производное 5-оксипиримидина, обладающее противоопухолевой активностью

Формула изобретения

1. Противоопухолевое средство, представляющее собой 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидин

2. Способ получения 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина, основанный на том, что амид изо-капроновой кислоты взаимодействует в ледяной уксусной кислоте с хлорацетилацетоном с образованием соответствующего оксазола, который взаимодействуя с водным раствором аммиака приводит к образованию заявляемого соединения.

3. Применение в качестве противоопухолевого средства соединения по п.1 для адъювантной противоопухолевой иммунотерапии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новому производному 5-оксипиримидина, которое может быть использовано при лечении онкологических заболеваний для адъювантной противоопухолевой иммунотерапии и для восстановления костномозгового кроветворения после применения лучевой терапии.

Современная медицина располагает широким спектром препаратов для лечения онкологических заболеваний. Внедрение в клиническую практику противоопухолевых моноклональных антител (МАТ) и низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ явилось важным шагом в направлении создания мишень-направленных (таргетных) средств [Yang Е.В., Guo Y.J., Zhang К. et al. Butein, a specific protein tyrosine kinase inhibitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol.245. - № 2. - P.435-438. Yang E.B., Guo Y.J., Zhang K. et al. Inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by chalcone derivatives // Biochem. Biophys. Acta. - 2001. - Vol.1550. - № 2. - P.144-152.].

Применение «таргетных» средств в клинической онкологии явилось прорывом в лечении определенных опухолей (например, в онкогематологии), но во многих случаях их эффективность оказывается ниже ожидаемой, кроме того, моноклональные антитела обладают широким спектром серьезных побочных эффектов (Корман Б.Д. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М. 2006, с.9-359; Проценко С.А. Поиски путей индивидуализации противоопухолевой терапии. Практическая онкология. 2007, т.8, № 4, с.173-181). Внедрение новых препаратов не решило и проблему формирования лекарственной резистентности опухолей. В последние годы, кроме таргетной, активно развиваются современные методы иммунотерапии в онкологии - для борьбы с различными опухолями и облегчения выраженных побочных эффектов при применении цитостатиков.

У больных с онкологическими заболеваниями рост большинства злокачественных новообразований сопровождается выраженными нарушениями иммунного ответа. В связи с этим одним из наиболее важных направлений является разработка новых современных препаратов для иммунотерапии рака.

Основные задачи современной иммунотерапии опухолей:

1) снижение побочных эффектов традиционной противоопухолевой терапии (миело- и иммуносупрессии);

2) профилактика рецидивов опухоли;

3) непосредственный противоопухолевой эффект.

В настоящее время доказана эффективность применения цитокинов [интерферона-альфа, интерлейкина-2 (ронколейкина), фактора некроза опухолей] при различных злокачественных новообразованиях как в режиме монотерапии, так и в сочетании с химиотерапией. Однако малые дозы часто бывают недостаточными, а высокие - токсичными. В частности, рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (ронколейкин), получаемый с помощью технологии рекомбинантной ДНК, с использованием штамма E.coli, содержащего модифицированный ген человеческого ИЛ-2. (Механизм действия СНК-411 подобен ронколейкину). Ронколейкин стимулирует эндогенную иммунную защиту, активирует Т-лимфоциты и естественные киллерные клетки, способствует продукции антител В-клетками, стимулирует клеточную секрецию вторичных цитокинов, запускает механизмы высвобождении гормонов. Показания - гипернефроидный рак почки, метастатическая меланома. Однако высокодозная иммунотерапия ИЛ-2 имеет в основном историческое значение и практически не используется из-за возникающих осложнений, вызванных токсичностью препарата (Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под редакцией Н.И. Переводчиковой. - М. 2013 г., стр.49-54).

Изыскание новых средств для лечения опухолевых заболеваний, их синтез и использование является актуальной задачей.

