новые стероидные соединения, обладающие повышенной растворимостью в воде и устойчивостью к метаболизму, и способы их приготовления

Формула изобретения

1. Соединение, выбранное из группы, включающей:

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он,

3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол,

3 -этенил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол,

3 -фтор-5 -прегнан-20-(R)-ол,

3 -фтор-5 -прегнан-20-(S)-ол,

3 -фтор-5 -прегнан-20-он,

3 -фтор-5 -прегнан-20-(R)-ол,

3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол,

3 -этинил-3 -ацетил-5 -прегнан-20-он,

3 -этинил-2 -гидроксил-5 -прегнан-20-она оксим,

3 -фтор-5 -прегнан-20-она оксим, и

3 -фтор-5 -прегнан-20-она оксим.

2. Соединение, выбранное из группы, включающей

3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-он,

3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-она оксим, и

4,4'-диметил- 5-прегнен-3 ,20(R)-диол.

3. Соединение, выбранное из группы, включающей

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он,

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-она оксим, и

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он оксим.

4. Фармацевтическая композиция для модулирования передачи сигнала рецептора ГАМК, которая содержит фармацевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-3 или 3 -этинил-3 -гидрокси-17-оксо-5 -андростан или 3 -фтор-5 -прегнан-20-он, и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Применение соединения по любому из пп.1-3 или 3 -этинил-3 -гидрокси-17-оксо-5 -андростана или 3,3-гидрокси-5 -андростан-17-она или 3 -фтор-5 -прегнан-20-она для получения фармацевтической композиции, предназначенной для облегчения, предотвращения или лечения расстройства ЦНС.

6. Способ облегчения, предотвращения или лечения расстройств ЦНС, отличающийся тем, что пациенту вводят соединение по любому из пп.1-3 или 3 -фтор-5 -прегнан-20-он.

7. Способ получения 3-этинил-замещенного стероида, содержащего кетонный фрагмент в положении 20 или 17, по любому из пп.1-3, включающий приведение соответствующего 3-гидроксилзамещенного стероида в контакт с реактивом Гриньяра, в отсутствие разрушения кетогруппы, находящейся в положении 17 или 20 молекулы.

8. Способ получения замещенного стероида, содержащего оксимный фрагмент в положении 20, 21 или 17, по любому из пп.1-3, включающий приведение соответствующего 3-замещенного стероида в контакт с хлоргидратом NH₂OH и ацетатом натрия в отсутствие разрушения кетогруппы, находящейся в положении 17, 21 или 20 молекулы.

9. Способ получения 3-фторзамещенного стероида, содержащего кетонный фрагмент в положении 20 или 17, по любому из пп.1-3, включающий приведение соответствующего стероида в контакт с DAST ((Диэтиламино)-трифторидом серы), в отсутствие разрушения кетогруппы, находящейся в положении 17 или 20 молекулы.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым стероидным соединениям, которые воздействуют на комплекс ионофорного хлорида и рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК_А-R), и которые могут быть использованы для лечения нарушений центральной нервной системы (ЦНС), связанных с ГАМК и ГАМК-стероидами, и/или вызванных стероидами нарушений центральной нервной системы.

СУЩЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Метаболиты прогестерона, дезоксикортикостерона, тестостерона, андростендиона кортизона и кортизола, известные как андростанолоны и прегнанолоны, неоднократно подвергали различным исследованиям, которые по меньшей мере частично выявили их действие в нейрологической сигнальной системе млекопитающих. Поскольку в данной области техники зачастую используют различные номенклатуры соединений, то в настоящем описании повсеместно будет использована номенклатура IUPAC. Все стероиды, вызывающие нарушения и расстройства ЦНС, рассматриваемые в настоящем описании, имеют одну общую особенность, а именно они содержат 3 -гидроксигруппу, 5 - или 5 -прегнан-стероидную основу и кетонную группу в положении 20. Примеры таких стероидов приведены в Таблице 1.

Таблица 1
Номенклатура прегнанолоновой группы
Номенклатура IUPAC	Номер CAS
3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он	516-54-1
3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он	128-20-1
3 ,21-дигидрокси-5 -прегнан-20-он	567-02-2
3 ,21-дигидрокси-5 -прегнан-20-он	567-03-3
3 ,11 ,17 ,21-тетрагидрокси-5 -прегнан-20-он	53-02-1
3 -11 ,17 ,21-тетрагидрокси-5 -прегнан-20-он	302-91-0
3 -17 ,21-тригадрокси-5 -прегнан-11,20-дион	547-77-3
3 -17 ,21-тригидрокси-5 -прегнан-11,20-дион	53-05-4

Насколько известно авторам настоящего изобретения все соединения, описываемые в настоящем описании и примерах как новые, не были описаны ранее. Тем не менее, другие стероиды, применяемые для лечения нарушений ЦНС, были описаны, например, в следующих документах.

В заявках США U.S. 5232917 (Bolger et al.) и U.S. 5925630; 5939545; 6143736; 6277838 (Upasani et al.) описан ряд 3 -гидроксистероидов и несколько 3 -стероидов. В этих патентах рассмотрена агонистическая модуляция рецептора ГАМК-А. Другими словами, содержание этих патентов в основном посвящено 3 -гидроксистероидам и их воздействию, подобному действию бензодиазепина. Общей особенностью строения всех стероидов, являющихся модуляторами рецептора ГАМК-А, является наличие 3 -гидроксигруппы.

В заявке WO 99/45931 (Bäckström и Wang) описано антагонистическое действие одного из стероидов, а именно 3 -ОН-5 -прегнан-20-она, но антагонистическое действие стероидов, описанных в этой заявке, не раскрыто.

В заявке WO 03/059357 (Bäckström et al.) описаны некоторые 3-бета-гидроксистероиды и их антагонистическое воздействие на рецептор ГАМК-А, но антагонистическое действие стероидов, описанных в этой заявке, не раскрыто.

Антагонистическое действие 3 -ОН-5 -прегнан-20-он и других 3 -ОН-5 / -прегнанстероидов описано Wang et al. (Wang M.D., Bäckström Т., Landgren S. (2000) "The inhibitory effects of allopregnanolone and pregnanoloneon the population spike, evoked in the rat hippocampal CA1 stratum pyramidale in vitro, can be blocked selectively by epiallo-pregnanolone", Acta. Physiol. Scand. 169, 333-341; Wang M., He Y., Eisenman L.N., Fields C., Zeng C.M., Mathews J. et al., "3 -hydroxypregnane steroids are pregnenolone sulfate-like ГАМК(А) receptor antagonists", J. Neurosci. 2002; 22(9):3366-75). В указанных статьях описано зависящее от дозы антагонистическое действие 3 -ОН-5 / -прегнанстероидов и сульфатированных стероидов. Тем не менее, соединения, рассматриваемые в настоящем описании, в этих публикациях не упомянуты.

