композиции стабильных солей элсамитруцина

Формула изобретения

1. Жидкая композиция элсамитруцина для лечения опухолевых заболеваний или состояний, включающая:

a) по меньшей мере одну стабильную соль элсамитруцина, где указанная по меньшей мере одна стабильная соль элсамитруцина представляет собой продукт свободного основания элсамитруцина и органической кислоты, который может существовать как стабильное твердое вещество и не включает псевдосоли или соли, полученные in situ, которые существуют только в растворе, и

b) фармацевтически приемлемый носитель,

причем указанная жидкая композиция не содержит антиоксиданты или метанол, этанол, хлороформ, н-бутанол или т-бутанол в качестве примесей, и указанная по меньшей мере одна стабильная соль элсамитруцина сохраняет по меньшей мере 90% своей противоопухолевой активности в течение 18 месяцев в жидкой форме при подходящей температуре хранения.

2. Жидкая композиция по п.1, которая не содержит буфер для поддержания pH раствора.

3. Жидкая композиция по п.1, в которой указанная по меньшей мере одна стабильная соль элсамитруцина сохраняет свою активность более чем на 90% в течение периода более чем 2,5 года при 25°C.

4. Жидкая композиция по п.1, дополнительно включающая регулирующий осмотическое давление агент.

5. Жидкая композиция по п.4, в которой указанный регулирующий осмотическое давление агент представляет собой маннит.

6. Жидкая композиция по п.1, имеющая pH от примерно 3,5 до примерно 4,5.

7. Жидкая композиция по п.1, имеющая pH от примерно 3,0 до примерно 4,0.

8. Жидкая композиция по п.1, имеющая pH примерно 4,0.

9. Жидкая композиция по п.1, в которой указанная стабильная соль элсамитруцина выбрана из группы, состоящей из лактата элсамитруцина, фумарата элсамитруцина, малеата элсамитруцина, сукцината элсамитруцина, тартрата элсамитруцина, тозилата элсамитруцина, метансульфоната элсамитруцина, бензоата элсамитруцина, салицилата элсамитруцина, гидрохлорида элсамитруцина, сульфата элсамитруцина и фосфата элсамитруцина.

10. Жидкая композиция по п.9, в которой указанная стабильная соль элсамитруцина представляет собой тозилат элсамитруцина.

11. Жидкая композиция по п.1, в которой указанный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду или солевой раствор.

12. Жидкая композиция по п.1, в которой указанный элсамитруцин имеет константу нулевого порядка (kT) скорости разложения, равную 5,79×10 ^-5 мг/мл в день при 5°C.

13. Жидкая композиция по п.1, в которой указанный элсамитруцин имеет константу нулевого порядка (kT) скорости разложения, равную 9,84×10^-4 мг/мл в день при 25°C.

14. Жидкая композиция по п.1, которая имеет pH примерно 4,0 и включает 1,32% мас./об. тозилата элсамитруцина и 4,77% (мас./об.) маннита.

15. Жидкая композиция по п.14, в которой указанный элсамитруцин имеет константу нулевого порядка (kT) скорости разложения, равную 5,79×10^-5 мг/мл в день при 5°C.

16. Жидкая композиция по п.14, в которой указанный элсамитруцин имеет константу нулевого порядка (kT) скорости разложения, равную 9,84×10^-4 мг/мл в день при 25°C.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка притязает на приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/015183, поданной 19 декабря 2007. Содержание этой заявки включено путем ссылки во всей ее полноте в настоящую заявку.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям элсамитруцина, подходящим для парентерального введения для лечения опухолевых заболеваний и состояний.

Уровень техники

Элсамитруцин представляет собой гетероциклический противоопухолевый антибиотик, выделенный из штамма J907-21 грамположительной бактерии Actinomycete, как описано в патентах США № № 4518589 и 4572895, которые включены в настоящую заявку путем ссылки во всем, что касается природы, химического состава, способов получения и биологической активности элсамитруцина. Элсамитруцин встраивается в ДНК в богатые гуанидином-цитозином (G-C) последовательности и ингибирует топоизомеразу I и II, приводя к однонитевым разрывам и ингибированию репликации ДНК. Элсамитруцин обладает значительной онколитической активностью по отношению к метастатическому раку груди, раку толстой кишки и раку прямой кишки, немелкоклеточному раку легкого и раку яичников, и у пациентов с рецидивировавшей или резистентной неходжкинской лимфомой.

Элсамитруцин с химической точки зрения известен как 10-((2-O-(2-амино-2,6-дидезокси-3-O-метил-альфа-D-галактопиранозил)-6-дезокси-3-C-метил-бета-D-галактопиранозил)окси)-6-гидрокси-1-метил-бензо(h)(1)бензопирано(5,4,3-cde)(1)бензопиран-5,12-дион и имеет структуру, полностью представленную формулой I. Элсамитруцин также известен как 10-O-элсаминосилелсарозилчартарин, BBM 2478A, BMY-28090, SPI-28090, BRN 5214813, элсамицин A, элсамитруцина и элсамитруцин.

В известный из уровня техники порошок лиофилизированного элсамитруцина вводят янтарную кислоту с добавлением стерильной воды. Это приводит к образованию соли элсамитруцина in situ в результате растворения основания элсамитруцина в органическом растворителе и затем добавления достаточного количества водной янтарной кислоты с образованием раствора с отношением солюбилизированного свободного основания к кислоте 1:1. Затем pH полученного раствора элсамитруцина-янтарной кислоты доводят до значения в диапазоне от 3,5 до 4,5 и смешивают с наполнителем, таким как маннит, чтобы повысить стабильность перед лиофилизацией (смотри, например, патент США № 5508268). Стабильные соли элсамитруцина в порошкообразной форме (кристаллической или аморфной) в настоящее время не доступны, следовательно, все высокорастворимые фармацевтические композиции элсамитруцина должны быть получены in situ с использованием свободного основания. Элсамитруцин типично вводят парентерально (обычно внутривенно) животным, включая людей, и поставляют в виде лиофилизированного порошка, который разводят стерильной водой для инъекций непосредственно перед применением вследствие присущей образованным in situ солям известного уровня техники нестабильности.

Следовательно, существует необходимость в композициях, которые содержат стабильные соли элсамитруцина. Данные композиции должны содержать соли, которые могут быть получены без использования свободного основания и соответствующих органических растворителей, необходимых для того, чтобы солюбилизовать свободное основание in situ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим водорастворимые, твердые соли элсамитруцина, которые подходят для парентерального введения для лечения опухолевых заболеваний и состояний.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает раствор по меньшей мере одной стабильной твердой соли элсамитруцина и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция не требует буфера для поддержания pH раствора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция не требует стабилизирующего антиоксиданта.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает регулирующий осмотическое давление агент.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает агент для установления pH в диапазоне от примерно 3,5 до примерно 4,5.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH композиции составляет примерно 4,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения твердая соль элсамитруцина композиции выбрана из группы, состоящей из лактата элсамитруцина, фумарата элсамитруцина, малеата элсамитруцина, сукцината элсамитруцина, тартрата элсамитруцина, тозилата элсамитруцина, метансульфоната элсамитруцина, бензоата элсамитруцина, салицилата элсамитруцина, гидрохлорида элсамитруцина, сульфата элсамитруцина и фосфата элсамитруцина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения твердая соль элсамитруцина композиции представляет собой тозилат элсамитруцина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду или солевой раствор.

Данные и другие задачи, преимущества и признаки изобретения будут более подробно рассмотрены далее.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 изображены кристаллы тозилата элсамитруцина, перекристаллизованного из смеси ацетонитрил:вода 1:1, полученного согласно идеям настоящего изобретения.

