимая форма этого антигена или его части, содержащая желаемый эпитоп. Альтернативно или дополнительно, клетки, экспрессирующие этот антиген на их клеточной поверхности, могут быть использованы для генерирования антитела или для скрининга на антитело. Другие формы этого антигена, применимые для генерирования антитела, будут очевидными квалифицированным в данной области специалистам. Предпочтительно, этим антигеном является рецептор DR4 или DR5.

(i) Поликлональные антитела

Поликлональные антитела индуцируют предпочтительно в животных множественными подкожными (sc) или внутрибрюшинными (ip) инъекциями релевантного антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгировать этот релевантный антиген с белком, который является иммуногенным в подлежащем иммунизации виде, например, гемоцианином фиссуреллы, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизующего агента, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидного эфира (конъюгацией через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутарового альдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂ или R¹²N=C=NR, где R и R¹ являются различными алкильными группами.

Животных иммунизируют против этого антигена, иммуногенных конъюгатов или производных объединением, например, 100 мкг или 5 мкг этого белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекцией этого раствора внутрикожно во множественных местах. Спустя один месяц этих животных повторно иммунизируют 1/5-1/10 начального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожной инъекцией во множественных местах. Спустя 7-14 дней у животных берут кровь и сыворотку анализируют на титр антител. Бустер-иммунизацию животных проводили до тех пор, пока титр антител не выходил на плато. Животных повторно иммунизируют конъюгатом того же самого антигена, но конъюгированного с другим белком и/или через другой сшивающий реагент. Конъюгаты могут быть также получены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Для повышения иммунной реакции используют подходящим образом агрегирующие агенты, такие как квасцы.

(ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию являются идентичными, за исключением возможных природно-встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Таким образом, определение «моноклональные» указывает на природу этого антитела как не являющегося смесью дискретных антител.

Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (см., например, Патент США № 4816567).

В гибридомном способе мышь или другое подходящее хозяин-животное, такого как хомячок, иммунизируют, как описано здесь выше, для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Moniclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых, исходных клеток миеломы. Например, если исходные клетки миеломы не имеют фермента гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для этих гибридом обычно будет включать в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда), где эти вещества предотвращают рост HGPRT-недостаточных клеток.

Предпочтительными клетками миеломы являются клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильное продуцирование высокого уровня антитела отобранными антителопродуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как НАТ-среда. Среди них, предпочтительными миеломными клеточными линиями являются мышиные миеломные линии, такие как линии, произведенные из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, доступные из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 и X63-Ag8-653, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур, Manassas, Virginia USA. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек также были описаны для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p.51-64 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой растут гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против этого антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Аффинность связывания этих моноклональных антител может быть, например, определена анализом Скетчарда Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, эти клоны могут быть субклонированы процедурами лимитирующего разведения и выращены стандартными способами (Goding, Moniclonal Antibodies: Principles and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие культуральные среды для этой цели включают в себя, например, среды D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, эти гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей в организме животного.

Моноклональные антитела, секретируемые этими субклонами, отделяют подходящим образом от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на протеин А-Сефарозе, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую эти моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Эти гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения эта ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьян, клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в ином случае не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей это антитело, включают в себя Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

В следующем варианте осуществления, антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, генерированных с использованием способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных антител и антител человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. Последующие публикации описывают получение высокоаффинных (в диапазоне нМ) антител человека перетасовкой цепи (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids, Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы являются жизнеспособными альтернативами традиционным гибридомным способам получения моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

Эта ДНК может быть также модифицирована, например, заменой кодирующей последовательностью для константных доменов тяжелой и легкой цепей человека гомологичных мышиных последовательностей (Патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), или ковалентным присоединением к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности полипептида неиммуноглобулина.

Обычно такие полипептиды не-иммуноглобулина заменяют константные домены антитела или они заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность в отношении одного антигена, и другой антигенсвязывающий сайт, имеющий специфичность в отношении другого антигена.

(iii) Гуманизированные антитела

Способы гуманизации антител не человека были описаны в данной области. Предпочтительно, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки не человека часто называют «импортными» остатками, которые обычно берутся из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть по существу выполнена согласно способу Winter et al., (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) путем замены последовательностей гипервариабельного района у грызунов соответствующими последовательностями антитела человека. Таким образом, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (Патент США № 4816567), в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека, был заменен соответствующей последовательностью вида, не являющегося человеком. На практике, гуманизированные антитела являются обычно антителами человека, в которых некоторые остатки гипервариабельного района и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызуна.

