фармацевтическая композиция, содержащая производное 1,2-дитиолтиона, для предотвращения или лечения заболевания, обусловленного повышенной экспрессией lxr-альфа

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью печеночного X рецептора (LXR ), содержащая в качестве эффективного компонента соединение, выбранное из группы соединений, перечисленных ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его сольват, гидрат или пролекарство:

2. Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью белка 1 с, связывающегося со стерол-зависимым регуляторным элементом (SREBP-1), содержащая в качестве эффективного компонента соединение, выбранное из группы представленной ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его сольват, гидрат или пролекарство:

3. Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения гипертензии, вызванной ренином, альдостеронизма, адренолейкодистрофии, гломерулосклероза, протеинурии, нефропатии, стеатоза печени, гипертриглицеридемии или гиперренинемии, содержащая в качестве эффективного компонента соединение, выбранное из группы, представленной ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его сольват, гидрат или пролекарство:

4. Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения стеатоза печени, содержащая в качестве эффективного компонента соединение, выбранное из группы, представленной ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его сольват, гидрат или пролекарство:

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что соединение формулы 1 представляет собой олтипраз (4-метил-5-(2-пиразинил)-1,2-дитиол-3-тион).

6. Фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения стеатоза печени, содержащая в качестве эффективного компонента олтипраз (4-метил-5-(2-пиразинил)-1,2-дитиол-3-тион), его фармацевтически приемлемую соль, его сольват, гидрат или пролекарство.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к производному 1,2-дитиолтиона для ингибирования экспрессии или активности печеночного Х рецептора (LXR ) и экспрессии или активности белка-1, связывающегося со стерол-чувствительным регуляторным элементом (SREBP-1). Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей производное 1,2-дитиолтиона. Фармацевтическая композиция является эффективной для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией LXR или SREBP-1. Такие заболевания могут включать стеатоз печени, гипертриглицеридемию, гиперренинемию, гипертензию, вызванную ренином, альдостеронизм, адренолейкодистрофию, гломерулосклероз, протеинурию и нефропатию.

Настоящее изобретение представляет собой кульминацию исследовательского проекта, поддержанного центром инженерных исследований (Engineering Research Center, ERC) министерства образования, науки и технологии (проект № R11-2007-107-01001-0, исследования в области метаболизма и воспаления).

Уровень техники

Печеночный Х рецептор (LXR), рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR) и фарнезоидный Х рецептор (FXR) являются ядерными рецепторами гормонов, относящимися к семейству рецепторов типа II. Эти рецепторы образуют гетеродимер с ретиноидным Х рецептором (RXR) и связываются с ДНК. В отсутствие связанного лиганда гетеродимер связывается с ДНК и образует комплекс вместе с ко-репрессорным белком; с другой стороны, при связывании лиганда происходят структурные изменения, белок ко-репрессор отделяется и связывается белок ко-активатор, в результате чего осуществляется транскрипция гена-мишени (Hermanson et al., Trends Endocrinol. Metab., 2002, 13: 55-60). Среди ядерных рецептеров гормонов LXR играет важную роль в контроле транскрипции гена, связанного с метаболизмом и гомеостазом холестерина. Примеры такого гена включают гены аполипопротеина Е (ароЕ), ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, холестерин-7 -гидролазы и скавенджер-рецептора класса В типа I (Schwartz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 274: 794-802). Дополнительно, LXR прямо воздействует на ген SREBP-1c и контролирует липидный метаболизм (Yoshikawa et al., Mol. Cell. Biol., 2001, 21: 2991-3000).

У LXR имеются два изомера, LXR и LXR . В большинстве случаев LXR присутствует в печени и LXR присутствует в большинстве органов. LXR активируется оксистеролами, являющимися природными лигандами, высокой концентрацией глюкозы и Т0901017 и GW3965, являющимися искусственными лигандами, и контролирует экспрессию генов, связанных с синтезом липидов и гомеостазом холестерина. Когда липиды продуцируются в печени, LXR функционирует как сенсор липидов и значительно повышает экспрессию и активность SREBP-1c, который является ключевым фактором транскрипции, контролирующим экспрессию липогенных генов, и таким образом способствует синтезу жирных кислот в тканях печени и повышению количества триглицеридов в крови.

Индуцированный LXR неалкогольный стеатоз печени может развиваться по двум разным путям: по SREBP-1c-зависимому пути и по SREBP-1c-независимому пути. SREBP-1c-зависимый стеатоз печени развивается благодаря увеличению экспрессии липогенных генов за счет опосредованной LXR активации транскрипции SREBP-1c. SREBP-1c-независимый стеатоз печени развивается, поскольку активность LXR приводит к повышению экспрессии CD36 белка, являющегося переносчиком жирных кислот, в результате чего большее количество жирных кислот перемещается в печень. Как описано выше, активность LXR способствует развитию неалкогольного стеатоза печени. Однако, лекарства, ингибирующие развитие стеатоза печени путем контроля активности LXR , пока не созданы.

SREBP представляет собой белок, который связывается со стерол-зависимым регуляторным элементом (SRE), являющимся участком контроля транскрипции гена, контролируемым стеролом, и существует в трех изоформах: SREBP-1а, SREBP-1c и SREBP-2. Транскрипция SREBP-1а и SREBP-1c осуществляется с одного и того же гена, а SREBP-2 синтезируется при экспрессии другого гена. SREBP-1c является фактором транскрипции, контролирующим транскрипцию генов, связанных с синтезом жирных кислот, а SREBP-2 является фактором транскрипции, контролирующим транскрипцию генов, связанных с синтезом холестерина, В нерабочем состоянии SREBP находится в мембране эндоплазматического ретикулюма и его размер составляет 125 кДа. Перед активацией, вызванной недостатком стерола, SREBP - связан с мембраной в неактивной форме. При активации SREBP перемещается в аппарат Гольджи и затем расщепляется с образованием активной формы белка размером 65 кДа. После активации SREBP перемещается в ядро, где связывается со стерол-зависимыми регуляторными элементами генов-мишеней и повышает экспрессию генов ферментов липидного синтеза. Гены, являющиеся мишенями SREBP-1c, представляют собой гены ферментов синтеза жирных кислот. Примеры таких ферментов включают синтазу жирных кислот (FAS), ацетил-КоА-карбоксилазу (ACC) стеароил-КоА-десатуразу (SCD). Когда количество свободных жирных кислот, поступающих из крови в печень и синтезируемых de novo в печени становится больше количества жирных кислот, секретируемых в форме липопротеина очень низкой плотности (VLDL) и подвергаемых -окислению, баланс липидного метаболизма в печени нарушается и развивается стеатоз печени. Таким образом, SREBP-1с, который индуцирует и контролирует продукцию белков FAS, ACC и SCD, участвующих в синтезе жирных кислот, является важным фактором, вносящим вклад в алкогольный или неалкогольный стеатоз печени (Kohijma et al., Int. J. Mol. Med., 2008, 21(4): 507-511, Donohue, World J. Gastroenterol. 2007, 13(37): 4974-4978). Стеатоз печени представляет собой болезненное состояние, при котором содержание жира в печени составляет 5% или более от общего веса печени. Заболевания печени, включая стеатоз печени, являются наиболее распространенной причиной смерти, не считая рака, среди взрослых людей в возрасте от 40 до 50 лет. В промышленных странах примерно 30% соответствующей популяции имеют симптомы стеатоза печени и примерно в 20% таких случаев развивается цирроз печени через стадию фиброза печени. 50% больных циррозом печени умирают от заболевания печени в течение 10 лет после постановки диагноза цирроза печени. Количество случаев неалкогольного стеатоза печени увеличивается из-за «прозападной» диеты с высоким содержанием липидов и недостатка физической нагрузки. В настоящее время единственным способом лечения стеатоза печени является исправление стиля жизни, например диеты.