Фиг.2A и 2B иллюстрируют активность лекарственной формы 2,5 мл элсамитруцина F2 RTU при 5°C в зависимости от времени.

Фиг.3A и 3B иллюстрируют активность лекарственной формы 2,5 мл элсамитруцина F2 RTU при 25°C в зависимости от времени.

Фиг.4A и 4B иллюстрируют активность лекарственной формы 2,5 мл элсамитруцина F2 RTU при 40°C в зависимости от времени.

Фиг.5A и 5B иллюстрируют активность лекарственной формы 2,5 мл элсамитруцина F2 RTU при 60°C в зависимости от времени.

На Фиг.6 показана диаграмма Аррениуса для лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU в перевернутом положении.

На Фиг.7 показана диаграмма Аррениуса для лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU в вертикальном положении.

Определение терминов

Перед изложением описания может быть полезно дать толкование определенным терминам, которые будут использованы ниже в настоящем описании.

Аналог(и): В том смысле как этот термин использован здесь, аналог(и) включают соединения, имеющие структурное сходство с другим соединением. Например, противовирусное соединение ацикловир является аналогом нуклеозидов и структурно схож с нуклеозидом гуанозином, который является производным основания гуанина. Таким образом, ацикловир имитирует гуанозин (биологически аналогичен ему ) и препятствует синтезу ДНК, замещая остатки гуанозина (конкурируя с ними) в вирусной нуклеиновой кислоте, и предотвращает трансляцию/транскрипцию. Таким образом, соединения, имеющие структурное сходство с другим (исходным соединением), которое имитирует биологическую или химическую активность исходного соединения, являются аналогами. Не существует минимальных или максимальных чисел замещений элементных или функциональных групп, требуемых для квалификации в качестве аналога, в том смысле как этот термин использован здесь, если аналог способен имитировать некоторым релевантным образом, либо идентично, комплиментарно, либо конкурентно, с биологическими или химическими свойствами исходного соединения. Аналоги могут представлять собой, и часто представляют собой, производные исходного соединения (смотри ниже производное ). Аналоги соединений, раскрытых здесь, могут иметь равную, меньшую или большую активность, чем их исходные соединения.

Производное: В том смысле как этот термин использован здесь, производное представляет собой соединение, полученное либо в природе, либо синтетически из (происходящее из) исходного соединения. Производное может являться аналогом (смотри выше аналог ) и, таким образом, может обладать схожей химической или биологической активностью. Однако, в том смысле как этот термин использован здесь, производное не обязательно должно имитировать активность исходного соединения. Не существует минимальных или максимальных чисел замещений элементных или функциональных групп, требуемых для квалификации в качестве производного. Например, противовирусное соединение ганкловир является производным ацикловира. Ганкловир имеет другой спектр противовирусной активности в отличие от ацикловира, а также другие токсикологические свойства. Производные соединений, раскрытых здесь, могут иметь равную, меньшую, большую или несхожую активность, в сравнении с их исходными соединениями.

Элсамитруцин: В том смысле как он использован здесь, термин элсамитруцин относится к противоопухолевому соединению, имеющему молекулярную массу приблизительно 825,83 Да и химически известному как 10-((2-O-(2-амино-2,6-дидезокси-3-O-метил-альфа-D-галактопиранозил)-6-дезокси-3-C-метил-бета-D-галактопиранозил)окси)-6-гидрокси-1-метил-бензо(h)(1)бензопирано(5,4,3-cde)(1)бензопиран-5,12-дион и которое имеет общую структуру, представленную формулой I. Элсамитруцин также известен как 10-O-элсаминосилелсарозилчартарин, BBM 2478A, BMY-28090, SPI-28090, BRN 5214813, элсамицин A, элсамитруцина и элсамитруцин. Смотри патенты США № № 4518589 и 4572895 касательно способов выделения элсамитруцина из природных источников и его характеризации. Смотри также Konishi M, Sugawara K, Kofu F, Nishiyama Y, Tomita K, Miyaki T, Kawaguchi H. 1986. Elsamicins, new antitumor antibiotics related to chartreusin I. Production, isolation, characterization and antitumor activity. J. Antibiot. (Tokyo) Jun; 39(6):784-91.

Композиция: В том смысле как он использован здесь, термин «композиция» относится к фармацевтически приемлемому препарату, включающему одну или более солей элсамитруцина настоящего изобретения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, такой как, но без ограничения ими: вода для инъекций или солевой раствор. Более того, композиции настоящего изобретения могут также включать стабилизаторы, консерванты или дополнительные терапевтические агенты. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть введены любым способом, известным специалистам в данной области, и идеально подходят для внутривенного введения или инъекции в кожу, мышцу или другие ткани тела. Фармацевтическая композиция может быть предназначена для перорального введения.

Соль: В том смысле как этот термин использован здесь, соль или соли включают любые соединения, которые получаются в результате замещения части или всего кислого водорода кислоты металлом или группой, действующей как металл: ионное кристаллическое соединение. В данном случае соль представляет собой продукт свободного основания и органической кислоты, который может существовать как стабильное твердое вещество и не включает псевдосоли или соли, полученные in situ, которые существуют только в растворе.

Подходящая(ие) солевая(ые) форма(ы): В том смысле как он использован здесь, термин подходящая(ие) солевая(ые) форма(ы) означает соль элсамитруцина, полученную в стабильном твердом состоянии либо в виде аморфной, либо в виде кристаллической формы.

Твердое вещество или твердая соль: В том смысле как он использован здесь, термин твердое вещество или твердая соль относится к соли элсамитруцина, существующей в твердом состоянии и содержащей менее 30% остаточной влаги, предпочтительно, менее 10% остаточной влаги и, более предпочтительно, менее 5% остаточной влаги. В том смысле как он использован здесь, термин влага относится к воде или органическому растворителю. Термин твердое вещество также использован здесь, чтобы отличить соли элсамитруцина настоящего изобретения от солей, образованных in situ и существующих главным образом в водной фазе. Более того, настоящие твердые соли не являются продуктом сушки в вакууме при замораживании или лиофилизации.

Стабильный: В том смысле как он использован здесь, термин стабильный относится к соли элсамитруцина или к парентеральной композиции, содержащей соль элсамитруцина (полученной способом, отличным от образования соли in situ), в которой соль элсамитруцина сохраняет показатели ЯМР, указывающие на практически идеальное солевое отношение 1:1 (таким образом, не показывая разложения в твердом состоянии) в ходе высушивания при повышенных температурах при 75°C в течение девяти часов или, более предпочтительно, при 98°C в течение ночи. Более того, в том смысле как он использован здесь, термин стабильный относится к соли элсамитруцина, содержащейся в парентеральной композиции, которая сохраняет по меньшей мере 90% своей противоопухолевой активности, как определено в in vitro испытании на торможение роста (смотри пример 4), в течение по меньшей мере 24 месяцев в твердой форме и в течение 18 месяцев в жидкой форме при подходящей температуре хранения.

Подробное описание изобретения

Элсамитруцин и структурно родственные ему антибиотики связываются с GC-богатыми участками ДНК, явно предпочитая В-ДНК по сравнению с Z-ДНК. Они ингибируют синтез РНК и вызывают однонитевой разрыв ДНК через образование свободных радикалов. Элсамитруцин можно также рассматривать как наиболее активный ингибитор топоизомеразы II из тех, о которых сообщалось до настоящего времени, и он может ингибировать образование некоторых комплексов ДНК-белок. Элсамитруцин связывается с P1 и P2 промотирующими участками онкогена c-myc, ингибирует связывание фактора транскрипции Sp1, ингибируя таким образом транскрипцию.

