соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина

Формула изобретения

Соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина общей формулы

где Х выбран из группы: Na, К, NH₄ ⁺ .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, конкретно к синтетическим биологически активным производным пиримидина.

Заявляемое вещество имеет выраженную противомикробную активность, направленную преимущественно против различных грибов, а также некоторых бактерий, простейших и вирусов, а также обладает противоопухолевым и противоболевым действием.

Кроме того, указанные соединения могут быть использованы для тех же целей в ветеринарии, косметологии, в качестве консервантов в строительстве, пищевой, кожевенной, деревообрабатывающей и других типах промышленности для профилактики и уничтожения различных микроорганизмов, преимущественно грибов.

Как известно, одну из наиболее серьезных проблем современной медицины представляют грибковые, а также бактериальные и вирусные заболевания, многие из которых крайне плохо поддаются лечению, что связано как с недостаточной эффективностью существующих препаратов, так и их быстрой изменчивостью, приводящей к появлению устойчивых форм, Fidel P.L. Jr, Vazquez J.A., Sobel J.D. Candida glabrata: review of epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to C.albicans 1999, 1:80-96. White T. Antifungal drug resistance in Candida albicans., ASM News 8:427-433.

Схожие проблемы актуальны для ветеринарии и промышленности, где широко распространена порча продукта, связанная с развитием и распространением микроорганизмов. Наиболее распространенными препаратами для лечения грибковых заболеваний являются нистатин, флюконазол, тербинафин и некоторые другие (Энциклопедия лекарств РЛС-2000, М., 2000, стр.987). Вместе с тем, каждый из препаратов имеет определенные недостатки. Флюконазол, несмотря на широкий спектр действия, является фунгистатиком и не убивает грибы, а только блокирует их рост и размножение. Тербинафин не убивает дрожжеподобные грибы. Это крайне затрудняет использование этих препаратов для лечения людей с ослабленной иммунной системой. Другим распространенным препаратом является нистатин. Его главными недостатками следует считать низкую активность против многоклеточных грибов и распространенную к нему устойчивость у микробов. Наиболее активным противогрибковым препаратом является амфотерицин В, который является крайне токсичным и плохо переносимым большим числом пациентов.

Наиболее близким по химической природе к заявляемому является -2,4-диоксо-5-арилиденимино-1,3-пиримидины общей формулы

где R независимо выбран из группы: Н, ОН, низший алкоксил, галоген, нитро, ди(низший)алкиламино; n=1-3, или два близлежащих R вместе бензольным кольцом, к которому они присоединены, при n=2,4 образуют бензо, дибензо и при n=2 образуют 3,4-диоксолановое кольцо, RU 2198166.

Это вещество выбрано нами в качестве прототипа. Недостатком данного вещества является малая активность по отношению к некоторым микроорганизмам - микобактериям и хламидиям.

Задачей изобретения является разработка нового противогрибкового препарата широкого спектра действия, обладающего выраженной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов, простейших, а также опухолевых клеток; также решается задача предотвращения порчи продуктов.

Поставленная задача решается путем синтеза нового вещества, а именно калиевой, или натриевой, или аммониевой солей 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина общей формулы

где X выбран из группы: Na, К, NH₄ ⁺ .

Перечень синтезированных и заявляемых соединений приведен в таблице 1.

Таблица 1
Название вещества	Обозначение	Брутто-формула
Натриевая соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина	I	С 11Н6Cl2N 3NaO3
Калиевая соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидин	II	С 11Н6Cl2KN 3О3
Аммониевая соль 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина	III	C 11H10Cl2N 4O3

Заявленные вещества новы, поскольку они не известны из доступных источников информации. Наличие широкого спектра эффективной биологической активности у вновь синтезированных заявленных веществ не вытекает явным образом из предшествующего уровня знаний.

Сущность изобретения поясняют приведенные далее:

- способ получения новых производных 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина;

- данные ПМР спектроскопии соединений I-III (таблица 2);

- данные экспериментов по определению противогрибковой активности заявляемых соединений в сопоставлении с известными эффективными современными средствами того же назначения, а именно:

эксперимент 1 - определение противогрибковой активности заявляемых соединений;

эксперимент 2 - определение совместного действия заявляемых соединений и противогрибкового препарата флюконазола;

эксперимент 3 - определение совместного действия заявляемых соединений и противогрибкового препарата - нистатина;

эксперимент 4 - определение терапевтического действия заявляемых соединений на экспериментальную инфекцию, вызванную грибами рода Candida;

эксперимент 5 - определение противоопухолевой активности заявляемых соединений;

эксперимент 6 - определение противоболевой активности заявляемых соединений;

эксперимент 7 - определение острой токсичности заявляемых соединений;

эксперимент 8 - определение действия на вирус простого герпеса;

эксперимент 9 - определение антимикобактериального действия;

эксперимент 10 - определение действия соединений по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям;

эксперимент 11 - определение антипротозойного действия соединений по отношению к трихомонадам (Trichomonas vaginalis);

эксперимент 12 - определение возможности использования заявляемых соединений для борьбы со смешанной микробной инфекцией;

эксперимент 13 - определение возможности использования заявляемых соединений для предотвращения порчи продуктов.

Способ получения новых производных 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3 -пиримидина (I, II, III).

Целевые соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина общей формулы

где Х выбран из группы: К, Na, NH₄ ⁺ , получаются взаимодействием 5-аминоурацила или его солей щелочных металлов с дихлорсалициловым альдегидом. В качестве растворителя использована смесь этанол-вода 1:1. Продукты получались с выходами выше 90% от теоретического.

Синтез натриевой соли 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)имино-1,3-пиримидина.

В колбу поместили 0,04 г едкого натра и 20 мл воды. К полученному раствору добавили 1,27 г 5-аминоурацила; полученную массу перемешивали до полного растворения аминоурацила. Параллельно в 50 мл этанола растворили 1,91 г 3,5-дихлорсалицилового альдегида и полученный раствор по каплям при перемешивании добавили к раствору натриевой соли 5-аминоурацила. Сразу же выпал осадок ярко-красного цвета. Реакционную смесь перемешивали в течение получаса. Полученный осадок отфильтровали, промыли спиртом, высушили. Выход продукта составил 98% от теоретического.

Соединения II и III были получены аналогичным способом, только вместо едкого натра были использованы едкое кали или гидроксид аммония.

Соединения общей формулы представляют собой бесцветные или ярко окрашенные кристаллические вещества, растворимые в диметилсульфоксиде, пиридине. Температуры плавления всех веществ превышают 300°С.

Индивидуальность веществ доказана методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV-254, элюент четыреххлористый углерод - изопропанол=9:1. Структура синтезированных веществ доказана методом ПМР-спектроскопии. Данные ПМР-спектроскопии соединений I-III представлены в таблице 2.

Таблица 2
№ соединения	CH-N	NH	CH(Ur)
I	9,5	11,3	7,9
II	9,5	11,2	7,9
III	9,5	11,4	7,9

Данные экспериментов по определению биологического действия заявляемых соединении.

Эксперимент 1. Определение противогрибковой активности заявляемых соединении.

Активность препаратов против грибов определяли методом серийных разведении (таблица 3). В качестве препарата сравнения использовался флюконазол. Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и титровали в среде N-1, RPMI, Сабуро, так, что данный препарат содержался в отдельных пробирках со средой в концентрациях от 200 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок (лунок) отличалась в два раза. В контроле использовали ДМСО, который разводили так же, как и препарат. Результаты учитывали после культивирования грибов при использовании оптимальных временных и температурных режимов для каждого вида.

Таблица 3 Определение действия заявляемых соединений на дрожжи
Гриб	Штамм	Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл)
		Флюконазол	I	II	III
S.cervisiae	VT-2	2	1	1	1
G.candidum	VT-06	1	1	1	1

Показанные данные свидетельствуют о высокой активности препаратов по отношению к дрожжам.

