индолил-замещенные пиразино-хинолины и их применение для лечения рака

Формула изобретения

1. Соединение формулы I,

,

в которой:

связи, обозначенные , представляют собой относительную стереохимию, в которой соответствующий атом водорода и 3-индолильная группа находятся в положении цис по отношению друг к другу;

X и Y независимо представляют собой -O-;

R¹ и R² могут вместе представлять собой C_1-2 алкиленовую мостиковую группу, образующую вместе с группами X и Y 5- или 6-членное кольцо;

R³-R¹⁰ независимо представляют собой H, галоген или -OR^b; или

любые две соседних группы R⁶-R⁹ могут связываться вместе с образованием дополнительного 5-6-членного кольца, необязательно

содержащего одну-три двойные связи, и это кольцо само является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-4алкила, необязательно замещенного одним или несколькими атомами фтора;

R ^b представляет собой H, C_1-6алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора, или -C(O)C _1-6алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора;

R¹¹ и R¹² независимо представляют собой H, C_1-6алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора, или -CH₂-фенил, в котором фенильный остаток необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-3алкила;

R¹³ и R¹⁴ независимо представляют собой H или C_1-6алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора,

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы I по п.1, где хиральный центр в 5-положении находится в R-конфигурации и/или хиральный центр в 9a положении находится в R-конфигурации.

3. Соединение формулы I по п.1, где хиральный центр в 5-положении находится в S-конфигурации и/или хиральный центр в 9a положении находится в S-конфигурации.

4. Соединение по п.1, где R³ -R¹⁰ независимо представляют собой: H или галоген.

5. Соединение по п.1, где R^b представляет собой H или незамещенный C_1-6алкил.

6. Соединение по п.1, где R¹¹ и R¹² независимо представляют собой: H; незамещенный C_1-6алкил или незамещенный CH₂-фенил,

и/или R¹³ и R¹⁴ независимо представляют собой H или незамещенный C_1-6 алкил.

7. Противоопухолевый фармацевтический состав, обладающий противоопухолевой активностью, содержащий соединение формулы I по любому из п. 1-6 или его фармацевтически приемлемую соль в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем.

8. Применение соединения по любому из п. 1-6 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рака, выбранного из рака предстательной железы, рака печени, рака легких и острых лимфоцитарных опухолей.

9. Применение по п.8, в котором пациент представляет собой млекопитающее, например человека.

10. Применение по п.8, где введение представляет собой пероральное, внутривенное. или подкожное введение в фармацевтически приемлемой лекарственной форме.

11. Применение по п.8, где ежедневный диапазон дозировки находится в пределах от примерно 0,01 мг до примерно 10 г.

12. Способ получения соединения формулы I (или его отдельного энантиомера) по любому из п. 1-6, в котором R¹ и R² связаны вместе, включающий:

реакцию соединения формулы I, в которой как R¹ , так и R² представляют собой атомы водорода, с соединением формулы II,



где L¹ и L² независимо представляют собой соответствующие уходящие группы, и R^1/2 представляет собой C_1-2алкилен (как

определено в п.1 в отношении связи между R¹ и R²).

13. Способ получения соединения формулы I (или его отдельного энантиомера) по любому из п. 1-6, включающий:

1) реакцию соединения формулы III,



или его отдельного энантиомера, где L ³ представляет собой соответствующую уходящую группу и R¹, R², R³, R⁴, R ⁵, R¹¹, R¹³, R¹⁴, X и Y являются такими, как определено в п.1, с соединением формулы IV,



где R⁶, R⁷, R⁸ , R⁹, R¹⁰ и R¹² являются такими, как определено в п.1,

с получением соединения формулы V; и

2) внутримолекулярную циклизацию соединения формулы V,



или его отдельного энантиомера, или его соли, где R¹, R², R³, R⁴ , R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹² , R¹³, R¹⁴, X и Y являются такими, как определено в п.1, с получением соединения формулы I.

14. Способ получения соединения формулы I (или его отдельного энантиомера) по любому из п. 1-6, в котором R¹¹ и/или R¹² представляют собой заместитель, иной, чем атом водорода, включающий:

реакцию соответствующего соединения формулы I, в котором R¹¹ и/или R¹² представляют собой атом водорода, с соединением (или двумя различными соединениями) формулы VA,

,

где R^11/12 представляет собой R¹¹ или R¹² (в зависимости от положения, в котором является желательным присоединение) по п.1, при условии, что он не представляет собой атома водорода.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым фармацевтически полезным соединениям, которые могут быть использованы в лечении рака. Настоящее изобретение также относится к способам синтеза для получения этих соединений.

Уровень техники

Рак представляет собой класс заболеваний, которым подвержены люди по всему миру. Как правило, клетки в доброкачественной опухоли сохраняют свои дифференцированные особенности и не делятся совершенно неконтролируемым образом. Доброкачественная опухоль обычно является локализованной и не дает метастаз.

В злокачественной опухоли клетки становятся недифференцированными, не отвечают на контрольные сигналы роста от организма и размножаются неконтролируемым образом. Злокачественные опухоли, как правило, делятся на две категории: первичные и вторичные. Первичные опухоли растут непосредственно из ткани, в которой они находятся. Вторичные опухоли могут происходить из первичных опухолей или могут возникать в другом месте в организме и способны к распространению на отдаленные места (образование метастаз) или к распространению метастаз. Обычные пути для распространения метастаз представляют собой прямой рост в соседние структуры, распространение через сосудистую или лимфатическую систему или через кровоток.

Метастазы опухоли являются главной причиной смертности у пациентов с раковыми заболеваниями. Имеются убедительные доказательства того, что ангиогенез является клинически релевантным для развития и распространения метастаз рака. Ангиогенез состоит из нескольких стадий: из деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции эндотелиальных клеток и образования капиллярных канальцев. Новые капиллярные сосуды, создаваемые опухолями, доставляют питательные вещества и кислород в растущую опухоль и удаляют катаболиты и диоксид углерода. Заболевания, связанные с аномальным ангиогенезом, требуют роста сосудов или вызывают его. Например, корнеальный ангиогенез включает три фазы: преваскулярный латентный период, активную неоваскуляризацию и созревание и регрессию сосудов.

Идентификация и механизм воздействия различных ангиогенных факторов, включая элементы воспалительной реакции, такие как лейкоциты, тромбоциты, цитокины и эйкозаноиды или неидентифицированные компоненты плазмы, нужно еще обнаружить.

Эта активность также требуется для распространения метастаз. Одним из важных ранних событий при развитии метастатического фенотипа является индукция генов, вовлеченных в ангиогенез, таких как VEGF и другие белки, которые высвобождаются из клеток опухоли и влияют на их окружающую микросреду. Раковые клетки продуцируют избыток проангиогенных факторов, таких как фактор роста васкулярного эндотелия (VEGF), bFGF (основной фактор роста фибробластов). Имеется семь членов семейства VEGF, включая VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и плацентарный фактор роста. VEGF действует специфично посредством рецепторов тирозинкиназы VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3. Ключевая молекула представляет собой VEGF-A (упоминается также ниже как 'VEGF'), она индуцирует ангиогенез посредством ускорения пролиферации, прорастания, миграции и образования канальцев эндотелиальных клеток. VEGF-A представляет собой один из наиболее сильнодействующих ускорителей ангиогенеза при раковых заболеваниях. VEGF связывается с VEGFR-1 и активирует передачу сигналов посредством киназ PI3K-Akt и таким образом приводит к увеличению выживания и миграции. С другой стороны, он индуцирует активность PLC посредством активирования c-src с последующим взаимодействием с VEGFR-2. Показано, что экспрессия VEGF связана со способностью ракового заболевания к распространению метастаз. VEGF может индуцировать развитие заболевания с помощью непосредственного воздействия на компоненты клеточного цикла с ускорением пролиферации клеток. Распространение метастаз представляет собой очень сложный процесс, который осуществляется с помощью ряда последовательных стадий, включая инвазию в соседние ткани, интравазацию, перенос через циркуляторную систему, остановку и рост во вторичной области.

Клинические исследования ясно показывают, что клетки опухоли могут испытывать период состояния покоя с последующим быстрым ростом во время рецидива. Хоуминг раковых клеток в конкретных органах остается в основном неизвестным. При карциномах начальная стадия метастатического распространения включает отсоединение эпителиальных клеток от внеклеточного матрикса и разрушение актинового цитоскелета с возникновением круглой формы. Перемещение мигрирующих клеток в окружающих микросреды тканях требует протеолитической модификации внеклеточных матриксов (ECM). Члены семейства белков матричных металлопротеиназ (MMP) играют важную роль в модификации ECM и в клеточной инвазии. MMP представляют собой цинк-зависимые эндопептидазы, которые играют разнообразные роли в биологии ECM, такие как высвобождение криптических фрагментов и неоэпитопов из макромолекул ECM, высвобождение факторов роста и модификация граница раздела клетка-ECM. Большинство MMP представляют собой секретируемые белки: однако шесть из них представляют собой мембранные белки. Главная функция MMP представляет собой деградацию структурных компонентов ECM и прямую или опосредованную миграцию клеток. Деградация внеклеточного матрикса не только ускоряет миграцию, но также высвобождает основные факторы роста из матричного хранилища. Интересно, что MMP вносят вклад в восстановление сосудов посредством деградации коллагена типа I, регуляции периваскулярных клеток и процессинга VEGF. Изменения архитектуры тканей после высвобождения MMP связаны с расщеплением E-кадгеринов и десмоглеинов. Экспрессия и взаимодействие MMP и TIMP, видимо, вовлечены в способность к инвазии и образованию метастаз при различных раковых заболеваниях.

Имеется несколько различных типов раковых заболеваний, которым подвержено все человечество, например те, которые описаны ниже. Рак предстательной железы (PCa) является одним из наиболее распространенных видов раковых заболеваний и представляет собой главную причину смертей, связанных с раком, по всему миру. Заболеваемость раком предстательной железы значительно увеличилась по всему миру (Jemal A, Siegel R, Ward E, et al., Cancer statistics, 2006, CA: a cancer journal for clinicians 56: 106-130, 2006; Yin M, Bastacky S, Chandran U, Becich MJ and Dhir R: Prevalence of incidental prostate cancer in general population: a study of a healthy organ donors; The Journal of urology 179: 892-895, discussion 895, 2008). Несмотря на последние успехи в ранней диагностике и лечении, PCa остается вторым из раковых заболеваний, вызывающих наибольшее количество смертей у мужчин в западном мире (Jemal et al., ibid, Yin et al., ibid).

Изначально большая часть раковых заболеваний предстательной железы восприимчива к андрогенной абляционной терапии, но большинство опухолей, в конечном счете, развивается до состояния, стойкого к воздействию андрогенов (Gronberg H: Prostate cancer epidemiology. Lancet 361: 859-864, 2003). Как только рак предстательной железы становится стойким к гормонам, раковые клетки могут вновь обрести способность к инвазии и к распространению метастаз в лимфатические узлы и отдаленные органы (Kalluri R: Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature reviews 3: 422-433, 2003).

Метастазы опухоли представляют собой главную причину смертности у пациентов с раковыми заболеваниями. Приблизительно у одной трети получавших лечение пациентов случается рецидив, и в настоящее время эффективного лечения для метастатического заболевания нет (Yin et al., ibid; Gronberg H, ibid; Albertsen PC, Hanley JA and Fine J: 20-year outcomes following conservative management of clinically localized prostate cancer. Jama 293: 2095-2101, 2005; Society AC: Cancer Facts & Figures 2008, Atlanta, GA, American Cancer Society, 2008). Развитие от гормон-зависимого до стойкого к гормонам и метастатического рака предстательной железы изучено плохо. При высокой распространенности заболевания, старении населения и при отсутствии эффективного лечения раковых метастаз имеется срочная необходимость в обнаружении и разработке новых терапевтических подходов.

Изначально PCa лечат с помощью гормональной терапии, которая имеет целью подавление продуцирования андрогенов и блокировку путей пролиферации и выживания медиируемых рецепторами андрогенов (AR). При запущенном PCa терапия с андрогенной депривацией (ADT) является главным поддерживающем лечением. Хирургическое удаление опухоли и использование агонистов гормонов или антагонистов AR, таких как флютамид, представляют собой главные типы ADT (DeMarzo AM, Nelson WG, Isaacs WB and Epstein JI: Pathological and molecular aspects of prostate cancer. Lancet 361: 955-964, 2003).

Доцетаксель, который имеет целью митотическое веретено и клеточный цикл пролиферации, используют при запущенных PCa. Однако в качестве единственного агента доцетаксель имеет самую умеренную активность. Современное лечение запущенного метастатического рака имеет успех при использовании антиангиогенных лекарственных средств. Avastin , ингибитор VEGF, нацелен на пути ангиогенеза для лечения метастатического рака предстательной железы и исследован при клинических испытаниях (Di Lorenzo G, Figg WD, Fossa SD, et al.: Combination of Bevacizumab and Docetaxel in Docetaxel-Pre-treated Hormone-Refractory Prostate cancer: A Phase 2 Study. European Urology 54: 1089-1096, 2008). Когда Avastin используют в качестве единственного агента или в сочетании с доцетакселем, доля положительной реакции значительно увеличивается. Однако побочные воздействия, вызываемые доцетакселем и Avastin , могут быть острыми, поскольку индивидуальные токсичности лекарственных средств при этом объединяются, вызывая множество побочных воздействий, в частности миелосупрессию и сердечную недостаточность (Friberg LE, Henningsson A, Maas H, Nguyen L and Karlsson MO: Model of chemotherapy-induced myelosuppression with parameter consistency across drugs. J Clin Oncol 20: 4713-4721, 2002). В дополнение к этому стоимость этих лекарственных средств очень высокая.