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии и направлено на получение соединений и композиций, пригодных для модуляции возбудимости головного мозга млекопитающего посредством воздействия на комплекс ионофорного хлорида и рецептора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК _А-R) и через другие системы нейромедиаторов (нейротрансмиттеров), которые как непосредственно, так и опосредованно, связаны с комплексом ГАМК_А-R. Было показано, что различные стероидные молекулы оказывают заметное воздействие на модуляцию и стимуляцию сигнализации через ГАМК, проявляя тем самым различное физиологическое воздействие. Было показано, что стероиды, включающие компоненты 3 -гидрокси-5 / -прегнан-20-она, специфично усиливают действие рецептора ГАМК-А {гамма-аминомасляной кислоты (А)}. Благодаря этим свойствам, эти природные стероиды, вырабатываемые при стрессе или связанные с половой функцией, также способны оказывать отрицательное воздействие и вызывать некоторые нарушения. Отрицательное воздействие 3 -гидрокси-прегнан-20-он-стероидов лежит в основе некоторых негативных воздействий ЦНС, вызываемых этими стероидами. Примеры соединений, оказывающих отрицательное воздействие, представляют собой 3 -гидрокси-5 / -прегнанолоновые стероиды, перечисленные в Таблице 1. Некоторые из указанных стероидов обладают очень мощным действием и, например, было показано, что высокая фармакологическая доза этих стероидов способна вызывать анестезию.

Поскольку 3 -гидроксипрегнанстероиды вырабатываются эндогенно и представляют собой метаболиты стероидных гормонов, необходимые для поддержания жизнедеятельности, то их выработка не может быть прекращена простым способом. Эти стероиды вырабатываются в большом количестве в течение периода времени, составляющего от нескольких суток до нескольких недель, при остром или хроническом стрессе, лютеиновой фазе менструального цикла и во время беременности. Они также вырабатываются в мозгу. Таким образом, в качестве терапевтических средств необходимо использовать специфичные блокаторы.

Ранее было показано, что некоторые 3 -гидроксипрегнанолоновые стероиды могут блокировать негативные эффекты в мозгу, возникающие в результате отрицательного влияния стероидов, вырабатываемых при стрессе и в результате половой функции. Недостатком ранее обнаруженных соединений является то, что они легко подвергаются метаболизму внутри организма, претерпевая превращения в критическом положении - 3 молекулы, и что они плохо растворимы в водном растворе.

Из-за высокой сложности комплекса ГАМК_А-R точный механизм его воздействия на участок рецептора в настоящее время еще недостаточно изучен. Семейство рецепторов ГАМК включает несколько сочетаний субъединиц; известно, что некоторые из них связаны со специфическими функциями и нарушениями ЦНС. Таким образом, одна из задач настоящего изобретения состоит в нахождении новых соединений, которые можно использовать для лечения аномалий в возбудимости рецепторов ГАМК или других нейромедиаторов, связанных с рецепторами ГАМК, оказывая общее или специфичное воздействие на некоторые сочетания субъединиц или функции. Нарушения, вызываемые эндогенно вырабатываемыми 3 -гидрокси-5 -стероидами или 3 -гидрокси-5 -стероидами через рецептор ГАМК-А, хорошо охарактеризованы и изучены. Также известно, что 3 -гидрокси-5 / -стероиды могут вызывать толерантность по отношению к самим себе и подобным им соединениям после некоторого периода их воздействия, и что после прекращения действия 3 -гидрокси-5 / -стероидов возникает синдром отмены. Этот тезис более подробно рассмотрен ниже.

Заболевания, вызываемые 3 -гидрокси-прегна(е)н-стероидами

a) Непосредственное воздействие

Установлено, что 3 -гидрокси-5 / -стероиды могут непосредственно вызывать ингибирование функций ЦНС. Примеры нарушений и симптомов, вызываемых непосредственным воздействием 3 -гидрокси-5 / -стероидов, включают предменструальное дисфорическое расстройство, предменструальный синдром, слабоумие, болезнь Альцгеймера, седативный эффект, утомляемость, синдром хронической усталости, нарушение памяти, нарушение способности к обучению, нарушение моторной функции, переломы, неуклюжесть, повышение аппетита и постоянный голод, ожирение, развитие негативного настроения, включающего напряжение, раздражительность, депрессию, понижение зрения и слуха, ухудшение малых эпилептических припадков, синдром выгорания.

b) Толерантность

Продолжительное и непрерывное воздействие 3 -гидрокси-5 / -стероидов вызывает нарушение функционирования системы рецепторов ГАМК-А. Развивается толерантность, и эта толерантность представляет собой начальный этап процесса, который в конечном итоге приводит к чувствительности к стрессу, затруднениям в концентрации, потере контроля над побуждениями и депрессии. Было обнаружено, что воздействие 3 -гидрокси-5 / -стероидов представляет собой фактор, который усиливает наркотическую зависимость. Это послужило основой для широкомасштабных исследований.

c) Синдром отмены

Непрерывное, но более короткое воздействие 3 -гидрокси-5 / -стероидов приводит к синдрому отмены после прекращения воздействия. Это явление наступает, например, во время менструации, когда прерывается выработка 3 -гидрокси-5 / -стероидов желтым телом яичников. Указанный синдром отмены также наступает после родов (post partum), после того, как прекращается выработка 3 -гидрокси-5 / -стероидов плацентой. То же явление отмечается по окончании периода стресса. Во время стресса, в качестве ответной реакции на стрессогенное воздействие, надпочечники вырабатывают 3 -гидрокси-5 / -стероиды. По окончании этого процесса могут возникнуть симптомы синдрома отмены. Примеры состояний, на которые влияет синдром/состояние отмены, включают парциальную эпилепсию, при которой в коре головного мозга пациента возникает эпилептический очаг, и в период отмены при менструации наступает ухудшение состояния. Это явление называется «менструальной эпилепсией». Другие примеры включают связанные с менструальным циклом мигрени и мигрени, связанные со стрессом, смену настроения post partum и «головную боль по выходным». Синдром отмены представляет собой указание на развившуюся ранее толерантность.

Ввиду вышесказанного, очевидно, что стероиды являются важными потенциальными медикаментами. Тем не менее, стероиды, встречающиеся в природе, подвергаются интенсивному метаболизму, и, таким образом, непригодны для перорального введения. При других способах введения также наблюдается интенсивный метаболизм, что не позволяет использовать указанные соединения в качестве медикаментов и лекарственных средств, поскольку в первую очередь в организме метаболически разрушается активная часть соединений.