Таблица 4 Определение действия заявляемых соединений на грибы рода Candida
Гриб	Штамм	Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл)
		Флюконазол	I	II	III
C.albicans	21	2	1	1	1
C.albicans	372	1	1	1	1
C.albicans	80	0,25	1	1	1,0
C.glabrata	382	16	0,125	0,125	0,125
C.glabrata	111	64	0,25	0,25	0,25
C.glabrata	160	32	0,125	0,125	0,125
C.krusei	5248	32	1	1	1

Показанные данные свидетельствуют о высокой активности препаратов по отношению к одноклеточным грибам рода Candida для большей части использованных штаммов, превосходящей таковую у препарата сравнения - флюконазола.

Таблица 5 Определение действия заявляемых соединений на многоклеточные грибы рода Aspergillus и Mucor
Гриб	Штамм	Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл)
		Флюконазол	I	II	III
Aspergillus	VT-70	>64	2	2	2
Mucor	VT-12	>64	1	1	1

Показанные данные свидетельствуют о высокой активности заявляемых препаратов, многократно превосходящей таковую у препарата сравнения - флюконазола, по отношению к грибам родов Aspergillus и Mucor.

Эксперимент 2. Определение совместного действия заявляемых соединений и противогрибкового препарата флюконазола. Результаты эксперимента приведены в таблице 6.

Таблица 6 Совместное применение флюконазола и заявляемых соединений
Гриб	Штамм	Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл)
		Флюконазол	I	II	Флюконазол +I	Флюконазол + II
Aspergillus	VT-70	>64	2	2	1	0,5
С. albicans	VT-18	6	1	1	0,5	0,5

Полученные данные указывают на возможность применения заявляемых соединений совместно с существующими лекарственными препаратами.

Эксперимент 3. Определение совместное действия заявляемых соединений и противогрибкового препарата - нистатина. Результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7 Совместное применение нистатина и заявляемых соединений
Гриб	Штамм	Минимальная подавляющая концентрация (МПК) (мкг/мл)
		Нистатин	I	II	Нистатин + I	Нистатин + II
C.krusei	VT-62	4	1	1	0,25	0,5
С. albicans	VT-18	2	1	1	0,5	0,5

Полученные данные указывают на возможность применения заявляемых соединений совместно с нистатином.

Эксперимент 4. Определение терапевтического действия заявляемых соединений на экспериментальную инфекцию, вызванную грибами рода Candida.

Исследование проводили на беспородных белых мышах весом 24-26 г. Животным внутривенно водили патогенный штамм С.albicans VT-18 в количестве 1×10⁹ бакт/животное. Вещество I вводили внутрибрюшинно. В контрольной группе по аналогичной схеме вводили изотонический раствор хлорида натрия или нистатин. Каждая группа включала 10 животных. Введение препарата продолжалось до момента гибели последнего животного в контрольной, нелеченной, группе. Испытуемый препарат вводили в дозе 5 мг/кг внутрибрюшинно. Флюконазол вводили аналогичным образом и в том же количестве. Эффективность действия оценивали по числу животных, выживших после гибели последнего погибшего в контрольной группе. В контрольной группе к 10 дню погибли все зараженные животные. Среди животных, получавших препарат I, остались живы все животные. Защита составила 100%. В группе, получавшей флюконазол, в живых остались 8 животных. Защита составила 80%. Полученные данные указывают на возможность и эффективность использования препарата I для лечения инфекционных состояний, вызванных грибами.

Эксперимент 5. Определение противоопухолевой активности заявляемых соединений. Результаты приведены в таблице 8.

Таблица 8
Вещество	Концентрация	Процент роста опухолевых клеток по сравнению с контролем
		Рак легкого	Рак груди	Рак нервной системы
I	100	24	5	2
II	100	20	5	2
III	100	42	12	-5

Исследование выполнено согласно требованиям Национального института здоровья США.

Эксперимент 6. Определение противоболевой активности заявляемых соединений.

В группе из 3 крыс оценивали время, необходимое для отдергивания хвоста, помещенного под направленный источник теплового излучения. Удлинение времени реакции более чем на 50% после внутрибрюшинного введения препарата (30 мг/кг) указывало на наличие анальгезирующей активности. В качестве препарата сравнения использовали анальгин (2 мг/кг). Результаты приведены в таблице 9.