По этой причине разработка альтернативных видов лечения с минимальным отрицательным воздействием и с более низкой стоимостью будет давать очень большие клинические и экономические выгоды.

Эффективное лекарственное средство - кандидат для лечения метастатического рака должно иметь свойства нацеливания на множество путей развития раковых клеток, включая пути клеточной пролиферации, пути апоптоза и передачу сигналов ангиогенеза. Высокая биологическая доступность для лечения агрессивных форм рака также является важной.

Перечисление или обсуждение в настоящем описании предшествующих документов, опубликованных в явном виде, не должно обязательно восприниматься так, что документ представляет собой часть современного уровня техники или распространенную общую информацию.

Соединение этопозид представляет собой соединение, которое используется при лечении различных раковых заболеваний. Это соединение содержит тетрациклическое ядро, содержащее диоксолил, тетрагидронафтил и тетрагидрофуранил, все они конденсированы последовательно.

Гетероциклические соединения, содержащие субъединицу пиразинотетрагидро тетрагидроизохинолина, или их варианты, известны для использования в качестве медикаментов, например, как описано в Международной заявке на патент WO 98/16526 и в журнальной статье Crescendi, Orlando, 1997, Eur. J. Biochem., 247, 66-73. Однако ни один из этих документов не относится к соединениям, в которых такая субъединица замещается индолильной группой.

Кроме того, следующее соединение:

в котором водород в 9a-положении находится в S-конфигурации, и 3-индолильная группа в 5-положении находится в R-конфигурации (то есть указанное выше соединение имеет абсолютную стереохимию), выделяют из ботанических экстрактов в Китае. Это соединение и/или экстракты, из которых его можно выделять, могут демонстрировать биологическую активность в качестве медикамента. Однако нет описания, касающегося потенциального синтетического получения таких соединений, и, более того, нет описания такого соединения с иной относительной и/или абсолютной стереохимией для использования в качестве медикамента.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению формулы I,

I,

в которой:

связи, обозначенные , представляют собой относительную стереохимию (то есть соответствующий атом водорода и 3-индолильная группа являются цис по отношению друг к другу);

X и Y независимо представляют собой -O-, -N(R^a)-, либо один из них может альтернативно представлять собой -N=;

R ^a представляет собой H или C_1-6 алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора;

R¹ и R² независимо представляют собой H, C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора), -C(O)C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора), -CH₂-фенил (этот фенильный остаток является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-3 алкила), или, R¹ и R² могут вместе представлять собой C_1-2 алкиленовую мостиковую группу (то есть R¹ и R² могут связываться вместе с образованием, вместе с группами X и Y, к которым они обязательно присоединены, 5- или 6-членного кольца, в котором имеется C_1-2 алкиленовая группа, связывающая заместители X и Y);

R ³-R¹⁰ независимо представляют собой H, галоген, -OR^b, -N(R^c)R^d, C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора) или -CH₂-фенил (этот фенильный остаток является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-3 алкила); или

любые две соседних группы R⁶-R⁹ (то есть R⁶ и R⁷, R⁷ и R⁸ или R⁸ и R⁹) могут связываться вместе с образованием дополнительного 3-8- (например, 5- или 6-) членного кольца, необязательно содержащего одну-три двойные связи, необязательно содержащего один-четыре (например, один или два) гетероатома, и это кольцо само является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-4 алкила (необязательно замещенного одним или несколькими атомами фтора);

R^b представляет собой H, C _1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора) или -C(O)C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора);

R^c и R^d независимо представляют собой H или C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора);

R¹¹ и R ¹² независимо представляют собой H, C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора), -C(O)C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора), фенил (необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C _1-3 алкила) или -CH₂-фенил (этот фенильный остаток является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-3 алкила);

R¹³ и R¹⁴ независимо представляет собой H, C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора) или -CH₂-фенил (этот фенильный остаток является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C_1-3 алкила),

или к его фармацевтически приемлемой соли,

эти соединения и соли упоминаются ниже как "соединения по настоящему изобретению".

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, как описано выше, при условии, что это соединение не представляет собой:

то есть при условии, что когда: X и Y представляют собой -O-; R¹ и R² вместе представляют собой -CH₂-остаток, связывающий X и Y; R³-R¹⁰, R¹², R¹³ и R¹⁴ представляют собой атомы водорода; R¹¹ представляет собой метил, тогда, когда атом водорода в положении 9a находится в S-конфигурации, 3-индолильная группа не находится в S-конфигурации,

эти соединения и соли также упоминаются ниже как "соединения по настоящему изобретению".

Для устранения сомнений, и при условии того, что утверждается выше, что 3-индолильная группа и соответствующий атом водорода (присоединенный с помощью "боковой" связи) являются цис по отношению друг к другу, следующие соединения формулы IA и IB находятся в рамках соединений по настоящему изобретению:

в которых целые числа являются такими, как определено выше (и R^5a предпочтительно представляет собой атом водорода; если только он не отсутствует), но в которых "боковые" связи (присоединенные к 3-индолильной группе и к соответствующему атому водорода) представляют собой связи абсолютной конфигурации, как представлено "R" или "S", выделенными жирным шрифтом. То есть они могут представлять собой соединение формулы IA, в котором как 3-индолильная группа в 5-положении, так и соответствующий атом водорода в 9a-положении находятся в S-конфигурации, или соединение формулы IB, в котором оба этих остатка (3-индолильная группа в 5-положении и соответствующий атом водорода в 9a-положении) находятся в R-конфигурации. Кроме того, соединение по настоящему изобретению может представлять собой смесь (например, рацемическую смесь) соответствующих соединений формулы IA и IB (в которых две боковые группы либо обе находятся в R-конфигурации, либо обе находятся в S-конфигурации), то есть смеси двух различных энантиомеров цис диастереоизомеров. Предпочтительно получают отдельные энантиомеры соединений по настоящему изобретению, например, такие, в которых энантиомерный избыток (ee) больше, чем 50:50, например, больше, чем 80:20, например, больше, чем 90:10 (наиболее предпочтительно, в этих ситуациях ee примерно равен или больше чем, 99%; однако это может зависеть от оптической чистоты исходных материалов, которые могут использоваться при синтезе). Наиболее предпочтительно являются желательными отдельные энантиомеры соединений по настоящему изобретению, в которых абсолютная стереохимия на двух соответствующий хиральных центрах представляет собой S-конфигурацию (смотри соединение IA, выше).

В настоящем описании утверждается, что соединения по настоящему изобретению являются такими, в которых 3-индолильная группа в 5-положении и соответствующий атом водорода в 9a-положении являются цис относительно друг друга. Под этим авторы подразумевают, что цис диастереоизомер присутствует в отношении по меньшей мере 80:20 по сравнению с нежелательным транс диастереоизомером. Предпочтительно он присутствует по меньшей мере в отношении 90:10, например по меньшей мере или примерно 95:5, и наиболее предпочтительно по меньшей мере или примерно 99:1 (например, в соединении по настоящему изобретению присутствует пренебрежимо малое количество транс диастереоизомера или он по существу отсутствует).

Фармацевтически приемлемые соли включают соли дополнения кислот и соли дополнения оснований. Такие соли могут быть получены с помощью обычных средств, например, посредством взаимодействия формы свободной кислоты или свободного основания соединения формулы I с одним или несколькими эквивалентами соответствующей кислоты или основания, необязательно, в растворителе или в среде, в которой соль является нерастворимой, с последующим удалением указанного растворителя или указанной среды, с использованием стандартных технологий (например, в вакууме, посредством сушки вымораживанием или посредством фильтрования). Соли также могут быть получены посредством обмена противоиона соединения по настоящему изобретению в форме соли с другим противоионом, например, с использованием соответствующей ионообменной смолы. Чтобы исключить сомнения, сольваты также включаются в рамки настоящего изобретения.

Соединения по настоящему изобретению могут содержать двойные связи и могут таким образом существовать как E (entgegen) и Z (zusammen) геометрические изомеры примерно вокруг каждой отдельной двойной связи. Все такие изомеры и их смеси включаются в рамки настоящего изобретения.

Соединения по настоящему изобретению могут также демонстрировать таутомеризм. Все таутомерные формы и их смеси включаются в рамки настоящего изобретения.

Соединения по настоящему изобретению могут также содержать один или несколько асимметрических атомов углерода и могут по этой причине демонстрировать оптическую изомерию и/или диастереоизомерию. Диастереоизомеры могут разделяться с использованием обычных технологий, например хроматографии или фракционной кристаллизации. Различные стереоизомеры могут выделяться с помощью разделения рацемической или другой смеси соединений с использованием обычных технологий, например фракционной кристаллизации или ВЭЖХ. Альтернативно, желаемые оптические изомеры могут быть получены посредством взаимодействия соответствующих оптически активных исходных материалов при условиях, которые не будут вызывать рацемизации или эпимеризации (то есть с помощью метода 'хиральной ванны'), посредством взаимодействия соответствующего исходного материала с 'хиральным вспомогательным материалом', который впоследствии может удаляться на соответствующей стадии, посредством дериватизации (то есть разрешения, включая динамическое разрешение), например, с помощью гомохиральной кислоты с последующим разделением диастереомерных производных с помощью обычных средств, таких как хроматография, или посредством взаимодействия с соответствующим хиральным реагентом или хиральным катализатором, все это - при условиях, известных специалистам в данной области. Все эти стереоизомеры и их смеси включаются в рамки настоящего изобретения.

Если не указано иное, C_1-q алкильные группы (где q представляет собой верхний предел диапазона), определенные в настоящем описании, могут иметь прямую цепь или, когда имеется достаточное количество (то есть минимум два или три, по потребности) атомов углерода, иметь разветвленную цепь и/или быть циклическими (формируя, таким образом, C_3-q-циклоалкильную группу). Когда имеется достаточное количество (то есть минимум четыре) атомов углерода, такие группы могут также быть частично циклическими. Такие алкильные группы могут также быть насыщенными или, когда имеется достаточное количество (то есть минимум два) атомов углерода, быть ненасыщенными (образуя, например, C_2-q алкенильную или C_2-q алкинильную группу). Если не указано иное, C_1-2 алкиленовые группы, как определено в настоящем описании, относятся к -CH₂- или -CH₂-CH ₂-, то есть к линейному (неразветвленному алкилену). Однако C_1-2 алкилен также охватывает ненасыщенный C_1-2 алкилен, то есть =C(H)- и -CH=CH-.

Термин "галоген", когда он используется в настоящем описании, включает фтор, хлор, бром и йод.

Чтобы исключить сомнения, когда в настоящем описании используется такой термин, как "R ¹-R¹⁵", специалист в данной области должен понимать, что означает R¹, R², R³ , R⁴, R⁵, R^5a (хотя R^5a предпочтительно отсутствует, то есть он представляет собой водород), R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R ¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R ¹⁴ и R¹⁵ включительно.

Настоящее изобретение также охватывает изотопно-меченные соединения по настоящему изобретению, которые являются идентичными тем, которые перечисляются в настоящем описании, но фактически, один или несколько атомов заменяются атомом, имеющим атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, обычно имеющегося в природе (или находящегося в природе в наибольшей пропорции). Все изотопы любого конкретного атома или элемента, как указано в настоящем описании, рассматриваются в рамках соединений по настоящему изобретению. Следовательно, соединения по настоящему изобретению также включают дейтерированные соединения, то есть такие, в которых один или несколько атомов водорода заменяются изотопом водорода, дейтерием.

Все индивидуальные признаки (например, предпочтительные признаки), рассмотренные в настоящем описании, могут рассматриваться в сочетании с любым другим признаком (включая предпочтительные признаки), рассмотренным в настоящем описании, или отдельно от него (следовательно, предпочтительные признаки могут рассматриваться в сочетании с другими предпочтительными признаками или независимо от них).

Специалист в данной области заметит, что соединения по настоящему изобретению, которые являются предметом настоящего изобретения, включают те, которые являются стабильными. То есть соединения по настоящему изобретению включают такие, которые являются достаточно стойкими, чтобы выдержать выделение, например, из реакционной смеси до желаемой степени чистоты.

Соединения по настоящему изобретению, которые могут рассматриваться, включают такие соединения, в которых любые две соседние группы R⁶-R⁹ не могут быть связаны вместе, то есть R⁶-R⁹ независимо представляет собой H, галоген, -OR^b, -N(R ^c)R^d, C_1-6 алкил (необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора) или -CH₂-фенил (этот фенильный остаток является необязательно замещенным одним или несколькими заместителями, выбранными из галогена и C _1-3 алкила).

Другие соединения по настоящему изобретению, которые могут рассматриваться, включают такие соединения, в которых: когда любые две соседние группы R⁶-R ⁹ (то есть R⁶ и R⁷, R⁷ и R⁸ или R⁸ и R⁹) связываются вместе с образованием дополнительного кольца, тогда это кольцо предпочтительно представляет собой 5- или 6-членное (например, 6-членное) карбоциклическое кольцо, предпочтительно содержащее двойные связи (например, одну или несколько, предпочтительно образуя бензольное кольцо, конденсированное с требуемой индолильной группой соединения формулы I);

R^5a представляет собой атом водорода.

