защищенные пептиды кальцитонина
Классы МПК: | C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот C07K14/585 кальцитонины A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот A61K38/23 кальцитонины A61P19/10 остеопороза |
Автор(ы): | Самуков В.В., Поздняков П.И., Сабиров А.Н. |
Патентообладатель(и): | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Общество с ограниченной ответственностью "Фармсинтез" |
Приоритеты: |
подача заявки:
2000-09-14 публикация патента:
27.11.2002 |
Изобретение относится к соединениям формулы Х1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y, где Х1 - H-, A1O-CO-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-; Y - -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; А1 есть трет-бутил; R1 - защитная группа формулы В1О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, R2 - защитная группа формулы В2О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr, R3 - защитная группа формулы В3О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys, В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu, причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил. Использование указанных защищенных пептидов позволяет упростить получение кальцитонина лосося. 2 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2
Формула изобретения
Защищенные пептиды общей формулыХ1-Ley-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,
где Х1= H-, A1O-CO-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;
Y= -OH, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;
А1 есть треть-бутил;
R1 - защитная группа формулы В1О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;
R2 - защитная группа В2О-СО- для гидроксильной группы остатка Туr;
R3 - защитная группа формулы В3О-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys;
В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,
причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения кальцитонина лосося и его аналогов, а именно к защищенным пептидам общей формулыX1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,
где Х1 - Н-, А1O-СО-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;
Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;
А1 - трет-бутил;
R1 - защитная группа формулы В1O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,
R2 - защитная группа формулы В2O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,
R3 - защитная группа формулы В3O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,
В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,
причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил. Гипокальциемический гормон кальцитонин является важнейшим лекарственным средством, применяемым для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме: гиперкальциемии различного происхождения, острой дистрофии костей, остеопороза, болезни Паже, замедленного сращивания костей после переломов или хирургических операций. В медицинской практике наибольшее применение находит кальцитонин лосося, по биологической активности более чем в 40 раз превосходящий кальцитонины человека и млекопитающих. Кальцитонин лосося представляет собой полипептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков, содержащий дисульфидный мостик между остатками цистеина в положениях 1 и 7 и амидированный С-концевой остаток пролина:

Основным источником кальцитонина медицинского назначения является химический синтез. Для химического синтеза кальцитонина используются два основных подхода, существующих в химии пептидов: твердофазный, или синтез на нерастворимом полимерном носителе, и жидкофазный, или синтез в растворе. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, твердофазный синтез по-прежнему остается мало приспособленным для получения пептидов в больших количествах, требуемых для клинических испытаний и серийного производства лекарственных средств. В этом отношении к недостаткам твердофазного синтеза можно отнести: а) необходимость применения полной постоянной защиты три функциональных аминокислот; б) использование больших избытков защищенных аминокислот, как правило, не подлежащих регенерации; в) ограниченные возможности контроля хода синтеза, невозможность очистки промежуточных продуктов; г) трудность масштабирования; д) опасность загрязнения целевого пептида близкими по структуре примесями, трудоемкость и многостадийность очистки конечного продукта; е) высокую стоимость исходных материалов - защищенных аминокислот, реагентов и полимеров. Поэтому жидкофазный синтез, несмотря на относительно высокую трудоемкость, является основным методом пилотного и промышленного производства пептидов, так как он обеспечивает тактическую гибкость в выборе схем защиты (от минимальной до полной) и методов конденсации, полный контроль хода синтеза, возможность очистки промежуточных продуктов, а также возможность масштабирования всего процесса. Однако эффективность процесса, выходы и качество конечных продуктов существенным образом зависят от оптимальности тактической схемы синтеза. Синтез кальцитонина в растворе осуществляют путем сборки его полной последовательности из соответствующим образом защищенных пептидных сегментов, удаления защитных групп, последующей очистки и выделения целевого продукта. Защищенные