Практически отсутствуют доступные лекарства, эффективные при лечении стеатоза печени, и больным рекомендуют только диету и упражнения. Однако получаемые при этом лечебные эффекты слишком низки. Таким образом, есть потребность в создании лекарственного средства для эффективного лечения стеатоза печени. В то же время в качестве поддерживающей лекарственной терапии применяют бетаин, глюкуронат, метионин, холин, липотрофные препараты, но медицинские или фармацевтические эффекты этих соединений не доказаны. Соответственно, имеется потребность в разработке лекарства для эффективного лечения стеатоза печени без побочных эффектов.

SREBP-1 и SREBP-2 в большей степени экспрессируются в почках старых людей и из-за повышенной экспрессии SREBP-1 и SREBP-2 синтез липидов и аккумуляция триглицеридов и холестерина в почках увеличивается, что может вызывать гломерулосклероз, протеинурию и нефропатию (Jiang et al., Kidney Int., 2005, 68(6): 2608-2620).

Показано, что LXR играет важную роль в секреции ренина в почках. Оба LXR и LXR в достаточной степени экспрессируются в околоклубочковых клетках, которые производят ренин. Согласно Morello et al., Т0901017 и GW3965, являющиеся агонистами LXR , повышают экспрессию мРНК ренина в почках и активность ренина в крови (Morello et al., J. Clin. Invest., 2005, 115: 1913-1922). Когда в крови присутствует избыток ренина, возникает гиперренинемия и в результате развиваются гипертензия и альдостеронизм.

LXR также контролирует экспрессию гена ABCD2, связанного с адренолейкодистрофией (ALD), и таким образом ингибитор LXR эффективен для лечения ALD, где ALD представляет собой очень редкое заболевание, возникающее, когда жирные кислоты с очень длинными цепочками (VLCFA) in vivo не разрушаются и проникают в мозг, где они повреждают нервные клетки (Weinhofer et а1., J. Biol. Chem., 2005, 280: 41243-41251).

Дитиолтионы представляют собой серосодержащие соединения и обнаруживаются в овощах семейства Brassicaceae; отдельные замещенные из их числа обладают защитным действием на печень. Представителем 1,2-дитиолтиона является олтипраз (4-метил-5-(2-пиразинил)-1,2-дитиол-3-тион), который был применен для лечения шистозомоза в ранних 80-х и для разработки лекарства с целью химического предотвращения рака и лекарства для лечения цирроза печени. Олтипраз вносит вклад в увеличение содержания тиола в клетках тканей in vivo и в дополнение к экспрессии ферментов, связанных с поддержанием пула глютатиона (GSH) индуцирует экспрессию ферментов, связанных с детоксификацией электрофильных веществ. Примеры ферментов, активности которых увеличиваются благодаря действию олтипраза, включают НАД(Ф)Н:хинонредуктазу, микросомальную эпоксидгидролазу, глютатион S-трансферазу (GST) и UDP-GT. Конкретно, GST представляет собой фермент, предотвращающий гепатотоксичность таких токсичных веществ, как тетрахлорид и ацетаминофен.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что олтипраз предотвращает экспрессию TGF и удовлетворяет требованиям к патенту на фармацевтическую композицию для предотвращения и лечения фиброза печени и цирроза (KR № 10-0404303.) Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что олтипраз повышает экспрессию C/EBP -LIP и ингибирует экспрессию генов C/ЕВР и PPAR и удовлетворяет требованиям к патенту на фармацевтическую композицию для предотвращения и лечения ожирения (KR № 10-0576157). Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что соединения 1,2-дитиотиона, такие как олтипраз, повышают киназную активность RSK1 (р90 рибосомальная S6 киназа 1) и удовлетворяет требованиям к патенту на содержащее 1,2-дитиолтион лекарство для предотвращения и лечения диабета и его осложнений (KR № 10-0590818).

Раскрытие изобретения

Технические задачи

Настоящее изобретение предоставляет ингибиторы LXR или SREBP-1. Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией LXR или SREBP-1.

Техническое решение

Авторы настоящего изобретения провели скрининг эффектов различных лекарств с целью решения технических задач, описанных выше. В результате они обнаружили, что экспрессия и активность LXR - и LXR -зависимых SREBP-1 ингибируется введением лекарств, содержащих производные 1,2-дитиолтиона, такие как олтипраз. Они также обнаружили, что при ингибировании SREBP-1 производными 1,2-дитиолтиона значительно ингибируется экспрессия липогенных генов, являющихся генами-мишенями, и поэтому ингибируется накопление триглицеридов в ткани печени, индуцированное богатой липидами диетой. На основе этих открытий авторы настоящего изобретения представляют фармацевтическую композицию, содержащую производное 1,2-дитиолтиона, для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией LXR или SREBP-1.