Вторая проблема, присущая стероидным соединениям, состоит в том, что они плохо растворяются в водных растворах и, следовательно, их трудно вводить in vivo.

Эти и другие проблемы могут быть решены при использовании соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения синтезировали новые соединения, которые не подвергаются метаболизму в положении 3 стероидной молекулы. Неожиданно было обнаружено, что благодаря модифицированной структуре эти соединения также обладают повышенной растворимостью в воде. Не прибегая к какой-либо теории, авторы настоящего изобретения предполагают, что полезные свойства новых соединений объясняются присутствием двойной связи в стероидном ядре, а также заменой кетогруппы оксимом в положениях 20, 21 или 17 в остовах молекул, соответственно, прегнана, прегнена, андростана и андростена указанной серии.

В общем, известно, что 3 -гидрокси-дельта4-5,5 / -стероиды вызывают нарушения функций ЦНС посредством упомянутых выше трех механизмов: а) непосредственным воздействием, b) развитием толерантности, и с) эффектом отмены. Соединения, предлагаемые согласно примерам реализации настоящего изобретения, относятся к производным прегнана, прегнена, андростана и андростена, но имеют некоторые дополнительные полезные функциональные группы. Указанные соединения могут быть использованы как таковые или в виде пролекарств и/или в сочетании с составами и другими композициями, позволяющими модулировать и усиливать их воздействие на ЦНС. Композиции, предлагаемые согласно настоящему изобретению, включают все композиции, в которых соединения, предлагаемые согласно настоящему изобретению, содержатся в количестве, эффективном для оказания предполагаемого воздействия.

Насколько известно авторам настоящего изобретения, предлагаемые соединения представляют собой первые из описанных стероидных соединений, обладающих повышенной устойчивостью по отношению к метаболизму и повышенной растворимостью в воде. Кроме того, указанные вещества предложены для изготовления фармацевтических препаратов, предлагаемых для лечения многих специфических нарушений ЦНС, связанных с действием стероидов или вызываемых действием стероидов, и для использования в соответствии с такими способами лечения в соответствии с прилагаемой формулой изобретения, полностью включенной в настоящее описание.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к новым соединениям, защищенным от метаболических превращений и обладающим повышенной растворимостью в воде, а также способам получения указанных соединений, оказывающих антагонистическое и блокирующее воздействие на нарушения ЦНС, вызываемые 3 -гидрокси-прегна(е)н-стероидами. Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что стероиды, представленные Формулами I или II, могут воздействовать как модуляторы сигнализации рецептора ГАМК, оказывая агонистическое, антагонистическое или обратное агонистическое действие.

Авторы настоящего изобретения показали, что присутствие фрагмента третичного спирта в положении 3 увеличивает период полужизни стероидного соединения в организме за счет предотвращения метаболического окисления или разрушения соединения внутри организма. Наличие донорно-акцепторной группы, включающей водородную связь, связанной с ядром D стероидной молекулы, влияет на способность стероида модулировать сигнализацию рецепторов ГАМК.

Настоящее изобретение относится к новым стероидам, соответствующим Формулам I или II, и фармацевтически приемлемым производным, солям, пролекарствам или сольватам указанных соединений

в которых

R₁ выбран из группы, включающей этинил, этенил, этил или другие насыщенные или ненасыщенные алкильные группы; гидроксильную группу в несвязанном виде или в сочетании с остатками карбоновых кислот, сахарами, алкильными группами, с образованием сложных эфиров или простых эфиров или гликозилированных соединений; атом фтора или другого галогена; протон;

R₂ выбран из группы, включающей этинил, этенил, этил или другие насыщенные или ненасыщенные алкильные группы; гидроксильную группу в несвязанном виде или в сочетании с остатками карбоновых кислот, сахарами, алкильными группами, с образованием сложных эфиров или простых эфиров или гликозилированных соединений; атом фтора или другого галогена; протон;

R₃ представляет собой 5 - или 5 -Н;

R₄ представляет собой нитрогруппу, гидроксильную группу в несвязанном виде или связанную со сложным эфиром, простым эфиром, сахаром; и

R₅ представляет собой протон.

Согласно одному из примеров реализации настоящего изобретения, соединения представляют собой стероиды, соответствующие вышеуказанным Формулам I или II, и фармацевтически приемлемым производным, солям, пролекарствам или сольватам указанных соединений, в которых

R₄, R₅ представляет собой =О или N в виде оксима =NOH, или гомо- или гетероцикл;

R₆ представляет собой метил, алкильную группу или группу -CH ₂OR, в которой R представляет собой Н, остаток карбоновой кислоты, алкильную группу или сахар; группу -СН₂Х, в которой Х представляет собой атом фтора или другого галогена;

R₇, R₁₀ представляет собой ОН, СН₃ или Н в положении семь;

R ₈, R₉ или R₁₁, R₁₂ представляют собой две Ме-группы или Me- и Н соответственно, или два атома -Н.

Согласно одному из примеров реализации изобретения R₇, R₁₀ представляют собой ОН или СН ₃ в положении семь.

Согласно одному из примеров реализации настоящего изобретения, соединения представляют собой стероиды, соответствующие вышеуказанной Формуле I, или фармацевтически приемлемые соли указанных соединений, в которых R₁ представляет собой этинильную группу; гидроксильную группу в несвязанном виде или в сочетании с остатками карбоновых кислот; атом фтора; или протон; R₂ представляет собой этинильную группу; гидроксильную группу в несвязанном виде или в сочетании с остатками карбоновых кислот; атом фтора; или протон; R ₃ представляет собой 5 - или 5 -Н; R₄ представляет собой гидроксильную группу, и R₅ представляет собой протон, или R₄, R₅ вместе представляют собой О или N в виде оксима =NOH; R₆ представляет собой метильную группу; R ₇ представляет собой Н; и R₈, R₉ представляют собой метил или Н.

Согласно одному из примеров реализации настоящего изобретения, соединения представляют собой стероиды, соответствующие вышеуказанной Формуле II, или фармацевтически приемлемые соли указанных соединений, в которых R₁ представляет собой этинильную группу или гидроксильную группу; R₂ представляет собой этинильную группу или гидроксильную группу; R₃ представляет собой 5 - или 5 -Н; R₄ и R₅ вместе представляют собой О или N в виде оксима =NOH; R₁₀ представляет собой Н; и R₁₁, R₁₂ представляют собой Н.