Предпочтительные соединения по настоящему изобретению включают такие соединения, в которых:

R⁵ и R^5a независимо представляют собой атомы водорода;

R⁶ -R⁹ независимо представляют собой: водород; галоген; -OR^b; -N(R^c)R^d; незамещенный C_1-6 алкил или незамещенный -CH₂-фенил; или

две соседние группы R⁶-R⁹ (например, R⁸ и R⁹) связываются вместе с образованием 6-членного кольца (например, бензольного кольца);

любые две или три из R⁶-R⁹ (например, R⁶ и R⁸, и, например, необязательно, R⁹) представляют собой атом водорода, а другие (например, R⁷) представляют собой атом водорода или заместитель, выбранный из галогена (например, хлор) и -OR^b, или любые два соседних заместителя (например, R⁸ и R ⁹) связываются вместе с образованием дополнительного 6-членного кольца (например, бензольного кольца);

R¹² представляет собой атом водорода, C_1-4 (например, C_1-2) алкил (например, метил); эта алкильная группа является предпочтительно незамещенной) или -CH₂-фенил.

Предпочтительные соединения по настоящему изобретению, которые могут рассматриваться, включают такие соединения, в которых:

R^a представляет собой H или незамещенный C_1-6 алкил;

R¹ и R² независимо представляет собой: H; незамещенный C_1-6 алкил; незамещенный -C(O)C_1-6 алкил; незамещенный -CH₂-фенил; или R¹ и R² могут вместе представлять собой C_1-2 алкиленовую мостиковую группу;

R³-R¹⁰ независимо представляет собой: -N(R^c)R^d; или предпочтительно H; галоген; -OR^b; незамещенный C_1-6 алкил или незамещенный -CH₂-фенил (более предпочтительно по меньшей мере пять (например, по меньшей мере шесть) из R ³-R¹⁰ представляют собой атомы водорода, то есть только два или предпочтительно один из R³-R ¹⁰ представляют собой заместитель, иной чем атом водорода);

R^b представляет собой незамещенный -C(O)C _1-6 алкил или предпочтительно H или незамещенный C _1-6 алкил;

R^c и R^d независимо представляют собой H или незамещенный C_1-6 алкил;

R¹¹ и R¹² независимо представляют собой: незамещенный -C(O)C_1-6 алкил, незамещенный -CH₂-фенил или предпочтительно H; незамещенный C_1-6 алкил; или незамещенный фенил;

R¹³ и R¹⁴ независимо представляют собой незамещенный -CH₂-фенил, или предпочтительно H, или незамещенный C_1-6 алкил;

предпочтительные заместители на фенильных остатках включают галоген (например, фтор и хлор) и метил.

Более предпочтительные соединения по настоящему изобретению, которые могут рассматриваться, включают такие соединения, в которых:

R^a представляет собой водород;

R¹ и R² независимо представляет собой водород или C_1-3 алкил (например, метил), или R¹ и R² вместе представляет собой -CH₂-, -CH₂CH₂- или -C(H)= (связывая вместе X и Y);

как X, так и Y представляет собой -O-; либо один из X и Y представляет собой -O-, а другой представляет собой -N(R^a)- или -N= (в этом случае, R¹ иR² предпочтительно представляют собой -CH₂- или -C(H)=); либо любой из X и Y представляет собой -N(R^a)-, а другой представляет собой -O- или -N= (в этом случае R¹ и R² предпочтительно представляют собой -CH₂- или -C(H)=);

R³-R¹⁰ независимо представляют атом водорода или -OR^b (например, любой из R³-R¹⁰ , например R⁵, может представляет собой -OR^b или атом водорода, а другие представляют атомы водорода);

R^b представляет атом водорода;

R¹³ и R¹⁴ независимо представляют атом водорода;

R¹¹ представляет собой C _1-4 (например, C_1-3) алкил (например, метил, этил или -пропил) или незамещенный фенил;

R¹² представляет атом водорода или C_1-3 алкил (например, метил);

Необходимый 3-индолильный остаток в 5-положении находится в S-конфигурации;

атом водорода в 9a-положении находится в S-конфигурации.

Предпочтительные кольца, которые могут представлять собой X, Y, R¹ и R ² (когда два последних представляют собой C_1-2 алкиленовую группу, связывающую X и Y), включают:

Например, 1,3-диоксолильную группу, 1,4-диоксинильную группу (предпочтительно 2,3-дигидро-[1,4]-диоксинильную группу), оксазолильную группу (например, оксазолильную или 2,3-дигидро-оксазолильную) или имидазолильную группу (специалист в данной области заметит, что две изображенных имидазолильных группы могут существовать в равновесии благодаря таутомеризму). Когда R¹ и R ² не связаны вместе, тогда такие группы независимо представляют атом водорода или C_1-3 алкил (например, метил), например, -X-R¹ и -Y-R² независимо представляет собой -OH или -OCH₃ (например, как -X-R¹, так и -Y-R² представляют собой -OH, или оба они представляют собой -OCH₃).

Кроме того, предпочтительные соединения по настоящему изобретению, которые могут рассматриваться, включают такие соединения, в которых:

X и Y независимо представляет собой -O-;

R¹ и R ² вместе представляет собой мостиковую группу -CH₂ -, соединяющую X и Y с образованием 1,3-диоксолильного остатка, то есть:

R³, R⁴, R⁵ , R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹², R¹³ и R¹⁴ независимо представляют атомы водорода;

R ¹¹ представляет собой C_1-3 алкил (например, метил);

необходимый 3-индолильный остаток находится в S-конфигурации;

атом водорода в 9a-положении находится в S-конфигурации.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с технологиями, которые хорошо известны специалистам в данной области, например, как описано ниже.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы I, включающему:

(i) для соединений формулы I, в которых R¹ и R² связываются вместе, взаимодействие соединения формулы I, в которой как R ¹, так и R² представляют атомы водорода (или его защищенного производного), с соединением формулы II,

L¹-R^1/2- L² II

где L¹ и L² независимо представляют собой соответствующие уходящие группы, такие как сульфонатная группа (например, -OS(O)₂CF₃ , -OS(O)₂CH₃, -OS(O)₂PhMe или нонафлат), хлор, бром или предпочтительно йод, и R^1/2 представляет собой C_1-2 алкилен (как определено выше в отношении связи R¹ и R²), при стандартных условиях реакции, например, в присутствии соответствующего основания, такого как NaH, NaOH, Na₂CO₃, K₂ CO₃, K₃PO₄, Cs₂CO ₃, алкоксидное основание (такое как f-BuONa или t-BuOK, или что-либо подобное) или аминовое основание (такое как Et ₃N, пиридин, трибутиламин, триметиламин, диметиламинопиридин, диизопропиламин и диизопропилэтиламин или что-либо подобное), или смесей оснований и соответствующего растворителя, такого как толуол, дихлорметан, ацетонитрил или полярный апротонный растворитель (такой как тетрагидрофуран, диоксан, простой диэтиловый эфир, диметилсульфоксид или диметилформамид), или их смесей. Предпочтительное основание включает Cs₂CO₃ , а предпочтительные растворители включают диметилформамид. Такая реакция может иметь место при комнатной температуре, но предпочтительно осуществляется при повышенной температуре (например, выше 100ºC, например, примерно при 150ºC);

(ii) соединения формулы I или их защищенные производные могут также быть получены посредством взаимодействия соединения формулы III

(или его отдельного энантиомера; например, хирального амина, в котором связь, несущая группу -NH₂ , имеет определенную конфигурацию), где L³ представляет собой соответствующую уходящую группу, такую как определено выше в отношении L¹ и L² (например, йод, бром или хлор), но предпочтительно представляет собой -OR^a (в которой R^a предпочтительно представляет собой C_1-6 алкил, например метил), и R¹, R ², R³, R⁴, R⁵, R¹¹ , R¹³, R¹⁴, X и Y являются такими, как определено выше, с соединением формулы IV,

или его защищенным производным, где R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R ¹⁰ и R¹² являются такими, как определено выше, при условиях реакции конденсации и циклизации, например, в присутствии уксусной кислоты и ацетата натрия (хотя могут использоваться различные растворители и/или основания), эта реакция может давать промежуточное соединение формулы V, как определено ниже. После этого (например, если образуется соль добавления кислоты, например, соль AcOH и промежуточного соединения формулы V), реакционная смесь может нейтрализоваться (например, посредством добавления NaHCO₃ (насыщенный водный раствор)), что может приводить к образованию соединения формулы I, например, посредством реакции внутримолекулярной циклизации любого промежуточного соединения формулы V, которое может образовываться. Специалист в данной области заметит, что стереохимия соединения формулы III может влиять на стереохимию соединения формулы I, образующегося таким образом. Например, если соединение формулы III содержит хиральный центр определенной конфигурации, тогда стереоспецифичность исходного материала может определять стереохимию продукта (например, формулы I), образующегося таким образом. Например, соединение формулы III с абсолютной стереохимией, как показано с помощью формулы IIIA на следующей далее схеме, может образовывать соединение формулы I с абсолютной стереохимией, показанной с помощью формулы IA, по следующей схеме:

Подобным же образом, специалист в данной области заметит, что начиная с рацемической формы соединения формулы III, можно получить любой из диастереоизомеров и/или энантиомеров соединения формулы I (например, посредством разделения диастереоизомеров, например, с помощью хроматографии, такой как ВЭЖХ, и посредством разделения энантиомеров, например, посредством разрешения);

(iii) внутримолекулярная циклизация соединения формулы V,

или его соли (например, соли добавления кислоты, такой как соль AcOH) или его отдельного энантиомера (отдельного энантиомера и отдельного цис-диастереоизомера), где R¹, R², R³, R⁴, R ⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ , R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ , R¹⁴, X и Y являются такими, как определено выше, которая может осуществляться при стандартных условиях, например, когда используется соль добавления кислоты соединения формулы V (например, если она образуется in situ), затем сначала может осуществляться нейтрализация (например, при таких условиях, как те, которые описаны в отношении стадии (ii), выше). Внутримолекулярная циклизация (то есть нуклеофильное замещение на карбонильной группе) может происходить естественным путем или может ускоряться посредством добавления соответствующего основания; или

(iv) соединения формулы I, в которых R¹¹ и/или R¹² представляют собой заместитель, иной, чем атом водорода (например, в которых они оба представляют собой заместители, иные, чем атомы водорода), могут быть получены из соответствующего соединения формулы I, в котором R¹¹ и/или R¹² представляют собой атом водорода, с соединением формулы VA (или двух различных соединений),

R^11/12-L⁴ VA

где R^11/12 представляет собой R¹¹ или R¹² (в зависимости от положения, в котором является желательным присоединение), при условии, что он не представляет собой атома водорода, в присутствии основания (такого как то, которое описано выше в отношении стадии способа (i); например, NaH) и в соответствующем растворителе (таком как тот, который описан выше на стадии способа (i); например, в полярном апротонном растворителе, таком как диметилформамид) при стандартных условиях, известных специалистам в данной области. Специалист в данной области заметит, что эти условия реакции будут работать при получении соединений, в которых R^11/12 представляет собой C_1-6 алкил, -C(O)-C_1-6 алкил или -CH₂фенил (в которых алкильный и фенильный остатки являются необязательно замещенными, как определено выше). Для получения соединений, в которых R^11/12 представляет собой необязательно замещенный фенил, должны использоваться различные условия, например условия реакции связывания в присутствии соответствующего катализатора (например, Pd(OAc)₂ или чего-либо подобного), необязательной добавки, основания и соответствующего растворителя.

Соединения формулы III могут быть получены посредством взаимодействия соединения формулы VI,

или его защищенного производного (например, амино-защищенного производного, например, -NHBoc-защищенного производного или его сложного эфира), или его отдельного энантиомера, где R¹, R², R³, R⁴ , R⁵, X и Y являются такими, как определено выше, с соединением формулы VII,

H(R¹¹)N-C(R ¹³)(R¹⁴)-C(O)L³ VII

где R¹¹, R¹³, R¹⁴ и L³ являются такими, как определено выше (и L³ предпочтительно представляет собой -OR ^a, как определено выше), при стандартных условиях реакции амидного связывания, например, в присутствии соответствующего реагента связывания (например, 1,1'-карбонилдиимидазола, N,N'-дициклогексилкарбодиимида, 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (или его гидрохлорида), N,N'-дисукцинимидилкарбоната или наиболее предпочтительно хлорангидрида бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфоновой кислоты (то есть Bop-Cl) или чего-либо подобного), необязательно, в присутствии соответствующего основания (например, гидрида натрия, бикарбоната натрия, карбоната калия, пиридина, триэтиламина, диметиламинопиридина, диизопропиламина, гидроксида натрия, трет-бутоксида калия и/или диизопропиламида лития (или их вариантов) и соответствующего растворителя (например, тетрагидрофурана, пиридина, толуола, дихлорметана, хлороформа, ацетонитрила, диметилформамида, трифторметилбензола, диоксана или триэтиламина). Предпочтительные агенты связывания включают Bop-Cl, предпочтительные основания включают триэтиламин и/или бикарбонат натрия (например, их смесь) и предпочтительная система растворителей представляет собой дихлорметан (в этом случае реакционная смесь может получать возможность для взаимодействия при комнатной температуре или вблизи нее в течение некоторого периода времени). Альтернативно, группа карбоновой кислоты соединения формулы VI может преобразовываться при стандартных условиях в соответствующий ацилохлорид (например, в присутствии SOCl ₂ или оксалилхлорида), этот ацилхлорид затем взаимодействует с соединением формулы VII, например, при условиях, сходных с теми, которые рассмотрены выше.

