соматостатиновые пептиды
Классы МПК: | C07K7/64 циклические пептиды, содержащие только нормальные пептидные связи C07K14/655 соматостатины A61K38/31 соматостатины A61K51/08 пептиды, например протеины A61P5/02 гормонов гипоталамуса, например TRH, GnRH, CRH, GRH, соматостатина |
Автор(ы): | АЛЬБЕРТ Райнер (CH), БАУЭР Вильфрид (CH), БРУНС Кристиан (DE), ЧАНДРАМОУЛИ Нагараджан (US), ЛЬЮИС Айан (CH), ВЕКБЕКЕР Гисберт (CH) |
Патентообладатель(и): | НОВАРТИС АГ (CH) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1996-06-28 публикация патента:
20.12.2000 |
Описывается новый циклический гексапептид формулы (II) цикло [А - Zzа - (D/L)Trp - Lys - Х1 - Х2] (II), где Х1 означает радикал формулы (а) или (б), где R1 означает необязательно замещенный фенил; R2 означает -Z1-СН2-R1, -СН2-СО-О-СН2-R1; или (с) или (d), где Z1 означает О или S; Х2 представляет собой
-аминокислоту, имеющую ароматический остаток на боковой цепи C
, или является аминокислотным звеном Dаb; А представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro,
где R3 представляет собой NR8R9-(С2-С6)алкилен или гуанидино (С2-С6)алкилен; R4 представляет собой водород или СН3; R11 представляет собой необязательно замещенный в кольце бензил, -(СН2)1-3 - ОН или -(СН2)1-5 -NН2; Rb представляет собой -(СН2)1-3; каждый из R8 и R9 независимо друг от друга представляют собой водород, (С1-С4)алкил, ацил или СН2ОН -(СНОН)с-СН2-, в котором с = 0, 1, 2, 3 или 4, или R8 и R9 образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклическую группу, которая может содержать дополнительный гетероатом, например пиридил или морфолино; Zzа представляет собой звено природной или неприродной
-аминокислоты, выбранной из группы, включающей Ala, Val, Thr, Ser, Leu, Nle, Jle, His, Trp, Arg, Tyr, Phe и NН2-Phe, в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения. Соединения обладают сродством по отношению к рецепторам соматостатина. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 2 табл. 
или


Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3





или



Формула изобретения
1. Циклический гексапептид формулы II
где X1 (означает радикал формулы (а) или (б),

или

где R1 означает необязательно замещенный фенил;
R2 означает -Z1-CH2-R1, -CH2-CO-O-CH2-R1;


где Z1 означает O или S;
X2 представляет собой


A представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro,

R4 представляет собой водород или CH3;
R11 представляет собой необязательно замещенный в кольце бензил, -(CH2)1-3-OH или -(CH2)1-5-NH2;
Rb представляет собой -(CH2)1-3;
каждый из R8 и R9 независимо друг от друга представляют собой водород, (C1-C4)алкил, ацил или CH2OH-(CHOH)c-CH2-, в котором c = 0, 1, 2, 3 или 4, или R8 и R9 образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклическую группу, которая может содержать дополнительный гетероатом, например, пиридил или морфолино;
ZZa представляет собой звено природной или неприродной