Преимущества

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит производные 1,2-дитиолтиона в качестве эффективного компонента. Фармацевтическая композиция является эффективной для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR , или заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью SREBP-1. Примеры производных 1,2-дитиолтиона включают олтипраз (4-метил-5-(2-пиразинил)-1,2-дитиол-3-тион), 3-метил-1,2-дитиол-3-тион и 5-(6-метоксипиразинил)-4-метил-1,2-дитиол-3-тион. В результате введения фармацевтической композиции ингибируется экспрессия и активность SREBP-1, где SREBP-1 является ключевым фактором транскрипции, контролирующим экспрессию генов липогенных ферментов путем регуляции активности LXR , и, следовательно, ингибируется экспрессия липогенных генов, в результате чего ингибируется аккумуляция триглицеридов в ткани печени, которая происходит из-за стеатоза печени, вызванного нарушением метаболизма. Соответственно, фармацевтические композиции, содержащие производные 1,2-дитиолтиона в качестве эффективного компонента согласно настоящему изобретению, являются эффективными для предотвращения и лечения стеатоза печени. Также, фармацевтические композиции являются эффективными для предотвращения и лечения гипертриглицеридемии, гиперренинемии, повышенного давления, вызванного ренином, альдостеронизма, адренолейкодистрофии, гломерулосклероза, протеинурии и нефропатии.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ ингибирования экспрессии или активности LXR или SREBP-1 с помощью соединения или композиции, представленных здесь. Ингибирование может приводить к предотвращению или лечению заболевания или состояния, связанного с повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или SREBP-1.

Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения заболевания или состояния, связанного с повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или SREBP-1, такого как, например, стеатоз печени, гипертриглицеридемия, гиперренинемия, гипертензия, вызванная ренином, альдостеронизм, адренолейкодистрофия, гломерулосклероз, протеинурия и нефропатия, с помощью соединений и композиций, представленных здесь.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показана схема введения олтипраза.

На фигуре 2 представлено действие лечения олтипразом на LXR , экспрессия которого повышена из-за диеты с высоким содержанием липидов. Результаты показаны в виде значений относительно уровня мРНК LXR в группе с нормальной диетой. (ND: нормальная диета, HFD: диета с высоким содержанием липида, Olt: олтипраз, **: р<0,01 по сравнению с ND группой и ##: р<0,01 по сравнению с группой, получавшей только HFD).

На фигуре 3 показано действие лечения олтипразом на активность LXR , повышенную в результате повышенной экспрессии LXR (S.S: сверхсдвиг).

На фигуре 4 показано действие лечения олтипразом на активность SREBP-1, экспрессия которого повышена из-за диеты с высоким содержанием липидов. (ND:нормальная диета, HFD: диета с высоким содержанием липида, Olt: олтипраз, **: р<0,01 по сравнению с ND группой и ##: р<0,01 по сравнению с группой, получавшей только HFD).

На фигуре 5 показано действие лечения олтипразом на экспрессию белка SREBP-1 после обработки H4IIE и HepG2, представляющих собой линию клеток печени и первичную культуру клеток печени крысы, соответственно, с помощью Т0901317, представляющего собой активатор LXR . Белок SREBP-1 идентифицируют с помощью вестерн-блоттинга. (S.E: кратковременная экспозиция пленок, L.E: длительная экспозиция пленок, А: лизат целых клеток и В: ядерная фракция клеток HepG2).

На фигурах 6-8 показаны результаты вестерн-блоттинга в случае действия производных 1,2-дитиолтиона на уровень SREBP-1, экспрессия которого повышена в результате обработки активатором LXR .

На фигуре 9 показаны сравнительные количества генов липогенных ферментов (FAS, ACC), экспрессируемых в ткани печени при диете с повышенным содержанием липидов при введении олтипраза животным с моделированным ожирением печени, вызванным богатой липидами диетой.

На фигуре 10 показано действие лечения олтипразом на количество триглицеридов в ткани печени на животной модели ожирения печени, вызванного богатой липидами диетой, при введении олтипраза животным с моделированным ожирением печени, вызванным богатой липидами диетой.

На фигуре 11 показаны изображения ткани печени, окрашенные с помощью Oil-Red-O, при введении олтипраза животным с моделированным ожирением печени, вызванным богатой липидами диетой.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение, основано на том факте, что производные 1,2-дитиолтиона, такие как олтипраз, ингибируют активность LXR и экспрессию и активность белка 1, связывающегося со стерол-зависимым регуляторным элементом (SREBP-1), который представляет собой клеточный белок, контролирующий экспрессию липогенных генов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что экспрессия LXR у мышей с повышенной активностью LXR в результате применения диеты с высоким содержанием липидов ингибируется олтипразом (фигура 2) и что связывающая способность LXR по отношению к LXR-связывающему элементу ДНК также уменьшается олтипразом (фигура 3). Также, авторы настоящего изобретения обнаружили, что экспрессия SREBP-1, которая увеличивается при добавлении к клеточной линии гепатоцитов Т0901317, известного как активатор LXR , ингибируется олтипразом или другими производными 1,2-дитиолтиона (фигуры 4-8).

При введении производных 1,2-дитиолтиона, таких как олтипраз, ингибируется экспрессия и активность SREBP-1, который является ключевым фактором транскрипции, контролирующим экспрессию генов липогенных ферментов, за счет контроля активности LXR , дополнительно, в результате ингибирования экспрессии липогенных генов предотвращается аккумуляция триглицеридов, которая происходит из-за нарушения метаболизма, индуцированного стеатозом печеночной ткани. Таким образом, поскольку фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит производные 1,2-дитиолтиона в качестве эффективного компонента, фармацевтическая композиция может быть эффективной для предотвращения и лечения стеатоза печени. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при введении олтипраза в ткань печени, в которой количество триглицеридов повышено в результате применения диеты с высоким содержанием липидов, количество триглицеридов существенно снижается (фигура 10 и 11) и экспрессия синтазы жирных кислот (FAS) и ацетил-КоА-карбоксилазы (ACC), являющихся ферментами синтеза жирных кислот, уровень которых повышен у мышей, получавших диету с высоким содержанием липидов, также значительно ингибируется (фигура 9).

На основе этих открытий авторы настоящего изобретения предоставляют фармацевтическую композицию для предотвращения и лечения заболеваний, вызванных повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или SREBP-1, где фармацевтическая композиция содержит в качестве эффективного компонента производные 1,2-дитиолтиона формулы 1 ниже, его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, или его пролекарство и фармацевтически приемлемый носитель.