пептидные сегменты, в свою очередь, синтезируют из защищенных аминокислот и/или более коротких пептидных сегментов. Аминокислотные последовательности сегментов, природа и расположение в их структуре защитных групп, порядок и способы сборки из сегментов полной последовательности кальцитонина определяются выбранной тактической схемой синтеза. Чтобы схема была эффективной и масштабируемой, при ее разработке необходимо следовать некоторым общим правилам: а) разбиение на сегменты нужно проводить таким образом, чтобы риск рацемизации при конденсации сегментов в единую цепь был минимальным; б) сегменты должны быть достаточно длинными, чтобы уменьшить число последовательных стадий при сборке молекулы кальцитонина; в) постоянные и временные защитные группы сегментов должны, с одной стороны, обеспечить необходимый уровень защиты от побочных реакций при синтезе сегментов и последующей их конденсации в единую цепь, с другой стороны, легко удаляться на финальной стадии процесса без повреждения структуры целевого продукта; г) защищенные пептидные сегменты должны быть хорошо растворимы в растворителях, используемых для конденсации сегментов. Эти требования во многом являются противоречащими друг другу, поэтому добиться их полного выполнения на практике очень трудно. Структурной особенностью молекулы кальцитонина лосося является наличие всего трех аминокислотных остатков (кроме двух остатков Cys), требующих обязательной постоянной защиты, - Lys11, Lys18 и Glu15, высокое содержание гидроксиаминокислот, а также наличие остатков His и Arg, постоянная защита которых при жидкофазном синтезе не является строго обязательной. Это открывает возможности для осуществления синтеза кальцитонина с применением разнообразных схем защиты - от минимальной до полной. Известны способы получения кальцитонина лосося и его аналогов из пептидных сегментов с полной постоянной защитой бензильного типа (патент Швейцарии 624660, Cl. C 07 C 103/52) и трет-бутильного типа (патент Японии 0616694, Cl. C 07 K 7/06; Европейский патент 606816, Cl. C 07 K 001/06). Полная защита позволяет минимизировать возможные побочные реакции при сборке последовательности кальцитонина. Вместе с тем, отщепление большого числа защитных групп кислотными реагентами по окончании синтеза само по себе часто является источником побочных реакций. Кроме того, растворимость полностью защищенных пептидов в органических растворителях существенно снижается с увеличением их длины. Это затрудняет проведение синтеза и делает почти невозможными очистку и контроль чистоты промежуточных продуктов. Тем самым теряется одно из основных преимуществ жидкофазного синтеза пептидов. Схемы синтеза кальцитонина и его аналогов из пептидных сегментов с минимальной постоянной защитой трет-бутильного типа, описанные, например, в статье Guttmann S., Pless J., Huguenin R.L., Sandrin E., Bossert H., Zehnder K. Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, p.1788-1795, в патентной заявке Германии 2025791, Cl. C 07 C, а также промежуточные (неполные) варианты постоянной защиты (например, патент Японии 0616694, Cl. C 07 К 7/06) позволяют улучшить ситуацию с растворимостью синтезируемого полипептида. Отщепление в мягких условиях небольшого числа защитных групп на финальной стадии процесса дает высокий выход целевого продукта, который не требует многостадийной очистки. Однако применение в качестве постоянной защиты кислотолабильных групп трет-бутильного типа исключает возможность одновременного использования групп аналогичного типа (например, трет-бутоксикарбонильной и трет-бутильной) в качестве высокоэффективных временных защитных групп для


X1-Leu-His-Lys(R1)-Leu-Gln-Thr-Tyr(R2)-Pro-Y,
где Х1 - Н-, А1O-СО-, H-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-, A1O-CO-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-;
Y - -ОН, -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2;
А1 - трет-бутил;
R1 - защитная группа формулы В1O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,
R2 - защитная группа формулы В2O-СО- для гидроксильной группы остатка Тyr,
R3 - защитная группа формулы В3O-СО- для эпсилон-аминогруппы остатка Lys,
В4 - защитная группа для гамма-карбоксильной группы остатка Glu,
причем В1, В2, В3 и В4 могут быть одинаковыми или разными и выбираются из ряда: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(замещенный арил)сульфонилэтил. Предметом изобретения, таким образом, являются пептидные сегменты 16-23, 11-23, 16-32 и 11-32 (I-IV) последовательности кальцитонина лосося, имеющие защитные группы на боковых радикалах аминокислотных остатков Lys11, Lys18, Glu15 и Тyr22 (табл.1). Сегменты I-IV могут иметь свободную








X2-Lys(R3)-Leu-Ser-Gln-Glu(B4)-OH (V),
где Х2 есть уретановая защитная группа, предпочтительно трет-бутоксикарбонильная, а R3 и В4 принимают значения, указанные выше. Удаление C








H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (VI). Сегмент IV (11-32) можно синтезировать двумя путями: 1) N





С продукта конденсации удаляют N