Согласно одному из примеров реализации настоящего изобретения, между атомами С4-С5 или С5-С6 или в других положениях молекулы может присутствовать ненасыщенная связь. R₈ , R₉ или R₁₁, R₁₂ представляют собой две Ме-группы или Me- и Н соответственно, или два атома -Н, или, если указанная ненасыщенная связь находится между атомами С4-С5, то один из R₈, R₉ или R₁₁ , R₁₂ соответственно, представляет собой Me- или Н, в то время как другой из названных радикалов отсутствует. В соответствии с одним из аспектов указанного примера реализации, соединения представляют собой стероиды соответствующие вышеуказанной Формуле I, в которых R₁ представляет собой этинильную группу или гидроксильную группу; R₂ представляет собой этинильную группу или гидроксильную группу; R₃ отсутствует; R ₄ представляет собой гидроксильную группу; R₅ представляет собой протон; или R₄ и R₅ вместе представляют собой =O или N в виде оксима =NOH; R ₆ представляет собой метильную группу; R₇ представляет собой Н; и R₈, R₁₁ представляют собой метил или Н; и R₉, R₁₂ представляют собой метил, Н или, если указанная ненасыщенная связь находится между атомами С4-С5, отсутствует.

Соединения, соответствующие Формулам I и II, могут существовать в виде оптических изомеров; следовательно, изобретение охватывает все индивидуальные изомеры, которые могут быть разделены при помощи обычных хроматографических способов, а также других известных способов разделения, известных специалистам в данной области техники.

Настоящее изобретение также охватывает все функционально эквивалентные производные и пролекарства, в которых гидроксильные группы стероидов образуют сложные эфиры и простые эфиры. Неограничивающие примеры подходящих производных включают: сульфаты, форматы, ацетаты, пропионаты, соединения, гликозилированные сахарами или олигосахаридами, метилаты, этилаты. Специалисту в данной области техники известны и другие функциональные группы, не включенные в вышеуказанный список, но пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением.

В Таблицах 2 и 3 приведены примеры структур ряда соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению, в которых гидроксигруппа в положении 3 стероидной структуры прегнана, прегнена, андростана или андростена защищена от метаболических превращений по 3-положению этинильной, этенильной или ацетатной структурой, присоединенной к стероидной молекуле, или указанная гидроксильная группа замещена атомом фтора.

В Таблице 4 приведены примеры структур ряда соединений, имеющих повышенную растворимость в воде по сравнению с 5-насыщенным соединением (UC2024), растворимость в воде которых увеличена за счет введения в молекулу оксимной группы вместо кетогруппы или простой гидроксильной группы (UC2027, UC2029).

Времена удержания [мин] при проведении ЖХВР соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению

Условия проведения ЖХВР:

Система ЖХВР: (Waters) Column Symmetry^® C₁₈ 3,5 мкм 4.6×75 мм (Waters); T: 45°С; истечение 1,0 мл/мин; условия изократического элюирования 40:60 об./об. H ₂O:МеОН. Объем пробы: 100 мкл.

Для элюирования использовали растворители ЖХВР чистоты, воду фильтровали через устройство Millipore; все растворители перед использованием фильтровали через фильтр Millipore с размером пор, равным 0,45 мкм, и подвергали дегазации в токе N₂.

Так как анализы проводили хроматографией с обращенной фазой, более короткие времена удержания соответствовали более высокой гидрофильности соединений.

Таблица 5
Эталонные вещества:	Время удержания [мин]
3 -5 -прегнан-20-он	24,4
3 -5 -прегнан-20-он	30,0

Таблица 6
Соединения, предлагаемые согласно настоящему изобретению:	Время удержания [мин]
UC 2021	7,8
UC 2024	14,0
UC 2025	13,9
UC 2026	16,9

Как видно из Таблиц 5 и 6, времена удержания соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению, меньше, чем у эталонных соединений, т.е. соединения, предлагаемые согласно настоящему изобретению, обладают большей гидрофильностью по сравнению с эталонными соединениями.

Синтез, разделение и идентификацию соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению, могут быть выполнены с использованием операций, которые известны специалистам в данной области техники.

Неожиданным образом авторы настоящего изобретения обнаружили, что реакция этинильного реактива Гриньяра с 3, 20/17 дикетон-стероидами в большинстве случаев селективно проходит по положению 3, и при этом не требуется установка/снятие защиты на других кетонных группах. При этом образуются как -, так и -изомеры, которые могут быть разделены хроматографическими способам и перекристаллизацией.

Исходными материалами, применяемыми для получения соединений, согласно настоящему изобретению, являются соответствующие стероиды, имеющие 3-гидроксильный заместитель и кетогруппу в положениях 20 или 17. Они могут быть превращены в соответствующие дионы окислением IBX (2-Iodoxybenzoic acid, 2-йодоксибензойной кислотой). Реакция протекает гладко и завершается полным превращением. При необходимости в качестве исходных материалов могут быть использованы и другие подходящие стероиды.

Реакции проводят в подходящем растворителе, например метаноле, этаноле, воде, ТГФ, диэтиловом эфире, дихлорметане или других растворителях или смесях растворителей, которые специалист в данной области техники может признать подходящими.

Реактивы выбирают таким образом, который позволяет, если это возможно, избежать использования таких реагентов, как тяжелые металлы, которые токсичны даже в следовом количестве или которые трудно извлечь при проведении обычной обработки.

Реакции, включающие использование реагентов, чувствительных к воздуху или влаге, проводят в инертной атмосфере, например в газообразном азоте или аргоне, в присутствии сухих растворителей. Диэтиловый эфир и тетрагидрофуран сушат над Na в присутствии бензофенона. Шприцы, применяемые для переноса реактивов и сухих растворителей, предварительно продувают инертным газом. Оптимальные условия реакции, например время и температуру, определяют мониторингом образования продуктов и расходования исходного материала при помощи подходящей хроматографической методики, например ТСХ или ГХ/МС.

Очистку производят с использованием хроматографических методик, например флэш-хроматографией на колонке силикагеля или препаративной жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР) с использованием специальной аппаратуры для ЖХВР. Специалистам в данной области техники известны и альтернативные способы очистки, а также лабораторные хроматографические методики, которые могут быть адаптированы для использования в промышленном масштабе с применением хроматографических колонок, пригодных для крупномасштабного синтеза.

Идентификацию продуктов производят при помощи подходящих способов анализа, например 1Н-ЯМР, 13С-ЯМР, масс-спектрометрии, ИК спектроскопии и любых других аналитических способов, которые специалист в данной области техники может признать подходящими для структурной идентификации и определения чистоты соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению.