Элсамитруцин показал активность у пациентов с рецидивировавшей или резистентной неходжкинской лимфомой и in vivo активность в отношении широкого ряда мышиных новообразований, включая лейкоз P388, лейкоз L1210 и меланому B16 и M5076, а также в отношении ксенотрансплантатов MX1 и HCT116 (смотри, например, Raber MN, Newman RA, Newman BM, Gaver RC, Schacter LP. 1992 Phase I trial and clinical pharmacology of elsamitrucin. Cancer Res. Mar 15; 52(6):1406-10).

Кроме того, экспериментальная терапия резистентной/рецидивировавшей неходжкинской лимфомы продемонстрировала, что связанная с элсамитруцином токсичность относительно слаба и заключалась главным образом в астении, тошноте и рвоте, и не включала миелосупрессию. Активность элсамитруцина и отсутствие миелосупрессии предполагает, что он подходит для лечения данного заболевания особенно в сочетании с другими доказавшими свою эффективность агентами (смотри Allen SL, Schacter LP, Lichtman SM, Bukowski R, Fusco D, Hensley M, O'Dwyer P, Mittelman A, Rosenbloom B, Huybensz S. 1996. Phase II study of elsamitrucin (BMY-28090) for the treatment of patients with refractory/relapsed non-Hodgkin's lymphoma. Invest. New Drugs. 14(2):213-17).

In vivo активность элсамитруцина также была исследована в сравнении с активностью доксорубицина (DX) на двух чувствительных клеточных линиях рака груди: одной положительной по рецепторам эстрогенов линии (ER+, MCF7) и одной отрицательной по рецепторам эстрогенов линии (ER-, MDA-MB-231), и на DX-резистентной сублинии (MCF7DX). Активность двух лекарственных средств также исследовали на 19 клинических образцах рака груди, взятых у нелеченых пациентов. Лекарственные средства испытывали при фармакологически релевантных концентрациях, как рассчитано из площади под кривой для 3-часового воздействия до летальной дозы, дающей смертность 10% (LD10) у мышей, и при 10- и 100-кратных концентрациях. В случае DX-чувствительных линий ингибирование РНК и включения предшественников ДНК, а также клеточной пролиферации, вызывалось в большей степени элсамитруцином, чем DX. Более того, антипролиферативный эффект был в 10 раз выше в случае ER+ MCF7, чем в случае клеточной линии ER- MDA-MB-231 (IC50: 0,25 против 0,21 микрограмм/мл). В сублинии MCF7DX наблюдалась перекрестная резистентность элсамитруцина к DX. В клинических образцах воздействия на включение предшественников ДНК отмечались чаще для элсамитруцина, чем для DX при одинаковых концентрациях лекарственных средств. In vitro чувствительность к элсамитруцину была более выражена в случае опухолей ER+, чем в случае опухолей ER-: минимальные концентрации ингибирования лекарственного средства составляли 0,1 и 3,5 микрограмм/мл, соответственно, в двух группах. Данные in vitro результаты могут указывать на обещающую роль элсамитруцина в клинической терапии, главным образом пациентов с раком груди ER+ (смотри Silvestrini R, Sanfilippo O, Zaffaroni N, De Marco C, Catania S. 1992. Activity of a chartreusin analog, elsamitrucin, on breast cancer cells. Anticancer Drugs. Dec; 3(6):677-81).

Патент США № 5508268, выданный 16 апреля 1996, авторы Nassar и др., патентообладатель Bristol-Myers Squibb (далее в настоящем описании патент '268), раскрывает парентеральные композиции, включающие основание элсамитруцина, органическую кислоту, стабилизатор и буфер. Композиции элсамитруцина, раскрытые в этом патенте, получали, используя различные органические кислоты, включая соляную, L(+)-молочную, L-винную, D-глюкуроновую, метансульфоновую, адипиновую и янтарную, причем янтарная кислота являлась предпочтительной. Композиции элсамитруцина получают согласно содержанию примера, приведенного в столбце 4, строки 5-30. В данном примере описана только сукцинатная соль. Конкретно, согласно приведенной в патенте '268 информации соль элсамитруцина образуется in situ при использовании органической кислоты в сочетании с по меньшей мере одним восстановителем (консервант) при pH, отрегулированном до приблизительно 4. Полученный раствор фильтровали и сохраняли в жидком состоянии для испытания на стабильность. В других вариантах осуществления, раскрытых в патенте '268, органическую кислоту, основание элсамитруцина, восстановитель и другие подходящие фармацевтические формообразующие, такие как сахара, но без ограничения ими, смешивают в растворе и полученную композицию лиофилизируют.

Однако патент '268 не раскрывает, не обсуждает и не дает сведений о стабильных твердых солях элсамитруцина. Полностью в отличие от идей патента '268 авторы настоящего изобретения обнаружили способы, которые дают стабильные твердые соли элсамитруцина, полученные с использованием основания элсамитруцина и выбранных органических кислот. Конечные композиции, полученные в соответствии с идеями настоящего изобретения, представляют собой твердые, сухие или частично высушенные порошки солей элсамитруцина в противоположность лиофилизатам, описанным в патенте '268. Таким образом, композиции солей элсамитруцина настоящего изобретения представляют собой истинные соли в твердом состоянии, а не in situ растворы, содержащие смесь солюбилизированного основания и органической кислоты.

Настоящее изобретение предлагает многочисленные преимущества по сравнению с in situ образованными смесями, описанными в патенте '268. Во-первых, соли элсамитруцина, полученные в соответствии с идеями настоящего изобретения, могут быть тщательно проанализированы на наличие примесей и очищены по необходимости, чтобы отвечать весьма высоким государственным предписаниям. Более того, истинные соли по настоящему изобретению могут быть с точностью взвешены и растворены в подходящих фармацевтических носителях, таких как вода для инъекций. Выбранные соли сами являются чрезвычайно стабильными при хранении в твердом состоянии и имеют длительные сроки хранения, как и соответствующие им солюбилизированные растворы. Таким образом, парентеральные растворы могут быть получены с использованием солей элсамитруцина настоящего изобретения и могут быть сохранены в течение длительных периодов времени.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает по меньшей мере одну стабильную твердую соль элсамитруцина и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция не требует буфера для поддержания pH раствора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция не требует стабилизирующего антиоксиданта.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает регулирующий осмотическое давление агент.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает агент для установления pH в диапазоне от примерно 3,5 до примерно 4,5.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения pH композиции составляет примерно 4,0.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения твердая соль элсамитруцина композиции выбрана из группы, состоящей из лактата элсамитруцина, фумарата элсамитруцина, малеата элсамитруцина, сукцината элсамитруцина, тартрата элсамитруцина, тозилата элсамитруцина, метансульфоната элсамитруцина, бензоата элсамитруцина, салицилата элсамитруцина, гидрохлорида элсамитруцина, сульфата элсамитруцина и фосфата элсамитруцина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения твердая соль элсамитруцина композиции представляет собой тозилат элсамитруцина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду или солевой раствор.

Раскрытые в настоящем изобретении композиции могут не требовать буфера для поддержания pH. Буферные агенты обычно представляют собой либо слабую кислоту, либо слабое основание, которые составляют буферный раствор. Буферные агенты обычно добавляют в воду, чтобы создать буферные растворы. Они представляют собой вещества, которые ответственны за буферное поведение, наблюдаемое в данных растворах. Данные агенты добавляют к веществам, которые подлежат помещению в кислые или основные условия, для того, чтобы стабилизировать вещество. Например, забуференный аспирин содержит буферный агент, такой как MgO, который будет поддерживать pH аспирина, когда он проходит через желудок пациента. Другим применением буферного агента являются антацидные таблетки, основная цель которых заключается в том, чтобы понизить кислотность желудка. Примерами буферных агентов являются следующие, но без ограничения ими: дигидрофосфат калия, янтарная кислота, L(+)-молочная кислота и L-винная кислота.