Настоящее изобретение относится к новому средству адъювантной противоопухолевой иммунотерапии, представляющему собой производное 5-оксипиримидина, в частности 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина (1, СНК-411) указанной ниже структурной формулы:

Ранее указанное соединение было зарегистрировано как соединение с RN890641-03-9 в БД ACS on STN REGISTRY. Способ получения этого соединения и его использование не были известны. 2-Изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидин (1, СНК-411) синтезирован в отделе химии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН. Противоопухолевое действие соединения указанной формулы и активирующее действие на костномозговое кроветворение предполагают применение этого соединения для противоопухолевой иммунотерапии в медицине.

Синтез основан на том, что амид изо-капроновой кислоты взаимодйствует в ледяной уксусной кислоте с хлорацетилацетоном с образованием соответствующего оксазола. Взаимодействие оксазола с водным раствором аммиака в автоклаве приводит к образованию заявляемого соединения.

Пример 1. 11,4 г (0,063 моль) 2-изобутил-4-метил-5-ацетил оксазола нагревают на масляной бане с десятикратным избытком 33% водного раствора аммиака в автоклаве при температуре 170°-180°C в течение 10 часов, охлаждают реакционную массу, затем выливают раствор в колбу и упаривают в вакууме водоструйного насоса и перекристаллизовывают из воды. Получают 7,0 г (62%) 2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидина с температурой плавления 118-120°C.

Найдено, %: С 66,3; Н 8,90; N 15,42. C₁₀H₁₆N ₂O₁.

Вычислено, %: С 66,67%; Н 8,87%; N 15,56; ПМР - спектр (ДМСО - d₆), б.м.д.: 0,84 (6Н, g, J 6,6 (СН₃)₂); 2,10 (1H, Н, СН); 2,31 (6Н, С, СН₃); 2,53 (2Н, g, J 7,0 СН ₂); 8,90 (1Н, С, ОН).

Фармакологическое изучение полученного соединения

При изучении соединения 1 (СНК-411) были выявлены различные свойства, в частности в результате терапии препаратом 1 мышей, несущих трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров человека и мышей. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток (СКК). Усиление пролиферации СКК под действием 1 может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий, а также при иммуносупрессии при онкологических заболеваниях. Указанные свойства соединения 1 свидетельствуют о перспективности его изучения в качестве противоопухолевого средства и для восстановления костномозгового кроветворения после применения лучевой терапии.

Пример 2. Острая токсичность соединения I определена в опыте на 50 белых беспородных мышах самцах массой 18-20 г при внутрибрюшинном введении. ЛД₅О составила 474 (416-540) мг/кг при расчете по Литчфилду и Уилкоксону. По классификации К.К. Сидорова соединение 1 относится к малотоксичным фармакологически эффективным веществам.

Пример 3. Изучено влияние соединения 1 на соматические показатели, число лейкоцитов и рост экспериментального опухолевого штамма - карциномы легких Льюиса (полученного из лаборатории штаммов ВОНЦ им. Н.Н. Блохина) у мышей F₁(СВА×С57В1/б), а также на противоопухолевую эффективность отечественного фторпиримидина фторафура, используемого в медицинской практике для лечения солидных опухолей. Опухоли от мышей C57BL/6 в эксперименте прививали подкожно мышам F ₁(СВА×С57В1/б) в область подмышечной впадины по 0,5 мл опухолевой взвеси. Противоопухолевой эффект регистрировали по размеру опухоли в момент забоя. Эффект соединения 1 на состояние мышей-опухоленосителей (C57BL/6) и рост опухолей оценивали после ранней (2-8 дни), отсроченной терапии (9-15 дни), дробным введением в/б соединения 1 в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней (суммарная доза равна 3/4 ЛД₅О) и однократного введения суммарной дозы на 8-ой день после инокуляции опухоли (таблицы 1 и 2).

При всех режимах введения соединения 1 мышам-опухоленосителям регистрировалось достоверное торможение роста опухоли.