Выбор вариабельных доменов человека как легкой, так и тяжелой цепей для использования в получении гуманизированных антител является очень важным для уменьшения антигенности. В соответствии с так называемом best-fit (наилучшим)-способом последовательность вариабельного домена антител грызуна подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем последовательность человека, которая является наиболее близкой к последовательности этого грызуна, берут в качестве каркасного района (FR) для этого гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Другой способ использует конкретный каркасный район, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же самый каркас может быть использован для нескольких других гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности в отношении этого антигена и других выгодных биологическых свойств. Для достижения этой задачи, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизированные антитела готовят способом анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны квалифицированным в данной области специалистам. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и изображают на дисплее возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Обследование этих дисплеев делает возможным анализ вероятной роли остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген. Таким путем могут быть выбраны остатки FR и комбинированы из реципиентных и импортных последовательностей таким образом, что достигается желаемая характеристика антитела, например, увеличенная аффинность в отношении антигена-мишени (антигенов-мишеней). Обычно остатки гипервариабельных районов непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание антител.

(iv) Антитела человека

В качестве альтернативы гуманизации могут быть генерированы антитела человека. Например, в настоящее время можно получить трансгенных животных (например, мышей, которые способны, после иммунизации, продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена района соединения (J_H) тяжелой цепи антитела в химерных мышах и мышах с зародышевой (эмбриональной) мутацией приводит к полному ингибированию эндогенного продуцирования антител. Перенесение ряда генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в таких мышей с зародышевой мутацией будет приводить к продуцированию антител человека после введения антигенов. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Патенты США с номерами 5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно, может быть использована технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) для получения антител и фрагментов антител человека in vitro, из репертуаров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов из неиммунизированных доноров. Согласно этому способу гены V-доменов антител клонируют в рамке считывания в ген либо большого, либо малого оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и выставляют в виде функциональных фрагментов антител на поверхности фаговой частицы. Поскольку эта нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, селекция на основе функциональных свойств этого антитела также приводит к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, этот фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Фаговый дисплей может выполняться в различных форматах; в отношении их обзора см., например, Johnson, Kevin S and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея могут использоваться несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили разнообразный ряд антиоксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Могут быть сконструированы репертуары V-генов из неиммунизированных людей-доноров, и антитела к разнообразному ряду антигенов (в том числе аутоантигенов) могут быть выделены по существу в соответствии со способами, описанными Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См. также Патенты США с номерами 5565332 и 5573905.

Антитела человека могут быть также генерированы in vitro активированными В-клетками (см. Патенты США 5567610 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

Были разработаны различные способы для получения фрагментов антител. Традиционно, эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Joutnal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут быть теперь получены непосредственно с использованием рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E. coli и химически связаны с образованием F(ab')₂ -фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидными квалифицированному практику. В других вариантах осуществления, предпочтительным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; Патент США № 5571894 и Патент США № 5587458. Этим фрагментом антитела может быть также «линейное антитело», например, описанное в Патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Биспецифические антитела

Биспецифические антитела являются антителами, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, F(ab') ₂-биспецифических антител).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где эти две цепи имеют различные специфичности (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Вследствие случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) образуют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка этой правильной молекулы, которую обычно выполняют с использованием стадий аффинной хроматографии, является трудоемкой, и выходы продукта являются низкими. Подобные процедуры описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Согласно другому подходу вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (антитело-антигенсвязывающие сайты) сливают с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Это слияние является предпочтительно слиянием с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирного района, СН2- и СН3-районов. Предпочтительно иметь первый константный район тяжелой цепи (СН1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из этих слияний. ДНК, кодирующие эти слияния тяжелой цепи иммуноглобулина, и, если желательно, легкую цепь иммуноглобулина встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает высокую гибкость в коррекции взаимных пропорций этих трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда неравные доли этих трех полипептидных цепей, используемые в этом конструировании, обеспечивают оптимальные выходы. Однако можно встраивать кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных долях приводит к высоким выходам или когда эти соотношения не имеют особого значения.

В предпочтительном варианте этого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и гибридной пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение этого желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в половине этой биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь отделения. Этот подход описан в WO 94/04690. В отношении дополнительных подробностей генерирования биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Согласно другому подходу, описанному в Патенте США № 5731168, может быть сконструирована граница между парой молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекаются из культуры рекомбинантных клеток. Эта предпочтительная граница содержит по меньшей мере часть С_Н3-домена константного домена антитела. В этом способе одна или несколько малых аминокислотных боковых цепей из границы первой молекулы антитела заменены более длинными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсирующие «впадины» идентичного или сходного размера относительно этих больших боковых цепей создаются на границе второй молекулы антитела заменой больших аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода этого гетеродимера в сравнении с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают в себя сшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в этом конъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела были предложены, например, для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых подходящих способов сшивания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980 вместе с рядом способов сшивания.

Способы генерирования биспецифических антител из фрагментов антител также были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены химическим связыванием. Brennan et al., Science, 229:81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992).