При получении настоящих композиций можно просто использовать агент, чтобы установить желаемое pH, но его использование для поддержания pH не является необходимым. Кислоты и основания могут быть использованы с данной целью. Примером одного такого агента является сильное основание, такое как NaOH. Сильное основание представляет собой основное химическое соединение, которое способно депротонировать очень слабые кислоты в кислотно-основной реакции. Соединения с pK_a более примерно 13 называются сильными основаниями. Обычными примерами сильных оснований являются гидроксиды щелочных металлов и щелочноземельных металлов, подобные NaOH и Ca(OH)₂.

Специалист обычной квалификации в данной области может определить желаемое pH или диапазон(ы) pH для композиции элсамитруцина и установить данное pH или диапазон(ы) pH, используя pH-регулирующий агент, если необходимо. Для целей настоящего изобретения диапазоны pH могут представлять собой следующие, но без ограничения ими: от примерно 3,5 до примерно 4,5 и от примерно 2,0 до примерно 4,0. В другом варианте осуществления pH может составлять примерно 4.

Также, настоящая композиция не требует стабилизирующего антиоксиданта. Стабилизирующий антиоксидант представляет собой молекулу, способную замедлять или предотвращать окисление других молекул. Окисление представляет собой химическую реакцию, которая переносит электроны от вещества к окислителю. Реакции окисления могут порождать свободные радикалы, которые запускают цепные реакции, которые повреждают клетки. Антиоксиданты обрывают данные цепные реакции, удаляя свободнорадикальные интермедиаты, и ингибируют другие реакции окисления за счет того, что окисляются сами. Поэтому антиоксидантами часто являются восстановители, такие как тиолы или полифенолы. Дополнительные примеры антиоксидантов включают следующие, но без ограничения ими: антиоксиданты, содержащие серу и щелочной металл. Примеры антиоксидантов, содержащих серу и щелочной металл, включают следующие, но без ограничения ими: метабисульфит натрия, ацетон-бисульфит натрия и формальдегид-сульфоксилат натрия.

Один или более регулирующих осмотическое давление агентов могут быть включены в раскрытую в настоящем изобретении композицию. Регулирующие осмотическое давление агенты представляют собой химикаты, которые устанавливают осмотическое давление раствора. Осмотическое давление представляет собой гидростатическое давление, оказываемое раствором в пространстве, разделенном полупроницаемой мембраной вследствие разницы в концентрациях растворенного вещества. Включение регулирующих осмотическое давление агентов может быть необходимо для соответствия осмотическому давлению организма пациента. Примеры таких регулирующих осмотическое давление агентов включают следующие, но без ограничения ими: маннит и хлорид натрия.

Раскрытые в настоящем изобретении композиции могут быть получены в виде готовых к использованию растворов. Тогда как ранее описанные растворы элсамитруцина, такие как описано в патенте США № 5508628, лиофилизировали, чтобы получить твердую форму, которую восстанавливали фармацевтическим носителем, таким как вода, непосредственно перед введением, раскрытые в настоящем изобретении композиции стабильны в жидкой форме и имеют длительный срок хранения, как описано в примерах ниже. Следовательно, раскрытые в настоящем изобретении растворы, могут быть сохранены и введены без восстановления перед использованием. Пригодная для использования композиция патента США № 5508628 требует лиофилизации, поскольку in situ образованный раствор соли элсамитруцина содержал остаточные растворители, такие как метанол, этанол, хлороформ, н-бутанол и т-бутанол. Высушивание при замораживании (также известное как лиофилизация или криосушка) представляет собой способ обезвоживания, типично используемый для консервации портящегося материала или чтобы сделать материал более удобным для транспортировки. Высушивание при замораживании осуществляется замораживанием материала и затем снижением окружающего давления и подводом достаточного тепла, чтобы позволить замороженной воде в материале сублимироваться непосредственно из твердой фазы в газ.

Присутствие остаточных растворителей было бы неприемлемым в случае введения пациенту. Лиофилизация была необходима для удаления данных примесей в патенте США № 5508628. В одном варианте осуществления раскрытые в настоящем изобретении композиции не содержат таких примесей, которые представляют собой, например, метанол, этанол, хлороформ, н-бутанол и т-бутанол.

Следующие примеры приведены в качестве иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что стабильные высушенные или почти высушенные соли элсамитруцина настоящего изобретения не ограничены следующими примерами. Идеи примеров, которые описаны ниже, могут быть использованы химиком-фармацевтом обычной квалификации в качестве руководства для создания других вариантов, которые приводят к таким же композициям, которые раскрыты здесь.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Первоначальное получение стабильных солей элсамитруцина настоящего изобретения

Малые порции солей элсамитруцина получали перед оптимизацией и масштабированием. Выбирали восемь противоионов на основе органических кислот, причем они включали молочную кислоту, малеиновую кислоту, янтарную кислоту, L-винную кислоту, п-толуолсульфокислоту (также называемую здесь п-TSA или тозилат), бензойную кислоту, салициловую кислоту и серную кислоту. Три растворителя выбирали на основе способов предварительного скрининга, известных специалистам в области фармацевтической химии, причем выбранные растворители включали диоксан, диметилформамид (DMF) и уксусную кислоту (AcOH). Дополнительное сочетание п-TSA/MeOH включали для суммарного числа двадцати пяти реакций варьирования.

В каждый реакционный флакон помещали 3,0×10^-5 моль основания элсамитруцина. Основание элсамитруцина растворяли в 0,25 мл DMF или AcOH при 55°C, 1,5 мл диоксана при 80°C или 12 мл MeOH при 70°C и перемешивали в течение пяти минут, чтобы обеспечить растворение. Затем в каждый флакон помещали 245-270 мкл 0,126 М раствора в диоксане одной из органических кислот, перечисленных выше (смотри Таблицу 1), что соответствовало 1,05 эквивалента каждой из восьми кислот (винную кислоту суспендировали в смеси метанол/вода 1:1 вследствие ее нерастворимости в диоксане).

Таблица 1
	Кислота	A - Диоксан (1,5 мл)		B - DMF (0,25 мл)		C - AcOH (0,25 мл)		D - MeOH (12 мл)
		API (мг)	Раствор кислоты 0,126 М (мл)	API (мг)	Раствор кислоты 0,126 М (мл)	API (мг)	Раствор кислоты 0,126 М (мл)	API (мг)	Раствор кислоты 0,126 М (мл)
1	Молочная	20,25	0,200	20,01	0,255	19,13	0,245	-	-
2	Малеиновая	19,96	0,255	21,22	0,270	20,23	0,260	-	-
3	Янтарная	20,42	0,260	19,18	0,245	19,12	0,245	-	-
4	L-винная	20,65	0,265	19,55	0,250	19,62	0,250	-	-
5	п-TSA	19,52	0,250	19,41	0,250	19,61	0,250	21,08	0,270
6	Бензойная	19,63	0,250	21,03	0,270	19,96	0,255	-	-
7	Салициловая	19,95	0,255	21,04	0,270	20,15	0,260	-	-
8	Серная	19,54	0,250	21,17	0,270	19,97	0,255	-	-
API = основание элсамитруцина

Начальную температуру поддерживали в течение десяти минут и затем снижали до комнатной температуры со скоростью 20°C/час для DMF и AcOH, 30°C/час для диоксана и 25°C/час для MeOH. Твердые вещества образовывались во флаконах с диоксаном/L-винной кислотой, диоксаном/п-TSA, диоксаном/серной кислотой и AcOH/серной кислотой. Твердые вещества отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. В случае флаконов, в которых твердые вещества не образовывались, проводили концентрирование досуха потоком азота и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. Метанол удаляли в вакууме, и полученный остаток высушивали в высоком вакууме при комнатной температуре. Все образцы анализировали рентгеновской дифракцией (XRPD), дифференциальной сканирующей калориметрией (DSC) и термогравиметрическим анализом (TGA) для определения кристалличности солей. Кристаллические твердые вещества были получены из диоксана/серной кислоты и из AcOH/серной кислоты; полукристаллические твердые вещества были получены из диоксана/L-винной кислоты, диоксана/п-TSA, DMF/молочной кислоты, DMF/малеиновой кислоты, DMF/L-винной кислоты, DMF/бензойной кислоты, DMF/серной кислоты, AcOH/молочной кислоты, AcOH/п-TSA и AcOH/бензойной кислоты. С помощью XRPD было найдено, что все остальные вещества являлись аморфными.