Действие соединения	2-8 дни	8 день	9-15 дни
Торможение лейкоцитоза	43% Р<0,01	29% Р<0,01	4% Р>0,05
Торможение роста опухоли	39% Р<0,01	23% Р<0,05	27% Р<0,05

Лимфотропный потенциал соединения 1, оцениваемый по увеличению веса тимуса мышей-опухоленосителей, также наиболее выражен при этом режиме и ранней терапии опухоли.

Соединение 1 частично корригирует лейкемоидную реакцию, индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов в периферической крови и рост опухоли. Коррекция лейкоцитоза и роста опухоли соединением 1 наиболее выражена при ранней терапии. Соединение 1 не оказывает влияния на вес тела и состояние ретикулоэндотелиальных органов (селезенка, печень) мышей-опухоленосителей. Учитывая имеющиеся литературные данные о существовании повышенной противоопухолевой эффективности фторафура при сочетании с природным пиримидиновым метаболитом урацилом, изучена возможность сочетания соединения 1 с фторафуром с целью потенцирования и повышения его противоопухолевой эффективности (таблица). Терапию фторафуром в дозе 400 мг/кг однократно проводили на 8 сутки после инокуляции опухоли при достижении расчетной массы опухоли 1,5-2,5% от веса тела. Соединение 1 (50 мг/кг, один раз в сутки в/б в течение 7 дней) вводили до (2-8 сутки) и после (9-15 сутки) терапии фторафуром или однократно в той же суммарной дозе одновременно с фторафуром на 8-й день после инокуляции опухоли. Однако ни при одном из использованных режимов не обнаружено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности фторафура. Таким образом, в результате монотерапии соединением 1 мышей, несущих сингенные трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Не выявлено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности цитостатика фторпиримидинового ряда - фторафура при комбинированном применении с соединением 1.

Пример 4. Для подтверждения противоопухолевой активности соединения 1 было изучено его влияние на активность естественных киллерных клеток человека (ЕКК). Цитотоксическую активность ЕКК определяли с использованием радиометрической методики против меченных ³Н-уридином клеток человеческой эритромиелолейкозной линии К-562 во взвеси мононуклеаров периферической крови. При этом получали суспензию мононуклеарных клеток периферической гепаринизированной крови нормальных (здоровых) доноров, вносили в нее препарат в разных концентрациях на 1 час, после чего препарат удаляли центрифугированием. Установлено, что соединение 1 обладает дозозависимым модулирующим действием на активность ЕКК (таблица 3).

Выявлена иммуномодулирующая активность. Наиболее сильным стимулирующим действием (увеличение на 50%) обладала доза 2 мкг/мл, дозы 0,2 и 20 мкг/мл стимулировали ЕКК на 20%, а доза 200 мкг/мл не работала. Таким образом, соединение 1 обладает выраженным модулирующим действием на активность ЕКК человека.

Пример 5. Действие соединения 1 на пролиферацию стволовых кроветворных клеток (СКК) костного мозга и образование эндогенных колоний в селезенке мышей

Мышам F1 (С57В1/6хСВА) вводили внутрибрюшинно соединение 1 в интервале доз 0,1-100 мкг/мышь. Через 1 сутки мышей облучали в сублетальной дозе 6,0 Грей, после которой выживает около 1% стволовых кроветворных клеток. Еще через 8 суток мышей забивали, фиксировали селезенки в растворе Буша и подсчитывали количество макроскопически видимых эндогенных колоний под лупой. В результате установлено (таблица 4), что в интервале доз 0,1-100 мкг/мышь препарат оказывал стимулирующее действие на образование эндогенных колоний через 8 суток после облучения. Стимулирующий эффект наиболее выражен в дозах 0,1 и 10 мкг/мышь (0,005 и 0,5 мг/кг).