Различные способы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток также были описаны. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновых молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух разных антител слиянием генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области для образования мономеров и затем повторно окисляли для образования гетеродимеров антител. Этот способ может быть также использован для получения гомодимеров антител. Технология «диател», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечивала альтернативный механизм для образования биспецифических фрагментов антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен (V_H) тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом (V_L) легкой цепи линкером, который является слишком коротким для создания возможности спаривания между этими двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены V_H и V_L вынуждены спариваться с комплементарными доменами V_L и V_H другого фрагмента с образованием посредством этого двух антигенсвязывающих сайтов. Сообщалась также другая стратегия получения биспецифических фрагментов антител с использованием димеров одноцепочечных Fv (scFv). См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). Антитела с тремя или более антигенсвязывающими сайтами описаны в WO 01/77342 (Miller and Presta).

Антитело, используемое в этих способах или включаемое в описанные здесь изделия, необязательно конъюгируют с цитотоксическим агентом.

Химиотерапевтические агенты, применимые в генерировании таких конъюгатов антитело-цитотоксический агент, были описаны выше.

Конъюгаты антитела и одного или нескольких токсинов с малой молекулой, таких как калихеамицин, майтансин (патент США № 5208020), трихотен и СС1065, также обсуждаются здесь. В одном варианте осуществления этого изобретения, антитело конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтансина (например, приблизительно 1 - приблизительно 10 молекул майтансина на молекулу антитела). Майтансин может быть, например, превращен в May-SS-Me, который может быть восстановлен до May-SH₃ и подвергнут реакции с модифицированным антителом (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)) для генерирования конъюгата майтансиноид-антитело.

Альтернативно, это антитело конъюгируют с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Семейство калихеамициновых антибиотиков способно производить разрывы в двухцепочечной ДНК при субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, ^I, ₂ ^I, ₃ ^I, N-ацетил- ^I, PSAG и ^I ₁ (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993) и Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают в себя цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модесцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года.

Кроме того, в этом изобретении обсуждается антитело, конъюгированное с соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

Различные радиоактивные изотопы являются доступными для приготовления радиоконъюгированных антагонистов или антител. Примеры включают в себя At²¹¹ , I¹³¹, ¹²⁵I, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶ , Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P ³² и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты этого антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием различных агентов связывания бифункциональных белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). ¹⁴С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-DTPA) является примером хелатообразующего агента для конъюгации радионуклеотида с рассматриваемым антагонистом или антителом. См. WO 94/11026. Этот линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение этого цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, может быть использован кислотонеустойчивый линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметилсодержащий линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

Альтернативно, слитый белок, содержащий антитело и цитотоксический агент, может быть получен, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом.

Антитела данного изобретения могут быть также конъюгированы с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см. WO 81/01145) в активное противораковое средство. См., например, WO 88/07378 и патент США № 4975278.

Ферментный компонент таких конъюгатов включает в себя любой фермент, способный действовать на пролекарство таким образом, что оно превращается в его более активную, цитотоксическую форму.

Ферменты, которые применимы в способе этого изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, применимую для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, применимую для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндеаминазу, применимую для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые применимы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, применимые для превращения пролекарств, которые содержат D-аминокислотные заместители; расщепляющие углеводы ферменты, такие как -галактозидаза и нейраминидаза, применимые для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; -лактамазу, применимую для превращения лекарственных средств, дериватизованных -лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, применимые для превращения лекарственных средств, дериватизованных в их атомах аминного азота феноксиацетильной или фенилацетильной группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно, антитела с ферментативной активностью, также известные как «абзимы», могут быть использованы для превращения пролекарств этого изобретения в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим могут быть получены, как описано здесь, для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.

Ферменты этого изобретения могут быть ковалентно связаны с антителом способами, хорошо известными в данной области, такими как использование обсуждаемых выше гетеробифункциональных сшивающих реагентов. Альтернативно, слитые белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающий район антитела, связанный с по меньшей мере функционально активной частью фермента этого изобретения, могут быть сконструированы с использованием способов рекомбинантных ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).

Здесь обсуждаются другие модификации этого антитела. Например, это антитело может быть связано с одним из различных небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.

Для увеличения полупериода существования в сыворотке этого антитела в это антитело можно включать рецепторсвязывающий эпитоп спасения (в частности, фрагмент антитела), как описано, например, в патенте США 5739277. В данном контексте, термин «рецепторсвязывающий эпитоп спасения» относится к эпитопу Fc-района молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который является ответственным за увеличение in vivo периода полужизни в сыворотке этой молекулы IgG. Альтернативно или дополнительно, можно увеличивать или уменьшать полупериод существования в сыворотке изменением аминокислотной последовательности Fc-района антитела для генерирования вариантов с измененным связыванием FcRn. Антитела с измененным связыванием FcRn и/или полупериодом существования в сыворотке описаны в WO 00/42072 (Presta, L).