Пример 2

Оптимизация получения солей элсамитруцина

Следующие три соли элсамитруцина, полученные согласно идеям примера 1, были выбраны для разработки масштабированного способа получения. Выбранными солями являлись тартрат элсамитруцина, сульфат элсамитруцина и тозилат элсамитруцина. Они были выбраны поскольку каждая из них давала кристаллические или полукристаллические твердые вещества, которые осаждались в ходе охлаждения, что может улучшить выделение и очистку (если необходимо) соли и, таким образом, делает их более подходящими для более масштабных технологий производства. Однако то, что они выбраны для целей примера 2, не следует рассматривать как ограничение.

L-Винную кислоту, серную кислоту и п-TSA растворяли в диоксане. В каждую из подходящих реакционных емкостей загружали 1,7×10 ^-4 моль основания элсамитруцина, которое растворяли в 7,5 мл диоксана при 80°C, и перемешивали в течение пяти минут, чтобы обеспечить растворение. Затем в каждый флакон помещали 350-380 мкл 0,5 М раствора органической кислоты в диоксане, что соответствовало приблизительно 1,05 эквивалента каждой из трех кислот (Таблица 2).

Таблица 2
Эксперимент №	Элсамитруцин (мг)	Растворитель	Количество (мл)	Кислота (0,5 М)	Количество (мл)
1	118	Диоксан	9,0	Серная	0,38
2	113	Диоксан	7,0	п-TSA	0,36
3	108	Диоксан	7,5	L-винная	0,35

Начальную температуру поддерживали в течение десяти минут и затем снижали до комнатной температуры со скоростью 30°C/час для диоксана. Твердые вещества образовывались при добавлении кислоты во флаконы в случае диоксана/L-винной кислоты и диоксана/серной кислоты, а для диоксана/п-TSA осаждение происходило в ходе охлаждения. После фильтрования твердые вещества высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. Образцы анализировали с помощью XRPD, DSC и TGA для определения кристалличности (Таблица 3) и других физических свойств.

Как показано в Таблице 3, все твердые вещества в примере 2 являлись полукристаллическими, содержали вплоть до примерно 5% остаточного растворителя и были неизменно вязкими вследствие большого количества растворителя, который удерживался в твердых веществах из-за быстрого осаждения.

Соли элсамитруцина настоящего изобретения также получали, используя способ более медленного осаждения, чем описано выше. В реакционные емкости загружали 7,6×10^-5 моль основания элсамитруцина и 5 мл диоксана при 80°C. После перемешивания смеси в течение пяти минут для обеспечения растворения основания, к растворенному основанию элсамитруцина прибавляли 400 мкл 0,2 М водного раствора винной кислоты, что соответствовало 1,05 эквивалентам. Температуру поддерживали при 80°C в течение десяти минут, и затем флаконы охлаждали до комнатной температуры со скоростью 30°C/час. В ходе охлаждения происходило осаждение фазы. Твердые вещества отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. Образцы анализировали с помощью XRPD, DSC и TGA для определения физических свойств [Таблица 3, OVL-A-55(1) и OVL-A-55(2)]. Первый образец [диоксан/серная кислота, OVL-A-55(1)] являлся кристаллическим согласно XRPD, но содержал 3,6% остаточно растворителя согласно TGA-анализу и имел три эндотермических пика на DSC-кривой. Второй образец [диоксан/L-винная кислота, OVL-A-55(2)] являлся полукристаллическим.

Затем, соли элсамитруцина получали в водной среде следующим образом. В реакционные флаконы загружали 100 мг основания элсамитруцина, 1,05 эквивалентов соответствующей кислоты (п-TSA, янтарную и L-винную кислоту добавляли в виде твердых веществ; серную кислоту растворяли в 0,5 мл воды) и воду (10 мл для п-TSA, янтарной и L-винной кислоты, 9,5 мл для серной кислоты). Суспензии нагревали до 80°C при перемешивании в течение десяти минут для образования прозрачного раствора и затем охлаждали до комнатной температуры со скоростью 30°C/час. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре осадки не образовывались ни в одном из экспериментов. Воду удаляли в слабом токе азота при 35°C. Осаждение наблюдалось в эксперименте с п-TSA после удаления одной трети воды, твердое вещество отфильтровывали и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. Фильтрат также анализировали. Другие три флакона упаривали досуха и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg. Результаты показали, что полученные твердые вещества являлись полукристаллическими с высоким содержанием аморфного компонента [Таблица 3, OVL-A-47(1), OVL-A-47(2-1), OVL-A-47(3) и OVL-A-65].

Пример 3

Кристаллизация тозилатной соли элсамитруцина с использованием микроскопии

На предметное стекло микроскопа насыпали с использованием шпателя 1-2 мг аморфного тозилата элсамитруцина, и помещали покровное стекло. Капли растворителя помещали сбоку покровного стекла так, чтобы позволить растворителю проникнуть под покровное стекло и растворить лекарственное средство. Лекарственное средство выдерживали в контакте с растворителем при комнатной температуре и рассматривали в микроскоп при увеличении 100× или 400×. Использовали растворители: изопропиловый спирт, метанол, этанол, ацетонитрил, ацетон, пропиленгликоль, тетрагидрофуран, дихлорметан и смеси 1:1 изопропилового спирта, метанола, этанола, ацетонитрила, ацетона с водой. Игольчатые или палочковидные кристаллы наблюдали под микроскопом в растворителях: этанол, метанол, пропиленгликоль, изопропиловый спирт, ацетон и во всех смесях вода:растворитель. Микроскопическое исследование образцов показывало, что тозилатная соль элсамитруцина становилась кристаллической в по меньшей мере одном растворителе.

Пример 4

Микрокристаллизация MSA-, п-TSA- и HCl-солей элсамитруцина

Малое количество соли (1-2 мг) помещали на предметное стекло микроскопа и накрывали покровным стеклом. Несколько капель растворителя прибавляли на край покровного стекла, чтобы капиллярное действие втянуло бы растворитель между предметным и покровным стеклом. Если материал растворялся частично, предметное стекло медленно нагревали на плитке до растворения большей части твердого вещества. Каждое предметное стекло охлаждали при комнатной температуре, обеспечивая медленную кристаллизацию. Для кристаллизации использовали смеси 1:1 метанола, этанола, изопропилового спирта и ацетонитрила в воде. Каждая соль во всех четырех различных системах растворителя давала кристаллы элсамитруцина. Кристаллы тозилатной соли элсамитруцина показали двулучепреломление в плоскополяризованном свете, как показано на Фиг.1.

Пример 5

Масштабирование перекристаллизации п-TSA-соли

Перекристаллизацию п-TSA-соли проводили путем медленного испарения в трубке Крейга. п-TSA-соли растворяли в смеси 1:1 ацетонитрила и воды при повышенной температуре. После горячего фильтрования в трубке Крейга растворитель из реакции медленно испарялся, что давало осадок. Под микроскопом наблюдали, что габитус кристаллов являлся игольчатым. Кристаллы отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме. Наблюдали, что материал был прозрачным к XRD, что подтверждало данные микроскопии о его кристалличности. При анализе дифференциальной сканирующей калориметрией материал показывал плавление с последующим разложением или кристаллизацией при 183°C и 186°C, соответственно. ¹H-ЯМР-анализ показал, что образец имеет отношение 1:1 API к противоиону (п-TSA).

Растворимость п-TSA-соли в воде проверяли, используя ВЭЖХ, после перемешивания суспензии при комнатной температуре в течение шести часов. Было найдено, что растворимость п-TSA-соли в воде составляет 15,6 мг/мл (Таблица 5, партия № OVL-A-137). Растворимость п-TSA-соли при pH 4 (бензоатный буфер) составляла 14,7 мг/мл (Таблица 5, OVL-A-143).

Соли элсамитруцина, полученные согласно идеям настоящего изобретения, исследовали на стабильность. Два образца выделенной п-TSA-соли (40 мг каждый) помещали в вакуумную печь при 75°C на девять часов. После данного воздействия образец № 1 извлекали, температуру поднимали до 98°C и второй образец высушивали в течение ночи. Данные ЯМР показали идеальное солевое отношение 1:1, и таким образом разложение не происходило в твердом состоянии в ходе высушивания при повышенных температурах. Потеря массы по TGA составляла приблизительно 2,5% для обоих образцов. Анализ по Карлу Фишеру показал, что две партии все еще содержали воду: образец № 1 имел содержание воды 4,0%, а образе № 2 имел содержание воды 4,6%. п-TSA-соль (16 мг) элсамитруцина растворяли в 1,6 мл бензоатного буфера (pH 4) и перемешивали при 50°C в течение десяти дней. Образцы для ВЭЖХ и MC отбирали в 3, 5 и 10 дни. Свидетельств присутствия продукта разложения не обнаруживали ни при использовании MC (пик при 282), ни при использовании ВЭЖХ.

Пример 6

Масштабирование образования HCl-соли

Элсамитруцин (200 мг) суспендировали в 1 мл ацетонитрила/воды (1:1) и нагревали до 75°C, что давало весьма вязкую суспензию. 1 М раствор HCl в воде (0,321 мл, 1,05 эквивалента) прибавляли к суспензии для образования прозрачного раствора. Затем смесь медленно охлаждали до комнатной температуры со скоростью 25°C/час при весьма острожном перемешивании. После перемешивания при комнатной температуре в течение приблизительно 6 часов, полученные твердые вещества выделяли фильтрованием и высушивали в вакууме при 50°C и 30 дюймах Hg, получая 187,5 мг (выход 88,86%) HCl-соли. Анализы DSC и XRD подтверждали кристаллическую природу соли.

Пример 7

Ингибирующая рост активность in vitro элсамитруцина и тозилатной соли элсамитруцина

Следующий эксперимент подтверждает, что соли элсамитруцина, полученные согласно идеям настоящего изобретения, сохраняют свою in vitro противоопухолевую активность при сопоставлении с основанием элсамитруцина. Элсамитруцин и тозилат элсамитруцина испытывали in vitro, используя клеточные линии B16F10 (мышиный рак легкого), HCT 116 (рак толстой кишки человека), HT29 (рак толстой кишки человека) и SK-MES-1 (немелкоклеточная карцинома легкого человека). Ингибирование клеточного роста оценивали в 96-луночных планшетах для микрокультур, используя полуавтоматический MTT-анализ (MTT: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид).

Клетки немелкоклеточной карциномы легкого человека SK-MES-1, мышиной меланомы B16F10 и рака толстой кишки человека HCT 116 и HT29 (собирательно тестируемые клеточные культуры ) выдерживали в забуференном RPMI 1640 с добавкой фетальной телячьей сыворотки, антибиотиков и других подходящих факторов роста, таких как глутамин. Тестируемые клетки (1500-2000 клеток/лунка) высеивали в 96-луночном планшете для микрокультур с суммарным объемом 100 мкл/лунка. После инкубирования в течение ночи во влажном инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ и 95% воздуха, элсамитруциновые растворы разводили до различных концентраций, используя RPMI 1640, и добавляли в каждую лунку в объеме 100 мкл. Готовили растворы основания элсамитруцина и тозилата элсамитруцина (элсамитруциновые растворы) и хранили их в морозильнике при -20°C. Растворы размораживали не более 10 раз для каждого эксперимента.

Планшеты для клеточных культур с посеянными тестируемыми клетками и с различными концентрациями элсамитруциновых растворов помещали во влажный инкубатор при 37°C с CO₂ и 95% воздуха на 5-10 суток. Затем планшеты быстро центрифугировали, и удаляли 100 мкл питательной среды. Клеточные культуры инкубировали с 50 мкл реагента MTT (1 мг/мл в забуференном фосфатом солевом растворе Dulbecco^TM) в течение 4 часов при 37°C. Полученный в результате фиолетовый осадок формазана солюбилизировали 200 мкл 0,04 N HCl в изопропаноле. Поглощение измеряли при длине волны 595 нм и при эталонной длине волны 650 нм, используя считывающее устройство TECAN^® GENios для микропланшетов. Во всех экспериментах данные по поглощению получали для каждого агента в двух перекрывающихся диапазонах концентрации. В большинстве случаев исследование повторяли, используя более широкие диапазоны концентрации.

Результаты каждого испытания сохраняли и импортировали в PRISM^® 3.03 для графического анализа и определения значений IC₅₀. Все результаты изображали в виде диаграммы как процент контролируемого поглощения в зависимости от концентрации лекарственного средства. Значения IC₅₀ оценивали, используя PRISM^® 3.03 с применением нелинейного регрессионного анализа, чтобы подогнать данные к сигмоидальной кривой доза-ответ, описываемой следующим четырехлогистическим уравнением:

Top представляет собой максимальный процент контролируемого поглощения, bottom представляет собой минимальный процент контролируемого поглощения при наибольшей концентрации агента, Y представляет собой наблюдаемое поглощение, X представляет собой концентрацию агента, IC₅₀ представляет собой концентрацию агента, которая ингибирует клеточный рост на 50% по сравнению с контрольными клетками и n представляет собой наклон кривой. Таблица 4 показывает, что элсамитруцин и тозилатная соль элсамитруцина обладают по существу одинаковым антипролиферативным эффектом в отношении протестированных клеточных линий. Таким образом, как продемонстрировано в Таблице 4, можно ожидать, что соли элсамитруцина, полученные согласно идеям настоящего изобретения, будут иметь эквивалентную или большую in vivo противоопухолевую активность сравнительно с терапевтическими композициями, полученными с использованием одного основания элсамитруцина. Тозилат элсамитруцина включает IC₅₀, которая находится в пределах предпочтительно примерно 20%, более предпочтительно, примерно 15% и, наиболее предпочтительно, примерно 10% схожего количества основания элсамитруцина.

