глюкокортикоиды, присоединенные посредством ароматического линкера в положении 21 к нитроэфирам, и их применение в офтальмологии

Формула изобретения

1. Соединение формулы (I), или его соль, или стереоизомер



где R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)



R₃ представляет атом водорода или F и R₄ представляет F;

R₁, R ₂, R₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении или ;

R представляет

или

где Y выбран из:

1) -R₅-CH(ONO ₂)R₆,

2) -R₅-CH(ONO₂ )-(CR₇R₈)_n-CH(ONO₂ )R₉ или

3) -[(CH₂)_o-X] _p-(CH₂)_q-CH(ONO₂)R ₉,

где R₅ прямой или разветвленный C ₁-С₁₀алкилен;

R₆, R₇ , R₈, R₉ каждый представляет Н;

n - целое число от 0 до 6;

о - целое число от 1 до 6;

р - целое число от 1 до 6;

q - целое число от 0 до 6;

X представляет О, S или NR₁₀, где R ₁₀ - Н или С₁-С₄алкил; предпочтительно X представляет О;

за исключением соединений формулы (I), где R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)



R₄ представляет F и R₃ - атом водорода, и R является соединением формулы (III), где Y представляет - R₅-CH(ONO₂)R₆ и R₆ - Н.

2. Соединение по п.1, где R₄ представляет F, R₃ представляет F, R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы (II), R₁, R₂, R₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении .

3. Соединение по п.2, где Y представляет:

1) -R₅-CH(ONO₂)R₆,

где R₅ - прямой С₁-С₅алкилен и R ₆ - Н; или

2) -R₅-CH(ONO₂ )-(CR₇R₈)_n-CH(ONO₂ )R₉,

где R₅ - прямой С₁ -С₂алкилен, R₉, R₇ и R₈ представляют Н и n равно 0 или 1; или

3) - [(CH ₂)_o-X]_p-(CH₂)_q -CH(ONO₂)R₉,

где R₉ представляет Н,

о - целое число от 2 до 4,

р - целое число от 1 до 4,

q - целое число от 0 до 4 и X представляет О.

4. Соединение по п.1, где R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы

(II),

R₁ представляет F и R₃ - атом водорода, и

R₁, R₂, R ₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении .

5. Соединение по п.4, где Y представляет:

1) -R₅-CH(ONO₂)-(CR₇R₈ )_n-CH(ONO₂)R₉,

где R ₅ - прямой C₁-С₆алкилен,

R₉, R₇ и R₈ представляют Н;

n равно 0 или 1; или

2) -[(CH₂)_o -X]_p-(CH₂)_q-CH(ONO₂ )R₉,

где R₉ представляет Н,

о - целое число от 2 до 4,

р - целое число от 1 до 4,

q - от 0 до 4 и X представляет О.

6. Соединение по п.1, выбранное из

7. Соединение по любому одному из пп.1-6 для применения при лечении глазных заболеваний.

8. Соединение по п.7, где глазным заболеванием является диабетический отек желтого пятна, диабетическую ретинопатию, дегенерацию желтого пятна, возрастную дегенерацию желтого пятна и другие заболевания сетчатки и желтого пятна.

9. Применение соединения формулы (I), или его соли, или стереоизомера



при лечении глазных заболеваний,

где в формуле (I)

R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)

,

R₃ представляет атом водорода, R ₄ представляет F,

R₁, R₂ и R₄ присоединены к 17, 16 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении ;

R представляет



Y представляет -R₅-CH(ONO₂ )R₆ и R₆ представляет Н.

10. Применение соединения по п.9, где глазные заболевания включают диабетический отек желтого пятна, диабетическую ретинопатию, дегенерацию желтого пятна, возрастную дегенерацию желтого пятна и другие заболевания сетчатки и желтого пятна.

11. Применение соединения по п.9 или 10 формулы (18)



при лечении глазных заболеваний.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается нитрооксипроизводных стероидов, способов их получения, фармацевтических композиций, содержащих эти соединения, и способов применения этих соединений и композиций для лечения глазных заболеваний, в особенности диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна и других заболеваний сетчатки и желтого пятна. Сетчатка представляет собой область глаза, которая чувствительна к свету. Желтое пятно является областью сетчатки, которая позволяет нам читать и распознавать лица. Заболевания желтого пятна, такие как возрастная дегенерация желтого пятна и диабетический отек желтого пятна, являются главной причиной слепоты.

Для лечения этих заболеваний было исследовано множество лекарственных средств по их воздействию на расстройства, вызывающие слепоту. В настоящее время эти лекарственные средства доставляются в желтое пятно и сетчатку хирургическими методами, такими как интравитреальные (в стекловидное тело) или периорбитальные инъекции, или системными путями введения.

Хирургические методы часто требуют повторных инъекций и могут привести к серьезным глазным осложнениям, включая эндофтальмиты, отслойку сетчатки и кровоизлияние в стекловидное тело. Аналогично, системное введение связано со множеством потенциальных системных побочных эффектов и с трудностью достижения терапевтического уровня лекарственных средств в сетчатке.

За последнее время было много сообщений об эффективности интравитреального триамцинолона ацетонида для лечения диффузного отека желтого пятна, невосприимчивого к лазерной терапии. Однако, интравитреальные инъекции триамцинолона связаны со множеством глазных осложнений. Осложнения от интравитреальной терапии триамцинолоном включают вызванное стероидом повышение внутриглазного давления, катарактогенез, послеоперационные инфекции, неинфекционный эндефтальмит и псевдо-эндефтальмит.

В настоящее время в симптоматической терапии в качестве основных эффективных лекарственных средства используются химиотерапия, стероиды и ингибиторы карбоангидразы, но их эффективность не доказана и их применение в течение длительного времени приводит к возникновению побочных эффектов, таких как катаракта, вызванное стероидами повышение внутриглазного давления, глаукома и инфекции, и непрерывное применение этих лекарственные средств при хронических заболеваниях, таких как сахарный диабет, является затруднительным.

В ЕР 0929565 описаны соединения общей формулы B-X ₁-NO₂, где В содержит остаток стероида, в частности гидрокортизон, и X₁ - двухвалентный связывающий мостик, который представляет собой бензильное кольцо, алкильную цепь или эфир. Соединения могут использоваться при лечении глазных расстройств.

ЕР 1475386 описывает соединения формулы A-B-C-NO₂, где А содержит остаток стероида и В-С представляет собой двухвалентный связующий мостик, который содержит остаток антиоксиданта. Соединения могут использоваться для лечения окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций. В описанных соединениях антиоксидантный линкер соединен с группой 21-ОН стероида через карбоксильную группу, образующую эфирную связь.

В WO 03/64443 описаны соединения общей формулы B-X₁ -NO₂, где В содержит остаток стероида и X₁ представляет собой двухвалентный связующий мостик, который является бензильным кольцом или гетероциклическим линкером. Соединения могут использоваться для лечения глазных заболеваний.

WO 07/025632 раскрывает соединения формулы R-Z-X-ONO₂ , где R-X содержит остаток триамцинолона ацетонида, валерианата бетаметазона или этилкарбоната преднизолона, и X₁ - двухвалентный связующий мостик, который представляет собой ароматическое кольцо, алкильную цепь, эфир, феруловую кислоту, ванилиновую кислоту или гетероциклическое кольцо. Соединения могут использоваться для лечения кожных заболеваний или заболеваний слизистой оболочки мембран, в особенности для лечения атопического дерматита, контактного дерматита и псориаза.

F. Galassi et al., Br J Ophtalmolory 2006, 90, 1414-1419 описывает действие дексаметазон 21-[(4-нитрооксиметил)] бензоата на модели экспериментальной глаукомы у кролика, вызванной кортикостероидом. Высвобождающий NO дексаметазон вводили местно два раза в день; результаты показывают, что соединение может предотвращать повышение внутриглазного давления, снижать ретро бульбарное кровообращение и морфологические изменения в ресничных (цилиарных) телах, возможно вызванных местным лечением кортикостероидами.

Объектом настоящего изобретения является разработка нитрооксипроизводных стероидов для лечения воспалительных заболеваний. Другим объектом настоящего изобретения является разработка нитрооксипроизводных стероидов для предотвращения или лечения глазных болезней, в особенности диабетической дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии, возрастной дегенерации желтого пятна и других заболеваний сетчатки и желтого пятна. В одном аспекте настоящего изобретения одно или более этих соединений снижают побочные эффекты, связанные со стандартной терапией стероидами. В другом воплощении изобретения одно или более этих соединений обладают улучшенной фармакологической активностью по сравнению с обычной стандартной терапией.