Композиции, содержащие агонисты рецептора гибели и ингибиторы EGFR, также обеспечены данным изобретением. Считается, что такие композиции будут особенно пригодными для хранения, а также для терапевтического введения. Эти композиции могут быть получены известными способами. Например, эти композиции могут быть получены посредством смены буфера на гель-фильтрационной колонке.

Обычно, в этой композиции используют подходящее количество фармацевтически приемлемой соли, для того чтобы сделать эту композицию изотоничной. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают в себя солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН этой композиции равен предпочтительно приблизительно 6 - приблизительно 9 и, более предпочтительно, приблизительно 7 - приблизительно 7,5. Лицам, квалифицированным в данной области, будет очевидно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от способа введения и концентраций агониста рецептора гибели и ингибитора EGFR.

Терапевтические композиции могут быть приготовлены смешиванием желаемых молекул, имеющих подходящую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных композиций, водных растворов или водных суспензий. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются предпочтительно нетоксичными в отношении реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают в себя буферы, такие как Трис, HEPES, PIPES, содержащий фосфат, цитрат и другие органические кислоты буфер; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (с менее чем 10 остатками) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN , PLURONICS или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Дополнительные примеры таких носителей включают в себя ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, динатрийгидрофосфат, калийгидрофосфат, хлорид натрия, коллоидальный диоксид кремния, трисиликат магнезии, поливинилпирролидон и вещества на основе целлюлозы. Носители для форм для местного введения или форм на основе гелей включают в себя полисахариды, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза или метилцеллюлоза, поливинилпирролидон, полиакрилаты, блоксополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и спирты древесного воска. Для всех введений используют подходящим образом общепринятые депо-формы. Такие формы включают в себя, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные формы, спреи для носа, сублингвальные таблетки и препараты пролонгированного высвобождения.

Композиции, подлежащие введению in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны до или после лиофилизации и воссоздания. Эта композиция может храниться в лиофилизированной форме или в растворе, если ее вводят системно. Если она находится в лиофилизированной форме, ее обычно готовят в комбинации с другими ингредиентами для воссоздания с подходящим разбавителем в момент использования. Примером жидкой композиции является стерильный, прозрачный, бесцветный не содержащий консервантов раствор, помещенный в однодозовый флакон для подкожной инъекции.

Терапевтические композиции обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное отверстие доступа, например, мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для гиподермической инъекции. Эти композиции предпочтительно вводят в виде повторяемых внутривенных (i.v.), подкожных (s.c.), внутримышечных (i.m.) инъекций или инфузий, или в виде аэрозольных композиций, подходящих для интраназальной или внутрилегочной доставки (в отношении внутрилегочной доставки см., например, ЕР 257956).

Описанные здесь молекулы могут также вводиться в форме препаратов пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают в себя полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие этот белок, причем эти матриксы находятся в виде имеющих сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают в себя сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), описанные Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) и Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (Патент США № 3773919, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), недеградируемый этилен-винилацетат (Langer et al., выше), деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как Lupron Depot (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988).

Агонисты рецептора гибели и ингибиторы EGFR, описанные здесь, могут быть использованы в различных терапевтических применениях. Среди этих применений находятся способы лечения различных раковых заболеваний. Диагностика у млекопитающих различных патологических состояний, описанных здесь, может выполняться квалифицированным в данной области специалистом. В данной области доступны способы диагностики, которые делают возможными, например, диагностику или детектирование рака или иммунного заболевания у млекопитающего. Например, рак может быть идентифицирован посредством способов, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, пальпацию, анализ крови, рентген, ЯМР и т.п. Связанные с иммунной системой заболевания могут быть также легко идентифицированы. В случае системной красной волчанки центральным медиатором заболевания является продуцирование аутореактивных антител к собственным белкам/тканям и последующее генерирование иммуноопосредованного воспаления. Многочленные органы и системы поражаются клинически, в том числе почка, легкое, скелетно-мышечная система, кожно-слизистая система, глаз, центральная нервная система, сердечно-сосудистая система, желудочно-кишечный тракт, костный мозг и кровь. Ревматоидный артрит (RA) является хроническим системным аутоиммунным воспалительным заболеванием, которое в основном включает в себя синовиальную оболочку (мембрану) множественных суставов с возникающим повреждением суставного хряща. Этот патогенез является зависимым от Т-лимфоцитов и ассоциирован с продуцированием ревматоидных факторов, аутоантител, направленных против собственного IgG, с возникающим образованием иммунных комплексов, которые достигают высоких уровней в суставной жидкости и крови. Эти комплексы в суставе могут индуцировать значительную инфильтрацию лимфоцитов и моноцитов в синовий и последующие значительные изменения синовиальной оболочки; суставное пространство/суставная жидкость инфильтрируются нейтрофилами. Пораженными тканями являются прежде всего суставы, часто симметричным образом. Однако встречается также внесуставное заболевание в двух основных формах. Одной формой является развитие внесуставных повреждений с развивающимся прогрессирующим заболеванием суставов и типичными повреждениями фиброза легких, васкулита и кожных язв. Второй формой внесуставного заболевания является так называемый синдром Фелти, который встречается поздно в ходе ревматоидного артрита, иногда после того как суставное заболевание стало бессимптомным, и включает в себя нейтропению, тромбоцитопению и спленомегалию. Это может сопровождаться васкулитом во множественных органах с образованием инфарктов, кожных язв и гангрены. Пациенты часто развиваются также ревматоидные узелки в ткани подкожного слоя, покрывающей пораженные суставы; поздняя стадия узелков имеет некротические центры, окруженные смешанным инфильтратом воспалительных клеток. Другие проявления, которые могут встречаться в RA, включают в себя: перикардит, плеврит, коронарный артериит, интерстициальный пневмонит с фиброзом легких, сухой кератоконъюнктивит и ревматоидные узелки.