в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения. 2. Циклический гексапептид по п. 1, представляющий собой цикло[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Рrо} -Phe-DTrр-Lys-Tyr(бензил)-Phe], цикло[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Рrо} -Tyr-DTrp-Lys-Thr(бензил)-Phe] и цикло[{ 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Рrо}-Phe-DTrp-Lys-Ser(бензил)-Phe]. 3. Циклический гексапептид по п.1, в котором A содержит аминогруппу, несущую хелатирующую группу, в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. 4. Циклический гексапептид по п.3, в котором хелатирующая группа выбрана из диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N, N", N"", N"""-тетрауксусной кислоты (DOTA) и 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-N,N",N"",N"""-тетрауксусной кислоты (TETA), в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. 5. Циклический гексапептид по п. 2, в котором аминокислотная группа концевой боковой цепи представлена Prо звеном, которое, кроме того, присоединено к хелатирующей группе, в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. 6. Циклический гексапептид по любому из пп.1 - 5 или его фармацевтически приемлемая соль или комплекс с обнаруживаемым элементом, предназначенный для использования в качестве фармацевтического средства. 7. Фармацевтическая композиция, обладающая средством по отношению к рецепторам соматостатина, содержащая терапевтически эффективное количество циклического гексапептида по любому из пп.1 - 5, или его фармацевтически приемлемой соли, или комплекса с обнаруживаемым элементом в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к соматостатиновым пептидам, способу их получения и фармацевтическим препаратам, содержащим их. Соматостатин - это тетрадекапептид, имеющий структуру:
С момента выделения и характеристики соматостатина проводился интенсивный поиск более сильнодействующих и более стабильных аналогов. Более конкретно в настоящем изобретении предлагается аналог соматостатина, содержащий аминокислотную последовательность формулы (I)
-(D/L)Trp-Lys-X1-X2- (I)
в которой X1 представляет собой радикал формулы (а) или (б)

или

где R1 представляет собой возможно замещенный фенил,
R2 представляет собой -Z1-CH2-R1, -CH2-CO-O-CH2-R1,

или

где Z1 представляет собой О или S, и
X2 представляет собой



-Z1-CH2-R1
или

Когда X2 содержит ароматический остаток на боковой цепи Cg, он соответственно может являться природной или неприродной



в которой X1 и X2 такие, как определено выше,
A представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro,






где R3 представляет собой NR8R9-C2-6-алкилен, гуанидино-C2-6-алкилен или C2-6-алкилен-COOH, R3a представляет собой H, C1-4алкил или независимо имеет одно из значений, данных для R3, R3b представляет собой H или C1-4алкил, Ra представляет собой OH или NR5R6, Rb представляет собой -(CH2)1-3- или -CH(CH3)-, R4 представляет собой H или CH3, R4a представляет собой возможно замещенный в кольце бензил, каждый из R5 и R6 независимо представляет собой H, C1-4 алкил,



ZZa представляет собой единицу природной или неприродной



а также в транс-форме. Настоящее изобретение охватывает каждый геометрический изомер индивидуально, а также их смеси. Если A представляет собой


Еще одной дополнительной группой предпочтительных соединений по изобретению является группа соединений, в которых N-терминальная аминокислота содержит замещенный Pro, в частности 4-замещенный Pro, например соединения формулы II, в которых A представляет собой 4-замещенный Pro. Предпочтительно A представляет собой 4-(R3-NH-CO-O)Pro. Дополнительными представителями соединений по изобретению являются соединения, содержащие аминогруппу, несущую хелатирующую группу, в частности соединение формулы (II), где A содержит аминогруппу боковой цепи, которая несет хелатирующую группу, в свободной форме, в форме соли или комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. Эти соединения наименованы здесь и далее как хелатные соединения по изобретению. Подходящими хелатирующими группами являются физиологически приемлемые хелатирующие группы, способные к комплексообразованию с обнаруживаемым элементом. Предпочтительно хелатирующая группа имеет в значительной степени гидрофильный характер. Примеры хелатирующих групп включают в себя, например, группы, полученные из полиаминополикарбоновых кислот или ангидридов, например группы, полученные из нециклических лигандов, например, этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), этиленгликоль- O,O"-бис(2-аминоэтил)-N,N,N",N"-тетрауксусной кислоты (EGTA), N, N"-бис (гидроксибензил) этилендиамин-N, N"-диуксусной кислоты (HBED) и триэтилентетрамингексауксусной кислоты (TTHA), группы, полученные из замещенных EDTA или DTPA, например параизотиоцианато-бензил-EDTA или -DTPA, группы, полученные из макроциклических лигандов, например 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N",N"",N"""-тетрауксусной кислоты (DOTA) и 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-N, N",N"",N"""-тетрауксусной кислоты (TETA) или 1,4,7,10-тетраазациклотридекан-N, N", N"", N"""- тетрауксусной кислоты (TITRA). Хелатирующая группа может быть присоединена либо непосредственно, либо через спейсерную группу к аминогруппе соединения по изобретению. Подходящие спейсерные группы включают в себя известные из уровня техники (GB-A-2225579) группы, например двухвалентный остаток амино-карбоновой кислоты, например








а) удаляют, по меньшей мере, одну защитную группу, которая присутствует в соматостатиновом пептиде, содержащем остаток формулы 1, причем соматостатиновый пептид находится в защищенной форме, или
б) сшивают амидной связью две пептидные единицы, причем каждая из них содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту в защищенной или незащищенной форме, при таком расположении амидной связи, при котором получают желаемую аминокислотную последовательность, и, если требуется, выполняют стадию, а) способа, или
в) удаляют функциональную группу незащищенного или защищенного соматостатинового пептида или превращают ее в другую функциональную группу таким образом, чтобы получить другой незащищенный или защищенный пептид и, в последнем случае, выполняют стадию а) способа, или
г) для получения хелатного соединения по изобретению сшивают хелатирующий агент и нехелатное соединение по изобретению в защищенной или незащищенной форме, содержащее свободную аминогруппу, таким образом, чтобы зафиксировать хелатирующую группу на желаемой аминогруппе соединения, и затем возможно выполняют стадию а) способа,
и выделяют полученное таким образом соединение по изобретению в свободной форме, в форме соли или возможно в форме комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. Стадия б) способа приводит к получению линейного пептида, но включает в себя также циклизацию посредством амидной связи линейного пептида с образованием циклического пептида, имеющего желаемую аминокислотную последовательность. При желании боковую цепь, которая присутствует в A, можно ввести в аминокислоту до стадии пептидного сочетания б) или в конечный линейный или циклический пептид согласно стадии в). Таким образом, в последнем случае соединение формулы II, в котором A представляет собой гидрокси-Pro, можно превратить в соединение формулы II, в котором A представляет собой R3-NH-CO-O-Pro. Циклизацию также можно осуществить традиционным способом с помощью гидразида. Когда линейный пептид получают на смоле, обычно не имеет значения, какая аминокислота выбрана, для ее размещения в C-терминальном положении, при условии, что последовательность аминокислот в линейном пептиде соответствует последовательности в желаемом аналоге соматостатина. Как только циклизация линейного пептида проведена, можно уже не определять, какая аминокислота была на C-конце линейного пептида. Несмотря на то, что в общем случае выбор первой аминокислоты для начала цепи не играет роли, поскольку линейный пептид будет циклизован, могут иметь место другие факторы, которые могут предпочесть одну исходную аминокислоту другой. Предпочтительно линейный пептид циклизуют таким образом, чтобы получить связь от Tpr в положении 3 до ZZa в положении 2 или от X2 в положении 6 до X1 в положении 5. Комплексообразование соединения по изобретению, содержащего аминогруппу, замещенную хелатирующей группой, может быть осуществлено взаимодействием хелатного соединения с соединением, дающим соответствующий обнаруживаемый элемент, например с металлической солью, предпочтительно водорастворимой солью. Взаимодействие можно проводить по аналогии с известными (Perrin, Organic Ligand, Cemical Data Series 22. NY Pergamon Press (1982); Krejcarit and Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com. 77: 581 (1977); Wagner and Welch, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979)) способами. Поскольку получение исходных материалов детально не описано, соединения известны или могут быть получены по аналогии с известными и практикуемыми в технике способами. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Все температуры выражены в oC. Используются следующие аббревиатуры:
Bzl = бензил(Bzl)= -CH2-фенил, присоединенный к кислороду или сере согласно (а) или (б)
DFM (ДМФ) = диметилформамид
BOC = трет-бутилоксикарбонил
Fmoc = 9-флуоренилметоксикарбонил
TFA = трифтороуксусная кислота
DIPCI = диизопропилкарбодиимид
DCCI = дициклогексилкарбодиимид
HOBt = гидроксибензотриазол
Dab = 2,4-диаминомасляная кислота
Dpr = 2,3-диаминопропановая кислота
Dpm = 2,6-диаминогептандиовая кислота
Dde = 4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиденэтил
RT (KT) = комнатная температура
HyPro = 4-гидрокси-Pro (транс-, если не установлено иначе)
Tic = тетрагидроизохинолинкарбоновая кислота
FAB = бомбардировка быстрыми атомами
M.S. = масс-спектрометрия
E.S. = эмиссионная спектроскопия
ПРИМЕР 1
цикло [HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]:
Смолу Fmoc-Phe-SASRIN



цикло [{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys- Tyr(Bzl)-Phe]
Fmoc-HyPro-OMe по каплям добавляют в раствор трисфосгена (0,6 экв.) в ТГФ. По истечении 1ч добавляют диметиламинопиридин (1,0 экв.) и N-BOC-диаминоэтан (6,0 экв. ), и реакционную смесь перемешивают при КТ. После того, как проведут операции тонкослойной хроматографии (TLC), растворитель удаляют в вакууме, и Fmoc-4-(N-BOC-аминоэтиламинокарбонилокси)Pro-OMe экстрагируют из двухфазной системы этилацетат/0,1М HCl с получением неочищенного продукта (MH+ = 554). Неочищенный метиловый эфир, выделенный ранее, затем расщепляют до свободной кислоты путем обработки 1N NaOH в системе диоксан/вода, и продукт, Fmoc-4- (аминоэтиламинокарбонилокси)-Pro-OH, очищают на силикагеле, (MNa+ = 562). Смолу Fmoc-Phe-SASRIN

цикло [{ 4-(морфолино-этил-аминокарбонилокси)-Pro} -Phe-DTrp-Lys- Tyr(Bzl)-Phe]
Синтез гидроксипролиновых производных осуществляют следующим образом. Fmoc-HyPro-OMe по каплям добавляют в раствор трисфосгена (0,6 экв.) в ТГФ. По истечении 1ч добавляют диметиламинопиридин (1,0 экв.) и N-этиламиноморфолин (6,0 экв.) и перемешивают смесь при КТ. После операций тонкослойной хроматографии (TLC) растворитель удаляют в вакууме и Fmoc-4- (морфолиноэтиламинокарбонилокси)Pro-OMe очищают на силикагеле, (MH+ 524). Затем метиловый эфир расщепляют путем обработки 1N NaOH в системе диоксан/вода, и продукт, Fmoc-4-(морфолиноэтиламинокарбонилокси)Pro-OH, очищают на силикагеле, (MH+ 510). Fmoc-Phe-SASRIN подвергают процедурам твердофазного синтеза Fmoc как в предыдущем примере, пока не будет собрана в структуру смола Fmoc-(D)Trp(BOC)-Lys(BOC)-Tyr(Bzl)- Phe(морфолиноэтиламинокарбамат)HyPro-Phe-SASRIN. Удаляют защиту Fmoc, применяя пиперидин. Расщепление пептидной смолы проводят путем ее обработки в стеклянной колонке 2%-ной TFA в CH2Cl2. Нейтрализацию проводят 1М раствором NaHCO3. Растворитель удаляют в вакууме, и защищенный линейный пептид лиофилизируют. Защищенный линейный пептид подвергают циклизации путем обработки DCCI (6,0 экв.) и HOBt (6,0 экв.) за период в 5 дней. Затем удаляют защиту путем обработки смесью TFA:H2O (95:5), и циклический пептид очищают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) и подвергают ионному обмену с получением ацетатной соли с помощью ионообменной смолы AG4-X4 до получения соединения, указанного в заголовке. MH+ (FAB): 1131. [