Формула 1

где Х представляет собой углерод или азот, Q представляет собой серу, кислород или -S=O и R¹ и R² каждое независимо выбирают из группы, включающей атом водорода, C_1-7-алкил, C_3-7-циклоалкил, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкокси, C_3-7 -циклоалкокси, C_1-7-алкилтио, C_3-7-циклоалкилтио, C_1-7-алкенил, C_1-7-алкинил, C_1-7 -алкилсульфонил, C_1-7-алкиламинокарбонил, HO-C _1-7-алкил, HS-C_1-7-алкил, гидрокси, тиол, галоген, карбоксил, нитро, циано, C_1-7-алкилкарбонил, C _1-7-алкоксикарбонил, C_1-7-алкилкарбонилокси, C_1-4-алкилкарбонил-C_1-4-алкил, C_1-4 -алкокси-C_1-4-алкил, C_1-4-алкилтио-C _1-4-алкил, амино, C_1-7-алкиламино, C_1-7 -алкилкарбониламино, C_1-4-алкокси-C_1-4-алкиламино, C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкиламино, C_1-4 -алкилсульфонамино, фенил, гетероарил, фенил-C_1-4-алкил, гетероарил-C_1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкокси-C _1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкилтио-C_1-4 -алкил, фенокси-C_1-4-алкил, фенилтио-C_1-4 -алкил, фенилкарбониламино, фенокси-C_1-4-алкилкарбониламино, фенил-C_1-4-алкокси-C_1-4-алкилкарбониламино, гетероарилокси-C_1-4-алкил, гетероарилтио-C_1-4 -алкил и гетероарил-C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкил, где гетероарил относится к 5- или 6-членному циклическому соединению, содержащему по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, включающей азот, серу и кислород; фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7 -алкокси, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C _1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, НО-C_1-4 -алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-C_1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей; фенил и гетероарил каждый независимо может быть конденсирован по меньшей мере с одним бензолом или гетероарилом, описанными выше; и конденсированные фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7-алкокси, C_1-7 -галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C_1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, HO-C_1-4-алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-C_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей.

Заболевания, вызванные повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или SREBP-1, могут представлять собой, не ограничиваясь этим, гипертензию, вызванную ренином, альдостеронизм, адренолейкодистофию, гломерулосклероз, протеинурию, нефропатию, стеатоз печени, гипертриглицеридемию или гиперренинемию. Так, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для предотвращения и лечения гипертензии, вызванной ренином, альдостеронизма, адренолейкодистофии, гломерулосклероза, протеинурии, нефропатии, стеатоза печени, гипертриглицеридемии или гиперренинемии, где фармацевтическая композиция содержит производные 1,2-дитиолтиона формулы 1 в качестве эффективного компонента м фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также предоставляет способ ингибирования экспрессии или активности LXR или SREBP-1 in vitro или in vivo, включающий введение фармацевтической композиции, где фармацевтическая композиция содержит в качестве эффективного компонента производное 1,2-дитиолтиона формулы 1 ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его пролекарство, его сольват или гидрат и фармацевтически приемлемый носитель.

Формула 1

где X представляет собой углерод или азот, Q представляет собой серу, кислород или -S=O и R¹ и R² каждое независимо выбирают из группы, включающей атом водорода, C_1-7-алкил, C_3-7-циклоалкил, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкокси, C_3-7 -пиклоалкокси, C_1-7-алкилтио, C_3-7-циклоалкилтио, C_1-7-алкенил, C_1-7-алкинил, C_1-7 -алкилсульфонил, C_1-7-алкиламинокарбонил, HO-C _1-7-алкил, HS-C_1-7-алкил, гидрокси, тиол, галоген, карбоксил, нитро, циано, C_1-7-алкилкарбонил, C _1-7-алкоксикарбонил, C_1-7-алкилкарбонилокси, C_1-4-алкилкарбонил-C_1-4-алкил, C_1-4 -алкокси-C_1-4-алкил, C_1-4-алкилтио-C _1-4-алкил, амино, C_1-7-алкиламино, C_1-7 -алкилкарбониламино, C_1-4-алкокси-C_1-4-алкиламино, C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкиламино, C_1-4 -алкилсульфонамино, фенил, гетероарил, фенил-C_1-4-алкил, гетероарил-C_1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкокси-C _1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкилтио-C_1-4 -алкил, фенокси-C_1-4-алкил, фенилтио-C_1-4 -алкил, фенилкарбониламино, фенокси-C_1-4-алкилкарбониламино, фенил-C_1-4-алкокси-C_1-4-алкилкарбониламино, гетероарилокси-C_1-4-алкил, гетероарилтио-C_1-4 -алкил и гетероарил-C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкил, где гетероарил относится к 5- или 6-членному циклическому соединению, содержащему по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, включающей азот, серу и кислород; фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7 -алкокси, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C _1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, HO-C_1-4 -алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-C_1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей; фенил и гетероарил каждый независимо может быть конденсирован по меньшей мере с одним бензолом или гетероарилом, описанными выше; и конденсированные фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7-алкокси, C_1-7 -галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C_1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, HO-C_1-4-алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-c_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей.

Настоящее изобретение также предоставляет способ предотвращения или лечения заболеваний или состояний, связанных с повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или SREBP-1, включающий введение фармацевтической композиции, где фармацевтическая композиция содержит в качестве эффективного компонента производное 1,2-дитиолтиона формулы 1 ниже, его фармацевтически приемлемую соль, его пролекарство, его сольват или гидрат и фармацевтически приемлемый носитель.