Соединения, рассмотренные в настоящем описании (например, соединения формул II, IV, VA, VI и VII, а также определенные другие соединения формулы III), являются либо коммерчески доступными, либо известными из литературы, либо могут быть получены, либо по аналогии со способами, описанными в настоящем описании, либо с помощью обычных процедур синтеза, в соответствии со стандартными технологиями, из доступных исходных материалов с использованием соответствующих реагентов и условий реакции. В этом отношении специалист в данной области может сослаться среди прочего на "Comprehensive Organic Synthesis" by B. M. Trost and I. Fleming, Pergamon Press, 1991.

Заместители R¹, R² , R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴ , X и Y в конечных соединениях по настоящему изобретению или в соответствующих промежуточных соединениях могут модифицироваться один или несколько раз, после процессов, описанных выше, или в течение их, с помощью способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Примеры таких способов включают замещение, восстановление, окисление, алкилирование, ацилирование, гидролиз, эстерификацию, этерификацию, галогенирование или нитрирование. Такие реакции могут приводить к получению симметричного или асимметричного конечного соединения по настоящему изобретению или промежуточного соединения. Группы предшественники могут заменяться другой такой группой, или группами, определенными в формуле I, в любой момент времени, в течение последовательности реакций. В этом отношении специалист в данной области может также сослаться на "Comprehensive Organic Functional Group Transformations" by A. R. Katritzky, O. Meth-Cohn and C. W. Rees, Pergamon Press, 1995.

Соединения по настоящему изобретению могут выделяться из их реакционных смесей с использованием обычных технологий (например, перекристаллизации).

Специалисту в данной области будет понятно, что в способах, описанных выше и ниже, функциональные группы промежуточных соединений могут потребовать защиты с помощью защитных групп.

Например, аминогруппы могут защищаться с помощью группы Boc посредством взаимодействия в присутствии основания (например, NaOH или аминового основания, такого как триэтиламин, диметиламинопиридин или что-либо подобное) с Boc₂O и в соответствующем растворителе (например, в воде или полярном апротонном растворителе, таком как диоксан, тетрагидрофуран, простой диэтиловый эфир или их смеси). Стандартные условия реакции снятия защиты включают снятие защиты в присутствии кислоты (например, в присутствии HCl, в таком растворителе, как полярный апротонный растворитель).

Защита и снятие защиты функциональных групп может иметь место до или после в какой-либо реакции в рассмотренных выше схемах.

Защитные группы могут удаляться в соответствии с технологиями, которые хорошо известны специалистам в данной области, и как описано ниже. Например, защищенные соединения/промежуточные соединения, описанные в настоящем описании, могут преобразовываться химически в незащищенные соединения с использованием стандартных технологий снятия защиты. В качестве 'защитной группы' авторы также включают соответствующие альтернативные группы, которые являются предшественниками реальной группы, которую желательно защитить. Например, вместо 'стандартной' амино-защитной группы может использоваться нитро или азидо группа для того, чтобы она служила эффективно в качестве амино-защитной группы, эти группы могут впоследствии преобразовываться (послужив в целях действия в качестве защитной группы) в амино группу, например, при стандартных условиях восстановления, описанных в настоящем описании. Защитные группы, которые могут рассматриваться, включают лактоновые защитные группы (или их производные), которые могут служить для защиты как гидрокси группы, так и -карбокси группы (то есть такой, что между двумя функциональными группами образуется циклический остаток).

Тип осуществляемого химического механизма будет диктовать необходимость и тип защитных групп, а также последовательность осуществления синтеза.

Использование защитных групп полно описывается в "Protective Group in Organic Synthesis", 3^rd edition, T. W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999).

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается синтетическая форма соединения по настоящему изобретению (то есть соединениия формулы I (или его соли)), которая характеризуется тем фактом, что ее получают синтетически, например, в соответствии со способами, описанными в настоящем описании. Такие соединения также упоминаются в настоящем описании как "соединения по настоящему изобретению".

Медицинские и фармацевтические применения

Соединения по настоящему изобретению определяются как фармацевтические средства. В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к соединению по настоящему изобретению, как выше (но без каких-либо условий, где это возможно) для применения в качестве фармацевтического средства. Также изобретение относится к синтетической форме соединения по настоящему изобретению (но без каких-либо условий, где это возможно) для применения в качестве фармацевтического средства.

Чтобы исключить сомнения, хотя соединения по настоящему изобретению могут обладать фармакологической активностью как таковые, могут существовать или быть получены определенные фармацевтически приемлемые (например, "защищенные"), производные соединений по настоящему изобретению, которые могут не обладать такой активностью, которые могут вводиться парентерально или перорально и после этого метаболизироваться в организме с получением соединений по настоящему изобретению. Такие соединения (которые могут обладать некоторой фармакологической активностью при условии, что такая активность заметно ниже, чем у "активных" соединений, до которых они метаболизируются) могут по этой причине описываться как "пролекарства" соединений по настоящему изобретению.

Как "пролекарство соединения по настоящему изобретению" авторы включают соединения, которые образуют соединение по настоящему изобретению в экспериментально детектируемом количестве, в пределах заданного времени (например, примерно 1 часа), после перорального или парентерального введения. Все пролекарства соединений по настоящему изобретению включаются в рамки настоящего изобретения.

Кроме того, некоторые соединения по настоящему изобретению могут сами по себе обладать минимальной фармакологической активностью или не обладать ею, но они могут вводиться парентерально или перорально, и после этого метаболизироваться в организме с образованием соединений по настоящему изобретению, которые обладают фармакологической активностью сами по себе. Такие соединения (которые также включают соединения, которые могут обладать некоторой фармакологической активностью, но у которых эта активность заметно ниже, чем у "активных" соединений по настоящему изобретению, до которых они метаболизируются), также могут описываться как "пролекарства".

Таким образом, соединения по настоящему изобретению являются пригодными для использования, поскольку они обладают фармакологической активностью и/или метаболизируются в организме после перорального или парентерального введения с образованием соединений, которые обладают фармакологической активностью.

Соединения по настоящему изобретению (как определено выше, но без условия(ий)) могут быть пригодными для использования при лечении рака. Под "раком" авторы подразумевают любое заболевание, которое возникает из-за неконтролируемого роста клеток (например, неконтролируемого деления), инвазии (например, непосредственного роста в соседних тканях) или распространения метастаз. Под "неконтролируемым ростом", авторы включают увеличение количества и/или размера раковых клеток (также упоминаемое в настоящем описании как "пролиферация"). Под "распространением метастаз" авторы подразумевают перемещение или миграцию (например, инвазивность) раковых клеток из области первичной опухоли в организме субъекта в одну или несколько других областей в организме субъекта (где клетки могут затем образовывать вторичные опухоли). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает соединения и способы полного или частичного ингибирования образования вторичных опухолей у субъекта с раковым заболеванием.

Преимущественно соединения по настоящему изобретению могут быть способны селективно ингибировать пролиферацию и/или распространение метастазы раковых клеток.

Под "селективностью" авторы подразумевают, что соединения по настоящему изобретению могут ингибировать пролиферацию и/или распространение метастаз раковых клеток до большей степени, чем они модулируют функции (например, пролиферацию) нераковых клеток. Предпочтительно соединения по настоящему изобретению ингибируют пролиферацию и/или распространение метастаз только раковых клеток.

Соединения по настоящему изобретению могут быть пригодными для использования в лечении любого типа рака, включая все опухоли (не-твердые и твердые опухоли). Тип рака может включать (но, не ограничиваясь этим) доброкачественные опухоли (такие как гемангиома, гепатоцеллюлярная аденома, кавернозная гемангиома, гиперплазия фокальных узелков, невринома слухового нерва, нейрофиброма, аденома желчных путей, цистанома желчных путей, фиброма, липомы, лейомиомы, мезотелиомы, тератомы, миксомы, узловая регенеративная гиперплазия, трахомы и пиогенные гранулемы) и злокачественные опухоли (такие как лейкемия, миелодиспластические синдромы (MDS), рак предстательной железы, рак груди, рак кожи, рак костей, рак печени, рак легких, рак мозга, рак гортани, мочевого пузыря, желчного пузыря, яичников, шейки матки, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, пищевода, надпочечников, нервной ткани, головы и шеи, толстой кишки, желудка, бронхов, почек, базально-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома как язвенного, так и папиллярного типа, метастатическая карцинома кожи, остеосаркома, саркома Эвинга, саркома ветикулярных клеток, миелома, гигантоклеточная опухоль, мелкоклеточная опухоль легких, не-мелкоклеточная опухоль легких, камни желчного пузыря, инсулинома, первичная опухоль мозга, острые и хронические лимфоцитарные и гранулоцитарные опухоли, волосатоклеточная опухоль, аденома, гиперплазия, медуллярная карцинома, феохромоцитома, нейромы слизистых, ганглионеврома кишечника, гиперпластическая опухоль корнеального нерва, опухоль марфаноидного внешнего вида, опухоль Вильма, семинома, опухоль яичников, опухоль лейомиомы матки, дисплазия шейки матки и карцинома in situ, нейробластома, ретинобластома, саркома мягких тканей, злокачественная карциноидная опухоль, местное повреждение кожи, грибовидный микоз, рабдомиосаркома, саркома Капоши, остеогенная и другая саркома, злокачественная гиперкальцемия, опухоль клеток надпочечников, истинная полицитемия, аденокарцинома, глиобластома мультиформа, лейкемии, лимфомы, злокачественные меланомы, плоскоклеточный рак и другие карциномы и саркомы). Другие раковые заболевания, которые могут рассматриваться, включают раковые заболевания яичек, мочеполового тракта, глиобластому, нейробластому, кератоакантому, плоскоклеточный рак, крупноклеточную карциному, фолликулярную карциному, недифференцированную карциному, папиллярную карциному, семиному, миелоидные расстройства, лимфоидные расстройства, опухоли волосковых клеток, полости рта и гортани (ротовой полости), губы, языка, ротовой полости, тонкого кишечника, толстой и прямой кишки, толстого кишечника, прямой кишки, мозга и центральной нервной системы, опухоль Ходжкина и лейкемию; гемопоэтические опухоли лимфоидной прослойки, включая лейкемию, острую лимфоцитарную лейкемию, острую лейкемию лимфобластов, лимфому B-лимфоцитов, лимфому T-лимфоцитов, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, лимфому волосковых клеток и лимфому Беркета; гемопоэтические опухоли миелоидной прослойки, включая острую и хроническую миелогенные лейкемии, миелодиспластический синдром и промиелоцитарную лейкемию; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; и другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, остеосаркому, пигментную ксеродерму, кератоксантому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши.

В частности, соединения по настоящему изобретению могут обладать сильнодействующей ингибиторной активностью по отношению к росту и инвазии стойких к гормонам и агрессивных опухолей предстательной железы человека (например, как может быть показано в моделях мышей с привитыми опухолями). По этой причине является особенно предпочтительным, чтобы соединения по настоящему изобретению могли быть пригодными для использования при лечении агрессивных раковых заболеваний, таких как рак предстательной железы.

Соединения по настоящему изобретению могут уменьшить скорость пролиферации клеток, когда они исследуются в анализе с использованием линии раковых клеток PC-3 (например, полученной от ATCC). Таким образом, соединения могут обладать преимущественным ингибиторным воздействием на способность к выживанию у опухолей этого типа и у раковых заболеваний, в целом. Линия раковых клеток PC-3 имеет несколько свойств, которые представляют собой гормон-независимый и инвазивный рак предстательной железы. Например, клетки PC-3 не имеют передачи функциональных сигналов рецепторов андрогенов (AR), быстро растут в культурной среде и могут образовывать большие и очень агрессивные опухоли, когда имплантируются голым мышам. Следовательно, биологические исследования, описанные ниже (например, модели мышей с привитыми опухолями PC-3), дают четкое предсказание полезности исследуемых соединений посредством моделирования постепенного распространения клеток карциномы предстательной железы in vivo.

Кроме того, сообщалось, что даже широко используемые противораковые лекарственные средства, такие как Avastin или доцетаксель сами по себе или в сочетании имеют низкое ингибиторное воздействие на клетки PC-3 (Petrylak DP: Future directions in the treatment of androgen-independent prostate cancer. Urology 65: 8-12, 200538, 2007; и Hung H: Bevacizumab plus 5-fluorouracil induce growth suppression in the CWR-22 and CWR-22R prostate cancer xenografts. Molecular cancer therapeutics 6: 2149-2157, 2007).

Соединения по настоящему изобретению могут нацеливаться на множество клеточных путей, которые ассоциируются с ростом, ангиогенезом и распространением метастаз опухоли. Соединения по настоящему изобретению могут также влиять на другие пути опухолей, такие как регуляция клеточного цикла и апоптоз.

По этой причине соединения по настоящему изобретению могут представлять собой ингибиторы VEGF (фактора роста васкулярного эндотелия), например, они могут ингибировать экспрессию рецепторов VEGF, включая, но, не ограничиваясь этим, VEGF и/или рецептор 2 VEGF (как может быть показано в исследовании, описанном в настоящем описании). Это может осуществляться селективно, или это может представлять собой один из множества механизмов, с помощью которых соединения по настоящему изобретению действуют для лечения рака. Путь передачи сигнала VEGF, как известно, связан с васкуляризацией и инвазией опухоли, и, следовательно, соединения по настоящему изобретению могут обладать противораковыми воздействиями посредством ингибирования ангиогенеза (и по этой причине могут классифицироваться как агенты против ангиогенеза). По этой причине в другом варианте осуществления настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению могут быть пригодными для использования при лечении заболевания, при котором является желательным и/или необходимым ингибирование ангиогенеза (и/или VEGF).