Объектом данного изобретения является соединение формулы (I), или его соль, или стереоизомер

,

где

R₁ и R ₂ взятые вместе являются группой формулы (II)

,

R₃ представляет атом водорода или F и R₄ представляет F,

R₁ , R₂, R₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении или ;

R представляет:

или

где Y выбран из:

1) -R ₅-CH(ONO₂)R₆

2) -R ₅-CH(ONO₂)-(CR₇R₈) _n-CH(ONO₂)R₉

или

3) - [(CH₂)_o-X]p-(CH₂ )_q-CH(ONO₂)R₉

где R₅ - прямой или разветвленный С₁-С _1Оалкилен;

R₆, R₇, R₈ и R₉ каждый представляет Н;

n - целое число от 0 до 6;

о - целое число от 1 до 6;

р - целое число от 1 до 6;

q - целое число от 0 до 6;

X представляет О, S или NR₁₀, где R₁₀ - Н или С₁ -С₄ алкил; предпочтительно X представляет О;

за исключением соединений формулы (I), где R₁ и R ₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)

,

R₄ представляет F и R₃ является атомом водорода, и R является соединением формулы (III), где Y представляет - R₅ -CH(ONO₂)R ₆ и R₆ - Н.

В другом воплощении изобретения описываются соединения формулы (I)

,

где

R₄ - F, R₃ - F, и

R₁ и R₂ , взятые вместе, являются группой формулы (II)

R₁, R₂, R₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении ;

R представляет:

или

,

где

где Y представляет

1) -R₅-CH(ONO₂)R₆

где R₅ прямой С₁-С ₅алкилен и R₆ - Н;

или

2) -R₅-CH(ONO₂)-(CR₇R₈ )_n-CH(ONO₂)R₉, где

R₅ - прямой C₁-С₆алкилен, R ₉, R₇ и R₈ представляют Н и n=0 или 1;

или

3) - [(CH₂) _o-X]_p-(CH₂)_q-CH(ONO ₂)R₉, где

R₉ представляет Н,

о - целое число от 2 до 4;

р - целое число от 1 до 4;

q - целое число от 0 до 4;

X представляет О. В другом воплощении изобретения описываются соединения формулы (I)

,

где

R₁ и R ₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)

где R₄ представляет F и R ₃ представляет атом водорода;

R₁ , R₂, R₃ и R₄ присоединены к 17, 16, 6 и 9 углеродным атомам стероидной структуры в положении ;

R представляет:

или

,

где

где Y представляет

1) -R₅-CH(ONO₂)-(CR₇ R₈)_n-CH(ONO₂)R₉, где

R₅ - прямой С₁-С ₆алкилен, R₉, R₇ и R₈ представляют Н; n=0 или 1; или

2) -[(CH₂ )_o-X]_p-(CH₂)_q-CH(ONO ₂)R₉, где

R₉ представляет Н,

о - целое число от 2 до 4;

р - целое число от 1 до 4;

q - целое число от 0 до 4 и X представляет О.

В другом воплощении изобретения описываются соединения, выбранные из следующей группы:

о - целое число от 1 до 6; предпочтительно о - целое число от 2 до 4, более предпочтительно о равно 2;

р - целое число от 1 до 6; предпочтительно р - целое число от 1 до 4; более предпочтительно р равно 1 или 2;

q - целое число от 0 до 6; предпочтительно q от 0 до 4, более предпочтительно О или 1;

Х представляет О, S или NR₁₀, где R₁₀ - Н или C₁-C ₄алкил; предпочтительно Х представляет О.

Предпочтительными R являются:

,

,

,

,

,

В другом воплощении изобретения описываются соединения, выбранные из следующей группы:

В другом воплощении изобретения описываются соединения формулы (I) для лечения воспалительных заболеваний.

В другом воплощении изобретения описываются соединения формулы (I) для лечения глазных заболеваний, в особенности диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна и других заболеваний сетчатки и желтого пятна. Предпочтительным соединением является описанное выше соединение формулы (I).

В другом воплощении изобретения описываются соединения формулы (I), включая соединения формулы (I), где R₁ и R₂, взятые вместе, являются группой формулы (II)

,

где R₄ представляет F и R ₃ - атом водорода, и R является соединением формулы (III), где Y представляет - R₅-СН(ONO₂)R₆ и R₆ представляет Н, для применения при лечении или предотвращения диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна и других заболеваний сетчатки и желтого пятна, в особенности диабетического отека желтого пятна. Предпочтительным соединением является соединение формулы (18).

В еще одном воплощении изобретения описывается фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество соединения формулы (I) и/или его соли или стереоизомера и офтальмоголически приемлемый эксципиент в подходящей для интравитреального или периорбитального введения форме.

Термин "эксципиент" использован здесь для обозначения любого компонента, отличного от соединения(ий) настоящего изобретения. Выбор эксципиента в большой степени зависит от таких факторов, как способ введения, влияние эксципиента на стабильность и тип лекарственной формы.

Еще в одном другом воплощении изобретения описывается фармацевтическая композиция, где соединение настоящего изобретения вводят в виде суспензии или эмульсии в офтальмологически приемлемом носителе.

Соединения настоящего изобретения, предназначенные для фармацевтического использования, можно вводить в виде кристаллических или аморфных продуктов. Соединения настоящего изобретения, предназначенные для фармацевтического использования, могут вводиться по одному или в комбинации с одним или более другими соединении настоящего изобретения.

Полезность соединений настоящего изобретения как лекарственных средств для лечения или профилактики диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна и других заболеваний сетчатки и желтого пятна продемонстрирована путем определения активности этих соединений обычными методами испытаний.

Способ синтеза

1) Соединение общей формулы (I), где R₁, R₂ , R₃ и R₄ как указано выше, радикал R как указано в формулах III и IV, где Y, как указано выше, может быть получено:

1.1) Реакцией соединения формулы (V),

где R₁, R₂, R ₃, R₄ - как указано выше, W представляет Н или С(O)Cl, с соединением формулы (VII) или (VIII)

,

где Y как указано выше и

W₁ представляет Н, когда W представляет -С(O)Cl, или

W₁ представляет -С(O)Cl или -CO-O-R _a, когда W представляет Н, где R_a представляет пентафторфенил или 4-нитрофенил, P₁ - защитные для диола группы, такие как ацеталь, р-метоксибензилиден, бутилиден, и группы, описанные в Т. W. Greene "Protective groups in organic synthesis", Harvard University Press, 1980, 2 ^nd edition.

1.1.a) Реакцию соединения формулы (V), где W представляет Н, с соединением формулы (VII) или (VIII), где W¹ представляет - С(O)Cl, или реакцию соединения формулы (V), где W представляет - С(O)Cl, с соединением формулы (VII) или (VIII), где W₁ - Н, может быть проведена в присутствии органического основания, такого как N,N-диметиламинопиридин (DMAP), триэиламин, пиридин. Реакцию проводят в инертном органическом растворителе, таком как N,N'-диметилформамид, тетрагидрофуран, бензол, толуол, диоксан, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С и до 40°С. Реакция заканчивается в диапазоне от 30 минут до 36 часов.

1.1.b) Реакцию соединения формулы (V), где W является Н, с соединением формулы (VII) или (VIII), где W₁ представляет -C(O)-R _a, где R_a как указано выше, можно проводить в присутствии катализатора, такого как DMAP, или в присутствии DMAP и кислоты Льюиса, такой как Sc(OTf)₃ или Bi(OTf) ₃. Реакцию проводят в инертном органическом растворителе, таком как N,N -диметилформамид, тетрагидрофуран, бензол, толуол, диоксан, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С и до 40°С. Реакция заканчивается в диапазоне от 30 минут до 36 часов;

1.2) с необязательным снятием с полученных на стадии 1.1.a) или 1.1.b) соединений защитных групп согласно методам, описанным в Т.W.Greene "Protective groups in organic synthesis". Harvard University Press, 1980, 2^nd edition. Для удаления защитной ацетальной группы предпочтительно используют соляную кислоту в тетрагидрофуране.

Получение соединений формулы (V)

2) Соединения формулы (V), где:

- W представляет Н и R₁ представляет ОН, R₂ представляет СН₃, R₃ - атом водорода, R₄ - F или Cl;

- или W - Н, R₃ - атом водорода или F, R₄ - F и R₁ и R₂ , взятые вместе, являются группой формулы (11)

,

являются коммерчески доступными.

2.1) Соединения формулы (V), где W представляет -С(O)Cl или -COR _a и R₁, R₂, R₃ и R ₄ - как указано выше, могут быть получены из соответствующих коммерчески доступных соединений формулы (V), где W представляет Н, используя известные из литературы методы.

Получение соединений формулы (VII) или (УПГ)

3) Соединения формулы (VII) или (VIII), где W₁-Н, P₁ как указано выше и Y представляет:

-R₅-CH(ONO₂)R₆

-[(CH₂)_o-X]_p-(CH₂ )_q-CH(ONO₂)R₉,

где R₅, R₆, R₉, о, р и q - как указано выше, могут быть получены следующим образом:

3.1.а) Реакцией соединения формулы (IX) или (X),

, ,

где Р - защищающая гидроксил группа, такая как силильная эфирная группа, например триметилсилил, третбутил-диметилсилил, или тритил, и которые описаны в Т.W. Greene "Protective groups in organic synthesis". Harvard University Press, 1980, 2^nd edition, P₁ - как указано выше,

с соединением формулы (XI) или (XII)

или

,

где R₅, R₆, R ₉, о, р и q как указано выше, и Q представляет ONO ₂ или Q₁, где Q₁ представляет атом хлора, атом брома, атом иода, мезильную группу или тозильную группу,

в присутствии конденсирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC), N -(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDAC), N,N -карбонилдиимидазол (CDI), необязательно в присутствии основания, например DMAP.

Реакцию проводят в сухом инертном органическом растворителе, таком как N,N -диметилформамид, тетрагидрофуран, бензол, толуол, диоксан, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С и до 50°С. Реакция заканчивается в пределах от 30 минут до 36 часов;

3.1.b) Реакцией указанного выше соединения формулы (IX) или (X) с соединением формулы (XIII) или (XIV)

или

,

где R₅, R₆, R ₉, о, р, q и Q как указано выше, и W₃ - Cl, Br, I,

в присутствии органического основания, такого как 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU), N,N-диизопропилэтиламин, диизопропиламин, или неорганического основания, такого как карбонат или гидроксид щелочноземельного металла, карбонат калия, карбонат цезия, в инертном органическом растворителе, таком как N,N'-диметилформамид, тетрагидрофуран, ацетон, метилэтилкетон, ацетонитрил, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С и до 40°С, преимущественно от 5°С до 25°С. Реакция заканчивается в пределах диапазона времени от 1 до 8 часов. Когда W₃ выбран из хлора или брома, реакцию ведут в присутствии йодистой соли, такой как KI;

3.1.с) Реакцией соединения формулы (IXa) или (Ха)

, ,

где Р и P₁ как указано выше, и R_b - пентафторфенил, 4-нитрофенил или - (N-сукцимидил),

с соединением формулы (XI) или (XII)

или

,

где R₅, R⁶, R ⁹, o, p, q и Q как указано выше,

в присутствии катализатора, такого как DMAP или в присутствии DMAP и кислоты Льюиса, такой как Sc(OTf)₃ или Bi(OTf)₃ . Реакцию ведут в инертном органическом растворителе, таком как N,N -диметилформамид, тетрагидрофуран, бензол, толуол, диоксан, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С до 40°С. Реакция заканчивается в пределах от 30 мин до 36 часов;

3.1.d) Реакцией соединения формулы (IXb) или (Xb)

, ?

с соединением формулы (XI) или (XII)

или

,

где R₅, R₆, R ₉, о, p, q и Q как указано выше, в присутствии органического основания, такого как N,N-диметиламинопиридин (DMAP), триэтиламин, пиридин. Реакцию проводят в инертном органическом растворителе, таком как N,N -диметилформамид, тетрагидрофуран, бензол, толуол, диоксан, полигалогенированный алифатический углеводород, при температуре от -20°С до 40°С. Реакция заканчивается в пределах диапазона времени от 30 мин до 36 часов;

3.2) Реакцией соединения, полученного на стадиях 3.1.а) - 3.1.d), где Q представляет Q₁, с источником нитрогруппы, таким как нитрат серебра, нитрат лития, нитрат натрия, нитрат калия, нитрат магния, нитрат кальция, нитрат железа, нитрат цинка или нитрат тетраалкиламмония (где алкил представляет C₁ -С₁₀ алкил) в подходящем органическом растворителе, таком как ацетонитрил, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, этилацетат, ДФА, в темноте при температуре от комнатной температуры до температуры кипения растворителя.

Альтернативно реакция с ArNO₃ может проводиться под воздействием микроволнового излучения в растворителе, таком как ацетонитрил или ТГФ, при температуре приблизительно 100-180°С в течение приблизительно 1-60 минут. Предпочтительным источником нитрогруппы является нитрат серебра;

3.3) С необязательным удалением защищающей гидроксил защитной группы Р согласно методам, описанным в Т.W.Greene "Protective Groups in organic synthesis", Harvard University Press, 1980, 2_nd edition. Для удаления силильной эфирной группы предпочтительным является ион фторида.

4) Соединения формулы (VII) или (VIII), где W ₁ - Н, P₁ как указано выше, и Y представляет

- R₅-CH(ONO₂)-(CR₇ R₈)_n-CH(ONO₂)R₉

-[(CH₂)_o-X]_p-(CH ₂)_q-CH(ONO₂)-(CR₇R ₈)_n-CH(ONO₂)R₉,

где R₅, R₉, R₇, R₈ , о, р и q как указано выше, и n - 0, могут быть получены следующим образом:

4.1.а) Реакцией указанного выше соединения формулы (IX) или (X) с соединением формулы (XV) или (XVI)

,

где R₅, о, р, q, Х и R ₉ как указано выше, согласно методу, описанному в 3.1.а);

4.1.b) Реакцией указанного выше соединения формулы (IX) или (X) с соединением формулы (XVII) или (XVII)

,

где R₅, о, р, q, Х и R ₉ как указано выше, и W₃ - Cl, Br, I,

согласно методу, описанному в 3.1. b);

4.1.с) Реакцией указанного выше соединения формулы (IXa) или (Ха) с соединением формулы (XV) или (XVI)

,

где R₅, о, р, q, Х и R ₉ как указано выше, согласно методу, описанному в 3.1.с);

4.1.d) Реакцией указанного выше соединения формулы (IXb) или (ХЬ) с соединением формулы (XV) или (XVI)

,

где R₅, о, р, q, Х и R ₉ как указано выше, согласно методу, описанному в 3.1. d):

4.2.а) Реакцией соединения формулы (VIIA) или (VIIIA)

,

где Р и P₁ как указано выше,

и Y представляет:

-R₅-CH=CH-R ₉

-[(CH₂)_O-X] _p-(CH₂)_q-CH=CH-R₉,

где R₅, о, р, q и R₉ указано как выше, с источником нитрогруппы, таким как нитрат серебра, в присутствии иода в подходящем органическом растворителе, таком как ацетонитрил, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, этилацетат, ДФА, в темноте при температуре от -20°С до температуры кипения растворителя. Альтернативно реакцию можно проводить под воздействием микроволнового излучения в растворителях, таких как ацетонитрил или ТГФ, при температуре в диапазоне приблизительно 100-180°С в течение приблизительно 1-60 минут; или

4.2.b) Дигидроксилированием двойной связи указанного выше соединения формулы (VIIA) или (VIIIA) с получением соединения (VIIB) или (VIIIB)

,

где Р и P₁ как указано выше,

и Y представляет:

-R₅-CH(OH)-CH(OH)-R ₉

-[(CH₂)O-X]_p-(CH ₂)_q-CH(OH)-CH(OH)-R₉,

где R₅, о, р, q и R₉ как указано выше,

реагентом для асимметричного дигидроксилирования по Шарплессу, таким как AD-смесь альфа или AD-смесь бета, в смеси вода/трет-бутанол при температуре от -20°С до 30°С, предпочтительно от -5°С до 5°С. Реакция заканчивается через 1-24 часа.

4.3) Реакцией соединения, полученного на стадиях 4.2.b), с азотной кислотой и уксусным ангидридом в подходящем органическом растворителе, таком как метиленхлорид, в диапазоне температур от -50°С до 0°С согласно известным из литературы методам.

4.4) С необязательным снятием защиты с полученных на стадии 4.2. а) или 4.3) соединений как описано в Т.W.Greene "Protective groups in organic synthesis", Harvard University Press, 1980, 2 ^edition. Для удаления защитной силильной эфирной группы предпочтительным является ион фторида.