Для определения пролиферации СКК костного мозга у мышей через 1 сутки после введения соединения 1 извлекали бедренные кости, вымывали костный мозг и культивировали клетки 1,5 часа в присутствии 1 мг/мл оксимочевины, инактивирующей пролиферирующие клетки. После инкубации клетки, обработанные оксимочевиной и необработанные (контроль), вводили по 5×10⁴/0,5 мл среды сингенным реципиентам, облученным в летальной дозе (таблица 5). Через 8 суток мышей забивали, фиксировали селезенки и просчитывали число колоний, как выше. Содержание СКК в 8-фазе клеточного цикла рассчитывали по формуле:

где А - число СКК в S-фазе (в %),

а - число колоний из костного мозга, инкубировавшегося без оксимочевины,

б - число колоний из клеток костного мозга, инкубировавшегося с оксимочевиной.

В результате исследования установлено (таблица 5), что соединение 1 обладает дозозависимой способностью стимулировать пролиферацию СКК.

Таким образом, соединение 1 индуцирует выраженную пролиферацию СКК костного мозга (тестируемой по самоубийству оксимочевиной) в дозах 0,1 и 1 мкг/мышь (0,005 и 0,05 мг/кг, уровень пролиферации составлял, соответственно 51 и 35%, в контроле - 13%). Дозы 10 и 100 мкг/мышь не повышали пролиферацию СКК.

Пример 6. Действие соединения 1 на миграцию СКК.

В разные сроки после введения соединения 1 у мышей определяли содержание СКК в периферической крови, отражающее и уровень миграции СКК. С этой целью гепаринизированную кровь разводили в 2 раза физиологическим раствором и вводили по 0,2 мл внутривенно сингенным мышам, облученным в летальной дозе.

В результате установлено (таблица 6), что соединение 1 в дозе 1 мкг/мышь (0,05 мг/кг) обладает выраженной способностью индуцировать выброс СКК в периферическую кровь, особенно через 3 дня. Через 1 сутки содержание СКК составляло 72,2/мл (контроль 17,8), а через 3 суток - 233/мл (контроль - 13,3).

Для иммунотерапии опухолей наиболее важными показателями являются активация противоопухолевого иммунного ответа - НК-клеток и цитотоксических Т-киллеров. Была проведена оценка популяционного состава лимфоцитов крови, селезенки и тимуса мышей C57BL/6 методом четырехцветного цитометрического анализа на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США).

При изучении влияния СНК-411 на количество NK-клеток в крови и органах у мышей линии C57/BL6 были получены следующие результаты:

CD335+(NKp46) - основной маркер NK-клеток у мышей, NKp46 экспрессируется на поверхности только активированных NK-клеток, а также литическая активность НК-клетки, главным образом, связаны с этим рецептором.

Введение только СНК-411 в дозе 50 мг/кг наиболее значимо стимулировало NK-клетки в 2,9, 1,9, 2,5 раза в крови, селезенке и печени, соответственно, в сравнении с контролем. Совместное введение ЦФ и исследуемого соединения вызывало только в крови значимую стимуляцию NK в 3,9 раза в сравнении с группой, получившей ЦФ (таблица 7).

При изучении влияния СНК-411 на содержание цитотоксических Т-лимфоцитов в крови и органах у мышей линии C57/BL6 введение СНК-411 в дозе 25 мг/кг наиболее значимо стимулировало Т-киллеры в 2,3 раза в крови и снижало в 2,7 раз в селезенке в сравнении с контролем, а в тимусе и печени наблюдалась тенденция к увеличению Т-киллеров. Введение СНК-411 в дозе 50 мг/кг значимо стимулировало содержание Т-киллеров в 3,3, 1,4 раза в печени и тимусе, соответственно, по сравнению с контролем. В крови и селезенке наблюдалась тенденция к увеличению Т-киллеров (таблица 8).

При использовании МТТ-теста начато исследование цитотоксического эффекта соединения СНК-411 in vitro.