Формула 1

где Х представляет собой углерод или азот, Q представляет собой серу, кислород или -S=O и R¹ и R² каждое независимо выбирают из группы, включающей атом водорода, C_1-7-алкил, C_3-7-циклоалкил, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкокси, C_3-7 -циклоалкокси, C_1-7-алкилтио, C_3-7-циклоалкилтио, C_1-7-алкенил, C_1-7-алкинил, C_1-7 -алкилсульфонил, C_1-7-алкиламинокарбонил, HO-C _1-7-алкил, HS-C_1-7-алкил, гидрокси, тиол, галоген, карбоксил, нитро, циано, C_1-7-алкилкарбонил, C _1-7-алкоксикарбонил, C_1-7-алкилкарбонилокси, C_1-4-алкилкарбонил-C_1-4-алкил, C_1-4 -алкокси-C_1-4-алкил, C_1-4-алкилтио-C _1-4-алкил, амино, C_1-7-алкиламино, C_1-7 -алкилкарбониламино, C_1-4-алкокси-C_1-4-алкиламино, C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкиламино, C_1-4 -алкилсульфонамино, фенил, гетероарил, фенил-C_1-4-алкил, гетероарил-C_1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкокси-C _1-4-алкил, фенил-C_1-4-алкилтио-C_1-4 -алкил, фенокси-C_1-4-алкил, фенилтио-C_1-4 -алкил, фенилкарбониламино, фенокси-C_1-4-алкилкарбониламино, фенил-C_1-4-алкокси-C_1-4-алкилкарбониламино, гетероарилокси-C_1-4-алкил, гетероарилтио-C_1-4 -алкил и гетероарил-C_1-4-алкилтио-C_1-4-алкил, где гетероарил относится к 5- или 6-членному циклическому соединению, содержащему по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, включающей азот, серу и кислород; фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7 -алкокси, C_1-7-галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C _1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, HO-C_1-4 -алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-C_1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей; фенил и гетероарил каждый независимо может быть конденсирован по меньшей мере с одним бензолом или гетероарилом, описанными выше; и конденсированные фенил и гетероарил могут быть замещенными или незамещенными и доступный заместитель можно выбирать из группы, включающей галоген, C_1-7-алкил, C_1-7-алкокси, C_1-7 -галоалкил, C_1-7-алкилтио, C_1-7-алкенилокси, C_1-4-алкилкарбонил, C_1-4-алкиламино, нитро, амино, циано, HO-C_1-4-алкил, HS-C_1-4-алкил, HO-C_1-7-алкокси, HO-C_1-7-алкилтио, HS-C _1-7-алкилтио, HS-C_1-7-алкокси, тиол, гидрокси и карбоксил, и если замещены, фенил и гетероарил могут иметь один или много заместителей.

В отдельных осуществлениях способов лечения или предотвращения заболеваний или состояний, опосредованных LXR или SREBP-1 заболевание или состояние представляет собой, например, стеатоз печени, гипертриглицеридемию, гиперренинемию, гипертензию, вызванную ренином, альдостеронизм, адренолейкодистрофию, гломерулосклероз, протеинурию или нефропатию. В отдельных осуществлениях соединения, раскрытые здесь, применяют для облегчения и/или замедления развития одного или более из числа этих заболеваний или состояний. Производные 1,2-дитиолтиона, содержащиеся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, могут включать органическое соединение, включающее 1,2-дитиол-3-тион и бициклическую молекулу и производное органического соединения. Бициклическая молекуля может быть пиразином, пиридазином, пиримидином, тиазолом или тиофеном (таблица 1).

Таблица 1
Примеры соединений, содержащих 1,2-дитиол-3-тион, для ингибирования экспрессии SREBP-1
R1:-Н, -алкил(C 1-8) R2:-Н, -галоген, алкокси R3:-Н, -O R4:-Н, -алкил(C1-8) один из R2 замещен	R1: -H, -алкил(C 1-8) Один из X, Y и Z представляют собой - N и другие представляют собой C	R1:-H, -алкил(C1-8 ) R2:-Н, -алкил(C1-8)	R1:-Н, -алкил(C1-8) R2:-H,-алкил(C 1-8) - галоген	R1:-Н, -алкил(C 1-8) R2:-H,-алкил(C1-8) R3 :-Н, -алкил(C1-8) R4:-H, -алкил(C1-8 )	R1:-Н, -алкил(C1-8 ) R2:-H, -алкил(C1-8) R3:-H, - алкил(C1-8) R4:-H, - алкил(C1-8 )

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемые соли, образуемые с применением вышеописанных соединений, их сольваты, их гидраты, их q гидраты или их пролекарства. Фармацевтически приемлемой дополнительной солью может быть фармацевтически приемлемая дополнительная соль кислоты или фармацевтически приемлемая дополнительная соль основания. Термин «фармацевтически приемлемая дополнительная соль кислоты», как применяется в данной спецификации, может включать нетоксичныую дополнительную соль кислоты, образованную с применением соединения формулы 1, и являющуюся терапевтически активной. Соединение формулы 1 исходно обладает основными свойствами и при обработке соответствующей кислотой соединение формулы 1 можно перевести в фармацевтически приемлемую дополнительная соль кислоты соединения формулы 1. Соответствующие кислоты могут быть неорганическими кислотами или органическими кислотами. Примеры соответствующих неорганических кислот включают галогеноводородные кислоты, такие как соляная кислота или бромистоводородная кислота, серную кислоту, азотную кислоту и фосфорную кислоту. Примеры соответствующих органических кислот включают уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, пропановую кислоту, гидроксиуксусную кислоту, молочную кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту (бутандиоевую кислоту), малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, бензенсульфоновую кислоту, р-толуолсульфоновую кислоту, цикламовую кислоту, салициловую кислоту, р-аминосалициловую кислоту и памоевую кислоту. Соединение с кислотными свойствами можно также перевести в фармацевтически приемлемую дополнительная соль основания путем обработки соответствующим неорганическим или органическим основанием. Соответствующими дополнительными солями основания могут быть, например, аммонийная соль, соли щелочных или щелочноземельных металлов, такие как литиевая соль, натриевая соль, калийная соль, магниевая соль, кальциевая соль, соль органического основания, такая как соль бензатина, соль N-метил-D-глюкамина или соль гидрабамина, или соль аминокислоты, такой как аргинин или лизин.

Фармацевтическую композиция согласно настоящему изобретению можно получать в виде лекарственной формы для орального введения или для инъекций с применением соответствующих подходов, известных в фармацевтике, и затем вводить. Лекарственная форма для орального введения может быть в виде твердой или мягкой капсулы, таблетки, порошка, суспензии, сиропа. Лекарственная форма, соответствующая оральному введению, может включать в дополнение к по меньшей мере одному фармацевтически активному компоненту по меньшей мере один фармацевтически неэффективный неактивный общепринятый носитель. По меньшей мере один фармацевтически неэффективный неактивный общепринятый носитель может включать, например, наполнитель, связующее вещество, дезинтегратор и лубрикант. Примеры наполнителя включают порошок, лактозу, карбоксиметилцеллюлозу и каолин. Примеры связующего агента включают воду, желатин, спирт, глюкозу, гуммиарабик и смолу трагаканта. Примеры дезинтегратора включают порошок, декстрин и алгинат натрия. Примеры лубриканта включают тальк, стеариновую кислоту, стеарат магния и жидкий парафин. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно включать агент, способствующий растворению, для растворения.

