способ получения сорбента на основе неорганических пористых гранул и полигидроксифуллерена для удаления атерогенных липопротеинов из плазмы крови

Формула изобретения

1. Способ получения сорбента для удаления атерогенных липопротеинов низкой плотности из плазмы крови, включающий:

предварительное прогревание неорганических пористых гранул силикагеля до 120-150°С, твердофазную реакцию предварительно прогретого силикагеля с полигидроксифуллереном С₆₀(ОН)_х, где х=12-24, взятом в количестве до 5% по массе силикагеля, в условиях вакуума при давлении 10 ^-5 мм рт.ст. и прогревании до 120°С и последующее перемешивание в течение 50-60 ч.

2. Способ получения сорбента для удаления атерогенных липопротеинов низкой плотности из плазмы крови, включающий:

предварительное прогревание неорганических пористых гранул силикагеля до 120-150°С, добавление диметилдихлорсилана, вакуумирование с одновременным прогревом до 120°С при давлении 10^-5 мм рт.ст., при этом протекает реакция ~Si-OH+Cl ₂SiMe₂ ~Si-O-Si(Me₂)Cl;

- удаление непрореагировавшего диметилдихлорсилана, добавление к хлорированному силикагелю раствора полигидроксифуллерена С₆₀(ОН)_х, где х=12-24, в сухом тетрагидрофуране, проведение реакции

-(Me ₂)Si-Cl+C₆₀(OH)_12-24 ~Si-O-(Me₂)-Si-O-C₆₀(OH)_x-1 в течение суток, удаление избытка реагента, промывка полученного сорбента.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технологии приготовления специфических сорбентов для процесса плазмосорбции и может найти применение в клинической практике при различных нарушениях липидного и липопротеинного обменов.

Одной из наиболее тяжелых форм нарушений липидного обмена является наследственная гиперхолестеринемия, приводящая к тяжелым атеросклеротическим поражениям сердечно-сосудистой системы. Основной причиной развития этой болезни считается нарушение функциональной активности: уменьшение или полное отсутствие на клеточных мембранах соответствующих рецепторов к атергенным липопротеинам (липопротеинам низкой плотности - ЛПНП) [1]. Снижение уровня ЛПНП необходимо также у больных с хронической почечной недостаточностью и у пациентов с тяжелыми формами ишемической болезни сердца [2]. Для снижения концентрации атерогенных липопротеинов, наряду с медикаментозными способами воздействия, особый интерес представляют сорбционные технологии, в частности метод плазмосорбции, позволяющий избирательно удалять за счет процесса адсорбции специфические субстанции, способствующие развитию патологических процессов в организме. При этом в крови должны сохраняться прочие некомплементарные сорбенту ингредиенты, необходимые для правильного функционирования организма.

Принцип терапии, основанный на элиминации атерогенных липопротеинов в экстракорпоральном контуре кровообращения, весьма перспективен при лечении нарушений липидного обмена у человека, но требует создания высокоэффективных селективных биосовместимых гемосорбентов.

Известны сорбенты на основе силикагеля с включением фуллерена (экстракта C₆₀/C₇₀ ), который ковалентно связан с поверхностью за счет функциональных аминогрупп (-NH₂), предварительно введенных в силикагель [3].

Наиболее близким к заявляемому изобретению является сорбент из пористых гранул органического или неорганического материала, содержащих на поверхности фуллерен, удерживаемый за счет сил Ван-дер-Ваальса [4]. Адсорбент является специфическим по отношению к ЛПНП плазмы крови, однако наличие незамещенного фуллерена приводит к гидрофобизации поверхности материала, что существенно снижает его адсорбционную емкость.

Заявляемый сорбционный материал обладает значительно более высокой избирательно адсорбционной емкостью по отношению к ЛПНП при сохранении низкой емкости по отношению к остальным компонентам плазмы крови, что позволяет сохранять их концентрацию в плазме крови на физиологически необходимом уровне. Данное явление представляет собой технический результат заявляемого способа получения сорбента. Этот эффект достигается за счет введения в неорганические пористые гранулы полигидроксифуллеренов С₆₀(ОН)_х (где х=12-24) двумя различными методами:

1) путем твердофазного «физического» связывания полигидроксифуллерена с поверхностью гранул за счет сил Ван-дер-Ваальса (способ 1);

2) посредством «химического» взаимодействия полигидроксифуллерена с поверхностными функциональными группами гранул, приводящего к его ковалентному связыванию (способ 2).

Способ 1 получения сорбента.

Твердофазное получение сорбента включает перемешивание гранул силикагеля и полигидроксифуллерена в вакуумной установке в течение 20-25 часов.