Таблица 5 Ингибирующая рост активность in vitro элсамитруцина и п-TSA-соли элсамитруцина по отношению к клетками немелкоклеточной карциномы легкого человека SK-MES-1, мышиной меланомы B16F10 и рака толстой кишки человека HCT 116 и HT29
Клеточная линия	Элсамитруцин IC50 (мкмоль)	п-TSA-соль элсамитруцина IC50 (мкмоль)
SK-MES-1	0,042	0,045
B16F10	0,024	0,028
HCT 116	0,074	0,079
HT 29	0,095	0,105

Пример 8

Стабильность композиции элсамитруцина

Композицию элсамитруцина F2 (10 мг/мл свободного основания элсамитруцина с 4,77% маннита при pH 4,0) в лекарственной форме объемом 2,5 мл использовали для исследования на стабильность. Композиция являлась стабильной как в вертикальном, так и перевернутом положениях при 5 и 25°C при хранении в течение 12 недель, и pH указанных образцов сохранялась вполне стабильной в диапазоне от 4,0 до 4,3. Однако уменьшение в величинах pH наблюдалось для тех образцов, которые хранились при повышенной температуре, поскольку происходило разложение. Используя метод Аррениуса, приблизительно оценивали, что константы нулевого порядка (kT) скорости разложения для образцов в вертикальном положении при 5 и 25°C составляли 5,79×10^-5 и 9,84×10^-4 мг/мл в день, соответственно. Для перевернутых образцов соответствующие константы нулевого порядка скорости разложения составляли 2,49×10^-5 и 6,28×10 ^-4 мг/мл в день при 5°C и 25°C, соответственно. Ожидалось, следовательно, что данная лекарственная форма элсамитруцина F2 способна сохранять свою активность более чем на 90% в течение периода более чем 2,5 года при 25°C (по сравнению с 47 годами для данной лекарственной формы при 5°C, необходимыми для того, чтобы достичь такого же падения активности).

Использованная композиция элсамитруцина F2 RTU состоит из тозилата элсамитруцина: 3,2903 г (эквивалентно 10 мг/мл свободного основания в конечном растворе), маннита: 11,9251 г, воды для инъекций: 250 мл. pH устанавливали равным 4,0, используя NaOH.

Схема исследования на стабильность: Готовили 250 мл исходного раствора тозилата элсамитруцина (10 мг/мл свободного основания, 4,77% маннита, pH 4,0). Флаконы янтарного цвета для сыворотки (80×5 мл) наполняли 2,5 мл исходного раствора тозилата элсамитруцина, продували азотом и закупоривали пробками. Данные закупоренные флаконы как в вертикальном, так и перевернутом положениях хранили в шкафах со следующими температурами: 4, 25, 40 и 60°C, соответственно. Токсичность исходного раствора фиксировали в начале отсчета времени. Образцы извлекали для измерения pH и для анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в различные моменты времени. При 60°C измерения проводили в 0, 2, 7, 10, 14 дни. При 40°C измерения проводили в 0, 7, 14, 28, 38, 64, 77, 84 дни. При 25°C измерения проводили в 0, 7, 14, 28, 64, 84 дни. При 4°C измерения проводили в 0, 7, 14, 28, 64, 84 дни.

Аппаратура и материалы, использованные в исследовании на стабильность, представляют собой следующие: Флаконы: 5 мл флакон Wheaton янтарного цвета для сыворотки (горлышко: внутренний диаметр × наружный диаметр 13×20 мм, номер изделия 223695, партия № 1394689), Пробка: 20-мм пробка Stelmi для сыворотки (бромбутил, серая, номер изделия 6720GC, партия № B603/18047), Алюминиевый уплотнитель: 20-мм необжатый алюминиевый уплотнитель Wheaton (изделие № 224193-01), Тозилат элсамитруцина: Albany Molecular Research, Inc., партия № DKK-M-27, Вода для инъекций (WFI): Phoenix Pharmaceuticals, партия № 703097F, Маннит: J.T. Baker, партия № C39645, 0,2 N раствор гидроксида натрия: VWR International, партия № 7050, 0,22-микронный мембранный фильтр из ацетат целлюлозы: Corning Inc., изделие № 430624, Диффузор: Waters, изделие № WAT007272, pH-Метр: Fisher Scientific Accumet Basic, оборудованный Ag/AgCl pH-электродом VWR Symphony (калиброван pH-стандартами от VWR при pH=4,01, 7,0 и 10,0), Осмометр: Advanced Instrument Osmometr, модель 3320.

Приготовление исходного раствора тозилата элсамитруцина: 3,2903 г тозилата элсамитруцина и 11,9251 г маннита точно отвешивали в мерную колбу на 250 мл. Примерно 200 мл воды для инъекций, перед использованием дегазированной барботированием азота посредством диффузора Waters в течение 1 часа, прибавляли в колбу. Смесь перемешивали в водяной бане при 45-50°C до растворения всего твердого вещества. После охлаждения до комнатной температуры pH раствора регулировали до 4,0, используя 0,2 N NaOH. Затем до метки добавляли воду для инъекций и повторно проверяли pH раствора. Затем раствор фильтровали через 0,22-микронный мембранный фильтр из ацетат целлюлозы и барботировали через раствор азот посредством диффузора Waters в течение 5 минут. Исходный раствор в объеме 2,5 мл переносили во флаконы янтарного цвета для сыворотки (в количестве 80 штук). Незаполненное пространство в каждом флаконе продували азотом и флаконы закупоривали, используя пробки Stelmi для сыворотки и необжатые алюминиевые уплотнители Wheaton.

Для описываемого здесь исследования на стабильность проводили ВЭЖХ-анализ масса/масса для элсамитруцина в дополнение к определению родственных загрязнений. Реагенты для проведения ВЭЖХ-анализа представляют собой следующие: ацетонитрил и трифторуксусную кислоту подходящего для ВЭЖХ класса чистоты (партия № 44093418) получали от EMD Science. Воду очищали, используя систему Millipore Milli-Q. Прибор представлял собой хроматографическую систему, которая состояла из сепарирующего модуля Waters Alliance 2695, оборудованного нагревателем колонки, автоматическим пробоотборником и фотодиодным матричным детектором Waters 2996. Сбор данных контролировался программным обеспечением Waters Empower Pro 2. В качестве колонки использовали колонку Cadenza Cd-C18, 3 мкм, 4,6×150 мм (Silverstone Sciences). Детектирование проводили при 267 нм. Подвижная фаза A содержала воду с 0,1% трифторуксусной кислоты. В 2000 мл воды пипеткой отмеривали 2 мл трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза B содержала ацетонитрил с 0,08% трифторуксусной кислоты. В 1250 мл ацетонитрила пипеткой отмеривали 1 мл трифторуксусной кислоты. 1 л воды тщательно смешивали с 1 л ацетонитрила.

ВЭЖХ-анализ проводили в различные моменты времени, как показано ниже.

Таблица 6
График проведения ВЭЖХ-анализа
Образец	Дни/Недели
Исходный раствор	0 день
60ºС	2 дня
4, 25, 40, 60ºС	7 дней
60ºС	10 дней
4, 25, 40, 60ºС	14 дней
4, 25, 40ºС	28 дней
40ºС	38 дней
4, 25, 40, 60ºС	64 дня
40ºС	77 дней
4, 25, 40ºС	84 дня

В следующей таблице приведены градиентные условия.

Таблица 7
Градиентные условия
Время (мин)	% A	% B	Градиентный режим
0	90	10	Начальный
4	72	28	Линейный
8	65	35	Линейный
15	60	40	Линейный
30	10	90	Линейный
32	10	90	Задержка
33	90	10	Линейный
45	90	10	Задержка

ВЭЖХ-анализ проводили с градиентом при скорости потока равной 1,0 мл/мин. Температура печи была установлена на 40°C. Температура автоматического пробоотборника составляла 25°C. Инжектируемый объем составлял 10 мкл. Разбавитель образца - ацетонитрил/вода (50/50, об./об.): 1 л воды тщательно смешивали с 1 л ацетонитрила. Пустой образец - ацетонитрил/вода (50/50, об./об.): разбавитель образца использовали в качестве пустого образца. Стандартный раствор - ~0,1 мг/мл элсамитруцина: 26,32 мг тозилата элсамитруцина точно взвешивали и растворяли в 200 мл разбавителя образца в мерной колбе на 200 мл. Подготовка раствора образца (один флакон на момент времени): 2 мл раствора элсамитруцина RTU вводили пипеткой в мерную колбу на 20 мл и разбавляли 18 мл разбавителя образца. 2 мл разбавленного раствора дополнительно разбавляли 18 мл разбавителя образца в мерной колбе на 20 мл, чтобы получить конечный образец для анализа (с концентрацией примерно 0,1 мг/мл). Время удерживания элсамитруцина составляло примерно 11,7 минут.