Термин "ингибирование" может относиться к любому измеримому уменьшению и/или предотвращению, которое в контексте ангиогенеза относится к уменьшению и/или предотвращению ангиогенеза (например, к экспрессии рецепторов VEGF, включая, но не ограничиваясь этим, VEGF и рецептор 2 VEGF). Ингибиторная активность может измеряться посредством сравнения ингибирования ангиогенеза в образце, содержащем соединение по настоящему изобретению, и (a) рецептор(ы) VEGF, такие как VEGF и/или рецептор 2 VEGF, с помощью эквивалентного образца в отсутствие соединения по настоящему изобретению. Измеряемое изменение может быть объективным (например, измеряемым с помощью некоторого исследования или маркера, например, при анализе или исследовании in vitro или in vivo, таком как одно из описанных ниже, или в ином пригодном для использования анализе или исследовании, известном специалистам в данной области) или субъективным (например, субъект сообщает показания или ощущения относительно воздействия).

Соединения по настоящему изобретению являются показанными как при терапевтическом, так и/или при профилактическом лечении рассмотренных выше состояний.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания (например, рака или другого заболевания, как рассмотрено в настоящем описании), которое может ассоциироваться с ангиогенезом (и/или VEGF; например, ингибированием экспрессии VEGF и/или рецептора 2 VEGF) или быть подверженным его влиянию, где это является желательным и/или необходимым, этот способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению, но без условия(ий), как определено выше, пациенту, страдающему от такого состояния или склонному к нему.

"Пациенты" включают пациентов млекопитающих (включая людей). Следовательно, способ лечения, обсуждаемый выше, может включать лечение организма человека или животного.

Термин "эффективное количество" относится к некоторому количеству соединения, которое оказывает терапевтическое воздействие на пациента, которого лечат. Воздействие может быть объективным (например, измеряемым с помощью некоторого исследования или маркера) или субъективным (например, когда субъект сообщает о показаниях или ощущениях от воздействия).

Соединения по настоящему изобретению могут вводиться перорально, внутривенно, подкожно, буккально, ректально, дермально, назально, трахеально, бронхиально, сублингвально, с помощью любого другого парентерального способа или посредством ингаляции, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме.

Соединения по настоящему изобретению могут вводиться сами по себе, но предпочтительно вводятся в виде известных фармацевтических составов, включая таблетки, капсулы или эликсиры для перорального введения, суппозитории для ректального введения, стерильные растворы или суспензии для парентерального или внутримышечного введения, и тому подобное. Тип фармацевтического состава может выбираться, исходя из предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. Такие фармацевтически приемлемые носители могут быть химически инертными по отношению к активным соединениям и не могут иметь вредных побочных воздействий или токсичности при условиях применения.

Такие составы могут быть получены в соответствии со стандартной и/или принятой фармацевтической практикой. В других случаях получение соответствующих составов может осуществляться безотносительно к настоящему изобретению специалистом в данной области, использующим рутинные технологии, и/или в соответствии со стандартной и/или принятой фармацевтической практикой.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится, таким образом, к фармацевтическому составу, содержащему соединение по настоящему изобретению, как определено выше, но без условия(ий), в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем и/или носителем.

В зависимости, например, от сильнодействия и физических характеристик соединения по настоящему изобретению (то есть активного ингредиента) фармацевтические составы, которые могут рассматриваться, включают такие, в которых активный ингредиент составляет по меньшей мере 1 вес.% (или по меньшей мере 10%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 50%). То есть отношение активного ингредиента к другим компонентам (то есть к добавке вспомогательного вещества, разбавителя и носителя) фармацевтической композиции составляет по меньшей мере 1:99 (или по меньшей мере 10:90, по меньшей мере 30:70 или по меньшей мере 50:50) по массе.

Количество соединения по настоящему изобретению в составе будет зависеть от тяжести состояния и от пациента, который должен лечиться, а также от соединения(ий), которое используется(ются), но оно может определяться безотносительно к настоящему изобретению специалистом в данной области.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения фармацевтического состава, как определено выше, включающему приведение в ассоциацию соединения по настоящему изобретению, как определено выше, или его фармацевтически приемлемого сложного эфира, амида, сольвата или соли с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем.

Соединения по настоящему изобретению могут также объединяться с другими терапевтическими агентами, которые могут быть пригодными для использования в лечении рака и/или пролиферативного заболевания (например, с другим ингибитором VEGF, как описано в настоящем описании). Соединения по настоящему изобретению могут также объединяться с другими видами терапии.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусматривается комбинированный продукт, содержащий:

(A) соединение по настоящему изобретению, как определено выше, но без условия(ий); и

(B) один или несколько терапевтических агентов, которые являются пригодным для использования в лечении рака и/или пролиферативного заболевания,

где каждый из компонентов (A) и (B) составляет в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем.

Такие комбинированные продукты дают возможность для введения соединения по настоящему изобретению в сочетании с другим терапевтическим агентом и могут, таким образом, присутствовать либо как отдельные составы, где по меньшей мере один из этих составов содержит соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере один содержит другой терапевтический агент, либо могут быть представлены (то есть составлены) как объединенный состав (то есть быть представлены как отдельный состав, содержащий соединение по настоящему изобретению и другой терапевтический агент).

Таким образом, изобретение дополнительно относится к следующему:

(1) фармацевтический состав, содержащий соединение по настоящему изобретению, как определено выше, но без условия(ий), один или несколько терапевтических агентов, который является пригодным для использования в лечении рака и/или пролиферативного заболевания, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель или носитель; и

(2) набор из частей, содержащих компоненты:

(a) фармацевтический состав, содержащий соединение по настоящему изобретению, как определено выше, но без условия(ий), в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем; и

(b) фармацевтический состав, содержащий один или несколько терапевтических агентов, которые являются пригодным для использования в лечении рака и/или пролиферативного заболевания в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем.

Каждый из этих компонентов (a) и (b) представлен в такой форме, которая является пригодной для введения в сочетании с друг с другом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения комбинированного продукта, как определено выше, но без условия(ий), включающему приведение в ассоциацию соединения по настоящему изобретению, как определено выше, или его фармацевтически приемлемого сложного эфира, амида, сольвата или соли с другим терапевтическим агентом (или агентами), который является (или являются) пригодным (пригодными) для использования в лечении рака и/или пролиферативного заболевания, и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, разбавителя или носителя.

Под термином "приведение в ассоциацию" авторы подразумевают, что два компонента делаются пригодными для введения в сочетании друг с другом.

Таким образом, по отношению к способу для получения набора из частей, как определено выше, посредством приведения двух компонентов "в ассоциацию" друг с другом, авторы предполагают, что два компонента набора из частей могут быть:

(i) представлены как отдельные составы (то есть независимо друг от друга), которые впоследствии объединяются вместе для использования в сочетании друг с другом при сочетанной терапии; или

(ii) упакованы и представлены вместе как отдельные компоненты "объединенной упаковки" для использования в сочетании друг с другом при комбинированной терапии.

В зависимости от расстройства и пациента, которого нужно лечить, а также от способа введения, соединения по настоящему изобретению могут вводиться пациенту в различных терапевтически эффективных дозах. Однако доза, вводимая млекопитающему, в частности человеку, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной для осуществления терапевтической реакции у млекопитающего в течение разумных временных рамок. Специалист в данной области заметит, что выбор конкретной дозы и композиции и наиболее соответствующего режима доставки также будет зависеть, среди прочего, от фармакологических свойств состава, природы и тяжести состояния, которое лечится, и от физического состояния и состояния рассудка пациента, а также от сильнодействия конкретного соединения, возраста, состояния, массы тела, пола и реакции пациента, который должен лечиться, и от стадии/тяжести заболевания.

Введение может быть постоянным или периодическим (например, с помощью инъекции болюса). Дозировка может также определяться временным режимом и частотой введения. В случае перорального или парентерального введения дозировка может варьировать примерно от 0,01 мг до примерно до 10 г (например, 1000 мг) соединения по настоящему изобретению в день. Например, диапазон дозировок может находиться в пределах от 1 мг/кг до 1000 мг/кг (например, от 10 мг/кг до 500 мг/кг, предпочтительно от примерно 20 мг/кг до 200 мг/кг), как это происходит с диапазонами, используемыми на моделях мышей, описанных ниже.

В любом случае медицинский работник или другой специалист в данной области будет способен рутинно определить реальную дозировку, которая будет наиболее пригодной для индивидуального пациента. Рассмотренные выше дозировки являются иллюстрациями для среднего случая; разумеется, могут существовать отдельные случаи, где нужны более высокие или более низкие диапазоны дозировок, и они находятся в рамках настоящего изобретения.

Соединения по настоящему изобретению могут иметь то преимущество, что они нацелены на множество путей, включая рост опухоли, апоптоз, ангиогенез и распространение метастаз. Соединения по настоящему изобретению могут также представлять собой эффективные ингибиторы ангиогенеза (и/или ингибиторы VEGF), то есть они могут (например, селективно, или в качестве одного из режимов действия) ингибировать ангиогенез (и/или VEGF; например, они могут ингибировать экспрессию VEGF и рецептора 2 VEGF).

Соединения по настоящему изобретению могут также иметь то преимущество, что они могут быть более эффективными, менее токсичными, более долгодействующими, более сильнодействующими, производить меньшие побочные воздействия, легче поглощаться и/или иметь лучший фармакокинетический профиль (например, более высокую пероральную биологическую доступность и/или более низкий клиренс) и/или иметь другие полезные фармакологические, физические или химические свойства по сравнению с соединениями, известными из литературы, либо для применения при указанных выше показаниях, либо в иных случаях.

Например, соединения по настоящему изобретению могут хорошо переноситься пациентом, то есть демонстрировать меньше побочных воздействий (например, потерю массы или другие токсичные побочные воздействия), например, по сравнению с другими терапевтическими агентами, или вообще их не демонстрировать. Это может иметь место даже при высоких концентрациях/дозах соединений по настоящему изобретению. Соединения по настоящему изобретению могут также демонстрировать хорошее сильнодействие (например, лучшее сильнодействие, чем другие терапевтические агенты) при относительно или сравнительно более низкой дозе. Следовательно, соединение по настоящему изобретению может иметь большое терапевтическое окно.

Соединения по настоящему изобретению могут иметь преимущества по сравнению с другими известными химиотерапевтическими агентами (например, Avastin , доцетакселем и/или этопозидом), которые включают лучшее сильнодействие и лучший профиль безопасности (то есть уменьшение побочных воздействий). Такие сравнительные преимущества могут быть продемонстрированы при биологических исследованиях, таких как те, которые описаны ниже.

Предпочтительные, неограничивающие примеры, которые воплощают определенные аспекты настоящего изобретения, будут теперь описываться со ссылками на следующие далее фигуры:

Фигура 1: Толерантность здоровых мышей к лечению соединением Примера 1 (также упоминается в настоящем описании как "Вещество X") при различных дозах.

A. Здоровых мышей лечат с 100 мг/кг Вещества X через день, в течение 13 дней. Массу тела каждой мыши измеряют периодически от дня 1 до дня 13, и значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD).

B. Здоровых мышей лечат с 200 мг/кг Вещества X через день в течение 13 дней. Массу тела каждой мыши измеряют через день, и значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD).

Фигура 2: Ингибирование роста опухоли на модели животных с привитыми опухолями при больших размерах опухолей.

Когда опухоли у мышей, имплантированных PC-3, вырастают до размеров 500-600 мм³, мышей лечат 40 мг/кг Вещества X или растворителя (Контроль) внутривенно в течение 20 дней и периодически измеряют размер опухоли. Значения размеров опухоли представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD).

Фигура 3: Ингибирование роста опухолей у модели животных с привитыми опухолями посредством перорального введения Вещества X

Когда опухоли мышей, имплантированных PC-3, вырастают до размеров 300-350 мм³, мышей лечат 40 мг/кг Вещества X или растворителя (Контроля). Вещество X вводится перорально.

Фигура 4: Ингибирование роста опухолей у модели животных с привитыми опухолями с помощью Этопозида и Вещества X

Когда опухоли у мышей, имплантированных PC-3, вырастают до размеров 200-300 мм³, мышей лечат 20 мг/кг Этопозида, 40 мг/кг Вещества X или растворителя (Контроля) внутривенно через день в течение 14 дней. Размер опухоли периодически измеряют, и значения размера опухоли представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD).

Фигура 5: Воздействие Вещества X на экспрессию VEGF и рецептора 2 VEGF

Иммуногистохимический анализ VEGF и рецептора 2 VEGF осуществляют на опухолях Контрольных мышей и мышей, получавших лечение Веществом X. Продемонстрированы репрезентативные картинки. Срезы опухолей (Контроль) или (Вещество X) окрашивают антителом против VEGF и рецептора 2 VEGF человека.

Фигура 6: Гистологические срезы цельных опухолей от Контрольных мышей и мышей, получавших лечение Веществом X, и оценка воздействия Вещества X на васкуляризацию

A. Сравнение внешнего вида и гистологии одной пары опухолей, окрашенных с помощью антитела рецептора 2 VEGF.

B. Иммуногистохимический анализ опухолей от Контрольных мышей и мышей, получавших лечение Веществом X, на экспрессию CD31. Срезы опухолей (Контроль) или (Вещество X) окрашивают антителом против CD31, (B). Области с высокой плотностью сосудов в центре или на периферических участках внутри опухолей исследуют. Регистрируют количество CD31-положительных пикселей в микроскопическом поле. Определяют по меньшей мере два среза на опухоль и три вида на срез. Осуществляют статистический T-анализ, и он является двухсторонним, и значение P, меньшее чем 0,05, считается статистически значимым, значение P, меньшее чем 0,01, отмечается двумя звездочками.