Полигидроксифуллерен получают в процессе гетерофазной реакции раствора фуллерена С ₆₀ в ароматическом растворителе (толуол, ксилол) с водным раствором щелочи (конц. 1% мас.) в присутствии межфазного катализатора тетрабутиламмония гидроксида с последующим осаждением продукта из концентрированного водного раствора метанолом. Окончательное выделение полигидроксифуллерена из водного раствора осуществляется с помощью лиофильной сушки.

Важным отличием заявляемого сорбента от существующих аналогов является меньшая токсичность, которая обусловлена более низкой токсичностью полигидроксифуллерена по сравнению с исходным фуллереном [4]. Кроме того, немодифицированный фуллерен С₆₀ нерастворим и может накапливаться в печени в виде кристаллических агрегатов [5], а используемый Полигидроксифуллерен является водорастворимым и легко выводится из организма.

Заявляемый сорбент имеет преимущество также в том, что при его получении способом 1 не используются токсические органические растворители.

Пример получения заявленного сорбента (способ 1).

В стакан объемом 800 мл помещали раствор фуллерена (200 мг) в ксилоле (толуоле) (100 мл) и 1% раствор щелочи (200 мл), добавляли 2 мл тетрабутиламмоний гидроксида в метаноле и интенсивно перемешивали 30 часов на магнитной мешалке при 50°С. Органический растворитель удаляли декантированием, а его следы - 3-4-х кратным испарением водного раствора продукта с помощью роторного испарителя. Далее для удаления щелочи проводили осаждение полигидроксифуллерена из концентрированного водного раствора метанолом с применением центрифугирования. После достижения рН=7 водного раствора продукт выделяли лиофильной сушкой. Образование С₆₀(ОН)_х подтверждали спектральными методами: ИК- и ПМР-спектроскопией в твердом теле (ПМР-ТТ).

ИК-полосы: 3360 см^-1 ( , О-Н); 1381 см^-1 ( , O-Н); 1068 см^-1 ( , С-O).

ПМР-ТТ сигналы: от 3.654 мд до 4.393 мд в зависимости от числа -ОН групп на фуллереновой сфере и адсорбированной воды.

Для проведения твердофазного взаимодействия в цельнопаяную колбу, снабженную магнитной мешалкой и соединенную с вакуумной линией, помещали 1 г аморфного силикагеля марки МСА, с диаметром пор 250 нм, удельной поверхностью 20 м² /г и общим объемом пор 0.89 мл/г, предварительного прогретого в термостате при t=120-150°С, и 20-45 мг С₆₀(ОН) _х. Вакуумирование проводили с одновременным прогревом до 120°С до достижения остаточного давления 10^-5 мм рт.ст., после чего колбу отделяли от вакуумной линии и помещали на магнитную мешалку для проведения реакции. Перемешивание продолжали в течение 50-60 часов.

Данный способ является технологически простым, не требует дорогостоящего оборудования и экологически безопасен.

Способ 2 получения сорбента.

Способ ковалентного связывания полигидроксифуллерена с поверхностью силикагеля включает две последовательные стадии:

1) обработка силикагеля диметилдихлорсиланом с целью превращения силанольных групп в диметилхлорсилоксановые: ~Si-OH+Cl ₂SiMe₂ ~Si-O-Si(Me₂)Cl;

2) взаимодействие -ОН групп полигидроксифуллерена С₆₀(ОН)_х , где х=12-24, с атомом хлора с образованием на поверхности силикагеля ковалентно связанного полигидроксифуллерена: -(Me₂ )Si-Cl+С₆₀(ОН)_х Si-O-(Me₂)-Si-O-C₆₀(OH)_x-1 .

Сорбент, полученный данным способом, отличается тем, что сохраняется размер гранул силикагеля, но особенно важно, что в процессе сорбции не происходит перехода в плазму крови полигидроксифуллерена.

Пример получения заявленного сорбента (способ 2).

Для проведения реакции силикагеля с диметилдихлорсиланом в цельнопаяную колбу и ампулу с реактивом, отделенную от колбы стеклянной перегородкой и соединенную с вакуумной линией, помещали 1 г аморфного силикагеля марки МСА, с диаметром пор 250 нм, удельной поверхностью 20 м²/г и общим объемом пор 0.89 мл/г, предварительно прогретого в термостате при t=120-150°С. Вакуумирование проводили с одновременным прогревом до 120°С до достижения остаточного давления 10 ^-5 мм рт.ст., после чего колбу отделяли от вакуумной линии. Введение диметилдихлорсилана Cl₂SiMe₂ осуществляли после разбивания перегородки и реакцию продолжали в условиях вакуумной системы в течение суток, после чего непрореагировавший диметилдихлорсилан удаляли переконденсацией в ампулу и отделением ампулы от реакционной колбы. К хлорированному силикагелю добавляли раствор полигидроксифуллерена С₆₀(ОН)_х (50 мг) в сухом тетрагидрофуране (25 мл) и оставляли для проведения реакции на сутки. После завершения реакции избыток реагента удаляли декантированием оставшегося раствора, и полученный сорбент промывали хлороформом и этанолом.

Содержание полигидроксифуллерена в силикагеле подтверждали спектральными методами. В спектрах ИК- и ПМР-ТТ отмечены те же полосы, что и в соответствующих спектрах полигидроксифуллеренов.

Таким образом, как следует из описания, техническим результатом данного изобретения является получение сорбентов для удаления атерогенных липопротеинов низкой плотности двумя различными способами (Способ 1 и Способ 2).

Исследование липидного состава и содержания общего белка в плазме крови до и после проведения сорбции новым сорбентом определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «Хитачи-902» (Япония) с использованием реагентов и контрольных материалов фирмы «Рош диагностика» (Швейцария).

Показатели липидного обмена (общий холестерин - ХС, триглицериды) определяли в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом. Принцип метода заключается в том, что эфиры холестерина и триглицериды подвергаются действию холестеролэстеразы и липопротеинлипазы с образованием, соответственно, спирта и жирных кислот. Затем в ходе реакции с кислородом в присутствии ферментов холестеролоксидазы и глицерофосфатоксидазы образуется перекись водорода.

Концентрацию холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяли прямым энзиматическим методом. Для определения использовали ферменты - холестерол-эстеразу и холестеролоксидазу, содержащие ПЭГ в аминогруппе, который изменяет реактивность ферментов и делает недоступными для их действия все другие фракции липопротеинов (ЛП). ПЭГ-модифицированные ферменты в сочетании с 2-х-валентными ионами Mg² проявляют селективную активность в отношении холестерина преимущественно ЛПВП. В результате реакции под воздействием пероксидазы образуется окрашенное соединение сине-фиолетового цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации холестерина ЛПВП. Данный метод применяется с 1995 года и имеет высокую корреляцию с методами ультрацентрифугирования и преципитации. Пределы линейности измерения для данного набора реактивов составляют 0.08-3.12 ммоль/л.

Концентрацию холестерина в ЛПНП определяли также прямым энзиматическим методом. В реактивы, содержащие ферменты холестеролэстеразу и холестеролоксидазу, включен детергент, обусловливающий селективную мицеллярную растворимость и ионы 2-х-валентного Mg², блокирующие в данном случае энзиматическое определение холестерина в липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП) и хиломикронах (ХМ). Пределы линейности для данного набора реактивов составляют 0.077-14.2 ммоль/л. Параллельно проводили определение концентрации ХС ЛПНП расчетным способом с применением формулы Фридвальда:

[ХС ЛПНП]=[ХС общий]-([ХС ЛПВП]+[ХС ЛПОНП]),

где [ХС ЛПНП] - концентрация холестерина ЛПНП;

[ХС общий] - концентрация общего холестерина;

[ХС ЛПВП] - концентрация холестерина ЛПВП;

[ХС ЛПОНП] - концентрация холестерина ЛПОНП.

Коэффициент атерогенности рассчитывали по формуле акад. РАМН А.Н.Климова [4]:

Коэффициент атерогенности = [ХС общий] - [ХС ЛПВП[/[ХС ЛПВП].

Данные приведены в виде средних значений ± стандартная ошибка. Проверку на нормальность распределения биохимических и клинических показателей проводили с применением критерия Шапиро-Уилка. Поскольку распределение в выборках преимущественно не подчинялось нормальному закону, то кроме параметрического метода (критерий Стьюдента) использовались непараметрические методы. Для оценки связи между явлениями использовали показатель соответствия ², при изучении корреляционных взаимодействий - ранговый коэффициент корреляции Спирмена, для оценки достоверности различий двух сравниваемых совокупностей - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (U).

Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0.05. При р<0.05 различия считались статистически достоверными.

Адсорбционную емкость силикагеля характеризовали коэффициентом элиминирования К_эл, который рассчитывали по формуле

К_ЭЛ=(C₀-C_K)/С₀,

где С₀ и С_К - концентрации компонент в плазме крови до и после сорбции.

Биологические данные по сорбции ХС ЛПНП из плазмы крови приведены в таблицах ниже. Для сравнения сорбционной активности силикагеля с включением полигидроксифуллерена С₆₀(ОН)_х (где х=12-24) (полученного по способу 1 настоящего изобретения) в таблицы включены данные сорбционной активности силикагеля с включением фуллерена (полученного по способу патента [3]).