Таблица 9 Оценка анальгезирующего действия заявляемых соединений
Препарат	Удлинение латентного периода реакции (%)
I	79
II	80
III	82
Анальгин	83

Полученные данные указывают на наличие у заявляемых соединений противоболевой активности.

Эксперимент 7. Определение острой токсичности заявляемых соединений.

Испытуемое соединение вводили перорально с помощью желудочного зонда (1000 мг/кг) или внутрибрюшинно (300 мг/кг) белым нелинейным мышам массой 20-25 г (по 5 самцов и 5 самок в каждой из испытуемых групп), после чего наблюдали за их состоянием на протяжении 14 дней. Отсутствие симптоматики, свойственной токсическим эффектам, и отсутствие гибели животных в течение указанного времени позволяет сделать вывод о низкой токсичности изучаемого соединения. При наличии острых токсических эффектов доза уменьшается до выявления максимальной переносимой дозы.

Таблица 10 Острая токсичность
Соединение	Концентрация испытуемых соединений (мг/л)
	Введение через рот	Введение внутрибрюшинное
I	1000	300
II	1000	300
III	1000	300

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют, что в пределах использованных доз вещества не проявляют острой токсичности в использованной модели.

Эксперимент 8. Определение действия на вирус простого герпеса.

Антивирусная активность изучалась по отношению к вирусу простого герпеса I типа (ВПГ-I/Ленинград/248/88) по общепринятому методу [Gentry G.A., Lawrency N., Lushbaugh N. Isolation and differentiation of Herpes simplex virus and Trichomonas vaginalis in cell culture, J. of Clinical Microbiology 1985, Vol.22, No.2, P.199-204]. Вирусы выращивали на перевиваемой культуре клеток Vero, полученной из банка клеточных культур Института цитологии РАН.

Результаты оценивали по наличию цитопатогенного действия вируса на клетки через 36 часов культивирования при 37°С в СО₂-инкубаторе.

Для оценки цитопатического действия вируса подсчитывали число неизмененных клеток. Результаты приведены в таблице 11.

Таблица 11 Действие препарата при концентрации 100 мкг/мл на вирус простого герпеса
Соединение	Число неизмененных клеток (% защиты)
Ацикловир	8000*(30 мкг/мл) (80%)
Контроль клеток	1000
DMSO	10000
I	9500 (95%)
II	9500 (95%)
III	9500 (95%)
прототип	9000 (90%)
* число клеток в 100 полях учета.

Полученные результаты указывают, что приведенные в таблице соединения обладают активностью против вируса герпеса, сравнимой с таковой у стандартного препарата ацикловира, и превосходят по активности вещество - прототип.

Эксперимент 9. Определение антимикобактериального действия.

Для определения активности был использован стандартный штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv, чувствительный ко всем антимикробным препаратам. Оценку антимикобактериального действия проводили методом серийных разведений.

Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и титровали так, что данный препарат содержался в отдельных пробирках со средой в концентрациях от 200 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. В контроле использовали ДМСО, который разводили так же, как и препарат. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С. Результаты приведены в таблице 12.

Таблица 12 Минимальная подавляющая концентрация (МПК) по отношению к M.tuberculosis H37Rv (мг/л)
Соединение	МПК
I	10
II	50
III	50
Прототип	100
Этамбутол	5,0

Приведенные данные показывают, что испытанные соединения обладают антимикобактериальной активностью по отношению к использованному штамму М. tuberculosis. Активность заявляемых соединений превосходит таковую у вещества - прототипа.

Эксперимент 10. Определение действия соединений по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям.

В экспериментах использованы стандартные коллекционные штаммы и бактерии, выделенные от больных. Оценку проводили методом серийных разведений с использованием питательных сред, пригодных для культивирования соответствующих видов микроорганизмов.

Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и титровали в концентрациях от 500 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С. Результаты приведены в таблице 13.