Ежедневная доза фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать в соответствии с тяжестью заболевания, временем развития заболевания, возрастом, состоянием здоровья и сложностью состояния больного. Например, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить в дозе 1-500 мг, предпочтительно 30-200 мг, на взрослого в день. Дозу можно вводить в виде болюса или в несколько порций.

Настоящее изобретение далее описано в деталях с помощью нижеследующих экспериментальных примеров. Экспериментальные примеры приведены только с иллюстративными целями и не ограничивают область притязаний настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Сравнительный пример 1. Подопытные животные и диета

Самцов мышей C57BL/6 (средний вес 25-30 г) в качестве подопытных животных получают от Charles River Orient (Сеул, Корея). В течение по меньшей мере одной недели перед тестированием мышей акклиматизируют к окружающей обстановке в исследовательском центре тестирования на животных фармацевтического колледжа Сеульского национального университета, которые представляют собой влажность 55±5%, температуру 22±2°C и контролируемую вентиляцию. Мышей повторно и попеременно экспонируют на свету и затем помещают в темноту с интервалами времени 12 часов (с 7 утра до 7 вечера). Во время тестирования количество пищи и воды, поглощаемое мышами, существенно не меняется. Вес и состояние мышей замеряют каждую неделю. Две группы мышей, соответственно, выращивают на диете с высоким содержанием липидов (Dyets Inc., Bethlehem) и на нормальной диете в течение 10 недель. В течение последних четырех недель в каждом случае мышам вводят олтипраз (10 или 30 мг/кг, 3 раза в неделю) (фигура 1). Каждая группа включает 10 мышей.

Сравнительный пример 2. Получение образцов

Олтипраз и производные 1,2-дитиолтиона получают от CJ Co., Ltd. Производное 1,2-дитиолтиона, применяемые в настоящем изобретении, можно получать по способу, раскрытому в KR № 10-0604261. Диету с высоким содержанием липидов для индукции ожирения печени получают от Dyet Co., USA. Олтипраз разводят 40% ПЭГ200 для получения необходимой концентрации.

Сравнительный пример 3. ПЦР в реальном времени

Для получения кДНК применяют общую РНК (2 мкг) и праймер d(T) ₁₆, которые экстрагируют из печени мышей, и обратную транскриптазу AMV. Относительные количества генов оценивают количественно с помощью ПЦР в реальном времени с применением красителя CyBr зеленого. ПЦР в реальном времени проводят с помощью установки Light-cycler ^2.0 фирмы Roche (Mannheim, Germany). ПЦР проводят по способу производителя с применением программы Light-cycler software 4,0 для анализа относительного количества соответствующих генов.

Сравнительный пример 4. Вестерн-блоттинг

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводят с помощью аппарата Mighty Small II SE 250 по способу Лэммли (Laemmli UK (1970)). Разведения аликвот образцов печени разводят буфером для образцов (63 мМ Трис (pH 6,8), 10% глицерин, 2% ДСН, 0,0013% бромфеноловый синий, 5% -меркантоэтанол) и затем проводят электрофорез с применением 7,5% и 9% геля, приготовленного на растворе электродного буфера (15 г Трис, 72 г глицина и 5 г ДСН на 1 л раствора). После завершения электрофореза белки из геля переносят на нитроцеллюлозные мембраны в буферном растворе (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% v/v метанол (pH 8,3)) в аппарате для электрофореза при 190 мА в течение одного часа. Проводят реакцию с анти-SREBP-1 в качестве первичного антитела и затем с антителами козы против кроличьего IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена, в качестве вторичных антител в течение 1 часа. Затем применяют хемилюминесцентную систему ECL (Amersham, Gaithesberg, МА) для визуализации иммунореактивного белка. Равную нагрузку по количеству белка в соответствующих образцах идентифицируют с применением антител против -актина (Sigma, St. Louis, МО).

Сравнительный пример 5. Способ анализа

Данные, приведенные в нижеследующих экспериментальных примерах, получены с помощью программы для фармацевтических расчетов. Так, значимость отличий между различными экспериментальными группами оценивают с помощью однонаправленного анализа квадратичного отклонения (mono-direction quadratic variance assay) (Fisher, R.A., Statistical Methods for Research Workers, Edinburgh: Oliver & Boyd, 1925) и затем результаты обрабатывают по способу Ньюмана-Койла (Newman Keuls) (Norman GR et al., Biostatistics: The Bare Essentials, 2000) (*p<0,05, **p<0,01).

Экспериментальный пример 1. Действие олтипраза на повышенную экспрессию LXR

Мышей растят на диете с высоким содержанием липидов и на нормальной диете в течение 10 недель. Оценивают экспрессию LXR в ткани печени группы мышей, получавшей диету с высоким содержанием липидов и получавшим олтипраз (10-30 мг/кг, 3 раза в неделю), который является соединением 1,2-дитиолтиона, в течение последних четырех недель. Выделяют мРНК из печеночной ткани, синтезируют кДНК с помощью ПЦР в реальном времени и затем проводят ПЦР в реальном времени с применением соответствующего праймера (мышиный LXR, 5'-TGCCATCAGCATCTTCTCTG-3' (смысловой) и 5'-GGCTCACCAGCTTCATTAGC-3' (антисмысловой)). Уровню экспрессии мРНК LXR в группе с нормальной диетой (ND) придают значение 1 и определяют относительные уровни экспрессии в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, или в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, и олтипраз. Результаты приведены на фигуре 2. Так, можно видеть, что экспрессия LXR , являющегося внутриклеточным сенсором липидов, значительно повышена в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, (p<0,01) и увеличение экспрессии LXR ингибируется путем введения олтипраза (p<0,01).