Таблица 1.
Сопоставление адсорбционной емкости фуллеренсодержащего силикагеля (ФСС), полученного по способу патента [3], и сорбента ( № 2, № 3), полученного по способу 1.
Компоненты плазмы	Содержание в исх. плазме С0	Время экспозиции 10 мин	Время экспозиции 10 мин
ФСС	№ 2	№ 3
СК	К ЭЛ	СК	КЭЛ	СК	КЭЛ
Белок, мг/л	68±6	66.6±6	0.0205	66±6	0.029	66.8±6	0.020
Триглицериды, мМ	1.19±0.12	1.13±0.12	0.0504	0.96±0.1	0.193	1.05±0.10	0.117
Холестерин (ХС), мМ	3.71±0.4	2.32±0.3	0.29	1.33±0.13	0.375	0.7±0.05	0.808
ХС ЛПНП, мМ	2.33±0.2	1.6±0.16	0.300	0.45±0.05	0.806	0.07±0.01	0.969
ХС ЛПВП, мМ	0.90±0.09	0.7±0.07	0.222	0.43±0.05	0.522	0.45±0.05	0.500

Таблица 2.
Сопоставление адсорбционной емкости фуллеренсодержащего силикагеля (ФСС), полученного по способу патента [3], и сорбента, полученного по способу 2 (образцы № 4, № 5).
Компоненты плазмы	Содержа ние в исх. Плазме, Со	Время экспозиции 10 мин	Время экспозиции 10 мин
ФСС	№ 4	№ 5
СК	К ЭЛ	СК	КЭЛ	СК	КЭЛ
Белок, мг/л	68±6	66.6±6	0.020	67.2±6	0.012	67.2±6	0.012
Триглицериды, мМ	1.19±0.12	1.13±0.12	0.060	1.0±0.1	0.150	1.1±0.1	0.075
Холестерин (ХС), мМ	4,71±0.5	3.3±0.3	0.300	2.95±0.3	0.350	3.1±0.3	0.342
хс лпнп, мМ	3.33±0.4	2.56±0.3	0.230	0.42±0.04	0.874	0.55±0.05	0.835
ХС ЛПВП, мМ	0.80±0.1	0.59±0.5	0.263	0.51±0.05	0.368	0.6±0.06	0.250

Таблица 3.
Сопоставление значений КЭЛ ФСС (патент [3]) и силикагелей, содержащих полигидроксифуллерен С60(ОН)х : № 6, № 7 (способ 1) и № 8, № 9 (способ 2).
Компоненты плазмы	КЭЛ
ФСС	№ 6	№ 7	№ 8	№ 9
Белок, мг/л	0.05+0.005	0.030	0.025	0.011	0.010
Триглицериды, мМ	0.1+0.01	0.180	0,117	0.159	0.070
Холестерин, мМ	0.33+0.03	0.375	0.808	0.373	0.342
ХС ЛПНП, мМ	0.33+0.03	0.800	0.953	0.861	0.825
ХС ЛПВП, мМ	0.1+0.01	0.456	0.378	0.360	0.257

Таблица 4.
Сопоставление значений Кэл в зависимости от способа получения сорбента.
Образец сорбента	Способ получения	Кэл (по ХС ЛПНП)
ФСС	Согласно патенту [3]	0.300
№ 2	Способ 1	0.806
№ 3	Способ 1	0.969
№ 4	Способ 2	0.874
№ 5	Способ 2	0.835
№ 6	Способ 1	0.800
№ 7	Способ 1	0.953
№ 8	Способ 2	0.861
№ 9	Способ 2	0.825

Как видно из приведенных данных, сорбенты, полученные согласно настоящему изобретению, обладают более высокой сорбцией ЛПНП из плазмы крови, чем известный сорбент [3].

Литература

1. Brown M., Goldstein J. - Proc. Nat. Acad Sci. USA. - 1974, v. 71, p.788-792.

2. Лопатин Н.А., Лопухин Ю.Я. - Эфферентные методы в медицине. - M.: «Медицина». - 1989, с.347.

3. Патент США № 5308481, МПК: B01D 15/08, опубл. 03.05.94 г.

4. Седов В.М., Подосенова Н.Г., Андожская Ю.С., Андожская И.В., Кузнецов А.С. (1998), Авторское свидетельство. Сорбент для удаления атерогенных липопротеидов низкой плотности из плазмы крови и способ его получения (заявка № 96116479, патент № 311854).

5. С.Wang, L.A.Tai, D.D.Lee, P.P.Kanakamma, C.K.Shen, T.Y.Luh, C.H.Cheng, K.C.Hwang. С₆₀ and Water-Soluble Fullerene Derivatives as Antioxidants Against Radical-Initiated Lipid Peroxidation. J. Med. Chem., 42(1999) 4614-4620.

6. Пиотровский Л.Б., Думпис М.А., Литасова Е.В., Сафонова А.Ф., Селина Е.Н., Бульон В.В., Родионова О.М., Сапронов Н.С. Токсикология углеродных наноструктур. Мед. Акад. Журн. 2010, т.10, с.125-134.