Агонисты рецептора гибели и ингибиторы EGFR могут вводиться в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузией на протяжении некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, внутриоболочечным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Необязательно, введение может выполняться через инфузию при помощи мини-насоса с использованием различных коммерчески доступных устройств.

Эффективные дозы и схемы введения для введения агониста рецептора гибели могут быть определены эмпирически, и выполнения таких определений находятся в рамках квалификации в данной области. Могут использоваться однократные или множественные дозы. В настоящее время считается, что эффективная доза или количество агониста рецептора гибели, применяемого отдельно, может находиться в диапазоне приблизительно 1 мг/кг - приблизительно 100 мг/кг массы тела или более в день. Масштабирование доз между видами может выполняться способом, известным в данной области, например, как описано в Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).

При введении агониста рецептора гибели in vivo нормальные дозовые количества могут варьироваться от приблизительно 10 нг/кг до 100 мг/кг массы тела млекопитающего или более в день, предпочтительно приблизительно 1 мкг/кг/день - 10 мг/кг/день, в зависимости от способа введения. Руководство по конкретным дозам и способам доставки обеспечено в литературе; см., например, Патенты США с номерами 4657760; 5206344 или 5225212. Понятно, что различные композиции будут эффективными для различных соединений лечения и различных нарушений, что введение, нацеленное, например, на один орган или на одну ткань, может требовать доставки способом, отличающимся от введения в другой орган или другую ткань. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что доза агониста рецептора гибели, которая должна вводиться, будет очень варьироваться в зависимости, например, от млекопитающего, которое будет получать этот агонист рецептора гибели, способа введения и других лекарственных средств или терапевтических средств, вводимых этому млекопитающему.

В способах этого изобретения, когда ингибитором EGFR является рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело анти-EGFR, например, С225 (цетуксимаб) или АВХ-EGFR, используют обычно курс терапии приблизительно 1 - приблизительно 1000 мг/м²; в частности, приблизительно 60 - приблизительно 600 мг/м²; в частности, приблизительно 150 - приблизительно 500 мг/м² площади поверхности тела. В конкретном варианте осуществления используемый курс терапии состоит из ударной дозы приблизительно 400 мг/м² с последующей еженедельной поддерживающей дозой приблизительно 180-250 мг/м². В соответствии с конкретными вариантами осуществления пациенты получают инъекцию антитела в виде 4-недельного протокола с увеличением дозы, вводимой один раз в неделю, до 200 мг/м². Если болезнь стабилизируется, то может быть начат дополнительный 8-недельный курс. В способах рассматриваемого изобретения, для введения ингибиторов EGFR с малой молекулой, например, OSI-774 и ZD-1839, используют обычно курс терапии от приблизительно 1 до приблизительно 1000 мг/день. В одном конкретном варианте осуществления ингибитор EGFR с малой молекулой вводят в количестве приблизительно 10 - приблизительно 750 мг/день; приблизительно 50 - приблизительно 500 мг/день или приблизительно 100 - приблизительно 250 мг/день.

Предполагается, что и дополнительные терапии могут быть использованы в этих способах. Эти одна или несколько других терапий могут включать в себя, но не ограничиваются ими, введение лучевой терапии, цитокина (цитокинов), ингибирующего рост агента (ингибирующих рост агентов), химиотерапевтического агента (химиотерапевтических агентов), цитотоксического агента (цитотоксических агентов), ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов фарнезилкиназы ras, ингибиторов ангиогенеза и ингибиторов циклинзависимой киназы, которые известны в данной области и определены дополнительно подробно в разделе I выше.

Приготовление и схемы введения доз для химиотерапевтических агентов могут быть использованы в соответствии с инструкциями изготовителей или определены эмпирически квалифицированным врачом-практиком. Приготовление и схемы введения доз для такой химиотерапии описаны также в Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Химиотерапевтический агент может предшествовать введению варианта Аро-2L или следовать за вариантом Аро-2L или может предоставляться одновременно с ним.

Иногда может быть предпочтительным вводить также один или несколько цитокинов или ингибирующий рост агент.