Фигура 7: Воздействие синтезированного Lund University и Enamine Соединения X на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A,Значенияпредставляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 8: Воздействие Примера 2 (Аналог 1) на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A, Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 9: Воздействие Примера 3 (Аналог 2) на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A, Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 10: Воздействие Примера 4 (Аналог 3) на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A, Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 11: Воздействие Примера 5 (Аналог 4) на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A, Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 12: Воздействие Примера 6 (Аналог 5) на рост клеток PC-3. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. A, Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. B, Кривая доза-реакция для эффекта ингибирования роста.

Фигура 13: Параллельное сравнение воздействий Аналогов 1 и 3 с этопозидом и доцетакселем. Количество жизнеспособных клеток через 48 часов. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.

Фигура 14: Противоопухолевое воздействие Аналога 1 и 3 на линию клеток лимфомы лейкемических моноцитов человека U937.

Фигура 15: Анализ пролиферации клеток в заданные моменты времени после лечения концентрациями IC₅₀ аналогов: Соединение X 30 мкМ, Аналог 1 36 мкМ, Аналог 2 60 мкМ, Аналог 3 32 мкМ, Аналог 4 30 мкМ.

Фигура 16: Результаты для различных соединений, исследуемых при анализе BrdU.

Фигуры 17, 18, 19 и 20: Результаты определенных примеров при анализе апоптоза

Фигуры 21, 22, 23 и 24: Результаты определенных примеров при анализе клеточного цикла

Примеры/биологические исследования

Материалы получают от коммерческих поставщиков и используют без дополнительной очистки, если только не отмечено иное. Все реакции, чувствительные к влажности и воздуху, осуществляют в атмосфере сухого азота с использованием стеклянных емкостей, высушенных в печке. Масс-спектры высокого разрешения (ESI) записывают на микроспектрометре Micromass Q-TOF. Спектры ЯМР записывают на Bruker Advance II при 400 МГц (¹ H), и химические сдвиги приводятся по отношению к остаточному пику дейтерированного растворителя. Всю флэш-хроматографию осуществляют на силикагеле Matrex 60 Å, 35-70 мкм. Анализ ТСХ осуществляют на пластинках с силикагелем Gel 60 F₂₅₄ (Merck) и визуализируют с помощью a) УФ света и b) ванилина/серной кислоты и нагрева.

Процедура синтеза промежуточного соединения (12). (Стадия I)

К раствору L-Dopa (11) (1 экв.) в диоксане (с получением 0,6 М раствор L-Dopa (11)) добавляют 1 М NaOH (1,1 экв.), H₂O (55 экв.) и Boc₂ O (1,1 экв.), растворенный в диоксане (с получением 2,8 М раствора Boc₂O). Через 30, 60 и 120 мин pH доводят до 10 посредством добавления 1 М NaOH. Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Раствор концентрируют при пониженном давлении, pH доводят до ~2 посредством добавления 1 М HCl и экстрагируют EtOAc×2. Объединенные органические фазы сушат над Na ₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Продукт дополнительно не очищают.

Общая процедура синтеза промежуточного соединения (15) и (16). (Стадия II)

К суспензии карбоновой кислоты (12) (1 экв.) и амина (например, (13), (14)) (1,1 экв.) в CH₂Cl₂ (с получением 0,03 M раствора карбоновой кислоты (11)) добавляют Et₃N (3,5 экв.) и полученный раствор охлаждают до 0ºC. Добавляют Bop-Cl (1,16 экв.), а затем NaHCO₃ (2,1 экв.) и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Летучие вещества выпаривают и остаток распределяют между EtOAc и 1 M HCl. Органическую фазу промывают насыщенн. (водн.) NaHCO ₃, насыщенным раствором соли, сушат над Na₂SO ₄, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc/петролейный эфир (60-80) в качестве элюента).

Общая процедура синтеза промежуточного соединения (17) и (18). (Стадия III)

К перемешиваемой суспензии Boc-защищенного первичного амина (например, (15), (16)) добавляют 2 M HCl в Et₂O (с получением 0,1 M суспензии защищенного амина (например, (15), (16)) при 0ºC. Суспензию перемешивают при 0ºC в течение 1 часа. Суспензию отфильтровывают, промывают Et₂O на льду, растворяют в MeOH и выпаривают. Продукт дополнительно не очищают.

Общая процедура синтеза промежуточного соединения (23), (24), (25) и (26). (Стадия IV)

К раствору индольного производного (например, (19), (20), (21), (22)) (1 экв.) в сухом ТГФ (с получением 0,05 M раствора индольного производного (например, (19), (20), (21), (22))) добавляют Boc₂O (1,5 экв.), а затем DMAP (0,3 экв.). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Раствор разбавляют H₂O, летучие вещества выпаривают и остаток экстрагируют EtOAc×2. Объединенные органические фазы промывают насыщенным раствором соли, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Продукт дополнительно не очищают.

Общая процедура синтеза промежуточного соединения/вещество (9), (10), (27), (28), (29) и (30). (Стадия V)

К раствору первичного амина (например, (17) или (18)) (1 экв.) в AcOH (с получением 0,07 M раствора первичного амина (например, (17) или (18))) добавляют 3 экв. NaOAc и 1 экв. альдегида (например, (23), (24), (25), (26)). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализуют посредством добавления насыщенн. (водн.) NaHCO₃ и экстрагируют 3 раза CH₂Cl ₂. Объединенные органические фазы промывают насыщенным раствором соли, сушат над Na₂SO₄ фильтруют и выпаривают. Остаток фильтруют на SiO₂ (EtOAc в качестве элюента)/очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc в качестве элюента).

Общая процедура синтеза вещества (1), (2), (3) и (4). (Стадия VI)

К смеси тетрагидроизохинолинового производного (например, (27), (28), (29), (30)) (1 экв.) и Cs₂CO₃ (1,5 экв.) в свежеперегнанном ДМФ (с полученном в 0,5 M раствора тетрагидроизохинолинового производного (например, (27), (28), (29), (30)) добавляют BrCH ₂Cl (1,5 экв.). Смесь нагревают при 150°C в течение 2,5 часа. Смесь фильтруют, разбавляют EtOAc, промывают H ₂O×2, насыщенным раствором соли, сушат над Na ₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc/петролейный эфир (60-80) в качестве элюента).

Процедура синтеза вещества (5). (Стадия VII)

К раствору (1) (1 экв.) в свежеперегнанном ДМФ (с получением в 0,4 M раствора (1)) при 0°C добавляют NaH (1,2 экв.), смесь перемешивают при 0°C в течение 10 мин, после чего добавляют MeI (1,2 экв.). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Добавляют H₂O и смесь экстрагируют EtOAc×3. Объединенные органические фазы промывают H₂O, насыщенным раствором соли, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc/петролейный эфир (60-80) в качестве элюента).

Процедура синтеза вещества (6). (Стадия VIII)

К раствору (1) (1 экв.) в свежеперегнанном ДМФ (с получением в 0,5 M раствора (1)) при 0ºC добавляют NaH (1,2 экв.), смесь перемешивают при 0°C в течение 10 мин, после чего добавляют бензилбромид (1,2 экв.). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Добавляют H₂O и смесь экстрагируют EtOAc×3. Объединенные органические фазы промывают H₂O, насыщенным раствором соли, сушат над Na₂ SO₄, фильтруют и выпаривают. Остаток очищают с помощью колоночной флэш-хроматографии (EtOAc/петролейный эфир (60-80) в качестве элюента).

Пример 1 (также упоминается в настоящем описании как "Вещество X")

(5S,9aS)-5-(1H-индол-3-ил)-8-метил-7,8,9a,10-тетрагидро-5H-1,3-диокса-5a,8-диаза-циклопента[b]антрацен-6,9-дион (альтернативное наименование: (2S,8S)-2-(1H-индол-3-ил)-6-метил-13,15-диокса-3,6-диазатетрацикло[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16] гептадека-1(10)11,16-триен-4,7-дион (1))

(a) N-Boc защищенный L-Dopa (2)

К раствору 5,004 г (25,4 ммоль) L-Dopa (1) в 40 мл диоксана и 25 мл H₂O добавляют 28 мл (28 ммоль) 1 M NaOH и 6,0893 г (27,9 ммоль) BOC₂O, растворенного в 8 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре. Через 30 минут pH доводят до 10 посредством добавления 1 M NaOH. pH опять доводят до 10 через 1 час и через 7,5 час. После последнего установления pH раствор перемешивают в течение ночи. Летучие вещества выпаривают и pH полученной водной фазы доводят до 2, и экстрагируют ее 3×100 мл EtOAc. Объединенные органические фазы промывают 150 мл воды, 150 мл насыщенного раствора соли, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают, с получением 7,6 г (25,4 ммоль, 100%) N-Boc-защищенного L-Dopa (2).

(b) сложный метиловый эфир N-Boc-{[(S)-2-амино-3-(3,4-дигидрокси-фенил)пропионил]метиламино}уксусной кислоты (3)

5,0341 г (16,9 ммоль) (2) и 2,6002 г (18,6 ммоль) гидрохлорида сложного саркозинметилового эфира суспендируют в 500 мл CH₂Cl₂, добавляют 8,3 мл (59,5 ммоль) Et₃N и смесь охлаждают до 0°C. Добавляют 5,0118 г (19,7 ммоль) Bop-Cl, а затем 2,9991 г (35,7 ммоль) NaHCO₃ и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Летучие вещества выпаривают и остаток распределяют между 400 мл EtOAc и 400 мл 1 M HCl (водн.). Органическую фазу промывают 400 мл насыщен. (водн.) NaHCO₃, 200 мл насыщенного раствора соли, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Флэш-хроматография (петролейный эфир:EtOAc, 1:4) дает 1,9425 г (5,1 ммоль, 30%) (3).

(c) сложный метиловый эфир {[(S)-2-амино-3-(3,4-дигидрокси-фенил)пропионил]метиламино}уксусной кислоты и хлористоводородной кислоты (4)

К 1,514 г (3,96 ммоль) (3) добавляют42 мл 2M HCl в Et ₂O при 0ºC. Полученную суспензию перемешивают при 0ºC в течение 1 часа. Суспензию отфильтровывают и промывают Et₂O на льду, повторно растворяют в минимальном количестве MeOH и выпаривают. Вещество дополнительно не очищают (0,897 г (2,8 ммоль, 71%) (4)).

(d) N-Boc-индол-3-карбоксальдегид

0,8754 г (6 ммоль) индол-3-карбоксальдегид извлекают в 170 мл свежеперегнанного ТГФ, добавляют2,0323 г (9,3 ммоль) Boc₂O, а затем 0,2006 г (1,6 ммоль) DMAP и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Добавляют 75 мл H₂O и летучие вещества выпаривают. Остаток экстрагируют 2×75 мл EtOAc. Объединенные органические фазы промывают 75 мл насыщенного раствора соли, сушат над Na ₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Это дает 1,4790 г (6 ммоль) Boc-защищенного индол-3-карбоксальдегида.

(e) (6S,11aS)-8,9-Дигидрокси-6-(1-Boc-1H-индол-3-ил)-2-метил-2,3,11,11a-тетрагидро-6H-пиразино[1,2-b]изохинолин-1,4-дион (5)

0,897 г (2,8 ммоль) (4) растворяют в 56 мл AcOH, 0,6969 г (8,4 ммоль) NaOAc и добавляют 0,6923 г (2,8 ммоль) Boc-защищенного индол-3-карбоксальдегида. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разделяют на две половины и каждую из половин нейтрализуют посредством добавления насыщен. (водн.) NaHCO₃ (pH 8), экстрагируют 150 мл CH₂Ch×3. Объединенные органические фазы промывают 200 мл насыщенного раствора соли, сушат над Na ₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Флэш-хроматография (EtOAc) дает 0,665 г (1,4 ммоль, 50%) (5).