Преимущества соединений, предлагаемых согласно настоящему изобретению, помимо прочего включают защиту от метаболизма и лучшую растворимость в воде. Преимущества способа синтеза включают то, что он состоит из известных операций и, после раскрытия его описания, относительно легок в исполнении.

Ниже представлены примеры стероидов, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением. Приведенные примеры способов и композиций, предлагаемых согласно настоящему изобретению, носят иллюстративный, но не ограничивающий характер. Специалисту в данной области техники известно, что в зависимости от природы субстрата могут быть использованы другие аналогичные реагенты, растворители, условия и параметры. Данные ЯМР были получены на спектрометре Bruker при частоте 400 МГц.

ПРИМЕРЫ

Примеры соединений Формулы I

Пример 1: UC2016 - 3 -фтор-5 -прегнан-20-он

3 -ОН-5 -прегнан-20-он (3 ммол) растворили в 20 мл сухого дихлорметана в атмосфере N₂. К смеси медленно по каплям при комнатной температуре (к.т.) прибавили DAST (700 мг, 4.33 ммол), и полученный желтоватый раствор оставили перемешиваться при комнатной температуре (к.т.) в течение 1 часа. Протекание реакции отслеживали при помощи ТСХ. Раствор тушили медленным добавлением 5%-ного раствора NaHCO ₃ (60 мл). Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×20 мл), объединенные органические фазы сушили над MgSO₄ , и растворитель удаляли под уменьшенным давлением, получая желтоватое масло, которое очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (пентан: этилацетат 9:1). Получали продукты в следующем порядке: элиминирование Н₂О в положениях 2,3 (выход: 67%); фторирование по положению 3-ОН с инверсией конфигурации 30% (UC2016); фторирование по положению 3-ОН с сохранением конфигурации (3% - следы).

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl ₃-d₆): 4.57-4.37 (dm, 1H); 2.51 (t, 1H); 2.12 (m, 1H); 2.11 (s, 3H); 2.02-1.99 (m, 2H); 0.83 (s, 3H); 0.67 (m, 1H); 0.61 (s, 3H).

Пример 2: UC2018 - 3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он (0.3 ммол) растворили в растворе, содержащем 2 мл дихлорметана и 5 мл МеОН, при к.т., в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH₄ (2.1 equiv.), и суспензию оставили перемешиваться в течение 3 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 20+20 мл Н₂О и диэтилового эфира. Водную фазу экстрагировали 30 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединяли органические фазы, сушили над MgSO ₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белое твердое вещество очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), с общим количественным выходом. Продукт, имеющий (R)-конфигурацию при 20-С, был основным продуктом (90%), что было подтверждено данными ЯМР.

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 3.72 (m, 1H); 2.41 (s, 1H); 2.02 (m, 1H); 1.86 (2m, 2H); 1.12 (d, 3H); 0.80 (s, 3H); 0.74 (s, 3H).

Пример 3: UC2019 - 3 -этинил-5 -прегнан-20-она 3 -ацетат

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он (0.25 ммол) и пиридин (2 эквив.) растворили в сухом дихлорметане, после чего при к.т. в атмосфере азота добавили по каплям уксусный ангидрид (4 эквив.).

Смесь оставили перемешиваться при 40°С в течение трех суток. Темную смесь затушили добавлением 50 мл 10% HCl, затем промывали 10%-ным водным раствором NaHCO₃ (2×30 мл) до достижения рН=7. Органическую фазу собирали, сушили над MgSO₄ и концентрировали. Желтоватый остаток очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), получая целевой сложный эфир с 87% выходом.

1H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 2.60 (s, 1H); 2.51 (t, 1H); 2.45 (m, 1H); 2.11 (s, 3H); 2.03 (s, 3H); 0.82 (s, 3H); 0.60 (s, 3H).

Пример 4: UC2024 - 3 -этинил-3 -гидрокси- -4-прегнен-20-он

Прогестерон (1 ммол) растворили в 25 мл сухого ТГФ при к.т. в атмосфере азота. К смеси при перемешивании по каплям прибавили при к.т. этинилмагнийбромид (1.1 эквив.), и раствор оставили перемешиваться в течение ночи при к.т. в атмосфере азота. Желтоватый раствор затем тушили насыщенным NH₄ Cl_(aq), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×30 мл). Объединенные органические фазы испаряли под уменьшенным давлением, полученное желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO ₄. Раствор частично отгоняли под вакуумом, и остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), обычные выходы 30%.

¹ H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 5.32 (s, 1H); 2.51 (m, 2H); 2.14 (m, 2H); 2.11 (s, 3H); 1.05 (s, 3H); 0.64 (s, 3H).

Пример 5: UC2026 - 3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-она оксим 3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он

3,20-5 -прегнандион (1.580 г, 5.0 ммол) растворяли в 50 мл сухого ТГФ при к.т. в атмосфере азота. К смеси при перемешивании по каплям прибавили при к.т. этинилмагнийбромид (1.1 эквив.), и раствор оставляли перемешиваться в течение ночи при к.т. в токе азота. Желтоватый раствор затем тушили насыщенным NH₄ Cl(aq), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×30 мл). Объединенные органические фазы испаряли под уменьшенным давлением, полученное желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO ₄. Раствор частично отгоняли под вакуумом, и остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), обычные выходы 72%. Конечные следы побочных продуктов могут быть удалены последующей перекристаллизацией из диэтилового эфира.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃ -d₆): 2.51 (t, 1Н); 2.47 (s, 3H); 2.14 (m, 1H); 2.11 (s, 3H); 0.81 (s, 1H); 0.60 (s, 3H).

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он

Был получен в виде побочного продукта в описанной выше реакции и выделен флэш-хроматографией на колонке силикагеля. Типичный выход 13%. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 2.52 (t, 1H); 2.43 (s, 1H); 2.11 (s, 3H); 0.80 (s, 3H), 0.60 (s, 3H).

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-она оксим

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он (10 ммол) растворяли в 5 мл дихлорметана и 50 мл этанола при к.т. в атмосфере воздуха, в 250 мл круглодонной колбе. В 5 мл Н₂О растворяли 4 эквив. хлоргидрата NH₂OH и 4 эквив. ацетата натрия, и затем прибавили эту смесь к раствору стероида. Прибавили 20 мл этанола, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь затем охлаждали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Белый остаток затем обрабатывали 50 мл Н₂О и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 3×30 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы затем сушили над MgSO₄ , фильтровали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (дихлорметан: диэтиловый эфир 4:1), обычные выходы 95-100%.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d ₆): 2.47 (s, 1H); 2.22 (t, 1H); 2.05 (m, 1H); 1.88 (s, 3H); 1.86 (m, 1H); 0.81 (s, 3H), 0.62 (s, 3H).