Таблица 13
Вещество	Минимальная подавляющая концентрация (мг/л)
	E.coli АТСС922	K.pneumoniae	P.aeruginosa ATCC27853	S.typhimur. VT-191	S.aureus	B.cereus	E.fecalis
I	50	150	300	50	25	100	150
II	100	150	200	100	100	100	150
III	50	100	250	50	50	100	150

Полученные данные указывают, что изученные вещества обладают широким спектром антимикробной активности по отношению к различным бактериям, в том числе к вегетативным формам спорообразующих бацилл (Bacillus cereus). Уровень активности указывает на возможность использовать данные вещества в качестве антисептика или в промышленности в качестве консервантов различных материалов.

Эксперимент 11. Определение антипротозойного действия соединений по отношению к трихомонадам (Trichomonas vaginalis).

В экспериментах использованы штаммы, выделенные от больных. Оценку проводили методом серийных разведений с использованием питательных сред, пригодных для культивирования соответствующих видов микроорганизмов.

Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и титровали в концентрациях от 500 до 0,025 мг/л. Концентрация препарата в среде соседних пробирок отличалась в два раза. Результат учитывали после 72-часового культивирования бактерий при 37°С. Установлено, что препараты I-III угнетают размножение использованных простейших в концентрациях от 50 до 0,1 мкг/мл.

Эксперимент 12. Определение возможности использования заявляемых соединений для борьбы со смешанной микробной инфекцией.

У лабораторных животных (морские свинки) выбривали часть волосяного покрова, наносили поверхностные царапины и втирали микробную смесь, состоящую из грибов рода Candida, стафилококка, кишечной палочки и энтерококка (штаммы см. пример 12). Через 24 часа у всех животных возникал местный воспалительный процесс. Для лечения использовали мазь, приготовленную из веществ I или II и ланолина. Вещества были добавлены в количестве 300 мг/кг. В контролях наносили чистый ланолин или стандартную мазь флюконазола. Каждая группа включала 5 животных. Критерием эффективности был срок полного заживления и восстановления кожного покрова. У животных в группах, леченных веществами, выздоровление наступило через 5 дней. В группах, получавших лечение ланолином или флюконазолом, через 6 дней все животные были больны и в дальнейшем были пролечены препаратами II и III.

Выздоровление этих групп наступило еще через 7 дней. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что заявляемые препараты могут быть использованы местно для борьбы со смешанными инфекциями, вызванные грамположительными и грамотрицательными бактериями и грибами.

Эксперимент 13. Определение возможности использования заявляемых соединений для предотвращения порчи продуктов.

В качестве модели было использовано сливочное масло, в которое были добавлены микробы, поименованные в примере 12 в количестве 10⁵ бактерий каждого вида на 1 грамм масла. В масло также были добавлены испытуемые вещества I, II, III (готовили по 10 проб на каждое вещество). Вещества добавляли в количестве 200 или 300 мг/кг. Пробы инкубировали при 37°С, каждый день делая количественные высевы на питательные среды, предназначенные для роста соответствующих бактерий и грибов. В контроле, в масло был добавлен растворитель - ДМСО, использованный для приготовления проб испытуемых препаратов. После 24 часов инкубации в контрольных пробах зарегистрировано нарастание количества внесенных микробов в 10 раз. Из проб, где вещества были внесены в количестве 300 мг/кг, микроорганизмы не высевались. При внесенных 200 мг/кг у пробы II зарегистрировано сохранение внесенного количества псевдомонад. Через две недели (время наблюдения) в пробах, содержащих 300 мкг/мл веществ II и III, роста микробов не наблюдалось.

Полученные данные свидетельствуют о возможности защиты пищевых продуктов от смешанной микробной порчи.

Промышленная применимость

Приведенные выше примеры и практические результаты синтеза и анализа заявляемых соединений подтверждают возможность лабораторного и промышленного синтеза заявляемых соединений средствами, освоенными современной фармацевтической и химической промышленностью, а также их строгую идентификацию общепринятыми методами контроля.

Серия экспериментов по определению биологической активности, представленная в отчетах, показала, что заявляемые соединения обладают выраженными противогрибковым (против одно- и многоклеточных грибов), а также противобактериальным и противовирусным, а также противоопухолевым и противоболевым действием. Приведенные факты доказывают достижение задач, поставленных изобретением.