Немедленно после использования колонку промывали растворителем B в течение 30 минут с последующей промывкой разбавителем образца в течение 45 минут. Колонку хранили в разбавителе образца по окончании каждого использования. Устанавливали, что средняя концентрация свободного основания элсамитруцина в исходном растворе в начале отсчета составляла 10,035 мг/мл при среднем осмотическом давлении, равном 301,6 мОсм/кг.

Активность лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU объемом 2,5 мл показана ниже в Таблице 8, в которой приведены данные об активности лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU объемом 2,5 мл в вертикальном и перевернутом положениях в течение периода 12 недель. Данная лекарственная форма являлась стабильной при 4 и 25°C в обоих положениях хранения, как показано на Фиг. 2A, 2B, 3A и 3B. Она показывала различные степени разложения при повышенных температурах. Константы нулевого порядка (kT) скорости разложения при 313 и 333 K перечислены в Таблице 9.

Таблица 9
Константы нулевого порядка (kT) скорости разложения при 313 K и 333 K
	kT (мг/мл в день)
Температура (K)	Вертикальное положение	Перевернутое положение
313	0,0065	0,0054
333	0,0618	0,0703

Определение констант (k при 278 K и k при 293K) скорости разложения элсамитруцина в лекарственной форме элсамитруцина F2 RTU объемом 2,5 мл: Применяя метод Аррениуса для ограниченных данных Таблицы 9, приблизительно оценивали, что константы скорости разложения лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU в вертикальном положении при 5°C (или 278 K) и 25°C (или 293K) составляли 5,79×10^-6 и 9,84×10 ^-4 мг/мл в день, соответственно. Чтобы получить снижение активности 10% (то есть с 10 мг/мл до 9 мг/мл) лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU в вертикальном положении потребуется примерно 17282 дней хранения при 5°C и 1016 дней при 25°C.

Аналогично, в перевернутом положении константы скорости разложения элсамитруцина в лекарственной форме элсамитруцина F2 RTU составляли 2,49×10^-5 и 6,28×10 ^-4 мг/мл в день при 5°C и 25°C, соответственно. Это означает, что активность лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU уменьшится на 10% при хранении в перевернутом положении при 5°C в течение периода 40236 дней, тогда как в случае хранения при 25°C для этого потребуется 1593 дня.

В общем, образцы лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU, хранившиеся в перевернутом положение, более стабильны, чем образцы, хранившиеся в вертикальном положении. Хотя причина различия в стабильности, наблюдающегося для двух положений при хранении, была не ясна, вероятно, она связана с композицией пробки Stelmi для сыворотки, которая, находясь в контакте с композицией, каким-то образом действительно замедляет механизм(ы) разложения.

Примесные профили: В Таблицах 3-6 приведен примесный профиль лекарственной формы элсамитруцина F2 RTU объемом 2,5 мл. Для флаконов, хранившихся при 5 и 25°C, pH композиции была довольно стабильной (в диапазоне от 4,0 до 4,3) в ходе периода испытания. Однако падение в значении pH наблюдалось с прогрессированием разложения в образцах, хранившихся при повышенной температуре. Основными образующимися при разложении примесями (образовались при стрессовых условиях 60°C) являлись примеси со следующим относительным временем удерживания: 0,59, 0,62, 1,41, 1,65, 1,82 и 1,84.

Если не указано другое, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакций и так далее, использованные в описании и в формуле изобретения, следует рассматривать как сопровождаемые во всех случаях термином примерно . Соответственно, если не указано обратное, числовые параметры, установленные в следующем описании и в прилагаемой формуле изобретения представляют собой приближенные значения, которые могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, получение которых является целью настоящего изобретения. Как минимум, и не являясь попыткой ограничить применение доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый цифровой параметр по меньшей мере следует истолковывать в свете числа приведенных значащих цифр и применяя обычный способ округления. Несмотря на то что числовые диапазоны и параметры, устанавливающие широкий объем описания, представляют собой приближенные значения, численные значения, установленные в конкретных примерах, приведены с возможно большей точностью. Любое численное значение, однако, в своей основе содержит определенные ошибки, неизбежно возникающие как результат стандартного отклонения, обнаруживаемого в соответствующих им измерениях, получаемых при испытаниях. Термины в единственном и множественном числе и похожие ссылки, использованные в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения), следует толковать как охватывающие единственное и множественное число, если иное не указано в настоящей заявке или явно не опровергается контекстом. Перечисление диапазонов значений в настоящей заявке предназначено лишь для того, чтобы служить способом сокращения при индивидуальной ссылке на каждое отдельное значение, входящее в диапазон. Если в настоящей заявке не указано иное, каждое индивидуальное значение включено в описание, как если бы оно было в отдельности приведено здесь. Все способы, описанные в настоящей заявке, могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящей заявке или если иное явно не опровергается контекстом. Использование любых примеров или иллюстративных формулировок (например, такой как ), приведенных в настоящей заявке, предназначено лишь для того, чтобы лучше пояснить изобретение и не налагает ограничение на объем изобретения, заявленного иным образом. Язык описания не должен истолковываться как указывающий на какой-либо не заявленный в формуле изобретения элемент, существенный для осуществления на практике изобретения.

Группировки альтернативных элементов или осуществлений изобретения, раскрытых в настоящей заявке, не должны истолковываться как ограничения. Каждый член группы может быть упомянут и заявлен в формуле изобретения индивидуально или в сочетании с другими членами группы или другими элементами, приведенными в настоящей заявке. Предполагается, что один или более членов группы могут быть включены в группу или исключены из нее по соображениям удобства и/или патентоспособности. Если имеет место такое включение или исключение, считается, что описание настоящей заявки содержит группу в модифицированном виде, таким образом удовлетворяя письменному описанию любых групп Маркуша, использованных в прилагаемой формуле изобретения.

В настоящей заявке описаны предпочтительные варианты осуществления данного изобретения, включая наилучший вариант осуществления изобретения, известный авторам изобретения. Конечно, разновидности указанных предпочтительных вариантов осуществления станут ясны специалистам обычной квалификации в данной области по прочтении вышеизложенного описания. Авторы изобретения предполагают, что квалифицированные специалисты используют такие разновидности при необходимости, и авторы изобретения подразумевают, что изобретение будет осуществлено на практике иначе, чем конкретно описано в настоящей заявке. Соответственно, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, описанного в формуле изобретения, приложенной к настоящей заявке, насколько позволяет применяемая правовая норма. Более того, любое сочетание вышеописанных элементов во всех возможных их вариантах охватывается изобретением, если здесь не указано иное или иное явно не опровергается контекстом.

Более того, на протяжении данного описания были даны ссылки на патенты и печатные публикации. Каждая из процитированных ссылок и печатных публикаций включены в настоящую заявку индивидуальным образом путем ссылки во всей полноте.

Завершая описание необходимо отметить, что следует понимать, что варианты осуществления изобретения, раскрытого в настоящей заявке, иллюстрируют принципы настоящего изобретения. Другие модификации, которые могут быть применены, входят в объем изобретения. Так, в качестве примера, но не ограничения, альтернативные конфигурации настоящего изобретения могут быть использованы в соответствии с изложенными здесь идеями. Соответственно, настоящее изобретение строго не ограничено проиллюстрированными и описанными конфигурациями.