Экспериментальный пример 2. Ингибирующее действие введения олтипраза на активность LXR

LXR контролирует экспрессию гена путем образования димера с RXR и связывания с соответствующим районом (LXRE) промотора гена-мишени. Изменяется ли связывающая способность LXRE при введении олтипраза, идентифицируют с помощью анализа электрофоретического сдвига. Двухцепочечный олигонуклеотид LXRE гена SREBP-1 метят с помощью радиоизотопа по 5 -концу с помощью [ -³²P]АТФ и Т4 полину клеотидкиназы и затем меченую пробу (1 мл, >10⁶ cpm) инкубируют с ядерной фракцией белков с буферном растворе для связывания. Реакционный раствор подвергают электрофорезу в 4% полиакриламидном геле и анализируют с помощью авторадиографии. Олигонуклеотидная последовательность LXRE, применяемая в данном тесте, представляет собой 5 -CAGTGACCGCCAGTAACCCCAGC-3 . Специфичность связывания с ДНК идентифицируют с помощью титрования немеченой («холодной») пробой и анализа сверхсдвига. Для титрования немеченой пробой заранее проводят реакцию с 20-тикратным избытком (на молярной основе) немеченых олигонуклеотидов. Для анализа сверхсдвига проводят реакцию антител против LXR или RXR (2 мкг) с реакционной смесью при комнатной температуре в течение примерно 30 мин и затем туда же добавляют пробы, меченые радиоизотопом, и дополнительно инкубируют в течение 30 мин, и затем подвергают электрофорезу.

При повышенной экспрессии LXR и RXR интенсивность медленно перемещающихся полос увеличивается по сравнению с контролем (см первую и вторую полосы на фигуре 3А). При проведении анализа сверхсдвига с помощью антител против LXR и RXR связывание белков с ДНК понижено из-за присутствия антител против LXR и RXR и образуются полосы со сверхсдвигом (смотри третью и пятую полосы на фигуре 3А). Такие результаты подтверждают специфичность связывания LXR /RXR с ДНК.

При введении олтипраза увеличение интенсивности полос с замедленной подвижностью (от первой до третьей полосы на фигуре 3) уменьшается (смотри четвертую и пятую полосы на фигуре 3 В). Такие результаты показывают, что связывающая способность LXR по отношению к ДНК значительно уменьшается при введении олтипраза.

Экспериментальный пример 3. Действие введения олтипраза на повышенную экспрессиею SREBP-1

Оценивают уровни экспрессии SREBP-1 в ткани печени мышей, применяемых в экспериментальном примере 1. мРНК выделяют из ткани печени, кДНК получают с помощью ПЦР в реальном времени и затем с ней проводят ПЦР в реальном времени с применением соответствующих праймеров (мышиный SREBP-1, 5'-AACGTCACTTCCAGCTAGAC-3' (смысловой) и 5'-CCACTAAGGTGCCTACAGAGC-3' (антисмысловой)). Уровню экспрессии мРНК SREBP-1 в группе с нормальной диетой (ND) придают значение 1 и определяют относительные уровни экспрессии в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, или в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов и олтипраз. Результаты приведены на фигуре 4. Так, можно видеть, что экспрессия SREBP-1 значительно повышена в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, (р<0,01) и увеличение экспрессии SREBP-1 ингибируется путем введения олтипраза (р<0,01).

Экспериментальный пример 4. Ингибирующее действие олтипраза на экспрессию и активность SREBP-1

H4IIE и HepG2, представляющие собой линию клеток печени и первичную культуру клеток печени крысы, соответственно, обрабатывают Т0901317 в качестве активатора LXR и затем идентифицируют белок SREBP-1 с помощью вестерн-блоттинга. Экспрессия SREBP-1 значительно повышена в течение 12 час после обработки Т0901317 (см. четвертые дорожки на соответствующих изображениях гелей (показанных на фигуре 5A). Повышенная экспрессия белка SREBP-1 уменьшается зависимым от концентрации образом при обработке олтипразом (пятая и шестая дорожки на соответствующих изображениях гелей на фигуре 5A), что демонстрирует ингибирование экспрессии SREBP-1 олтипразом.

Дополнительно, увеличение ядерной локализации SREBP-1 в клетках HepG2, обработанных Т0901317, снижается зависимым от концентрации образом при обработке олтипразом (фигура 5 В), что демонстрирует ингибирование активности SREBP-1 олтипразом.

Клеточные фракции получают следующим способом. Буферный раствор с низким осмотическим давлением (10 мМ HEPES (pH 7,9), 10 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% Nonidet Р-40, 1 мМ ДТТ и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF)) добавляют к линии клеток печени и помещают на лед на 10 мин. Затем полученный раствор центрифугируют при 7200 g в течение 5 мин и супернатант применяют в качестве цитоплазматической фракции. Отдельно, буферный раствор с высоким осмотическим давлением (20 мМ HEPES (pH 7,9), 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ и 1 мМ PMSF) добавляют к линии клеток печени и помещают на лед на один час. Затем полученный раствор центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин и супернатант применяют в качестве ядерной фракции. Отдельно буферный раствор (10 мМ HEPES (pH 7,9), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 0,5% Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40, 1 мМ ДТТ и 0,5 мМ PMSF) добавляют к клеткам, промытым PBS, и затем лизируют в течение 1 часа. Затем полученный раствор центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин и супернатант применяют в качестве целого клеточного экстракта. Эти клеточные фракции держат при температуре -70°C перед употреблением. Концентрацию белка определяют по способу Брэдфорда с помощью соответствующего набора (Bio-Rad protein assay kit, Hercules, CA, USA).

Экспериментальный пример 5. Ингибирующее действие производных 1,2-дитиолтиона на экспрессию SREBP-1

Действие производных 1,2-дитиолтиона на повышенную экспрессию SREBP-1, индуцированную активатором LXR (Т0901317), оценивают с применением линии клеток H4IIE. Экспрессия SREBP-1, повышенная в результате обработки клеток линии H4IIE с помощью Т0901317, ингибируется путем обработки производными 1,2-дитиолтиона (фигуры 6-8).

Экспериментальный пример 6. Ингибирующее действие олтипраза на экспрессию FAS и ACC, представляющих собой ферменты синтеза жирных кислот

Оценивают уровни экспрессии FAS и ACC, которые являются продуктами генов-мишеней SREBP-1, в ткани печени мышей, применяемых в экспериментальном примере 1. мРНК выделяют из ткани печени, кДНК получают с помощью ПЦР в реальном времени и затем с ней проводят ПЦР в реальном времени с применением соответствующих праймеров (мышиный ACC1, 5'-GTCAGCGGATGGGCGGAATG-3' (смысловой) и 5'-CGCCGGATGCCATGCTCAAC-3' (антисмысловой); мышиный FAS, 5'-AGCGGCCATTTCCATTGCCC-3' (смысловой) и 5'-CCATGCCCAGAGGGTGGTTG-3 (антисмысловой). Уровню экспрессии мРНК FAS и ACC1 в группе с нормальной диетой (ND) придают значение 1 и определяют относительные уровни экспрессии мРНК FAS или ACC в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, или в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов и олтипраз. Результаты приведены на фигуре 9. Так, можно видеть, что экспрессия FAS и ACC значительно повышена в группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов, (p<0,01) и увеличение экспрессии FAS и ACC ингибируется путем введения олтипраза (p<0,01).