Пример 6: UC2029 - 3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-она оксим

3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-он (10 ммол) растворяли в атмосфере воздуха в 5 мл дихлорметана и 50 мл этанола при к.т. в 250 мл круглодонной колбе. В 5 мл Н₂О растворяли 4 эквив. хлоргидрата NH₂OH и 4 эквив. ацетата натрия, и затем прибавили к раствору стероида. Прибавили 20 мл этанола, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь затем охлаждали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Белый остаток затем обрабатывали 50 мл Н₂О и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 3×30 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы затем сушили над MgSO₄, фильтровали и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (дихлорметан: диэтиловый эфир 4:1), обычные выходы 85%.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 5.32 (s, 1H); 2.51 (s, 1H); 2.19 (m, 2H); 2.06 (m, 1H); 1.88 (s, 3H); 2.03 (s, 3H); 1.05 (s, 3H); 0.65 (s, 3H).

Пример 7: UC2030 - 3 -фтор-5 -прегнан-20-она оксим 3 -фтор-5 -прегнан-20-он

3 -ОН-5 -прегнан-20-он (3 ммол) растворяли в 20 мл сухого дихлорметана в атмосфере N₂. К смеси медленно по каплям при -78°С прибавили DAST (700 мг, 4.33 ммол), и полученный желтоватый раствор оставили перемешиваться при к.т. в течение 1 часа. Протекание реакции отслеживали при помощи ТСХ. Раствор тушили осторожным добавлением 5%-ного раствора NaHCO₃ (60 мл). Водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×20 мл), объединенные органические фазы сушили над MgSO₄, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением, получая желтоватое масло, которое очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (пентан: этилацетат 9:1). Получали продукты в следующем порядке: элиминирование Н₂O в положениях 2,3 (выход: 67%); фторирование по положению 3-ОН с инверсией конфигурации 30%; фторирование по положению 3-ОН с сохранением конфигурации (3% - следы).

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 4.87-4.75 (d, 1H); 2.53 (t, 1H); 2.11 (s, 3H); 2.00 (m, 1H); 0.95 (m, 1H); 0.80 (m, 1H); 0.78 (s, 3H); 0.60 (s, 3H).

3 -фтор-5 -прегнан-20-она оксим

3 -фтор-5 -прегнан-20-он (10 ммол) растворяли в атмосфере воздуха в 5 мл дихлорметана и 50 мл этанола при к.т. в 250 мл круглодонной колбе. В 5 мл Н₂О растворяли 4 эквив. хлоргидрата NH₂OH и 4 эквив. ацетата натрия, и затем прибавляли к раствору стероида. Прибавили 20 мл этанола, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь затем охлаждали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Белый остаток затем обрабатывали 50 мл Н₂О и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 3×30 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы затем сушили над MgSO₄, фильтровали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (дихлорметан: диэтиловый эфир 4:1). Количественный выход.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 4.90-4.78 (d, 1Н); 2.26 (t, 1H); 2.10 (m, 1H); 1.90 (s, 3H); 0.98 (m, 1H); 0.82 (s, 3H); 0.65 (s, 3H).

Пример 8: UC2034 - 3 -фтор-5 -прегнан-20-она оксим

был получен в соответствии с протоколом синтеза Примера 7, для получения UC2030, из соответствующего изомера 3 -фтор-5 -прегнан-20-она в качестве исходного реагента.

Пример 9: UC2032 - 4,4'-диметил- 5-прегнен-3 ,20(R)-диол

4,4'-диметил- 5-прегнен-3,20-дион

525 мг прогестерона растворили в 10 мл сухого толуола при к.т. К раствору прогестерона при перемешивании и в атмосфере N₂ прибавили по каплям 3.4 мл (2 эквив.) 1.0 М раствора трет-бутилата натрия в сухом толуоле. Желтоватый раствор оставляли перемешиваться в течение 20 мин. Затем к смеси прибавили по каплям 2 эквив. MeI, и перемешивали в течение ночи при к.т. в атмосфере N₂.

Смесь тушили 10 мл воды и 10 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 2×30 мл дихлорметана. Органические фазы собирали, сушили над MgSO₄, растворитель удаляли под вакуумом, с получением желтоватого остатка, который очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан). Дальнейшую очистку целевой фракции осуществляли флэш-хроматографией на колонке силикагеля (1:9 этилацетат: пентан). Выход: 25%.

¹ Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 5.56 (m, 1H); 2.54 (m, 3H); 2.13 (s, 3H); 1.23 (s, 6H); 0.86 (s, 3H); 0.64 (s, 3H).

4,4'-диметил- 5-прегнен-3 ,20(R)-диол

91 мг 4,4'-диметил- 5-прегнен-3,20-диона растворяли в 3.0 мл дихлорметана и 15 мл МеОН при к.т. в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH₄ (2.1 эквив.), и суспензию оставили перемешиваться в течение 6 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 20+20 мл Н₂О и диэтилового эфира. Водную фазу экстрагировали 30 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединенные органические фазы сушили над MgSO₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белый твердое вещество очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), 95% выход.

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃ -d₆): 5.60 (m, 1Н); 3.75 (m, 1H); 3.26 (m, 1H); 2.09-2.13 (m, 2H); 1.18 (s, 6H); 1.21 (s, 3H); 1.10 (s, 3H); 0.80 (s, 3H).

Примеры, полученные на основе Формулы II

Пример 10: UC2021 - 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он

3,17-андростандион (5.0 ммол) растворяли в 50 мл сухого ТГФ при к.т. в атмосфере азота. К смеси при перемешивании и при к.т. по каплям прибавили этинилмагнийбромид (1.1 эквив.), и раствор оставили перемешиваться в течение ночи при к.т. в токе азота.

Раствор затем тушили насыщенным NH₄Cl(aq), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×30 мл). Объединенные органические фазы испаряли под уменьшенным давлением, полученное желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO₄. Раствор частично отгоняли под вакуумом, и остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), обычные выходы 65%. Конечные следы побочных продуктов могут быть удалены последующей перекристаллизацией из диэтилового эфира.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 2.47 (s, 1H); 2.42 (m, 1H); 2.10-2.04 (m, 2H); 1.02 (m, 1H); 0.86 (s, 3H); 0.83 (s, 3H).

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он

Был получен в виде побочного продукта в описанной выше реакции и выделен при помощи препаративной ЖХВР. Типичный выход 8%.

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 2.43 (s, 1H); 0.86 (s, 3H), 0.83 (s, 3H).