Для удаления защитных групп пептид VIII подвергают кратковременному действию разбавленного раствора основания, например обработке 0.1 н. водным раствором гидроксида натрия в течение 3-20 мин при температуре от 0 до 20oС, смесь нейтрализуют, например, добавлением избытка уксусной кислоты, после чего выделяют из полученного раствора кальцитонин лосося известными способами, например ионообменной или/и обращенно-фазовой хроматографией. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:
ДМФА - диметилформамид,
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид,
ОБТ - 1-гидроксибензотриазол,
ТФУ - трифторуксусная кислота,
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,
Cpsc - 2-(4-хлорфенил)сульфонилэтоксикарбонил,
Msc - 2-метилсульфонилэтоксикарбонил,
Psc - 2-фенилсульфонилэтоксикарбонил,
Pse - 2-фенилсульфонилэтил,
Tse - 2-(4-толил)сульфонилэтил,
Tce - 2,2,2-трихлорэтил. Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem., 1984, v. 138, N 1, pp. 9-37. Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию. Значения хроматографических подвижностей Rf приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота 95:5:3 (А) или 90:10:3 (Б); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 60: 5: 15:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводили в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (М+H)+ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина) или на масс-спектрометре MALDI-TOF VISION 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия). Анализ аминокислотного состава проводили на анализаторе Biotronik LC5001 после кислотного гидролиза образцов пептидного материала в запаянных ампулах (6 н. НС1, 24 ч, 110oС). Пример 1. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Iа). а. Вос-Рrо-ОТсе. 3.9 г Вос-Рrо-ОН растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 50 мг 4-диметиламинопиридина и 2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 4.2 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0oС и 30 мин при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 50 мл воды, 50 мл насыщенного NaHCО3 и 50 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Получают 6.1 г бесцветного масла, Rf 0.65-0.7 (А). б. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Масло Вос-Рrо-ОТсе (пример Iа) растворяют в 30 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 50 мл ДМФА. К раствору добавляют 9.5 г Boc-Tyr(Psc)-OH, 2.0 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 2 ч при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату добавляют 150 мл этилацетата и экстрагируют 100 мл воды, 100 мл насыщенного NаНСО3, 100 мл 0.5 М KHSO4 и 50 мл насыщенного NaCl. Органический слой упаривают досуха и обрабатывают остаток петролейным эфиром. Получают 10.5 г бесцветного кристаллического продукта, Rf 0.7-0.75 (А); масс-спектр: (М+H)+ 724.2 (вычислено: 723.08). в. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1б) растворяют в 40 мл 2 М НСl в уксусной кислоте, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток переупаривают с толуолом, промывают эфиром и растворяют в 70 мл ДМФА. К раствору добавляют 4 г Boc-Thr-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.4 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.5 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 3 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Получают 11 г бесцветного аморфного вещества, Rf 0.40-0.45 (А); масс-спектр: (М+Н)+ 823.5 (вычислено: 823.19). г. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1в) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11 г трифторацетата H-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.95 г Boc-Gln-OH, 1.8 мл N-метилморфолина и 2.2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 3.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oC и 3 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1б. Остаток после упаривания экстракта обрабатывают эфиром и получают 10.4 г целевого продукта, Rf 0.15-0.20 (А), 0.50-0.55 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 921.5 (вычислено: 952.33). д. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1г) растворяют в 50 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.8 г трифторацетата H-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г моногидрата Boc-Leu-OH, 1.4 мл N-метилморфолина и 2 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.8 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 8 ч при 20oС, затем обрабатывают реакционную смесь как описано в примере 1г. Получают 9.6 г целевого пентапептида, Rf 0.10-0.15 (А), 0.55-0.60 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1067.3 (вычислено: 1065.50). е. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-ОТсе (пример 1д) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 9.5 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рrо-ОТсе. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 6.5 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.4 г ОБТ. Перемешивают смесь 8 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 11.4 г гексапептида, Rf 0.35-0.40 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1404.2 (вычислено: 1405.91). ж. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 60 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 11.5 г трифторацетата Н-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 5.