цикло[X-Y-DTrp-Lys-Z-Phe]
в которой X, Y и Z определены ниже в Таблице 1. Пептид из примера 29 может быть получен следующим образом. Защищенный пептид, цикло[(NH2-C(=NH)-NH-C2 H4-NH-CO-O-)]-Pro-Tyr-DTrp-Lys(Dde)-Tyr(Bzl)-Phe, собирают на смоле, применяя процедуру твердофазного синтеза Fmoc, как описано в Примере 2. Вместо Ng-Boc-Lys используют Ng-Dde-Lys, чтобы предпочтительно ввести функциональность гуанидинила в основную боковую цепь остатка HyPro. После того, как сборку пептида в структуру заканчивают, концевую Fmoc группу удаляют, пептид подвергают циклизации и в конце удаляют защиту, как в Примере 2. Этот пептид растворяют в ДМФ, добавляют диизопропилэтиламин (3 экв.) и HOBt (4 экв.), затем добавляют 3,5-диметилпиразолилформамидиния нитрат (4 экв.) и раствор перемешивают в течение 72 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме, а затем подвергают обработке безводным гидразином (2% в ДМФ) в течение 30 мин для удаления группы Dde на Lys. Неочищенный пептид, указанный в заголовке (Пример 29), затем очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) в системе ацетонитрила и водного фосфата триэтиламмония. ПРИМЕР 41
цикло[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Ala-DTrp- Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe]
MH+ (E.S.): 984,5
ПРИМЕР 42
цикло[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}- (p-NH2)-Phe-DTrp-Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe]
MH+ (E.S.): 1076,6
ПРИМЕР 43
цикло[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-

MH+ (E.S.): 1025,5
ПРИМЕР 44
цикло[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Tyr]
MH+ (E.S.): 991,6
ПРИМЕР 45
цикло[MePhe-His-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Dab]
MH+ (E.S.): 1005
ПРИМЕР 46

a) цикло[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-) Pro-Phe-DTrp-Lys(

60 мг цикло [4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe- DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe], 12 мг NaHCO3 и 12 мг (BOC)2O растворяют в 10 мл смеси ДМФ/вода (7/3) и выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение ночи. После удаления растворителя указанный в заголовке продукт выделяют хроматографией на силикагеле с применением системы метиленхлорид/метанол/уксусная кислота50% (8/2/0,25) в качестве подвижной фазы. б) цикло[4-(DTPA-NH-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp- Lys)

120 мг DTPA-гидразида растворяют в 5 мл ДМФ и доводят до pH 3 добавлением по каплям смеси диэтиловый эфир/3N HCl. После охлаждения до -15o в реакционную смесь добавляют 4 мкл трет- бутилнитрита и раствор из 15 мг соединения, полученного выше в а), в 3 мл ДМФ, содержащего 15 мкл основания Хюнига (Hunig). По истечении 4 часов растворитель удаляют выпариванием, и удаляют защиту полученного остатка без какой-либо дополнительной очистки. в) цикло[4-(DTPA-NH-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys- yr(Bzl)-Phe]
Неочищенный продукт со стадии б) обрабатывают 5 мл смеси TFA/вода (95/5) при 0o в течение 10 минут. После разбавления 50 мл воды раствор непосредственно переносят на колонку RP18-HPLC и элюируют градиентом вода/ацетонитрил/TEA0,1%. Чистые фракции объединяют и лиофилизируют. FAB-MS: 1436,6
ПРИМЕР 47
Соединение из Примера 46 в), меченое 111In
1 мг соединения из Примера 46 в) растворяют в 5 мл 0,01М раствора уксусной кислоты. Полученный раствор пропускают через 0,22-микронный фильтр Millex

цикло[4-(DOTA-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Ser (Bzl)-Phe]
M.S.: 1371,57
Это соединение метят изотопом 90Y следующим образом: 20 мкл 90Y (1,2 мкюри, 0,04М HCl) добавляют к 20 мкл из 50 мкМ указанного выше соединения (0,15 М NH4= Ac, 0,3% BSA (бычий сывороточный альбумин), pH 4,5). Этот раствор инкубируют при 100o в течение 15 минут. Отбирают аликвоту и разбавляют ее 4 мМ DTPA (pH 4,5) перед тем, как анализировать с помощью колонки C18 HPLC с обращенной фазой для определения количества свободного нехелатного 90Y в реакционной смеси (по присутствию [90YDTPA]2-). ПРИМЕР 49