Пример 11: UC2025 - 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-она оксим

3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он (10 ммол) растворяли в атмосфере воздуха в 5 мл дихлорметана и 50 мл этанола при к.т. в 250 мл круглодонной колбе. В 5 мл H₂O растворяли 4 эквив. хлоргидрата NH₂OH и 4 эквив. ацетата натрия, и затем прибавляли к раствору стероида. Прибавили 20 мл этанола, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь затем охлаждали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Белый остаток затем обрабатывали 50 мл Н₂О и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали 3×30 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы затем сушили над MgSO₄ , фильтровали, и растворитель удаляли под уменьшенным давлением. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией на колонке силикагеля, дихлорметан: диэтиловый эфир 4:1, обычные выходы 95-100% (количественный).

¹Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d ₆): 2.56-2.41 (m, 2Н); 2.48 (s, 1Н); 1.87 (m, 2H); 1.00 (m, 1H); 0.80 (m, 1Н); 0.90 (s, 3Н), 0.83 (s, 3Н).

Пример 12: UC2027 - 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-она оксим

Названное соединение было получено в соответствии с прописью, приведенной для соединения UC2025, с применением 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-она в качестве исходного соединения; оно было получено в виде побочного продукта в реакции, описанной для синтеза соединения UC2021.

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆): 2.51-2.47 (m, 2H); 2.43 (s, 1Н); 1.00 (m, 1Н); 0.80 (m, 1Н); 0.90 (s, 3Н), 0.83 (s, 3Н).

Пример 13: UC2005 - 3 -этинил-3 -гидрокси 5 -прегнан-20-он

5 -прегнан-3,20-дион (200 мг, 0.63 ммол) растворили в 5 мл сухого ТГФ при к.т. в атмосфере азота. К смеси при перемешивании по каплям прибавили при к.т. этинилмагнийбромид (1.1 эквив.), и раствор оставили перемешиваться в течение ночи при к.т. в атмосфере азота. Желтоватый раствор затем тушили 10 мл насыщенного NH ₄Cl_(aq), и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×10 мл). Объединенные органические фазы испаряли под уменьшенным давлением, полученное желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали насыщенным солевым раствором и сушили над MgSO ₄. Раствор частично отгоняли под вакуумом, и остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), обычные выходы 72%. Возможные следы побочных продуктов могут быть устранены с помощью дальнейшей перекристаллизации из диэтилового эфира.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d₆): 2.51 (t, 1H); 2.48 (s, 1H); 2.11 (s, 3H); 0.97(s, 3H); 0.60 (s, 3H).

Пример 14: UC2007 - 3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он (26 мг, 0.08 ммол) растворили в растворе, содержащем 2 мл дихлорметана и 5 мл МеОН, при к.т., в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH ₄ (15 мг), и суспензию оставили перемешиваться в течение 3 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 5+5 мл Н₂О и диэтилового эфира. Водную фазу экстрагировали 20 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединяли органические фазы, сушили над MgSO₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белое твердое вещество очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), с общим количественным выходом. Продукт, имеющий (R)-конфигурацию при 20-С, был основным продуктом (90%), что было подтверждено данными ЯМР.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d₆): 3.72 (m, 1H); 2.48 (s, 1H); 2.03 (m, 2H); 1.13-1.14 (d, 3H); 0.97 (s, 3H); 0.74 (s, 3H).

Пример 15: UC2009 - 3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-диол

3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он (103 мг, 0.3 ммол) растворили в растворе, содержащем 2 мл дихлорметана и 5 мл МеОН, при к.т., в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH ₄ (60 мг), и суспензию оставили перемешиваться в течение 3 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 20 мл диэтилового эфира и 20 мл Н₂О. Водную фазу экстрагировали 30 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединяли органические фазы, сушили над MgSO₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белое твердое вещество очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир: дихлорметан), с общим количественным выходом. Продукты представляли собой 3 -этинил, 5 -прегнан-3 ,20диол и титульное соединение в соотношении 2.5:1 согласно данным ЯМР.

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃-d₆): 6.14-6.10 (dd, 1H); 5.33 (d, 1H); 5.17 (d, 1H); 3.76 (m, 1H); 2.04 (dt, 1H); 1.17 (d, 3H); 0.88 (s, 3H); 0.77 (s, 3H).

Пример 16: UC2013 - 3 -фтор-5 -прегнан-20(R)-ол

3 -фтор-5 -прегнан-20-он (0.3 ммол) растворили в растворе, содержащем 5 мл дихлорметана и 20 мл МеОН, при к.т., в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH₄ (84 мг), и суспензию оставили перемешиваться в течение 1.5 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 20 мл дихлорметана и 20 мл H₂ O. Водную фазу экстрагировали 30 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединяли органические фазы, сушили над MgSO ₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белое твердое вещество очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (элюент 1:9 этилацетат: пентан), с общим количественным выходом. Продукт, имеющий (R)-конфигурацию при 20-С, был основным продуктом (90%), что было подтверждено данными ЯМР.

¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃-d₆): 4.94-4.81 (dm, 1H); 3.73 (m, 1H); 1.13 (d, 3H); 0.97 (s, 1H); 0.74 (s, 3H).

Пример 17: UC2014 - 3 -фтор-5 -прегнан-20(S)-ол

Получили как побочный продукт синтеза UC2013. Отделяли сначала промывной колоночной хроматографией на силикагеле и затем препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией. Обычный выход 5-10%.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d₆): 4.93-4.81 (dm, 1H); 3.70 (m, 1H); 1.21 (d, 3H); 0.96 (s, 3H), 0.65 (s, 3H)

Пример 18: UC2017 - 3 -фтор-5 -прегнан-20(R)-ол

3 -фтор-5 -прегнан-20-он (322 мг, 1.0 ммол) растворили в растворе, содержащем 2 мл дихлорметана и 20 мл МеОН, при к.т., в колбе, имеющей отверстие для аэрации. Добавили за один прием NaBH ₄ (190 мг, 5 ммол), и суспензию оставили перемешиваться в течение 2 часов при к.т. Бесцветный раствор испаряли под вакуумом, получая белый остаток, который экстрагировали 20 мл дихлорметана и 20 мл H₂O. Водную фазу экстрагировали 30 мл дихлорметана: диэтилового эфира (1:1), объединяли органические фазы, сушили над MgSO₄, и растворители удаляли под вакуумом. Белое твердое вещество очищали промывной колоночной хроматографией на силикагеле (элюент 1:9 этилацетат: пентан), с общим количественным выходом. Продукт, имеющий (R)-конфигурацию при 20-С, был основным продуктом (90%), что было подтверждено данными ЯМР.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃-d₆): 4.86-4.74 (dm, 1H); 3.72 (m, 1H); 1.88 (m, 1H); 1.13 (d, 3H); 0.78 (s, 3H); 0.75 (s, 3H).