5) Соединения формулы (VII) или (VIII), где W ₁ - Н, P₁ - как указано выше и Y представляет

-R₅-CH(ONO₂)-(CR₇ R₈)_n-CH(ONO₂)R₉

-[(CH₂)_o-X]_p-(CH ₂)_q-CH(ONO₂)-(CR₇R ₈)_n-CH(ONO₂)R₉, где R ₅, R₉, R₇, R₈, о, р и q как указано выше, и n - целое число от 1 до 6,

могут быть получены следующим образом:

5.1) Реакцией указанного выше соединения формулы (IX) или (X) с соединением формулы (XIX) или (XX)

или

где R₅, R₉, R₇, R₈, n, о, р и q как указано выше, Q ₂ представляет ONO₂ или ОН и W₃ - Cl, Br, I, согласно методу, описанному в 3.1b);

5.2) Реакцией соединения, полученного на стадиях 5.1), где Q представляет ОН, с источником нитро группы согласно методу, описанному в 4.3).

5.3) С необязательным удалением защищающей гидроксил группы Р согласно методу, описанному в 3.3).

Получение соединений (IX), (IXa), (IXb), (X), (Ха) и (Xb)

5) Соединения формулы (IX), (IXa), (IXb), (X), (Ха) и (Xb), где Р, P₁ и P_b как указано выше, могут быть получены, исходя из коммерчески доступной ванилиновой кислоты или галлиевой кислоты согласно известному в литературе методу.

Получение соединений (XI)-(XX)

6.1) Соединения формулы (XI)-(XIV), где R₅, R ₆, R₉, о, р, q и W₃ как указано выше, и Q представляет Q₁, где Q₁ как указано выше, являются коммерчески доступными или могут быть получены согласно известным в литературе методам.

6.2) Соединения формулы (XI)-(XIV), где R₅, R₆ , R₉, о, р, q и W₃ как указано выше, и Q представляет группу ONO₂, могут быть получены из соответствующих соединений, где Q представляет Q₁, реакцией с источником нитрогруппы как описано выше.

6.3) Соединения формулы (XV)-(XX), где W₃, R₅ , R₉, R₇, R₈, n, о, р и q как указано выше, являются коммерчески доступными или могут быть получены согласно известным в литературе методам.

Пример 1 - (Соединение (1))

Синтез 4-(нитроокси) бутил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дтфтор-11-гидрокси-16,17-16,17-(1-метилэтилиденбис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоата.

А) 4-(Нитроокси)бутил 4-гидрокси-3-метоксибензоат.

К раствору ванилиновой кислоты (5,0 г, 29,73 ммол) в N,N-диметилформамиде (50 мл) добавляют карбонат цезия (9,68 г, 29,73 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют 20% раствор 1-бром-4-(нитроокси)бутана в дихлорметане (29,45 г). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 69 часов. Смесь вливают в 5% водный раствор NaH ₂PO₄ и экстрагируют диэтиловым эфиром (3×70 мл). Органические слои промывают водой (70 мл), сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 65+M^TMKP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 95/5 (500 мл) до н-гексан/этилацетат 1/1 при 4000 мл, н-гексан/этилацетат 1/1 (500 мл)). Получают 5,88 г продукта.

В) 4-(Нитроокси)бутил-3-метокси-4-((4-нитрофенокси)карбонилокси) бензоат.

К охлажденному до 0°С раствору соединения А (2,94 г, 10,30 ммол) в дихлорметане (50 мл) добавляют пиридин (1,01 мл, 10,30 ммол) и р-нитрофенил хлорформиат (2,07 мл, 10,30 ммол). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь промывают 1М водным раствором HCl (2×50 мл), органический слой сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 65+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 93/7 (500 мл) до н-гексан/этилацетат 1/1 при 4000 мл, н-гексан/этилацетат 1/1 (500 мл)). Получают 3,50 г продукта.

С) 4-(Нитроокси)бутил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-16,17-(1-метилэтилиденбис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат.

К раствору соединения В (1,00 г, 2,28 ммол) в хлороформе (30 мл) добавляют трифлат скандия (0,10 г, 0,22 ммол) и DMAP (0,54 г, 4,56 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют флуоцинолон ацетонид (0,99 г, 2,28 ммол). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 28 часов. Смесь разбавляют дихлорметаном, промывают 5%-ым NaH₂ PO₄ и затем насыщенным водным раствором карбоната натрия. Органический слой сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (500 мл) до н-гексан/этилацетат 3/7 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 3/7 (500 мл)). Получают 0,29 г продукта.

Продукт кристаллизуют из смеси н-гексан/этилацетат.

Т.Пл.=199-200°С

¹H-NMR: (DMSO), : 7.65 (2Н, d); 7.38 (1Н, d); 7.27 (1H, d); 5.60 (1H, dm); 5.50 (1H, s); 5.35 (2H, m); 4.60 (2H, t); 4.35 (2H, t); 4.20 (1H, m); 3.89 (3H, s); 2.75-2.50 (2H, m); 2.25 (1H, m); 2.00 (2H, m); 1.90-1.30 (13H, m); 1.15 (3H, s); 0.83 (3H, s).

Пример 2 - (Соединение (3))

Синтез 5, 6-бис(нитроокси)гексил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-диор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоата.

D) Гекс-5-енил 4-гидрокси-3-метоксибензоат

К раствору ванилиновой кислоты (0,6 г, 3,56 ммол) в N,N-диметилформамиде (7 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,93 г, 5,35 ммол) и 6-бромгекс-1-ен (0,71 мл, 5,35 ммол). Реакционную смесь перемешивают при 50°С в течение 8 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 95/5 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 7/3 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 3/7 (400 мл)). Получают 0,59 г продукта.

Е) Гекс-5-енил 4-(трет-бутилдиметилсилилокси)-3-метоксибензоат

К раствору соединения D (1,16 г, 4,64 ммол) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляют имидазол (1,18 г, 17,40 ммол) и третбутилдиметилхлорсилан (1,31 г, 8,7 ммол). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Смесь вливают в водный раствор (50 мл) и экстрагируют диэтиловым эфиром (3×50 мл). Органические слои сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: н-гексан/этилацетат 95/5. Получают 1,56 г продукта.

F) 5,6 Бис(нитроокси)гексил-4-(третбутилдиметилсилилокси)-3-метоксибензоат

К раствору соединения Е (1,4 г, 3,97 ммол) в ацетонитриле (30 мл) добавляют нитрат серебра (0,8 г, 4,77 ммол). Реакционную смесь охлаждают до -15°С и добавляют иод (1,21 г, 4,77 ммол). Реакционную массу перемешивают при -15°С в течение 20 минут. Повышают температуру до 25°С и добавляют иод (2,7 г, 15,9 ммол). Реакционную смесь нагревают до 100°С в течение 60 минут под воздействием микроволнового излучения. Полученную смесь охлаждают, фильтруют и удаляют растворитель при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (400 мл) до н-гексан/этилацетат 7/3 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 7/3 (400 мл)). Получают 1,19 г продукта.

G) 5,6 Бис(нитроокси)гексил 4-гидрокси-3-метоксибензоат

К охлажденному до О С раствору соединения F (1,19 г, 2,43 ммол) в тетрагидрофуране (40 мл) добавляют 1М раствор тетрабутиламмоний фторида в тетрагидрофуране (2/43 мл, 2,43 ммол). Реакционную массу перемешивают при 0°С в течение 20 минут. Смесь вливают в 5% водный раствор NaH₂PO ₄ и экстрагируют этилацетатом (3×50 мл). Органические слои промывают водой (50 мл), сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 1/1 при 1000 мл, н-гексан/этилацетат 1/1 (200 мл)), до п-гексан/этилацетат 4/6 при 200 мл, п-гексан/этилацетат 4/6 (400 мл)). Получают 0,9 г продукта.

H) 2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-Дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтил карбонохлоридат.

К охлажденному до 0°C раствору флуоцинолон ацетонида (1,2 г, 2,65 ммол) в тетрагидрофуране (24 мл) добавляют в атмосфере N₂ 20% раствор фосгена в толуоле (5,58 мл, 10,6 ммол). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 30 минут и при комнатной температуре в течение 12 часов. Избыток фосгена удаляют нагреванием при 40°С в течение 45 минут. Растворитель упаривают под вакуумом. Сырой продукт используют на следующих стадиях без очистки.

I) 5,6 Бис(нитроокси)гексил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат.

К раствору соединения Н (0,56 г, 1,09 ммол) в дихлорметане (24 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,21 мл, 1,2 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют раствор соединения G (0.45 г, 1,2 ммол) в дихлорметане (3 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 8/2 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 2/8 при 2400 мл, н-гексан/этилацетат 2/8 (400 мл)). Получают 0,67 г продукта.

¹H-NMR: (CDCl³), : 7.70 (2Н, d); 7.30 (1H, d); 7.07 (1H, d); 6.45 (1H, s); 6.38 (1H, dd); 5.52-5.28 (2H, m); 5.16-4.91 (2H, dd); 5.04 (1H, d); 4.74 (1H, dd); 4.50 (1H, m); 4.43-4.35 (3H, m); 3.95 (3H, s); 2.60-2.10 (4H, m); 1.90-1.47 (16H, m); 1.25 (3Н, s); 0.95 (3Н, s).

Пример 3 (Соединение (5))

Синтез 2-(2-(2-(нитроокси)этокси)этокси)этил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-ЗН-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоата

J) 4-(Трет-бутилдиметисилилокси)-3-метоксибензойная кислота

К раствору ванилиновой кислоты (2,0 г, 11,89 ммол) в N,N-диметилформамиде (50 мл) добавляют имидазол (4,04 г, 59,45 ммол) и трет-бутилдиметилхлорсилан (4,48 г, 29,72 ммол). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь вливают в водный раствор (70 мл) и экстрагируют диэтиловым эфиром (3×70 мл). Органические слои сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент ацетонитрил/вода 65/35 (600 мл) до ацетонитрил/вода 80/20 при 1200 мл). Получают 0,70 г продукта.

К) 2-(2-(2-Хлорэтокси)этокси)этил-4-(трет-бутилдиметилсилилокси)-3-метоксибензоат

К раствору соединения J (1,25 г, 4,42 ммол) в дихлорметане (60 мл) добавляют 2-(хлорэтокси)-этокси этанол (0,83 г, 5,75 ммол) и DMAP (каталитическое количество). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют EDAC (1,10 г, 5,75 ммол). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (40 мл) до н-гексан/этилацетат 6/4 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 6/4 (400 мл)). Получают 1,25 г продукта.

L) 2-(2-(2-Нитрооксиэтокси)этокси)этил 4-(трет-бутилдиметилсилилокси)-3-метоксибензоат

К раствору соединения K (1,53 г, 3,54 ммол) в ацетонитриле (45 мл) добавляют йодистый натрий (3,18 г, 21,24 ммол). Реакционную смесь нагревают до 120°С в течение 20 минут под воздействием микроволнового излучения. Полученную смесь охлаждают, фильтруют и удаляют растворитель при пониженном давлении. К раствору остатка в ацетонитриле (45 мл) добавляют нитрат серебра (2,04 г, 14,16 ммол). Реакционную смесь нагревают до 120°С в течение 5 минут под воздействием микроволнового излучения. Получающуюся смесь охлаждают, фильтруют и удаляют растворитель при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (600 мл) до н-гексан/этилацетат 6/4 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 6/4 (400 мл). Получают 1,37 г продукта.

М) 2-(2-(2-Нитрооксиэтокси) этокси) этил 4-гидрокси-3-метоксибензоат

К охлажденному до 0°С раствору соединения L (1,10 г, 2,4 ммол) в тетрагидрофуране (40 мл) добавляют 1М раствор тетрабутиламмонийфторида в тетрагидрофуране (2,4 мл, 2,4 ммол). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 20 минут. Смесь выливают в 5% водный раствор NaH₂PO ₄ (100 мл) и экстрагируют этилацетатом (3×50 мл), органические слои промывают водой (100 мл), сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column FLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (600 мл) до н-гексан/этилацетат 1/1 при 2000 мл, н-гексан/этилацетат 1/1 (400 мл). Получают 0,76 г продукта.

N) 2-(2-(2-(нитроокси)этокси)этокси)этил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат.

К раствору соединения Н (0,508 г, 0/98 ммол) в дихлорметане (15 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,18 мл, 1,06 ммол). Реакционную смесь охлаждают при 0°С и добавляют раствор соединения М (0,37 г, 1,08 ммол) в дихлорметане (3 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, Cartridge column PLASH 40+M KP-Sil, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 8/2 (200 мл) до этилацетат 100% при 2400 мл, этилацетат 100% (400 мл). Получают 0,70 г продукта.

¹H-NMR: (CDCl³), : 7.70 (2Н, d); 7.30 (1H, d); 7.07 (1H, d); 6.45 (1H, s); 6.38 (1H, dd); 5.52-5.32 (1H, m); 5.15-4.91 (2H, dd); 5.04 (1H, d); 4.57-4.49 (4H, m): 4.41 (1H, m); 3.95 (3H, s); 3.84 (2H, dd); 3.78 (2H, dd); 3.68 (4H, m); 2.60-2.10 (4H, m); 1.90-1.47 (ЮН, m); 1.25 (3H, s); 0.95 (3H, s).

Пример 4 (Соединение (6))

Синтез 4-(нитроокси)бутил 3-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3 -оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-4,5-дигидроксибензоата.

О) Метил 7-гидрокси-2-(4-метоксифенил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксилат.

К суспензии метилгаллата (10 г, 54,3 ммол) в толуоле (25 мл) добавляют р-толуолсульфокислоту (29 мг) и диметилацеталь-р-анисальдегид (11,56 мл, 67,88 ммол). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 1,5 часов с непрерывным удалением воды. Смесь разбавляют дихлорметаном (70 мл), промывают насыщенным водным раствором МаНСОз (100 мл) и экстрагируют этилацетатом (3х50 мл). Органический слой промывают водой (100 мл), сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток кристаллизуют н-гексаном. Получают 8,6 г продукта.

Р) 7-Гидрокси-2-(4-метоксифенил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоновая кислота

К суспензии соединения О (8,6 г, 28,41 ммол) в смеси вода/этанол 5/95 (260 мл) добавляют гидроокись натрия (2,5 мл, 62,5 ммол). Реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 15 часов, растворитель упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в воде (150 мл) и экстрагируют этилацетатом (100 мл). Водный слой подкисляют 1N водным HCl до рН 4 и экстрагируют этилацетатом (6×50 мл). Органические слои сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Сырой продукт (5,78 г) используют на следующей стадии без какой-либо очистки.

Q) 4-(Нитроокси)бутил-7-гидрокси-2-(4-метоксифенил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксилат.

К раствору соединения Р (5,78 г, 20,05 ммол) в N,N-диметилформамиде (50 мл) добавляют карбонат цезия (6,52 г, 20,05 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют 20% раствор 1-бром-4-(нитроокси)бутана в дихлорметане (19,85 г). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 40 часов. Смесь вливают в 5% водный раствор NaH ₂PO₄ и экстрагируют диэтиловым эфиром (2×70 мл). Органические слои промывают водой (50 мл), сушат над сульфатом натрия и концентрируют под пониженным давлением. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, SNAP Cartridge silica 100 г, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 1/1 при 1200 мл, н-гексан/этилацетат 1/1 (400 мл)). Получают 4,36 г продукта.

R) 4-(Нитроокси)бутил 7-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро)-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[d][1,3]диоксол-5-сарбоксилат.

К раствору соединения Q (0,519 г, 1,28 ммол) в дихлорметане (13 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,179 мл, 1,28 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют раствор соединения Н (0,6 г, 1,16 ммол) в дихлорметане (3 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, SNAP Cartridge silica 100 г, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 3/7 при 1200 мл, н-гексан/этилацетат 3/7 (400 мл)). Получают 0,979 г продукта.

4-(Нитроокси)бутил 3-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-4,5-дигидроксибензоат.

К раствору соединения R (0,97 г, 1,09 ммол) в тетрагидрофуране (22,4 мл) добавляют IN водный НС1 (22,4 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 17 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток экстрагируют этилацетатом (2×30 мл), органические слои сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, SNAP Cartridge silica 100 г, элюент: градиент ацетон/дихлорметан 5/95 (200 мл) до ацетон/дихлорметан 2/8 при 900 мл, до ацетон/дихлорметан 3/7 при 600 мл). Получают 0,344 г продукта.

¹H-NMR: (CDCl₃ ), : 7.51 (2Н, dd); 7.14 (1H, d); 6.47 (1H, s); 6.40 (1H, dd); 5.52-5.32 (1H, m); 5.24-4.93 (2H, dd); 5.03 (1H, d); 4.53 (2Н, t): 4.43-4.33 (3Н, m); 2.54-2.17 (4Н, m); 2.00 -1.65 (8Н, m); 1.53 (3Н, s); 1.47 (3Н, s); 1.25 (ЗН, s); 0.94 (3Н, s).

Пример 5 - (Соединение (10))

Синтез 4-(нитроокси)бутил 3-((2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-4,5-дигидроксибензоат.

S) 2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтил карбонохлоридат.

К охлажденному до 0°C раствору триамцинолон ацетонида (3 г, 6,9 ммол) в тетрагидрофуране (33 мл) в атмосфере N² добавляют 20% толуольный раствор фосгена (21,8 мл, 41,4 ммол). Реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 1 часа и при комнатной температуре в течение 17 часов. Избыток фосгена удаляют нагреванием при 40°С в течение 30 минут. Растворитель упаривают под вакуумом. Сырой продукт используют на следующей стадии без какой-либо очистки.

Т) 4-(Нитроокси)бутил 7-((2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фтор-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[d][1,3]диоксол-5-карбоксилат.

К раствору соединения Q (0,583 г, 1,32 ммол) в дихлорметане (14 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,231 мл, 1,32 ммол). Реакционную смесь охлаждают до 0°С и добавляют раствор соединения S (0,6 г, 1,2 ммол) в дихлорметане (3 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, SNAP Cartridge silica 100 г, элюент: градиент н-гексан/этилацетат 9/1 (200 мл) до н-гексан/этилацетат 3/7 при 1200 мл, н-гексан/этилацетат 3/7 (400 мл)). Получают 0,819 г продукта.

U) 4-(Нитроокси)бутил 3-((2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фторо-11-гидрокси-16,17-((1-метилэтилиден)бис(окси)-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-4,5-дигидроксибензоат.

К раствору соединения Т (0,81 г, 0,93 ммол) в тетрагидрофуране (19,5 мл) добавляют 1N водный HCl (19,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. Растворитель упариваютпод вакуумом. Остаток экстрагируют этилацетатом (2×30 мл), органические слои сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают с помощью флеш-хроматографии (Biotage System, SNAP Cartridge silica 100 г, элюент: градиент ацетон/дихлорметан 5/95 (200 мл) до ацетон/дихлорметан 3/7 при 900 мл, ацетон/дихлорметан 3/7 (200 мл)).

Получают 0,245 г продукта.

¹H-NMR: (CDCl ₃), : 7.51 (2Н, dd); 7.23 (1H, d); 6.38 (1H, s); 6.18 (1H, dd); 5.21-4.90 (2H, dd); 5.03 (1H, d); 4.53 (2Н, t): 4.41-4.32 (3Н, m); 2.69-2.35 (4Н, m); 2.00-1.65 (10Н, m); 1.53 (3Н, s); 1.45 (3Н, s); 1.24 (3Н, s); 0.94 (3Н, s).

Пример 6 - (Соединение (17))

2-(2-(2-(Нитроокси)этокси)этокси) этил 4-((2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фтор-11-гидрокси-16,17-((1 метилэтилиден)бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат

Соединение синтезировали, используя процедуру, описанную в примере 3, исходя из соединения S и соединения M.

¹H-NMR: (CDCl₃), : 7.71 (2H, d); 7.26 (1H, d); 7.15 (1H, d); 6.31 (1H, dd); 6.12 (1H, s); 5.12 (1H, d); 4.91 (1H, d); 5.01 (2H, d); 4.56 (2H, m); 4. 49 (2H, t): 4.40 (1H, m); 3.95 (3Н, s); 3.79 (2H, t); 3.76 (2H, m); 3.67 (4Н, m); 2.65-2.35 (4Н, m); 2.15-2.00 (1H, m); 1.92-1.84 (1H, m); 1.72-1.55 (2H, m); 1.51 (3Н, s); 1.45 (3Н, s); 1.25 (5Н, m); 0.93 (3Н, s).

Пример 7 - (Соединение (18))

4-(Нитроокси)бутил 4-((2-((9R,10S,11S,13S,16R,17S)-9-фтор-11-гидрокси-16,17-(1-метилэтилиден бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат

Соединение синтезировали, используя процедуру, описанную в примере 1, исходя из триамцинолон ацетонида и соединения В.

¹H-NMR: (CDCl ₃), : 7.65 (2Н, m); 7.26 (1Н, d); 7.17 (1H, d); 6.40 (1H, dd); 6.10 (1H, s); 5.11-4.84 (2H, dd); 4.99 (1H, d); 4.53 (2Н, t); 4.37 (2Н, t); 3.93 (3Н, s); 2.71-2.30 (5Н, m); 2.00-1.50 (6Н, m); 1.87 (4Н, m); 1.50 (3Н, s); 1.41 (3Н, s); 1.22 (3Н, s); 0.92 (3Н, s).

Пример F1: Исследование сосудистого тонуса Тестируемые соединения:

- Соединение (1), описанное в пр. 1;

- Соединение (3), описанное в пр. 2:

- Соединение (5), описанное в пр. 3;

- Соединение (6), описанное в пр. 4;

- Соединение (10), описанное в пр. 5;

- Соединение (18), описанное в пр. 7.

Контрольные соединения:

Флуоцинолон ацетонид (FC)

Триамцинолон ацетонид (ТААС)

Способность соединений настоящего изобретения индуцировать вазорелаксацию по сравнению с соединениями - предшественниками исследовали in vitro на изолированных препаратах грудной аорты кролика (Wastall J.C. at al., Br. J. FharmacoL, 134:463-472, 2001). Самцов новозеландских кроликов (1,8-2 кг) анестезировали тиопенталом натрия (50 мг/кг, iv), скарифицировали путем обескровливания, затем вскрывали грудную клетку и рассекали аорту. Аорты немедленно помещали в буфер Кребса-Хепса (рН 7.4; состав мМ: NaCl 130.0, KCl 3/7, NaHCO₃ 14.9, КН ₂РО₄ 1.2, MgSO₄·7H₂ O 1.2, глюкоза 11.0, HEPES 10.0, CaCl₂·2Н ₂О 1.6) и разрезали на кольцевые сегменты (длиной 4-5 мм). Для измерения изометрического натяжения ² каждое кольцо помещали в инкубатор для тканевых культур на 5 мл, заполненный буфером Кребса-Хепса (37°С) и продуваемый 95% O₂ , 5% CO₂, и затем соединяли с силовым измерительным преобразователем (Grass FT03), связанным с измерительной системой BIOPAC MP150. Препаратам давали возможность уравновеситься в течение 1 часа при пассивном натяжении 2 г, меняя буфер каждые 15 минут и затем стимулировали действием 90 мМ KCl (3 раза) с промежуточным промыванием. По достижении уравновешивания вызывали их предварительное субмаксимальное сокращение метоксамином (3 мкМ) и при достижении стабильного предварительного сокращения строили кумулятивную кривую концентрация-ответ для тестируемых соединений. Интервалы времени между дозами определяли на основе времени, необходимом для достижения полного ответного устойчивого состояния. Ответы на тестируемые соединения выражали как процент остаточного сокращения и строили диаграмму в зависимости от концентрации тестируемого соединения. Значения ЕС₅₀ (где ЕС ₅₀ представляет собой концентрацию, обеспечивающую 50% максимальной релаксации на тестируемое соединение) интерполировали из этих диаграмм. Как показано в Таблице 1 тестируемые соединения способны вызывать релаксацию в зависимости от концентрации.

Таблица 1:
Исследование сосудистого тонуса.
Тестируемое соединение	ECso (мкМ)
FC	нет эффекта
Соединение (1)	2,2
Соединение (3)	0,21±0,07
Соединение (5)	0,83±0,25
Соединение (6)	1,44±0,41
ТААС	нет эффекта
Соединение (18)	1,56
Соединение (10)	2,3 5±0,98

Пример F2

Оценка эффективности соединений настоящего изобретения in vivo на ФРЭС индуцированной модели пропотевания жидкости через сосуды крысы.

Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЕС) активизирует общие пути пропотевания через сосуды, связанного с различными патологическими процессами, включая диабетический отек желтого пятна (DME). Тестируемые соединения:

- Соединение (1), описанное в Примере 1,

- Флуоцинолон ацетонид (ФК): контрольное соединение для соединения (1),

- Соединение (18), описанное в Примере 7,

- Триамцинолон ацетонид (ТААС): контрольное соединение для соединения (18).

Самцов крыс линии Спраг Доули (~250 г; Charles River laboratory) анестезировали ингаляцией изофлурана и местно наносили на глаза каплю 0.5% тетракаина на глаза. Зрачки расширяли местным применением 1% циклопентолата гидрохлорида для того, чтобы видеть иглу для осуществления интравитреальной (в стекловидное тело) инъекции. Рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов (ФРЕС; 100 нг/глаз) или ФРЕС 100 нг/глаз плюс тестируемые соединения готовили в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе (CMC) в стерильном физиологическом растворе и вводили в стекловидное тело иглой 30-го калибра (Xu, Q., et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 42:789-794, 2001). Соединения настоящего изобретения сравнивали с соответствующими им стероидами в эквимолярных дозах. Например, для сравнения с флуоцинолон ацетонидом как при 25, так и при 50 мкг/глаз, соединение (1) вводили в дозе 42,4 и 84,7 мкг/глаз соответственно. Контрольные животные получали носитель. Для сравнения рядом с триамцинолон ацетонидом аналогичными дозами вводили соединение (18).