Агонисты рецептора гибели и ингибиторы EGFR (и одна или несколько других терапий) могут вводиться совместно (одновременно) или последовательно. В конкретных вариантах осуществления, Аро2L/TRAIL и ингибитор EGFR вводят совместно. В другом варианте осуществления, Аро2L/TRAIL вводят перед введением ингибитора EGFR. В другом воплощении ингибитор EGFR вводят до введения EGFR. После введения обработанные in vitro клетки могут анализироваться. При обработке in vivo обработанное млекопитающее может быть подвергнуто мониторингу различными путями, хорошо известными квалифицированному врачу-практику. Например, опухолевые клетки могут быть испытаны патологическими способами для оценки некроза, или сыворотка может быть анализирована на реакции иммунной системы.

Изделие, такое как набор, содержащий агонисты рецептора гибели и ингибиторы EGFR, применимые в лечении описанных здесь нарушений, содержит по меньшей мере один контейнер и один ярлык. Подходящие контейнеры включают в себя, например, склянки, флаконы, шприцы и тест-пробирки. Эти контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Ярлык на контейнере или присоединенный к контейнеру, указывает, что эта композиция используется для лечения выбранного состояния. Это изделие может дополнительно содержать контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями для использования. Это изделие может также содержать контейнер с другим активным агентом, описанным выше.

Следующие примеры представлены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения каким-либо образом объема данного изобретения.

Все патентные и литературные ссылки, цитируемые в данной заявке, включены тем самым в качестве ссылки в их полном объеме.

ПРИМЕРЫ

Коммерчески доступные реагенты, приводимые в этих примерах, использовали в соответствии с инструкциями изготовителя, если нет других указаний. Источником клеток, идентифицированных в следующих примерах и во всем описании посредством номеров доступа АТСС, является Американская Коллекция Типовых Культур (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia).

Пример 1

Получение соединения формулы 4

Реакция:

В синтезе соединения формулы 4 использовали следующие материалы:

Материалы	Количество	Единицы	Эквиваленты/объемы
Соединение формулы 3	88,0	кг	1 эквивалент
Тионилхлорид	89,0	кг	2,5 эквивалентов
Диметилформамид	11	кг	0,5 эквивалента
Метиленхлорид	880,0	л	10 л/кг
Раствор 50% NaOH	по необходимости	л	1 эквивалент
Гептан	880,0	л	10 л/кг

Следующая процедура является примером процедуры для синтеза соединения формулы 4:

88,0 кг соединения формулы 3, 880,0 л метиленхлорида и 11,0 кг диметилформамида загружали в чистый, сухой, футерованный стеклом сосуд в атмосфере азота. 89 кг тионилхлорида добавляли к этой смеси при поддержании ее при температуре, меньшей, чем 30°С, во время загрузки. Затем содержимое этого реакционного сосуда нагревали в течение минимально пяти часов при температуре дефлегмации перед взятием пробы на завершение реакции и рН доводили до величины, поддерживаемой между 7,0-8,0, с использованием 50% NaOH, по мере необходимости, и температуру реакционной смеси поддерживали при температуре, меньшей, чем 25°С. Эту двухфазную смесь перемешивали в течение пятнадцати - двадцати минут и давали ей осадиться в течение по меньшей мере тридцати минут. Слои разделяли и органический слой концентрировали до 1/3 его объема удалением метиленхлорида. Добавляли 880 л гептана с непрерывной дистилляцией остающегося метиленхлорида, пока дистиллят не достигал температуры 65-68°С. Затем эту смесь охлаждали до 10-15°С на протяжении часов и гранулировали в течение по меньшей мере 1 часа с выделением твердых веществ фильтрованием и промывали 220 л гептана. Твердые вещества (соединение формулы 4) сушили над безводным сульфатом натрия в вакуумной сушилке при 45-50°С.

Пример 2

Альтернативное получение соединения формулы 4

В реакции, показанной в примере 1, может быть успешно использован бикарбонат натрия вместо гидроксида натрия, как показано в этом примере.

Материалы	Количество	Единицы	Эквиваленты/объемы
Соединение 3	30,0	кг	1 эквивалент
Тионилхлорид	36,4	кг	3 эквивалентa
Диметилформамид	3,75	кг	0,5 эквивалента
Метиленхлорид	300	л	10 л/кг
Раствор 50% NaOH	по необходимости	л
Гептан	375	л	12,5 л/кг
Гептан (промывка)	90	л	3л/кг
Бикарбонат натрия	64,2	кг	7,5 эквивалентов

30,0 кг соединения формулы 3, 300,0 л метиленхлорида и 3,75 кг диметилформамида загружали в чистый, сухой, футерованный стеклом сосуд в атмосфере азота.