116 мг соединения из Примера 46 а), 12 мг NaCNBH3 и 2 эквивалента соответствующего альдегида растворяют в 25 мл смеси DMF/HOAc1% и выдерживают при 60o до тех пор, пока исходный материал можно будет определить тонкослойной хроматографией (TLC). После удаления растворителя остаток очищают хроматографией на силикагеле (метиленхлорид/метанол/HOAc50% 9/1/0,125 ---> 8/2/0,25) для того, чтобы разделить моно- и диалкилированный конечный продукт. 1) Альдегид: (D)-глюкоза
X1 = HOCH2-(CHOH)4-CH2- X2=H
E.S. -MH+ = 1225,4
2) Альдегид: (D)-глюкоза
X1 = X2= HOCH2-(CHOH)4-CH2-
E.S. -MH+ = 1389,6
3) Альдегид: 2,3-O-изопропилилен-(D)-глицеральдегид
X1 = HOCH2-CHOH-CH2- X2 = H
4) Альдегид: 2,3-O-изопропилиден-(D)-глицеральдегид
X1 = X2 = HOCH2-CHOH-CH2-
E.S. -MH+ = 1209,4
5) Альдегид: гидроксиацетальдегид
X1 = X2 = HOCH2-CH2-
E.S. -MH+ = 1149,4
Как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемых солей и комплексов соединения по данному изобретению демонстрируют ценные фармакологические свойства, о которых свидетельствуют испытания как in vivo, так и in vitro, и являются, таким образом, показанными для лечения. В частности, соединения по данному изобретению связываются с по меньшей мере одним подтипом рецепторов к соматостатину. Клонированы и описаны 5 подтипов рецепторов к соматостатину: SST-1, SST-2, SST-3, SST-4 и SST-5. hSST-1, hSST-2, hSST-3 и их последовательности известны (Y. Yamada et al. in Proc. Nat. Acad. Sci., 89, 251-255 (1992)). hSST-4 и его последовательность известны (L. Rohrer et al. in Proc. Acad. Sci., 90, 4196-4200 (1993)). hSST-5 и его последовательность известны (R. Panetta et al. in Mol. Pharmacol. 45, 417-427, 1993). Анализ связывания может быть проведен, как описано ниже, используя мембраны, приготовленные из селективных по отношению к hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5 линий клеток, например клеток CHO, стабильно экспрессирующих hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5. Используют ткань мозга или гипофиза, в которой визуализируют hSST посредством, например, гибридизации in situ и/или ауторадиографии рецепторов. Мембраны приготавливают в соответствии с известными способами (JC. Reubi et al. in J. Clin. Endocrinol. Metab. 1987, 65, 1127-1137). Мембраны, приготовленные из селективных по отношению к hSST линий клеток, например клеток CHO, стабильно экспрессирующих hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5, трижды инкубируют в общем объеме 300 мкл при температуре 22oC в течение 30 минут с возрастающими концентрациями: [125I-Tyr3]-октреотида в буфере Hepes (pH 7,6) с концентрацией 10 ммоль/л, содержащем 0,5% BSA. Инкубацию прерывают посредством быстрой фильтрации через стекловолоконные фильтры Whatman GF/B, каждый из которых затем промывают четыре раза 5 мл охлажденного на льду раствора 10 ммоль/л Трис/150 ммоль/л NaCl. Фильтры обсчитывают в счетчике LKB с эффективностью подсчета 78%. Специфическое связывание представляет собой общее связывание минус неспецифическое связывание в присутствии 1 мкмоль/л соматостатина-14. Эксперименты проводят трижды. Константу сродства (Kd) и количество сайтов связывания рассчитывают, исходя из графиков данных по Statchard. ИК50 (концентрация, при которой ингибирование составляет половину от максимального в конкурентном анализе связывания с использованием [125I-Tyr3] -октреотида, т. е. того же радиолиганда, что указан выше) соединений по данному изобретению, указанных, например, выше, в вышеописанных анализах связывания с hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 и/или hSST-5 находится, соответственно, в диапазоне нМолей, а предпочтительно составляет от 0,1 до 10 нМ (см. табл. 2). Более того, соединения по данному изобретению обладают способностью ингибировать высвобождение гормона роста (GH), о чем свидетельствует ингибирование высвобождения GH из культуры клеток гипофиза in vitro. Передние доли гипофизов взрослых крыс-самцов нарезают на маленькие кусочки и диспергируют, используя 0,1%-ный трипсин в 20 мМ буфере Hepes. Диспергированные клетки выращивают в течение четырех дней в MEM(Gibco), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1 мМ NaHCO3, 2,5 нМ дексаметазона, 2,5 мг/мл инсулина и 20 Ед/мл пенициллина/стрептомицина. В день эксперимента присоединившиеся клетки дважды промывают средой Кребса-Рингера (Krebs-Ringer), забуференной 2 мМ Hepes и дополненной 5 мМ глюкозы и 0,2% BSA. Затем клетки инкубируют с исследуемым соединением в присутствии фактора высвобождения гормона роста в концентрации 3