Пропотевание через сосуды сетчатки измеряли описанным ранее методом (Xu, Q., et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 42:789-794, 2001). Через приблизительно 18 часов после инъекции тестируемых соединений крыс внутрибрюшинно анестезировали кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (4 мг/кг). Затем вводили в яремную вену 45 мг/кг синего Эванса (ЭС). Краске дали возможность циркулировать в течение 2 часов. Вскрывали грудную полость и крыс перфузировали 1%-ым формалином в 0,5 М цитратном буфере (рН 3.5, 37°С) через левый желудочек. Из энуклеированных глаз осторожно отслаивали сетчатки, помещали их в предварительно взвешенные пробирки Эппендорфа, сушили в скоростном вакууме в течение ночи и регистрировали сухой вес. Экстрагировали Эванс синий, инкубируя каждую сетчатку в 120 мкл формамида в течение 18 часов при 70°С, и центрифугировали в течение 2 часов при 6000 оборотах в минуту. Измеряли абсорбцию 60 мкл экстракта при 620 нм и определяли фоновую абсорбцию при 740 нм. Конечную абсорбцию вычисляли, вычитая фоновую абсорбцию при 740 нм от абсорбции при 620 нм. Измеряли стандартную кривую Эванса синего в формамиде и рассчитывали Пропотевание Эванса синего в формамиде, выраженное как мкл/г/час, как показано ниже:

[ЕВ (нг/мл) × 120 (мкл) × 1000] / [сухой вес сетчатки (мг) × время циркуляции (час) × ЭС в плазме (нг/мл) × 100].

Как показано на приведенной ниже фигуре 1 а, интравитреальная инъекция 100 нг ФРЭС приводит к 3,5-кратному увеличению (n=17, Р 0.05) проницаемости сосудов спустя 18 часов после инъекции. Обработка 25 мкг/глаз флуоцинолон ацетонида и 42,4 мкг/глаз соединения (1) ингибирует ФРЭС-индуцированное пропотевание на 86,1% и 77,1% соответственно (Фигуры 1а и 1b, n=9, Р<0.05). Аналогично триамцинолон ацетонид в дозе 10 мкг/глаз и эквивалентная ему доза соединения (18) вызвали снижение на 67.5% и 54,3% соответственно (Фигуры 2а и 2b). Во всех случаях ингибирование пропотевания сходно по величине как для соединений настоящего изобретения (соединения (1) и (18)), так и для соответствующего им стероида.

Пример F3

Оценка улучшения стероид-индуцированного повышения внутриглазного давления (ВГД) in vivo у крыс с помощью соединений настоящего изобретения. Тестируемые соединения:

- Соединение (1), описанное в Примере 1

- Флуоцинолон ацетонид (ФК): контрольное соединение

- Дез-нитроаналог соединения (I): бутил 4-((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-дифтор-11-гидрокси-16,17-16,17-(1-метилэтилиден бис(окси))-10,13-диметил-3-оксо-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-додекагидро-3Н-циклопента[а]фенантрен-17-ил)-2-оксоэтокси)карбонилокси)-3-метоксибензоат.

Самцов серых крыс (250-275 г; Charles River laboratory) перед измерениями внутриглазного давления (IOP) акклиматизировали в течение недели. Перед интравитреальной инъекцией тестируемых соединений у бодрствующих крыс измеряли изначальное (базовое) IOP с помощью тонометра Tonolab (Tinolat Inc) (Pease, M.E., et al J. Glaucoma, 15:512-519, 2006). Затем крыс анестезировали ингаляцией изофлурана и местно наносили на глаза каплю 0,5% тетракаина. Зрачки расширяли местным применением 1% циклопентолата гидрохлорида и 2,5% фенилэфрина гидрохлорида для того, чтобы видеть иглу для осуществления интравитреальной инъекции тестируемых соединений. Соединение (1) сравнивали с соответствующим ему стероидом и des - нитро аналогом в эквимолярных дозах. Например, для сравнения с флуоцинолон ацтонидом как при 25, так и при 50 мкг/глаз, соединение (1) вводили в дозе 42,4 и 84,7 мкг/глаз соответственно. Дез-нитроаналог соединения (1) вводили в дозе 39,1 мкг/глаз (эквивалент 25 мкг FC). Контрольные животные получали носитель.

Для каждого момента времени из пяти измерений выбирали среднее. Измерения IOP проводили в первую и вторую недели после интравитреальной инъекции тестируемых соединений.

Базовое давление у серых крыс составляло 18 мм Hg. Как показано на приведенной ниже фигуре 3, спустя одну неделю после инъекции флуоцинолон ацетонида ЮР увеличилось на 4 мм Hg при 25 мкг/глаз и на 3 мм Hg при 50 мкм/г соответственно. Эти результаты были подтверждены после двух недель (р<0.05). Однако, инъекция соединения (1) в дозах 25 или 50 мкг/глаз, эквивалентных 42,4 и 84,7 мкг/глаз соответственно, не вызвала изменения IOP в первую и вторую неделю после инъекции (фигура 3). В другом эксперименте, как показано на приведенной ниже фигуре 4, дезнитроаналог соединения (1) в дозе 25 мкг/глаз, эквивалентных 39, 1 мкг/глаз, флуоцинолон ацетонид (FC) в дозе 25 мкг/глаз вызвали увеличение IOP по сравнению с соединением (1) в дозе 25 мкг/глаз, эквивалентных 42,4 мкг/глаз.

Пример F4

Оценка эффективности действия соединений на внутриглазное давление, глазную гемодинамику и защиту сетчатки и оценка содержания воспалительных цитокинов во внутриглазной жидкости на in vivo индуцированной эндотелином-1 ишемии у новозеландских белых кроликов. Тестируемые соединения

- Соединение (1) Примера 1

- Флуоцинолон ацетонид (FC): контрольное соединение

Тест система и методы

Для эксперимента использовали двадцать взрослых Новозеландских кроликов альбиносов мужского пола весом 2-2,5 кг. Животные были разделены на две группы для выбранной специфической обработки. Методы эксперимента соответствовали методам, разрешенным Ассоциацией по исследованию зрения и офтальмологии по использованию животных, в соответствии с надлежащей лабораторной практикой по использованию животных. Правил Италии по защите животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (DM 116/1992), а так же в соответствиями с Правилами Европейского союза (OJ ofECL 358/1, 12/12/1986). Кролики содержались в отдельных клетках и имели свободный доступ к пище и воде. Животные находились в помещении с контролируемой комнатной температурой (22°-23°С) с режимом 12/12 часов свет/темнота.

Модель глазной ишемии получали инъекцией два раза в неделю в течение 6 недель эндотелина-1 (ЕТ-1) 250 нМ и 500 мкл стерильного физиологического раствора в стекловидное тело обоих глаз, используя канюлю для слезного канала, под общим наркозом (тилетамин плюс золазепам (золетил 100, 0,05 мг/кг) плюс ксилазин (ксилор 2%, 0,05 мл/кг) внутримышечно.

Флуоцинолон ацетонид (FC) (0,5 мг/глаз в 100 мкл наполнителя) или Соединение (1) (эквивалентные 0,5 мг / глаз в 100 мкл наполнителя) по каплям вводили в стекловидное тело (IVT) спустя две недели после начала введения ЕТ-1 (Т2) в один глаз, тот же объем наполнителя вводили в другой глаз.

- Внутриглазное давление

Внутриглазное давлении (ВГД) измеряли дважды, используя Tono-Pen XL (Medtronic Solan. USA) как описано Maren s group (Exp. Eye Res. (1992) 55:73-79; Exp.Eye Res. (1993) 57: 67-78), с измерением стандартного давления в двух точках. Измерение ВГД осуществляли два независимых исследователя (С.U. и R.М.), используя тот же самый тонометр.

Данные, приведенные в Таблице 2, показывают, обработка ЕТ-1 не изменяло ВГД у новозеландский белых кроликов. Флуоцинолон ацетонид увеличивал внутриглазное давление после индуцированной ЕТ-1 ишемии, соединение (1), напротив, не изменяло внутриглазное давление после индуцированной ЕТ-1 ишемии.