36,4 кг тионилхлорида добавляли к этой смеси при поддержании ее при температуре, меньшей, чем 30°С, во время загрузки. Затем содержимое этого реакционного сосуда нагревали при температуре дефлегмации в течение 13 часов перед взятием пробы на завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до 20-25°С и добавляли медленно к перемешиваемому раствору бикарбоната натрия 64,2 кг и воды 274 л, охлажденному до 4°С, так что температура поддерживалась при температуре, меньшей, чем 10°С. Конечный рН этой смеси доводили до диапазона 7,0-8,0 с использованием 50% раствора гидроксида натрия, по мере необходимости. Эту двухфазную смесь перемешивали в течение пятнадцати - двадцати минут и давали ей осадиться в течение по меньшей мере тридцати минут при 10-20°С. Слои разделяли и органический слой концентрировали до 1/3 его объема удалением метиленхлорида. Добавляли 375 л гептана с непрерывной дистилляцией остающегося метиленхлорида, пока дистиллят не достигал температуры 65-68°С. Затем эту смесь охлаждали до 0-5°С на протяжении 4 часов и гранулировали в течение по меньшей мере 1 часа с выделением твердых веществ фильтрованием и промывали 90 л гептана. Твердые вещества (соединение формулы 4) сушили над безводным сульфатом натрия в вакуумной сушилке при 50°С.

Пример 3

Получение соединений 6 и 2 (стадия 2)

Реакция:

Следующие материалы использовали в синтезе соединения формулы 6, в качестве промежуточного продукта, и соединения формулы 2:

Материалы	Количество	Единицы	Эквиваленты/объемы
Соединение 5	61,1	кг	1,2 эквивалента
Толуол	489	л	8 л/кг (WRT относительно соединения 5)
Шарики NaOH	4,5	кг	0,16 эквивалента
Ускоритель фильтрования	0,5	кг	0,017 кг/кг (WRT относительно соединения 5)
Соединение 4	90,8	кг	1,0 эквивалент
Ацетонитрил	732	л	12 л/кг (WRT относительно соединения 5)

Следующая процедура является примером процедуры для синтеза соединения формулы 2 и промежуточного соединения формулы 6:

61,1 кг соединения формулы 5, 4,5 кг шариков гидроксида натрия и 489 л толуола загружали в чистый, сухой реакционный сосуд в атмосфере азота и температуру реакции доводили до 105-108°С. Ацетон удаляли на протяжении четырех часов дистилляцией при атмосферном давлении при одновременном добавлении толуола для поддержания минимального объема 6 л растворителя на кг соединения формулы 5. Затем эту реакционную смесь нагревали при температуре дефлегмации с возвратом дистиллятов в сосуд до завершения этой реакции. Затем смесь охлаждали до температуры 20-25°С, после чего суспензию 40,0 л толуола и 0,5 кг ускорителя фильтрования загружали в эту реакционную смесь и эту смесь перемешивали в течение десяти-пятнадцати минут. Полученный материал фильтровали для удаления ускорителя фильтрования и фильтровальный осадок промывали 30 л толуола (соединение формулы 4).

Фильтрат (соединение формулы 6) помещали в чистый, сухой реакционный сосуд в атмосфере азота и 90,8 кг соединения формулы 4 загружали в этот реакционный сосуд вместе с 732 л ацетонитрила. Реакционный сосуд нагревали до температуры дефлегмации и хорошо перемешивали. Скорость мешалки уменьшали при появлении тяжелых твердых веществ. После завершения этой реакции содержимое реакционного сосуда охлаждали в течение трех-четырех часов примерно до температуры 25°С, а затем перемешивали по меньшей мере в течение одного часа при температуре 20-25°С. Затем твердые вещества (соединение формулы 2, форма полиморфа А или смесь полиморфа А и В) выделяли фильтрованием и фильтровальный осадок промывали двумя порциями по 50 л ацетонитрила и сушили в вакууме при температуре 40-45°С.

Было обнаружено, что образование полиморфа А является преимущественным при уменьшении количества ацетонитрила относительно толуола и особенно преимущественным при добавлении изопропанола вместо ацетонитрила. Однако использование изопропанола или других спиртов в качестве сорастворителей является неблагоприятным вследствие склонности к образованию простой эфирной связи между кислородом спирта и углеродом 4 хиназолина, вместо желаемой этинилфениламиногруппы.

Кроме того, было обнаружено, что доведение рН этой реакции до рН 1 - рН 7, особенно до рН 2 - рН 5, например, до рН 2,5 - рН 4, например, до рН 3, будет улучшать скорость этой реакции.