Оценку прямого цитотоксического эффекта соединения СНК-411 проводили методом МТТ-теста с использованием человеческой эритромиелоидной линии К-562 в сравнении с гидрохлоридом доксорубицина и тегафуром (фторафуром). Соединения тестировали в 4 параллельных измерениях при 4-х концентрациях - 10^-8 М, 10^-7 М, 10^-6 М, 10^-5 М. Оценку результатов проводили колориметрически. Оптическую плотность измеряли на фотометре для многолуночных планшетов при =545 нм при _{сравнения}=630 нм. Далее вычисляли % выживаемости клеток по сравнению с контролем. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Наиболее выраженное цитостатическое действие соединение СНК-411 проявило в концентрации 10^-5 М, что сопоставимо с действием доксорубицина г/хл в концентрации 10^-8 М и тегафура в концентрации 10^-7 М. Таким образом, согласно начатым исследованиям соединение СНК-411 обладает мягким цитотоксическим эффектом на человеческую эритромиелоидную линию К-562.

Таким образом, при изучении соединения 1 (СНК-411) были выявлены различные свойства, в частности в результате терапии соединением 1 мышей, несущих трансплантаты карциномы легких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров человека и мышей. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток (СКК) и противоопухолевая активность. Усиление пролиферации СКК под действием 1 может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий, а также при иммуносупрессии при онкологических заболеваниях. Указанные свойства соединения 1 свидетельствуют о перспективности его использования в качестве противоопухолевого средства и для восстановления костномозгового кроветворения. Соединение 1 может быть также использовано для повышения защитных функций организма после применения лучевой терапии.

Полученные результаты указывают на перспективность использования соединения СНК-411 в качестве средства адъювантной противоопухолевой иммунотерапии.

Таблица 1
Влияние соединения I на соматические показатели и рост карциномы легких Lewis при различных режимах введения (М+m)
Группы животных	Число животных	Вес тела		Лейкоциты, тыс. в мм3	Печень, г	Селезенка, мг	Тимус, мг	Вес опухоли, г
		до терапии	после терапии
контроль роста опухоли	19	24,03±0,71	22,90±0,49	24,0±1,85	1,50±0,05	337±16,2	35,60±2,20	2,71±0,22
соединение I, 50 мг/кг (2-8 дни)	10	23,29±0,85	23,97±0,92	13,70±0,54 Р<0,01	1,42±0,07	329±14,4	42,50±2,83	1,65±0,26 Р<0,01
соединение I, 50 мг/кг (9-15 дни)	10	23,73±0,63	23,08±0,67	23,10±2,08	1,47±0,04	310±18,2	30,70±1,56	1,99±0,17 Р<0,05
соединение I, 360 мг/кг (1 раз на 8 день)	10	23,08±0,43	22,63±0,43	17,05±1,31 Р<0,01	1,42±0,03	310±14,5	37,10±1,41	2,10±0,20 Р<0,05
Примечание: 1 день опыта - инокуляция опухолевого штамма

Таблица 2
Влияние соединения I и фторафура на соматические показатели и рост карциномы легких Lewis при различных режимах введения (М+m)
Группы животных	Число животных	Вес тела		Лейкоциты, тыс. в мм3	Печень, г	Селезенка, мг	Тимус, мг	Вес опухоли, г
		до терапии	после терапии
контроль роста опухоли	19	24,03±0,71	22,90±0,79	24,0±1,85	1,50±0,05	337±16	35,60±2,20	2,71±0,22
соединение I, 50 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (2-8 дни)	10	23,29±0,6	21,90±0,74	14,12±0,85 Р<0,01	1,42±0,08	365±26	2I,30±1,01	1,54±0,16 Р<0,05
соединение I, 50 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (9-15 дни)	10	23,80±0,33	22,74±0,45	17,93±1,39	1,42±0,06	345±26	16,56±1,06	1,81±0,17 Р<0,05
Физ. раствор+Фторафур, 400 мг/кг (2-8 дни)	10	23,05±0,78	21,63±0,91	15,96±1,51 Р<0,05	1,51±0,08	393±55	26,44±1,76	2,33±0,24
соединение I, 300 мг/кг+Фторафур, 400 мг/кг (1 раз на 8 день)	10	24,10±0,4	23,88±0,42	21,17±2,14	1,59±0,05	422±13,6	33,60±1,42	2,69±0,28