Самок бесшерстных мышей (nu/nu Balbc-A, IFFA Credo, Lyon, France) массой 19-22 г содержат в группах по 5 животных в макролоновых клетках (тип III, 16х22х11см). Клетки помещают в вентилируемые шкафы (IFFA Credo), температура в которых поддерживается на уровне 24



Исследования ангиопластики проводят на модели повреждения баллонным катетером. Баллонную катетеризацию проводят в день О, практически так, как описано (Powell et al. (1989)). Под анестезией изофлюраном катетер Фогерти (Fogarty) 2F вводят в левую общую сонную артерию через наружную сонную артерию, после чего раздувают баллон (растяжение - около 10 мкл H2O). Раздутый баллон извлекают вдоль общей сонной артерии трижды, причем два последних раза слегка вращают, чтобы добиться равномерной деэндотелизации. Затем катетер удаляют, на наружную сонную артерию накладывают лигатуру во избежание кровотечения и животным дают восстановиться. В данном исследовании используют две группы по 12 крыс RoRo (400 г, приблизительный возраст - 24 недели): одну - контрольную и одну - получающую соединение по данному изобретению. Весь уход, экспериментальные процедуры и анализ проводят на основе полной рандомизации. Исследуемое соединение вводят в виде постоянной инфузии с использованием минидозаторов со скоростью 10-50 мкг/кг в час, начиная за 3 дня до повреждения баллоном (день -3) и до окончания исследования через 14 дней после повреждения (день +14). Крыс содержат в отдельных клетках и предоставляют им пищу и воду ad libitum. Затем крыс анестезируют изофлюраном, через левый желудочек вводят перфузионный катетер, который фиксируют в дуге аорты, а аспирационную канюлю вводят в правый желудочек. Выполняют перфузию под перфузионным давлением 150 мм Hg, вначале в течение одной минуты 0,1 М забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS, pH 7,4), а затем в течение 15 минут 2,5%-ным глютаральдегидом в фосфатном буфере (pH 7,4). Затем сонные артерии иссекают, отделяют от окружающих тканей, погружают в 0,1 М какодилатный буфер (pH 7,4), содержащий 7% сахарозы, и инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. На следующий лень сонные артерии погружают в 0,05%-ный KMnO4 в 0,1 М какодилате и встряхивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем ткани дегидратируют последовательным воздействием различных концентраций этанола: 2х10 минут в 75%-ном, 2х10 минут в 85%-ном, 3х10 минут в 95%-ном и 3х10 минут в 100%-ном этаноле. Затем дегидратированные сонные артерии укладывают в Technovit 7100 в соответствии с рекомендациями производителя. Окружающую среду оставляют полимеризоваться в течение ночи в эксикаторе под аргоном. Из середины каждой сонной артерии твердым металлическим ножом на дисковом микротоме вырезают срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивают по Гимзе (Giemse) в течение 2 минут. Таким образом приготавливают около 5 срезов каждой сонной артерии, после чего поперечное сечение среднего слоя, неоинтимы и просвета оценивают морфометрически с помощью системы анализа изображений (MCID, Toronto, Canada). Согласно результатам данного исследования, соединения по изобретению ингибируют пролиферацию миоинтимы при их введении путем постоянной инфузии в суточной дозе от 0,2 до 10 мг/кг, а предпочтительно - от 0,05 до 5 мг/кг. Таким образом, соединения по изобретению также являются полезными для профилактики заболеваний сосудов в трансплантатах или борьбы с подобными заболеваниями, например васкулопатиями алло- или ксенотрансплантатов, такими как атеросклероз сосудов в трансплантатах, например в пересаженном органе: сердце, легком, сочетанием трансплантате сердце-легкие, печени, почке или поджелудочной железе, или для профилактики или лечения рестеноза и/или окклюзии сосудов после повреждения