Пример 4

Перекристаллизация соединения формулы 2 (которое может быть в форме полиморфа А или смеси полиморфов А и В) в полиморф В (Стадия 3)

Реакция:

Следующие материалы использовали в превращении полиморфа А (или смеси полиморфов А и В) в полиморф В соединения формулы 2:

Материалы	Количество	Единицы	Эквиваленты/объемы
Полиморф А (соединение 2)	117,6	кг	1 эквивалент
2В-этанол	1881,6	л	16 л/кг
Вода	470,4	л	4 л/кг

Следующая процедура является примером процедур, используемых для превращения полиморфа А (или смеси полиморфов А и В) в более термодинамически стабильный полиморф В соединения формулы 2:

117, 6 кг полиморфа А (или смеси полиморфов А и В) загружали в чистый, сухой реакционный сосуд вместе с 1881,6 л 2В-этанола и 470,4 л воды в атмосфере азота. Температуру доводили до температуры дефлегмации (~80°С) и эту смесь перемешивали до растворения твердых веществ. Этот раствор охлаждали до 65-70°С и осветляли фильтрованием. При низкой скорости перемешивания этот раствор дополнительно охлаждали до 50-60°С на протяжении минимального времени 2 часов и осадок гранулировали в течение 2 часов при этой температуре. Эту смесь дополнительно охлаждали до 0-5°С на протяжении минимального времени 4 часа и гранулировали в течение минимального времени 2 часа при этой температуре. Твердые вещества (полиморф В) выделяли фильтрованием и промывали по меньшей мере 100 л 2В-этанола. Было определено, что эти твердые вещества являются кристаллической формой полиморфа В гидрохлорида [6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хианзолин-4-ил]-(3-этинилфенил)амина, по существу свободной от формы полиморфа А. Твердые вещества, полученные по этому способу, являются по существу гомогенными кристаллами полиморфа В, относительно формы полиморфа А. Этот способ позволяет получать полиморф В в количестве по меньшей мере 70 мас.%, по меньшей мере 80 мас.% по меньшей мере 90 мас.%, по меньшей мере 95 мас.% и по меньшей мере 98 мас.% относительно массы полиморфа А. Должно быть понятно, что описанные здесь способы являются только примерами и не предназначены для исключения вариаций в вышеуказанных параметрах, которые позволяют получать полиморф В в варьирующих грануляциях и выходах в соответствии с желаемыми применениями хранения, манипулирования и приготовления этого соединения. Эти твердые вещества сушат в вакууме при температуре ниже 50°С и полученный продукт размалывают с получением полиморфа В в подходящей для применения форме.

Полиморф В проявляет порошковую рентгенограмму, имеющую характерные пики, выраженные в 2-тета (2 ) при приблизительно 6,26, 12,48, 13,39, 16,96, 20,20, 21,10, 22,98, 24,46, 25,14 и 26,91.

Пример 5

Анализ экспрессии рецептора Аро2L/TRAIL и EGFR в клеточной линии Н460

Для испытания экспрессии на поверхности клеток рецепторов Аро2L/TRAIL (DR4, DR5) и EGFR в линиях клеток немелкоклеточного рака легкого человека линию клеток Н460 (АТСС) анализировали при помощи FACS с использованием моноклональных антител, специфических в отношении DR4 (mAb 4Н6.17.8; АТСС НВ-12455), DR5 (mAb 3Н3.14.5; НВ-12534) и EGFR. Эти клетки либо предобрабатывали Tarceva , Taxol®, либо, альтернативно, клетки не получали предобработки, как указано на фиг.4. Диаграмма в виде столбцов на фиг.4 иллюстрирует соответствующие уровни экспрессии рецептора.

Пример 6

Действия Аро2L/TRAIL, Tarceva или комбинированной обработки на рост раковых клеток in vitro

Серийные разведения клеток Н460, SKMES1, G142 и Н332Т выполняли в 96-луночных планшетах для культуры ткани (Falcon). Действия лиганда Аро-2 (аминокислоты 114-281, описанные в РСТ US00/17579) и Tarceva испытывали, как описано на фиг.5А-5D. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Краситель Аламаровый синий (Trek Diagnostic Systems, Inc.) добавляли в эти лунки в течение последних 3 часов 24-часового периода инкубации. Флуоресценцию считывали с использованием 96-луночного флоурометра с возбуждением при 530 нм и испусканием 590 нм. Результаты выражали в относительных единицах флуоресценции (RFU). Для анализа данных использовали 4-параметрическую программу построения кривой (Kaleidagraph).

Результаты этих биоанализов показаны на фиг.5А-5D.

Пример 7

Действие Аро2L/TRAIL, Tarceva или комбинированной обработки на рост опухолевых ксенотрансплантатов in vivo

Мышей инъецировали подкожно клетками Н460 немелкоклеточного рака легких (АТСС) (5 миллионов клеток на мышь). Затем мышей делили на 6 групп исследования (6 мышей на группу) и обрабатывали носителем, Tarceva (Genentech, Inc.), Аро2L.0 (полипептид Аро2L/TRAIL, состоящий из аминокислот 114-281 фиг.1 (см. Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)) или их комбинациями, как показано на фиг.6. Опухоли в обработанных носителем мышах росли быстро, тогда как обработка Аро2L/TRAIL и Tarceva заметно задерживала рост опухоли.