(f) (5S,9aS)-5-(1H-индол-3-ил)-8-метил-7,8,9a,10-тетрагидро-5H-1,3-диокса-5a,8-диаза-циклопента[b]антрацен-6,9-дион (6)

0,665 г (1,4 ммоль) (5) и 0,6853 г (2,1 ммоль) Cs₂CO₃ суспендируют в 3,3 мл свежеперегнанного ДМФ. Добавляют 0,140 мл (2,1 ммоль) BrCH₂Cl и смесь нагревают при 150ºC в течение 1,5 часа. Источник тепла удаляют и смеси позволяют охлаждаться до комнатной температуры, после чего смесь фильтруют и распределяют между 100 мл EtOAc и 100 мл H₂O. Водную фазу экстрагируют 2×100 мл EtOAc. Объединенные органические фазы промывают 150 мл насыщенного раствора соли, сушат над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают. Флэш-хроматография (петролейный эфир EtOAc, 1:4) дает 0,167 г (0,43 ммоль, 31%) (6).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): 11,07 (уш.с, 1H), 7,54 (д, J=7,9 Гц, 1H), 7,36 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,09 (т, J=7,4 Гц, 1H), 6,98 (т, 7,5 Гц, 1H), 6,94 (с, 1H), 6,84 (с, 1H), 6,74 (с, 1H), 6,71 (с, 1H), 5,99 (с, 1H), 5,98 (с, 1H), 4,21 (д, J=17,5 Гц, 1H),4,05 (дд, J ₁=11,9 Гц J₂=4,4 Гц, 1H), 3,99 (д, J=17,64 Гц, 1H), 3,10 (м, 2H), 2,78 (с, 3H)

m/z вычисл. для C₂₂H₂₀N₃O₄ (M+H) ⁺: 390,1448; найдено: 390,1454

Пример 2 (также упоминается в настоящем описании как "Аналог 1")

(2S,8S)-2-(5-хлор-1H-индол-3-ил)-6-метил-13,15-диокса-3,6-диазатетрацикло-[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16]гептадека-1(10),11,16-триен-4,7-дион (2)

¹H ЯМР (400 МГц, CD₂ Cl₂): 8,37 (уш.с, 1H), 7,79 (д, J=2,1 Гц, 1H), 7,35 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,19 (дд, J₁=8,7Гц J₂=2,0 Гц, 1H), 7,08 (с, 1H), 6,79 (д, J=2,5 Гц, 1H), 6,72 (с, 1H), 6,62 (1H), 5,99 (д, J=1,3 Гц, 1H), 5,97 (д, J=1,3 Гц, 1H), 4,29 (дд, J₁=12,6 J₂=4,3 Гц, 1H), 4,13 (д, J=17,7 Гц, 1H), 4,01 (д, J=17,7 Hz, 1H), 3,31 (дд, J₁=16,3 Гц J₂=4,2 Гц, 1H), 3,01 (дд, J₁=16,2 Гц J₂=12,5 Гц, 1H), 2,92 (с, 3H)

m/z вычисл. для C₂₂H₁₈ClN₃O ₄Na (M+Na)⁺: 446,0878; найдено: 446,0884

Пример 3 (также упоминается в настоящем описании как "Аналог 2")

(2S,8S)-2-(5-метокси-1H-индол-3-ил)-6-метил-13,15-диокса-3,6-диазатетра-цикло[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16]гептадека-1(10),11,16-триен-4,7-дион (3)

¹H ЯМР (400 МГц, CDCl ₃): 8,73 (уш.с, 1H), 7,34 (м, 1H), 7,24 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,11 (с, 1H), 6,87 (дд, J₁=8,8 Гц J₂=2,6 Гц, 1H), 6,62 (м, 3H), 5,93 (д, J=1,3 Гц, 1H), 5,91 (д, J=1,3 Гц, 1H), 4,35 (дд, J₁=16,3 Гц J₂=4,3 Гц, 1H), 4,08 (м, 1H), 3,98 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,85 (с, 3H), 3,31 (дд, J₁=16,3 Гц J₂=4,3 Гц, 1H), 2,94 (м, 1H), 2,88 (с, 3H).

m/z вычисл. для C₂₃ H₂₁N₃O₅Na (M+Na)⁺ : 442,1373; найдено: 442,1379

Пример 4 (также упоминается в настоящем описании как "Аналог 3")

(2S,8S)-6-метил-2-{1H-нафто[1,2-b]пиррол-3-ил}-13,15-диокса-3,6-диазатетра-цикло[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16]гептадека-1(10)11,16-триен-4,7-дион (4)

¹H ЯМР (400 МГц, CD₂ Cl₂): 9,818 (уш.с, 1H), 8,09 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,89 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,82 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,49 (т, J=8,1 Гц, 1H), 7,49 (д, J=8,8 Гц, 1H), 7,39 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,16 (с, 1H), 6,69 (д, J=2,1 Гц, 1H), 6,60 (с, 1H), 6,59 (д, J=3,9 Гц, 1H), 5,92 (д, J=1,1 Гц, 1H), 5,91 (д, J=1,1 Гц, 1H), 4,35 (дд, J₁ =12,4 Гц J₂=4,2 Гц, 1H), 4,11 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,96 (д, J=17,8 Гц, 1H), 3,29 (дд, J₁=16,4 Гц J ₂=4,3 Гц, 1H), 3,00 (дд, J₁=16,1 Гц J₂ =12,5 Гц, 1H), 2,88 (с, 3H)

m/z вычисл. для C ₂₆H₂₂N₃O₄ (MH-H)⁺ : 440,1605; найдено: 440,1610

Пример 5 (также упоминается в настоящем описании как "Аналог 4")

(2S,8S)-6-метил-2-(1-метил-1H-индол-3-ил)-13,15-диокса-3,6-диазатетрацикло-[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16]гептадека-1(10),11,16-триен-4,7-дион (5)

¹H ЯМР (400 МГц, CD₂ Cl₂): 7,74 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,33 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,26 (дт, J₁=8,2 Гц J₂=1,1 Гц, 1H), 7,12 (м, 2H), 6,73 (с, 1H), 6,65 (с, 1H), 6,62 (с, 1H), 5,99 (д, J=H Гц, 1H), 5,97 (д, J=H Гц, 1H), 4,34 (дд, J₁=12,4 Гц, J ₂=4,2 Гц, 1H), 4,11 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,96 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,71 (с, 3H), 3,32 (дд, J₁=16,3 Гц, J ₂=4,3 Гц, 1H), 3,01 (дд, J₁=16,2 Гц J₂ =12,6 Гц, 1H), 2,89 (с, 3H)

m/z вычисл. для C ₂₃H₂₂N₃O₄ (M+H)⁺ : 404,1605; найдено: 404,1610

Пример 6 (также упоминается в настоящем описании как "Аналог 5")

(2S,8S)-2-(1-бензил-1H-индол-3-ил)-6-метил-13,15-диокса-3,6-диазатетрацикло-[8.7.0.0 ^3,8.0^12,16]гептадека-1(10),11,16-триен-4,7-дион (6)

¹H ЯМР (400 МГц, CD₂ Cl₂): 7,77 (д, J=7,9 Гц, 1H), 7,20 (м, 9H), 6,77 (с, 1H), 6,72 (с, 1H), 6,67 (с, 1H), 5,98 (д, J=1,1 Гц, 1H), 5,97 (д, J=1,1 Гц, 1H), 5,27 (с, 2H), 4,34 (дд, J,=12,4 Гц, J₂=4,3 Гц, 1H), 4,12 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,98 (д, J=17,7 Гц, 1H), 3,32 (дд, J₁=16,3 Гц, J₂=4,4 Гц, 1H), 3,01 (дд, J₁=16,3 Гц J₂=12,5 Гц, 1H), 2,92 (с, 3H)

m/z вычисл. для C₂₉H₂₅N ₃O₄Na (M+Na)⁺: 502,1737; найдено: 502,1743

Биологические примеры

Биологический пример A

Материалы и методы

Материалы

Вещество X растворяют в 100% ДМСО, разбавленном до 5% в буфере PBS.

Модель мышей с привитыми опухолями для роста опухоли и распространения метастаз

Используют атимических голых мышей NMRI в возрасте 6-8 недель (Taconic; Bomholt, Denmark). Модель мышей с привитым раком предстательной железы получают посредством подкожного имплантирования клеток гормон-независимой опухоли PC3 атимическим голым мышам, как описывалось ранее (Wegiel B, Bjartell A, Tuomela J, et al.: Multiple cellular mechanisms related to cyclin Al in prostate cancer invasion and metastasis. Journal of National Cancer Institute 100: 10221036, 2008).

Клетки PC-3 покупают у American Type Culture Collection (Manassas, VA) и культивируют в RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сывороткой теленка. Используют клетки PC-3 при 1×10⁶/на мышь. Мышей разделяют на три группы (6 мышей в группе). В первой группе позволяют опухолям расти до размера 170-400 мм³ до начала лечения. Во второй группе опухолям позволяют расти до размера 550-650 мм³ до начала лечения. В третьей группе опухолям позволяют расти до размера 700-800 мм³ до начала лечения. Диаметр опухоли измеряют дважды в неделю с использованием штангенциркуля. Объемы опухолей вычисляют с использованием уравнения a*(b2/2), где a и b представляет собой длину и ширину опухоли соответственно.

Лечение соединением Примера 1 (также упоминается в настоящем описании как "Вещество X") или PBS, содержащим 5% ДМСО (носитель), в качестве Контроля, начинают, когда опухоли достигают желаемого размера, как описано выше. При первом наборе экспериментальных условий Вещество X вводят внутривенно через день. Во втором наборе экспериментальных условий Вещество X вводят перорально через день. Рост опухоли оценивают периодически, как описано в разделе Результаты. Мышей умерщвляют после лечения посредством эвтаназии посредством вдыхания изофлуорена. У каждой мыши удаляют лимфатические узлы, печень, легкие, селезенку и бедренную кость. Половину опухолевых тканей используют для гистологии и иммуногистохимического анализа. Для анализа гистологии ткани фиксируют в 4% парафармальдегиде и погружают в парафин. Срезы окрашивают с помощью гематоксилинозина (H&E) или окрашивают иммуногистохимически с помощью антител и анализируют под оптическим микроскопом. Другую половину тканей используют для анализа белков и таким образом для этого их быстро замораживают в жидком азоте. Массу тела мыши в первый и последний день лечения регистрируют и сравнивают. Инвазию опухоли и распространение метастаз исследуют в различных тканях от умерщвленных мышей.

Для сравнительных исследований мыши с опухолями с размером 190-250 мм³ лечатся цитотоксичным лекарственным средством Этопозид (Sigma) при дозе 20 мг/кг посредством внутривенных инъекций через день. Размер опухоли измеряют, как описано в разделе Результаты. Трех мышей лечат Этопозидом или носителем в качестве Контроля. Мышей умерщвляют и ткани собирают, как описано выше.

Основное исследование токсичности

Для оценки токсичности Вещества X здоровых мышей лечат Веществом X с помощью внутривенной инъекции при дозе 100 мг/кг или 200 мг/кг через день в течение 13 дней. Массу тела каждой мыши измеряют периодически от дня 1 до дня 13 лечения. Наблюдения за мышами в клетке, включающие: смертность, выбывание, потребление корма и активность, осуществляют через день. Образцы крови отбирают в день 1 и в день 13 для измерения количества клеток крови. Для оценки токсичности Вещества X на мышах с опухолями мыши, несущие подкожные опухоли PC-3, лечатся Веществом X при высоких дозах 200 мг/кг через день в течение 19 дней. Измеряют массу тела и осуществляют наблюдения мышей в клетке через день. Лимфатические узлы, печень, легкие, селезенку и бедренную кость удаляют у каждой мыши и исследуют. Токсичность Вещества X также оценивают на мышах, несущих опухоли, которых лечат 80 мг/кг Вещества X ежедневно, как описано выше.

Иммуногистохимия и количественное определение ангиогенеза

Иммуногистохимию на тканях опухолей осуществляют, как описано ранее (Wegiel B, Bjartell A, Ekberg J, Gadaleanu V, Brunhoff C and Persson JL: A role for cyclin Al in mediating autocrine expression of vascular endothelial growth factor in prostate cancer. Oncogene 24: 6385-6393, 2005), используя антитела к CD-31 человека (Dako, Golstrup, Denmark A/S). Применяют вторичные антитела антикролик, коъюгированные с пероксидазой. Используют раствор диаминобензидинового колориметрического реагента (Dako). Срезы негативно окрашивают с помощью гематоксилина (Sigma, St. Louis, MO). Образцы просматривают на микроскопе Olympus BX5I при увеличении 20× или 40×. Для анализа ангиогенеза опухоли, срезы опухолей, окрашенные с помощью антитела против CD31, исследуют и определяют количественно. Исследуют области с высокой васкулярной плотностью внутри опухоли. Регистрируют количество CD31-положительных пикселей в поле зрения микроскопа. Определяют, по меньшей мере, два среза на опухоль и три вида на срез.

Результаты

Безопасность при основном исследовании токсичности

Основные исследования безопасности Вещества X осуществляют сначала на здоровых мышах без опухолей, чтобы исследовать, является ли безопасной высокая доза 100 мг/кг в режиме введения через день. Как показано на Фигуре 1A, значительного изменения массы тела в течение периода лечения 13 дней с помощью высокой дозы Вещества X нет. Наблюдения за мышами в клетке показывают отсутствие аномалий в потреблении корма и ежедневных активностях или каких-либо наблюдаемых токсических воздействий в течение 13 дней. Осуществляют анализ печени и почек, и детектировать какие-либо аномалии в гистологии этих органов нельзя (данные не показаны). Эти основные исследования токсичности показывают, что Вещество X является безопасным при высокой дозе для здоровых мышей.

Мышей лечат с помощью 200 мг/кг Вещества X через день в течение длительного периода времени в 13 дней. Как показано на Фигуре 1B, массы тела мышей, несущих опухоли, являются стабильными в течение периода исследований. Наблюдения мышей в клетке показывают отсутствие аномалий в потреблении корма и ежедневных активностях или какого-либо наблюдаемого токсического воздействия. Осуществляют анализ печени и почек, и детектировать какие-либо аномалии в гистологии этих органов нельзя (данные не показаны).

Затем авторы исследуют высокую дозу Вещества X у мышей с привитыми опухолями PC-3, воспроизводя тем самым его воздействие на пациентов с раком предстательной железы. Авторы генерировали привитые опухоли PC-3 человека у мышей посредством подкожной имплантации клеток опухолей голым мышам. Кроме того, авторы исследуют безопасность дозы 40 мг/кг, которая генерирует значительную противоопухолевую активность на модели мышей с привитыми опухолями. Ежедневное лечение мышей, несущих опухоли, с помощью этой дозы может демонстрировать безопасность Вещества X при лечении рака. Массы тела мышей, несущих опухоли, которых лечат с помощью Вещества X ежедневно в течение 30 дней, остаются постоянными в течение всего периода лечения (данные не показаны). Наблюдения мышей в клетке показывают отсутствие аномалий потреблении корма и/или ежедневных активностей или какого-либо другого заметного токсического воздействия. Осуществляют анализ печени и почек, и детектировать какие-либо аномалии в гистологии этих органов нельзя (данные не показаны).

Ингибирование роста опухолей у модели животных с привитыми опухолями

Авторы создают модель мышей с привитыми опухолями рака предстательной железы для исследования воздействия Вещества X на рост опухолей и распространение метастаз in vivo. Клетки PC-3 метастатического рака предстательной железы водят подкожно с помощью инъекции в правый бок каждой мыши для получения модели мыши с привитой опухолью. Когда опухоли вырастают до размера 190-240 мм³, мышей лечат внутривенно Веществом X при 20 мг/кг или носителем в качестве Контроля в течение 21 дня. Опухоли Контрольной группы, получавшей лечение только носителем, растут до экспоненциально большого размера после 21 дня, в то время как у мышей, получавших лечение Веществом X, опухоль уменьшается в размере. Это демонстрирует значительное ингибиторное воздействие Вещества X на рост опухоли у мышей с привитыми опухолями in vivo.

Ингибирование роста и инвазии опухолей у мышей с привитыми опухолями, с большими и инвазивными опухолями

Затем авторы оценивают воздействие Вещества X на рост и инвазию опухолей у мышей, несущих большие опухоли. Авторы обнаружили ранее, что опухоли PC-3, вырастающие до размера 400 мм³, могут становиться метастатическими, и клетки опухолей могут проникать в лимфатические узлы, печень или легкие. Для исследования того, может ли Вещество X контролировать агрессивный рост опухоли, авторы позволяют трансплантированным опухолям вырастать до размера приблизительно 500-600 мм³, а затем начинают лечение мышей с помощью 40 мг/кг Вещества X или растворителя в качестве Контроля с помощью внутривенной инъекции. В то время как большие опухоли в Контрольной группе продолжают быстрый рост, опухоли у мышей, получавших лечение Веществом X, не растут, но демонстрируют небольшое уменьшение в размерах на день 20 (Фигура 2).

Затем авторы исследуют воздействие Вещества X на большие и инвазивные опухоли в течение более продолжительного периода времени. Авторы делят мышей на две группы, одну группу лечат 40 мг/кг Вещества X с помощью внутривенной инъекции в течение 30 дней, в то время как другую группу лечат Веществом X в таком же режиме лечения в течение 20 дней. В 21 день мышей группы 2 лечат 40 мг/кг Вещества X с помощью перорального введения. Результат показывает, что рост опухоли у мышей, получавших лечение Веществом X, ингибируется в течение периода лечения, и опухоли значительно уменьшаются в размерах в конце лечения. В противоположность этому опухоли в Контрольной группе растут экспоненциально и становятся метастазирующими. Во второй группе, получавшей лечение, мыши, получавшие лечение Веществом X с помощью перорального введения, имеют чуть больший размер опухоли, чем у мышей, получавших лечение с помощью непрерывных внутривенных инъекций, демонстрируя, что Вещество X является биологически доступным перорально, но пероральная биологическая доступность ниже, чем при внутривенной инъекции. Авторы осуществляют гистологию и иммуногистохимический анализ, и детектировать никакой инфильтрации клеток опухоли во вторичные области у любой из этих мышей в конце исследований невозможно. В противоположность этому, опухоли у Контрольных мышей, как обнаружено, дают метастазы в лимфатические узлы (данные не показаны).

Авторы также лечат мышей с помощью перорального введения Вещества X в течение периода лечения. Как показано на Фигуре 3, Вещество X, вводимое мышам посредством перорального введения, может ингибировать рост опухоли, хотя воздействие и не является таким сильным, как при внутривенных инъекциях.

Сравнение воздействия этопозида и Вещества X на рост опухолей у мышей с привитыми опухолями

Для сравнения воздействия Вещества X с цитотоксическим лекарственным средством, широко используемым для лечения инвазивных опухолей, авторы исследуют воздействие Этопозида при 20 мг/кг с помощью внутривенных инъекций (IV) на мышей, несущих опухоли PC-3, выросшие до размера приблизительно 250 мм³. Как показано на Фигуре 4, опухоли Контрольной группы растут до экспоненциально большого размера через 14 дней. В противоположность этому опухоли в группе лечения Этопозидом растут медленно. Что важнее, Вещество X показывает более сильное ингибиторное воздействие на опухоли по сравнению с Этопозидом.

Воздействие Вещества X на экспрессию VEGF и рецептора 2 VEGF у мышей с привитыми опухолями

Авторы исследуют экспрессию VEGF и VEGFR2, важных ангиогенных факторов, которые могут ускорить васкуляризацию опухоли, и необходимы для инвазии опухоли. Осуществляют иммуногистохимический анализ на опухолях, иссеченных у Контрольных мышей или мышей, получавших лечение Веществом X. По сравнению с Контролем экспрессия VEGF и VEGFR2 значительно даун-регулируется в опухолях, получавших лечение с помощью Вещества X (Фигура 5). Это говорит о том, что Вещество X может представлять собой ингибитор VEGF, который нацелен на пути передачи сигналов VEGF.

Воздействие Вещества X на гистологию и васкуляризацию опухоли для опухолей у мышей с привитыми опухолями

Авторы также характеризуют гистологию опухоли посредством окрашивания рецептора 2 VEGF у мышей, получавших лечение носителем или Веществом X. Параллельное сравнение срезов, содержащих цельные опухоли, от Контрольных мышей и от мышей, получавших лечение Веществом X, четко показывает различия в размерах и морфологии опухоли между двумя группами (Фигура 6A). Размер опухолей от мышей, получавших лечение Веществом X, заметно меньше, чем у Контрольных мышей. Интересно, что имеются большие пустые области в опухолях, получавших лечение Веществом X, это говорит о том, что наступающее уменьшение опухоли может быть связано с очисткой от мертвых клеток опухоли. Кроме того, эти результаты подтверждают, что Вещество X способно ингибировать рост в больших и инвазивных опухолях.

Затем авторы измеряют экспрессию CD31, белка, экспрессируемого в сосудистой системе опухоли и важного для инвазии опухоли, в опухолях, получавших лечение Веществом X, с помощью иммуногистохимического анализа (Фигура 6B). Авторы определяют степень васкуляризации опухоли посредством количественного определения экспрессии CD31 и сосудов, положительных по отношению к CD31, в опухолях, включая крайние и центральные области опухолей. Имеется статистически значимое уменьшение экспрессии CD31 и количества сосудов, экспрессирующих CD31 в опухолях, получавших лечение Веществом X, по сравнению с Контрольными опухолями (Фигура 6C). Этот результат говорит о том, что Вещество X может ингибировать рост и инвазию опухоли посредством предотвращения васкуляризации агрессивных опухолей PC-3.

Биологический пример B

Материалы и методы

Химикалии

Все вновь синтезируемые соединения и Этопозид сначала растворяют в 100% ДМСО при начальной концентрации 100 мМ, а затем разбавляют до конечной концентрации 200 мкМ в культурной среде. Коммерческую форму Авастатина (25 мг/мл) разбавляют до соответствующих концентраций в культурной среде.

Культура клеток

Гормон-независимые и метастатические клетки PC-3 рака предстательной железы покупают от American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) и культивируют в RPMI-1640, дополненной 10% фетальной сывороткой теленка. Этопозид покупают от Sigma, Авастатин от Roche.

Анализ пролиферации клеток и определение IC₅₀

Для счета клеток, в целом 6×10⁴ клеток при плотности 0,3×10⁶/мл высевают в 96-луночный планшет. Клетки обрабатывают соединениями, Этопозидом или Авастином, в качестве положительных контролей, при 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ в течение 48 часов. Для Авастина используют концентрации 5 мкМ, 20 мкМ и 50 мкМ. Клетки метят трипановым синим и количественно определяют жизнеспособные клетки.

Воздействие Аналогов на пролиферацию клеток PC-3 определяют с использованием набора для анализа пролиферации клеток на основе нерадиоактивного BrdU (Roche, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Этопозид и Авастин используют в качестве положительных контролей. Вкратце, 2×10³ клеток культивируют в 96-луночном планшете в среде RPMI-1640, содержащем 10% FBS, в течение 48 часов, включая мечение BrdU в течение 18 часов. Инкорпорирование BrdU в клеточную ДНК определяют посредством измерения поглощения на 450 нм и 690 нм на устройстве для считывания планшетов ELISA.

Анализ апоптоза с помощью Аннексина V

Клетки обрабатывают 50 мкМ и 100 мкМ соединений и Этопозида в течение 48 часов, собирают, промывают PBS и повторно суспендируют в буфере для связывания (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,14 M NaCl, 2,5 M мМ CaCl₂) (BD Bioscience, san Jose, CA, USA), окрашивают APS-коъюгированным Аннексином V и 7-AAD (BD Bioscience). Клетки инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, и долю апоптоза измеряют с помощью проточной цитометрии (Calibur, BD) и анализируют с использованием программного обеспечения FCS Express Professional (De NoVo software, CA, USA).

Анализ клеточного цикла

Клетки собирают после обработки, затем фиксируют в 70% EtOH, охлажденном на льду. Затем клетки промывают PBS и инкубируют в буфере для окрашивания ДНК, содержащем 1 мг/мл цитрата натрия (Sigma), 0,1 мг/мл пропидия йодида (Sigma), 3 мкл/мл TritonX-100, 0,02 мг/мл RNaseA (Sigma), в течение 30 мин при 4°C. Профили клеточных циклов измеряют на цитофлуориметре FACS Calibur (BD) и анализируют с использованием программного обеспечения FCS Express Professional (De NoVo, CA, USA) и программного обеспечения Multicycle (Phoenix Flow Systems, Inc., CA, USA).

Результаты

Оценка воздействия соединения X и его аналогов на рост клеток PC-3 метастатического рака предстательной железы

A. Сравнение значений IC₅₀ для Соединения X, синтезированного Lund University и Enamine.

Различий по эффективности между различными загрузками соединений X нет. Обе они индуцируют зависимое от дозы ингибирование роста клеток со статистически значимым уменьшением количества клеток при 5 мкМ. Значение IC₅₀ для ингибирования роста, как вычислено, составляет 30 мкМ (смотри Фигуру 7).

B. Воздействие Аналога 1 на рост клеток PC-3

Аналог 1 имеет вычисленное значение IC₅₀ для роста клеток, равное 36 мкМ. Статистически значимое ингибирование роста клеток начинается в пределах между 10 мкМ и 20 мкМ (смотри Фигуру 8).

C. Воздействие Аналога 2 на рост клеток PC-3

Статистически значимое ингибирование роста клеток под действием Аналога 2 начинается с концентрации 5 мкМ. Определенное значение IC₅₀ для роста клеток составляет 60 мкМ (смотри Фигуру 9).

D. Воздействие Аналога 3 на рост клеток PC-3

Аналог 3 показывает воздействие, начиная с 5 мкМ, как Соединение X, и IC₅₀ составляет 32 мкМ (смотри Фигуру 10).

E. Воздействие Аналога 4 на рост клеток PC-3

Обработка клеток Аналогом 4 демонстрирует статистически значимое ингибирование роста клеток от 10 мкМ до 100 мкМ. Вычисленное значение IC₅₀ составляет 30 мкМ (смотри Фигуру 11).

F. Воздействие Аналога 5 на рост клеток PC-3

Обработка клеток PC-3 Аналогом 5 приводит к уменьшению количества клеток (Фигура 12).

Фигура 13 показывает параллельные сравнения воздействия Аналогов 1 и 3 с Этопозидом и Доцетакселем.

Фигура 14 показывает противоопухолевое воздействие Аналога 1 и 3 на линию клеток лейкемической моноцитарной лимфомы человека U937.

Анализ пролиферации клеток на основе BrdU

Результаты изображены на Фигурах 15 и 16.

Анализ апоптоза

Результаты изображены на Фигурах 17, 18, 19 и 20.

50 мкМ	контроль	этопозид	Аналог 1	Аналог 3
Ранний апоптоз, %	2,78	9,22	10,98	15,21
Поздний апоптоз/некроз, %	4,39	6,73	4,23	6,55
Всего, %	7,17	15,95	15,21	21,76

100 мкМ	контроль	этопозид	Аналог 1	Аналог 3
Ранний апоптоз, %	4,88	9,35	16,83	17,51
Поздний апоптоз/некроз, %	3,13	4,98	8,29	5,52
Всего, %	8,01	14,33	25,12	23,03

Имеется увеличение количества как ранних, так и поздних апоптотических клеток для клеток, обработанных аналогом 1 и аналогом 3, по сравнению с контролем и Этопозидом, как положительным контролем.

Анализ клеточного цикла

Результаты изображены на Фигурах 21, 22, 23 и 24

50 мкМ	G0/G1, %	S+G2+M, %
Контроль	65,65	34,35
Этопозид	15,91	84,09
Аналог 1	63,26	36,74
Аналог 3	67,52	32,48

100 мкМ	G0/G1,%	S+G2+M, %
Контроль	62,59	37,41
Этопозид	21,39	78,61
Аналог 1	60,44	39,56
Аналог 3	51,77	48,23

Если основываться на полученных результатах, блокировка фазы G₂/M имеется у клеток, обработанных Этопозидом, но не у клеток, обработанных аналогом 1. Может осуществляться блокировка у клеток, обработанных аналогом 3 при 100 мкМ.