Пример 19: Действие анализируемых UC-стероидов в отношении ГАМК-стероида

Клетки HEK-293, перманентно трансфецированные генами 1 2 2 субъединиц ГАМК_А-рецепторов, экспрессирующие функциональный 1 2 2L ГАМК_А-рецептор.

На следующем этапе получали линии клеток согласно изобретению, экспрессирующие функциональный ГАМК(гамма-аминомасляная кислота)-А-рецептор. Субъединицы ГАМК-А рецептора 1 (308-1727 NM_000806), 2 (214-1679 NM_000813) и 2L (290-1785 NM_198904), включая встроенные последовательности Козака, расположенные непосредственно перед стартовыми кодонами, субклонировали в векторы экспрессии для клеток млекопитающих, содержащие гены устойчивости к генетицину, гигромицину В и зеоцину соответственно. Способ получения плазмид, применяемых при субклонировании разных субъединиц, описан в публикации Rahman, M, Borra, VB, Isaksson, M, Johansson, IM, Ragagnin, G, Bäckström, Т and Wang, MD Clin Exp Pharmacol Physiol 2008. PMID 18430052, Epub готовится к выходу в печать. Векторы экспрессии pcDNA 3.1+/Генетицин, pcDNA 3.1-/Гигромицин и pcDNA 3.1+/Зеоцин были приобретены у компании «Invitrogen».

Краткое описание применяемого способа. Кодирующие области генов субъединиц 1, 2 и 2L ГАМК-А рецептора при помощи рестриктаз EcoR I ( 1 и 2L) и Not I + ВаmН I ( 2) вырезали из плазмид, предварительно сгенерированных (Rahman et al., 2008) и очищенных. Указанные вырезанные области, кодирующие субъединицы, встраивали в векторы экспрессии для клеток млекопитающих pcDNA 3.1+/Генетицин ( 1), pcDNA 3.1-/Гигромицин ( 2) и pcDNA 3.1+/3еоцин, линеаризованные при помощи тех же рестриктаз, которые применяли для кодирующих областей. Посредством поочередной трансфекции субъединиц получили линию клеток HEK-293, стабильно экспрессирующую три субъединицы ГАМК-А-рецептора. Трансфекцию проводили с применением липофектамина и реагента DNA-Plus (оба от компании «Invitrogen»). Трансфекцию отслеживали путем селекции в средах с соответствующими антибиотиками, отделения клеток при помощи антител, обладающих специфичностью к субъединицам ( 2 и 2) и получения колоний из одиночных клеток. Получаемые линии клеток анализировали методом иммуноцитохимии на наличие трех указанных субъединиц ГАМК-А рецептора. Для концентрирования клеток применяли цитоцентрифугу. Применяли стандартный протокол ICC (Межведомственного координационного комитета) с вторичными антителами, меченными флюорофорами Texas red и Alexa flour 488. Затем клетки анализировали методом иммунофлуоресценции. В данном протоколе из приборов применяли цитоцентрифугу и флуоресцентный микроскоп для анализа наличия ожидаемых белков ГАМК-А рецептора. Когда получили стабильную линию клеток, выполняли избранный тест, чтобы показать функцию ГАМК-А рецептора при нормальной и хорошей реактивности по отношению к ГАМК и THDOC / Тетрагидродеоксикортикостерона.

Таблица 6
Действие анализируемых UC-стероидов с 3 / -этинил-, 3 / -гидроксильной группой в концентрации 1 мкМ, тестируемых в отношении ГАМК-стероида THDOC (3-альфа-гидрокси-5-альфа-прегнан-20-он-21-ол) в концентрации 200 нМ + ГАМК 30 мкМ, определяемые как поток хлорида через ГАМК-А-рецептор.
Стероид	Средний % (СОш.С) потока хлорида относительно 200 нМ THDOC + 30 мкМ ГАМК = 100%	Значимый эффект по сравнению с контролем 200 нМ THDOC + 30 мкМ ГАМК = 100%
UC2005; 3 -этинил-3 -гидрокси-5 -прегнан-20-он	+58,8(20,3)	Агонист
UC2007; 3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-прегнан	-35,8(14,5)	Антагонист
UC2018; 3 -этинил-5 -прегнан-3 ,20(R)-прегнан	-27,1(12,6)	Антагонист
UC2019; 3 -этинил-3 -ацетил, 5 -прегнан-20-он	+16,9(13,8)	Слабый агонист
UC2024; 3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-он	-19,5(7,7)	Антагонист
UC2029; 3 -этинил-3 -гидрокси- 4-прегнен-20-он-оксим	-15,8(5,5)	Антагонист
UC2021; 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он	-20,1(9,73)	Антагонист
UC2025; 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он-оксим	-19,3(6,9)	Антагонист
UC2027; 3 -этинил-3 -гидрокси-андростан-17-он-оксим	-22,8(25,7)	Антагонист
UC2032; 4,4'-диметил- 5-прегнен-3 20(R)-прегнан	+14.8(2,7)	Слабый агонист

Таблица 7
Действие анализируемых UC-стероидов с группой 3 / -фтор в концентрации 1 мкМ, тестируемых в отношении ГАМК-стероида THDOC (3-альфа-гидрокси-5-альфапрегнан-20-он-21-ол) в концентрации 200 нМ + ГАМК 30 мкМ, определяемые как поток хлорида через ГАМК-А-рецептор.
Стероид	Средний % (СОш.С) потока хлорида относительно 200 нМ THDOC + 30 мкМ ГАМК = 100%	Значимый эффект по сравнению с контролем 200 нМ THDOC + 30 мкМ ГАМК = 100%
UC2012; 3 -фтор-5 -прегнан-20-он	-0,73(2,6)	Нет эффекта
UC2013; 3 -фтор-5 -прегнан-20-(R)-ол	-20,9(23,8)	Антагонист
UC2014; 3 -фтор-5 -прегнан-20-(S)-ол	+10,7(18,3)	Нет эффекта / слабый агонист
UC2016; 3 -фтор-5 -прегнан-20-он	-31,4(1,8)	Антагонист
UC2017; 3 -фтор-5 -прегнан-20-(R)-ол	-14,8(6,8)	Слабый антагонист
UC2030; 3 -фтор-5 -прегнан-20-он-оксим	-20,2(3,3)	Антагонист
UC2034; 3 -фтор-5 -прегнан-20-он-оксим	+14,8(2,7)	Слабый агонист