Таблица 2:
Воздействие флуоцинолон ацетонида (FC) или соединения (1) против носителя на ВГД. ВГД измеряли ежедневно перед введением лекарственного средства
	ВГД (мм Hg)
	Носитель	FC*	Носитель	Соединение (1)
базальное	13,00±2,83	13,50±0,17	12,60±2,01	12,70±1,89
ЕТ-1	13,50±0,71	13,00±2,83	12,80±1,55	13,30±1,49
I неделя	14,00±2,83	15,50±0,71	13,30±1,49	15,30±0,95
II неделя	14,40±0,71	19,00±0,00	13,60±1,96	15,00±1,33
III неделя	15,00±1,41	13,00±2,83	13,00±2,83	13,00±2,83
IV неделя	13,50±1,27	13,00±2,83	13,00±2,83	13,00±2,83
V неделя	13,30±1,77	13,00±2,83	13,00±2,83	13,00±2,83
VI неделя	13,00±1,56	13,00±2,83	13,00±2,83	13,00±2,83
* р<0,001 против носителя (N=10)

- Электроретинограмма (ЭРГ)

Электроретинограмму (ЭРГ) снимали в базальных условиях (ТО), перед началом медикаментозного лечения (Т2) и в конце медикаментозного лечения (Т6). До начала исследования были проведены биомикроскопия с помощью щелевой лампы и непрямая офтальмоскопия всех глаз. Животные, демонстрирующие помутнение роговицы или хрусталика или поражение сетчатки, были исключены. Применяли местную анестезию, используя каплю 0,2% оксибупрокаин гидрохлорид (Novesine, Sandoz). Глазные зрачки расширяли местным применением тропикамида (1%), адаптацию к темноте осуществляли в течение, по крайней мере, 2 часов, и снимали стандартные электроретинограммы (ЭРГ) обоих глазах, используя роговичные электроды. В уши были вставлены электрод сравнения и заземляющий электрод, сделанные из хирургических игл из нержавеющей стали. Сигналы ЭРГ регистрировали с помощью Retimax (CSO, Флоренция, Италия). Регистрировали адаптированный к темноте скотопический ответ (ответ палочковой системы сетчатки) и скотопический ответ на световые вспышки (фотопическая или колбочковая ЭРГ). Интенсивность вспышек менялась от -2,50 до +0,4 log scot кД сек/м² . Для каждого глаза определяли среднюю из трех отдельных ЭРГ. Для каждой стадии рассчитывали амплитуду а- и b- волн. Базовые величины сравнивали с ответом, полученным при Т2 и в конце лечения (Т6). Лечение с помощью ЕТ-1 значительно снижало амплитуду фотопической или колбочковой ЭРГ (Т2, р<0.05 против ТО и Т6 р<0.05 против ТО). Результаты, представленные в Таблице 3, показывают, что глаза, обработанные флуоцинолон ацетонидом (FC) или Соединением (1), проявляют значительно (р<0.05 против транспортного средства) меньшее снижение волновой амплитуды ЭРГ, чем те, которые были обработаны наполнителем. Кроме того. Соединение (1) было немного более эффективным, чем флуоцинолон ацетонид.

Таблица 3:
Влияние соединения (1) или флуоцинолон ацетонида (FC) на фотопическую ЭРГ после обработки ЕТ-1.
Фотопическая ЭРГ (амплитута (мкВ))
Базальная	Носитель	FC	Соединение (1)
147,41±7,43	68,85±6.41	136,34±11,98	140,94±6,22
* р<0,001 против носителя (N=8)

- Глазная гемодинамика

Оценку гемодинамики проводили, используя цветовое доплеровское картирование (ЦДК) DynaView ТМ II SSD-1700 (Aloka Holding Europe AG, Милан, Италия). Все животные были обследованы с помощью цветной доплеровской визуализации перед инъекцией ЕТ-1 (ТО), перед началом закапывания лекарственного средства (Т2) и в конце медикаментозного лечения (Т6). Особое внимание было уделено оценке кровотока в глазничной и цилиарной артериях. Для каждого сосуда измеряли скорость кровотока и рассчитывали индекс резистентности (ИР) (Galassi F. et al., Acta Opht. Scand Suppl. (2000) 37-38).

Данные, представленные в Таблице 4, показывают, что флуоцинолон ацетонид значительно увеличивает (р<0.001 против наполнителя) индекс резистентности в глазничной артерии, что указывает на снижение кровяной перфузии; этот эффект не наблюдается при обработке Соединением (1).

Таблица 4:
Влияние Соединения (1) или флуоцинолон ацетонида (FC) против носителя на глазную гемодинамику, оцененную с помощью индекса резистентности.
	Индекс резистенции
	Базальный	Через 2 недели	Через 6 недель
Носитель	0,46±0,07	0,44±0,06	0,48±0,05
FC	0,45±0,06	0,45±0,06	0,60±0,04
Соединение (1)	0,43±0,06	0,43±0,08	0,41±0,03
* р<0,001 против носителя (N=10)

- Содержание воспалительных цитокинов во внутриглазной жидкости

Образцы внутриглазной жидкости были забраны как из передней камеры, так и из задней камеры каждого глаза перед введением ЕТ-1 (ТО), перед введением Соединения (1) или флуоцинолон ацетонида (Т2) и в конце обработки (Т6). Каждый раз повторно вводили то же самое количество физиологического раствора. Образцы внутриглазной жидкости были сразу же заморожены при -80°С до использования.

Во внутриглазной жидкости определяли фактор некроза опухоли (TNFa) и интерлейкин 6 (IL-6) с помощью коммерческого набора, используя метод ELISA (Amersham Pharmacia Biotech). Для IL-6 и TNFa минимальные обнаруживаемые концентрации составили 0,10 пг/мл. Коэффициент вариации для серии экспериментов составил 0,7% для всех анализов. Данные, представленные в таблице 5, показывают, что обработка ЕТ-1 значительно увеличивает содержание TNFa, IL-6 и ФРЭС в образцах внутриглазной жидкости, в то время как Соединение (1) противодействует этим эффектам более эффективно, чем флуоцинолон ацетонид (FC).

Таблица 5:
Влияние Соединения (1) и флуоцинолон ацетонида (FC) на содержание TNF , IL-6 и ФРЭС во внутриглазной жидкости
	TNF (пг/мл)	ФРЭС (пг/мл)	IL-6 (пг/мл)
Базальное	0,55±0,44	-	0,67±0,43
Носитель	27,00±4,30	166,76±4,54	20,47±2,97
FC	20,76±1,74	114,58±5,61	16,82±0,98
Соединение (1)	18,93±0,98	105,79±1,98	15,70±1,73
* р<0,001 против носителя (N=6).

- Защита сетчатки: Морфологический анализ

Глаза каждого животного энуклеировали, удаляли роговицу и стекловидное тело и фиксировали глаза параформальдегидом. Затем образцы дегидратировали увеличивающейся концентрацией спирта (50°-75°-95°-100°). После обработки 95° спиртом глаза разделяли по продольной плоскости от роговицы до прикрепления зрительного нерва. Полученные таким образом образцы заливали в парафин. Секции 8 мм толщиной окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопические поля регистрировали с помощью цифровой камеры, применяя оптический микроскоп с объективом 20x и 40x. По оцифрованным изображениям осуществляли морфологический анализ тканей сетчатки. Анализ тканей сетчатки показал, что долговременная обработка ЕТ-1 вызывает глубокие морфологические изменения, подтверждая таким образом функциональные ухудшения, наблюдаемые на ЭРГ. Эти морфологические изменения отсутствовали у животных, обработанных Соединением (1), тогда как флуоцонолон ацетонид не был эффективен.

Подробное описание рисунков

Фигура 1а: Измерение пропотевания сетчатки у ФРЭС-индуцированных крыс: контроль, обработка соединением (1) и соответствующим ему стероидом, флуоцинолон ацетонидом (FC).

Фигура 1b: Процент ингибирования пропотевания FC и соединением (1), рассчитанный на основании Фигуры 1 а.

Фигура 2а: Измерение пропотевания сетчатки у ФРЭС-индуцированных крыс: контроль, обработка соединением (18) и соответствующим ему стероидом, триамцинолон ацетонидом (ТААС).

Фигура 2b: Процент ингибирования пропотевания соединением (18) и соответствующим ему стероидом, триамцинолон ацетонидом (ТААС), рассчитанный на основании Фигуры 2а.

Фигура 3: Действие на ВГД интравитреального введения in vivo флуоцинолон ацетонида против соединения (1) у серых крыс.

Фигура 4: Действие на ВГД интравитреального введения in vivo флуоцинолон ацетонида (FC), соединения (1) и дез-нитроаналога соединения (1) у серых крыс.