Экспериментальный пример 7. Ингибирующее действие олтипраза на количество триглицеридов, аккумулированных в печеночной ткани в результате применения диеты с высоким содержанием липидов

Оценивают действие олтипраза на количество триглицеридов в ткани печени мышей в экспериментальном примере 1. Количество триглицеридов в печеночной ткани является индексом ожирения печени. После введения олтипраза (Bae et al., Hepatology, 2007, 46: 730-739) измеряют количество триглицеридовв ткани печени. У мышей, получавших диету с высоким содержанием липидов в течение 10 недель, количество триглицеридов в ткани печени значительно увеличивается по сравнению с мышами в группе, получавшей нормальную диету (p<0,01), но после введения олтипраза количество триглицеридов в ткани печени значительно уменьшается (p<0,01) (фигура 10).

Экспериментальный пример 8. Терапевтическое действие олтипразана на ткань печени в животной модели стеатоза печени, вызванного диетой с высоким содержанием липидов

Терапевтические эффекты олтипраза на ожирение печени, вызванное диетой с высоким содержанием липидов, применяемой в экспериментальном примере 1, идентифицируют с помощью окрашивания Oil-Red-O с применением специфичного к жиру красителя. Ткани печени животных с ожирением печени фиксируют с помощью нейтрального раствора 10% формалина и подвергают известной процедуре фиксации и процессу дегидрирования/обезвоживания и затем полученные ткани печени заплавляют в парафин. Помещенные в парафин кусочки ткани разрезают на срезы толщиной 4 мкм, окрашивают Oil-Red-O и затем идентифицируют с помощью оптического микроскопа. В группе, получавшей диету с высоким содержанием липидов (HFD + носитель), появляется значительное красное окрашивание; в группе, получавшей олтипраз (HFD + олтипраз) окрашенная в красный цвет часть значительно уменьшается (фигура 11). Таким образом, можно видеть, что терапевтическое действие олтипраза является высоким.

Получены различные составы, содержащие производные 1,2-дитиолтиона в качестве эффективного компонента.

Пример состава 1

Олтипраз	25 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем применяют известный способ получения таблеток, получая таким образом препарат в таблетках.

Пример состава 2

3-метил-1,2-дитиол-3-тион	50 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем применяют известный способ получения таблеток, получая таким образом препарат в таблетках

Пример состава 3

5-(6-метоксипиразинил)-4-метил-
1,2-дитиол-3-тион	100 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем применяют известный способ получения порошка, получая таким образом препарат в порошке.

Пример состава 4

Олтипраз	250 мг
Лактоза	50 мг
Крахмал	10 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем применяют известный способ получения порошков, получая таким образом препарат в порошке.

Пример состава 5

Олтипраз	25 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	28 мг
Тальк	2 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем заполняют ими мягкие желатиновые капсулы по известной процедуре изготовления капсул с целью получения препарата в виде капсул.

Пример состава 6

5-(6-метоксипиразинил)-4-метил-
1,2-дитиол-3-тион	50 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	28 мг
Тальк	2 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты смешивают и затем заполняют мягкие желатиновые капсулы по известной процедуре изготовления капсул с целью получения препарата в виде капсул.

Пример состава 7

Олтипраз	100 мг
Изомеризованный сахар	10 г
Сахар	30 мг
Натрия карбоксиметилцеллюлоза	100 мг
Лимонная отдушка	По необходимости
Очищенная вода	до нужного объема

(Общий объем всех компонентов 100 мл)

Суспензию получают с применением этих компонентов по известному способу получения суспензий и затем заполняют склянку темного стекла на 100 мл и стерилизуют, получая таким образом препарат в виде суспензии.

Пример состава 8

3-метил-1,2-дитиол-3-тион	250 мг
Лактоза	30 мг
Крахмал	20 мг
Стеарат магния	По необходимости

Эти компоненты перемешивают до гомогенности и заполняют ими покрытый полиэтиленом мешок и запаивают его, получая таким образом препарат в виде порошка.

Пример состава 9

Одна мягкая капсула содержит:

Олтипраз	100 мг
Полиэтиленгликоль 400	400 мг
Концентрированный глицерин	55 мг
Очищенная вода	35 мг

Полиэтиленгликоль и концентрированный глицерин смешивают и затем к ним добавляют очищенную воду. Температуру полученной смеси поддерживают на уровне примерно 60°C, к ней добавляют производное 1,2-дитиолтиона и равномерно смешивают путем перемешивания при скорости примерно 1500 об/мин. Затем при медленном перемешивании температуру снижают до комнатной и удаляют пузырьки с помощью вакуумного насоса, получая таким образом содержимое для мягкой капсулы. Поверхностную пленку мягкой капсулы получают путем мягкой обработки известным в данной области техники желатином или пластификатором. Одну капсулу получают с применением 132 мг желатина, 52 мг концентрированного глицерина, 6 мг 70% раствора дисорбита, этилванилина в качестве дополнительного агента отдушки и карнаубского воска в качестве покрывающего агента согласно общепринятому способу получения капсул.

Промышленное применение

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению является эффективной для предотвращения и лечения заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью LXR или заболеваний, обусловленных повышенной экспрессией или повышенной активностью SREBP-1. При введении фармацевтической композиции экспрессия и активность SREBP-1 ингибируется, где SREBP-1 является ключевым фактором транскрипции, контролирующим экспрессию генов липогенных ферментов путем изменения активности LXR , и дополнительно ингибируется экспрессия липогенных генов, в результате чего ингибируется аккумуляция трицлицеридов в ткани печени, которая происходит из-за стеатоза печени, вызванного метаболическим нарушением. Соответственно, фармацевтические композиции, содержащие производные 1,2-дитиолтиона в качестве активного компоненты согласно настоящему изобретению, являются эффективными для предотвращения и лечения стеатоза печени. Также, фармацевтические композиции являются эффективными для предотвращения и лечения гипертриглицеридемии, гиперренинемии, гипертензии, вызванной ренином, альдостеронизма, адренолейкодистрофии, гломерулосклероза, протеинурии и нефропатии.