Таблица 3
Влияние соединения 1 на активность ЕКК человека
Доза 1 (мкг/мл)	Стимуляция активности ЕКК (в %)	Р
0,2	21,4*	<0,05
2,0	50,4*	<0,05
20,0	19,8	>0,05
200,0	0

Таблица 4
Влияние соединения 1 на образование эндогенных колоний в селезенке
доза соединения 1 (мкг/мышь)	число колоний	индекс стимуляции
-	2,9±1,0	1,0
0,1	9,8±2,7	3,4
1,0	4,3±1,2	1,5
10,0	8,6+3,1	3,0
100,0	4,5±1,0	1,6

Таблица 5
Влияние соединения 1 на пролиферацию СКК костного мозга через 1 сутки после введения
Доза соединения 1 (мкг/мышь)	число колоний в селезенке		число СКК в 8-фазе, %
	без оксимочевины	с оксимочевиной
-	9,71	8,42
0,1	14,5	7,0	51,7
1,0	9,0	5,84	35,2
10,0	8,43	7,6	9,9
100,0	10,4	10,5	0

Таблица 6
Влияние соединения 1 на содержание СКК в периферической крови
Доза соединения 1 (мкг/мышь)	число СКК в 1 мл крови
	через 1 сутки	через 3 суток
-	17,8	13,3
0,1	52,5	23,3
1,0	722	233,0
10,0	35,7	20,0
100,0	45,7	20,0

Таблица 7
CD335+(NKp46)	Кровь	Селезенка	Печень
Контроль	7,7±1,1	12,4±3,8	11,6±1,0
ЦФ, 200 мг/кг	10,3±1,0	10,6±3,9	36,9±1,7** в 3,2 р
СНК-411, 25 мг/кг	3,5±0,2** в 2,2 р	10,1±0,4	18,2±2,4* в 1,6 р
СНК-411, 50 мг/кг	23,4±2,2** в 2,9 р	24,0±1,9** в 1,9	28,7±2,8** 2,5 р
ЦФ+СНК, 25 мг/кг	33,2±3,3** в 4,3 р	12,4±1,0	23,7±2,6** в2,0 р
ЦФ+СНК, 50 мг/кг	39,0±2,3** в 5,0 р	14,4±0,9	39,3±3,0** 3,4 р

Таблица 8
CD8+	Кровь	Селезенка	Печень	Тимус
Контроль	6,4±0,7	14,8±3,4	6,5±1,1	4,3±0,5
ЦФ, 200 мг/кг	23,0±1,4** в 3,6 р	18,2±1,8	30,1±1,9** 4,6	20,7±0,9** в 4,8 р
СНК-411, 25 мг/кг	14,4±0,9** в 2,3 р	5,5±0,7** 2,7 р	11,5±2,1 (Р=0,07)	5,8±0,6
СНК-411, 50 мг/кг	8,6±0,8 (р=0,06)	12,4±0,9	21,2±2,2** 3,3 р	6,2±0,4** в 1,4 р
ЦФ+СНК, 25 мг/кг	18,1±2,7** в 2,8 р	19,1±1,8	24,0±2,5** 3,7 р	18,1±0,5** в 4,2 р
ЦФ+СНК, 50 мг/кг	23,8±1,4** в 3,7 р	14,9±0,6	11,3±2,6 (р=0,15)	19,8±1,2** в 4.6 р