сосудов, например ангиопластики. Необходимые для применения по всем этим показаниям дозы будут, естественно, варьироваться в зависимости, например, от применяемого соединения по изобретению, реципиента, способа введения и тяжести подлежащего лечению состояния. Тем не менее, в целом удовлетворительных результатов удается достичь при введении порядка от 1 мкг до 0,5 мг/кг в день соединения по данному изобретению. Показанная пациентам суточная доза составляет от 2 мкг до примерно 20 мг, предпочтительно от 0,01 до примерно 20 мг, в частности от примерно 10 до примерно 5000 мкг соединения подкожно, удобным образом вводимого в разделенных дозах до трех раз в сутки в форме стандартной дозы, содержащей, например, от 0,5 мкг до примерно 10 мг, в частности от примерно 2 мкг до 10 мг соединения в форме замедленного высвобождения. Соединения по изобретению могут вводиться как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемых солей или комплексов. Подобные соли и комплексы могут быть приготовлены обычным способом и обладать такой же выраженной активностью, как и свободные соединения. В данном изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по изобретению, например соединение формулы II, в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемых солей или комплексов, в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Подобные композиции могут быть изготовлены в виде препаратов обычным образом. Соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли и комплексы могут вводиться обычным путем, например парентерально, в форме растворов или суспензий для инъекций, или в назальной форме, или в форме свечей. В соответствии с вышеизложенным в данном изобретении дополнительно предложены:
а) соединение по данному изобретению, например соединение формулы II, или его фармацевтически приемлемая соль, или комплекс для использования в качестве фармацевтического средства. б) способ профилактики или лечения нарушений, как указано выше, у субъекта, нуждающегося в подобном лечении, заключающийся во введении указанному субъекту эффективного количества соединения по изобретению, например соединения формулы II, или его фармацевтически приемлемой соли, или комплекса, или
в) соединения по изобретению, или его фармацевтически приемлемая соль, или комплекс для использования в приготовлении фармацевтической композиции для использования по любому определенному выше в п. б) способу. Как указывают результаты стандартных исследований, хелатные соединения по данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли пригодны либо для применения в комплексе с





1. Применение хелатного соединения по данному изобретению, например хелатного соединения формулы II в форме комплекса для обнаружения у субъекта in vivo клеток и тканей, содержащих рецепторы к соматостатину, и регистрации расположения рецепторов, с которыми связывается данный комплекс. Меченные радиоактивной меткой соединения по изобретению могут вводиться внутрибрюшинно, а предпочтительно внутривенно, например в форме инъекционных растворов или суспензий, предпочтительно в виде однократной инъекции. Предпочтительно, чтобы введение радиоактивной метки производилось незадолго до введения субъекту. Удобным является введение хелатного соединения по изобретению в дозе, содержащей 0,2-20 мКи, а предпочтительно 1-10 мКи, нуклида в виде стабильного комплекса. У животных показанный диапазон доз может составлять 0,01-1 мкг/кг хелатного соединения по данному изобретению в комплексе с 0,02-0,5 мКи


Класс C07K7/64 циклические пептиды, содержащие только нормальные пептидные связи
Класс C07K14/655 соматостатины
Класс A61K51/08 пептиды, например протеины
Класс A61P5/02 гормонов гипоталамуса, например TRH, GnRH, CRH, GRH, соматостатина