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 1.4 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 12.3 г гептапептида, f 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1444.1 (вычислено: 1442.94). з. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1e) растворяют в 60 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 12 г бистрифторацетата H-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 70 мл ДМФА, к раствору добавляют 3 г N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 2.2 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 18 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток этилацетатом. Осадок отфильтровывают, переосаждают из ДМФА эфиром и получают 11.6 г октапептида, f 0.10-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1554.6 (вычислено: 1556.11). и. Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ia). К раствору 6.5 г Тсе-эфира сегмента Iа (пример 1з) в 60 мл тетрагидрофурана, 15 мл воды и 5 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 3 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 150 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Продукт переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 5.3 г целевого сегмента Ia, Rf 0.40-0.45 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1524.1 (вычислено: 1524.84); аминокислотный состав: Glx 0.93 (1); Thr 0.85 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.09 (1); Тyr 0.91 (1); His 1.13 (1); Lys 1.02 (1). Пример 2. Получение Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-G1n-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib). a. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. 3.2 г трифторацетата H-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 1е) растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Msc), 0.5 мл N-метилморфолина и 450 мг ОБТ. Перемешивают смесь 4 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 3.9 г гексапептида, Rf 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 1342.2 (вычислено: 1343.84). б. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2а) растворяют в 15 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 4.0 г трифторацетата Н-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.8 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-His(Boc), 450 мкл N-метилморфолина и 400 мг ОБТ. Перемешивают смесь 12 ч при 20oС, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении и обрабатывают остаток эфиром. Осадок отфильтровывают, переосаждают из уксусной кислоты эфиром и получают 4.0 г гептапептида, Rf 0.30-0.40 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1381.1 (вычислено: 1380.87). в. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Boc-His(Boc)-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce (пример 2б) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 3.9 г бис-трифторацетата H-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 20 мл ДМФА, к раствору добавляют 900 мг N-гидроксисукцинимидного эфира Boc-Leu и 0.82 мл N-метилморфолина. Перемешивают смесь 24 ч при 20oС, затем обрабатывают смесь как описано в примере 1з и получают 3.8 г октапептида, Rf 0.08-0.15 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1495.1 (вычислено: 1494.04). г. Boc-Leu-His-Lys(Msc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент Ib). К раствору 1.8 г Тсе-эфира сегмента Ib (пример 2в) в 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 20 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 50 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 1.4 г целевого сегмента Ib, Rf 0.35-0.40 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1464.0 (вычислено: 1462.77); аминокислотный состав: Glx 1.04 (1); Thr 0.82 (1); Leu 2.00 (2); Pro 1.13 (1); Тyr 0.95 (1); His 1.08 (1); Lys 1.01 (1). Пример 3. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OH (сегмент IIа). a. Boc-Glu(OPse)-OTce. 4.2 г Boc-Glu(OPse)-OH растворяют в 20 мл сухого этилацетата, добавляют 20 мг 4-диметиламинопиридина и 1.2 мл 2,2,2-трихлорэтанола, охлаждают в ледяной бане и добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 30 мин при 0oС и 60 мин при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат экстрагируют 20 мл воды, 30 мл насыщенного NaHCО3 и 30 мл насыщенного NaCl, затем упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.0 г бесцветного кристаллического продукта, Rf 0.55-0.6 (А). б. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Glu(OPse)-OTce (пример 3а) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 4.8 г трифторацетата H-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 2.6 г Boc-Gln-OH, 1.1 мл N-метилморфолина и 1.35 г ОБТ, охлаждают в ледяной бане и затем добавляют 2.3 г ДЦГК. Перемешивают 1.5 ч при 0oС и 7 ч при 20oС, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом и кристаллизуют из эфира. Получают 5.4 г дипептида, Rf 0.15-0.20 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 676.3 (вычислено: 676.02). в. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3б) растворяют в 20 мл ТФУ, через 30 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г пентафторфенилового эфира Boc-Ser и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 1.5 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают гексаном, затем обрабатывают эфиром и получают 5.5 г трипептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 762.9 (вычислено: 763.10). г. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTcc. Boc-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3в) растворяют в 20 мл ТФУ, через 50 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.4 г трифторацетата H-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Его растворяют в 15 мл ДМФА, к раствору добавляют 3.4 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Вос-Leu, 450 мг ОБТ и 1.1 мл N-метилморфолина. Перемешивают 5 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 5.2 г тетрапептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.40-0.45 (Б); масс-спектр: (М+Н)+ 877.4 (вычислено: 876.28). д. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce. Boc-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OTce (пример 3г) растворяют в 20 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток кристаллизуют из эфира и получают 5.3 г трифторацетата H-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-ОТсе. Его растворяют в 25 мл ДМФА, к раствору добавляют 4.3 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc), 450 мг ОБТ и 1.4 мл N-метилморфолина. Перемешивают 2 ч при 20oС и упаривают реакционную смесь до масла. Остаток промывают водой, эфиром, упаривают с этанолом, затем обрабатывают эфиром и получают 6.5 г пентапептида, Rf 0.05-0.10 (А), 0.30-0.35 (Б); масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 1117.4 (вычислено: 1116.56). e. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-OH (сегмент Va). К раствору 6.0 г Тсе-эфира сегмента Va (пример 3д) в 50 мл тетрагидрофурана, 10 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 2 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 30 мин, отфильтровывают шлам и упаривают фильтрат досуха. Остаток обрабатывают 100 мл воды, осадок отделяют фильтрованием и сушат на воздухе. Пептид переосаждают из смеси метанола и уксусной кислоты эфиром и сушат в вакууме. Получают 4.2 г целевого сегмента Va, Rf 0.55-0.60 (В); масс-спектр: (М+Н)+ 1084.6 (вычислено: 1085.30); аминокислотный состав: Glx 2.04 (2); Ser 0.85 (1); Leu 1.00 (1); Lys 1.06 (1). ж. Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Рго-ОТсе (Тсе-эфир сегмента IIа). 1.65 г Тсе-эфира сегмента Ia (пример 1з) растворяют в 15 мл ТФУ, через 40 мин при 20oС упаривают, остаток обрабатывают эфиром и выделяют 1.7 г бис-трифторацетата H-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-OTce. Его растворяют в 10 мл ДМФА, к раствору добавляют 1.2 г сегмента Va (пример 3е), 270 мг ОБТ, 230 мкл N-метилморфолина и, при охлаждении в ледяной бане, 300 мг ДЦГК. Смесь перемешивают 2 ч при охлаждении, затем 18 ч при 20oС. Отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривают до масла и остаток обрабатывают 100 мл этилацетата. Осадок отделяют фильтрованием, переосаждают из ДМФА этилацетатом, промывают эфиром и получают 2.32 г тридекапептида; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 2524.2 (вычислено: 2522.26). з. Сегмент IIа. К 2.3 г Тсе-эфира IIа (пример 3ж) в смеси 10 мл ДМФА, 20 мл тетрагидрофурана, 5 мл воды и 2 мл уксусной кислоты при быстром перемешивании добавляют порциями в течение 10 мин 1 г активированной цинковой пыли. Смесь перемешивают еще 50 мин, затем обрабатывают как описано в примере 3е. Получают 2 г сегмента IIа; масс-спектр (после удаления Вос-защиты): (М+Н)+ 2389.6 (вычислено: 2390.87); аминокислотный состав: Glx 2.73 (3); Ser 0.83 (1); Thr 0.87 (1); Leu 3.00 (3); Pro 1.11 (1); Тyr 0.91 (l); His l.06 (l); Lys 2.02 (2). Пример 4. Получение Boc-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IIIa). К раствору 770 мг сегмента Ia (пример 1и), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI (Helv. Chim. Acta, 1969, v. 52, 1788-1795), 135 мг ОБТ и 100 мкл N-метилморфолина в 6 мл ДМФА добавляют 140 мг ДЦГК и перемешивают смесь 24 ч при 20oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого гептадекапептида растворяют в 20 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке 4

Получают из 750 мг сегмента Ib (пример 2) и 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, как описано для сегмента IIIa в примере 4. После хроматографической очистки выделяют 0.86 г трифторацетата сегмента IIIb; масс-спектр: (М+Н)+ 2334.2 (вычислено: 2333.76); аминокислотный состав: Asx 1.08 (1); Glx 1.00 (1); Ser 0.84 (1); Thr 3.50 (4); Gly 1.96 (2); Leu 2.00 (2); Pro 1.88 (2); Туr 0.95 (1); His 1.09 (1); Lys 1.03 (1); Arg 1.00 (1). Пример 6. Получение Boc-Lys(Psc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OPse)-Leu-His-Lys(Psc)-Leu-Gln-Thr-Tyr(Psc)-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (сегмент IVa). Вариант 1. К раствору 1.25 г сегмента IIа (пример 3), 600 мг бис-трифторацетата сегмента VI, 135 мг ОБТ и 120 мкл М-метилморфолина в 10 мл ДМФА добавляют 160 мг ДЦГК и перемешивают смесь 40 ч при 20oС. Реакционную смесь обрабатывают как описано в примере 1ж, полученный осадок сырого 22-пептида растворяют в 30 мл смеси ацетонитрил-вода (1:4) и хроматографируют на колонке






Класс C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов
Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот