ингибитор матриксных металлопротеиназ

Формула изобретения

1. Ингибитор матриксных металлопротеиназ, содержащий экстракт гриба Ganoderma atrum, полученный с использованием в качестве экстрагирующего растворителя воды и/или низших спиртов.

2. Лекарственное средство для подавления метастазирования, содержащее от 0,03 до 10 вес.% экстракта гриба Ganoderma atrum, полученного с использованием в качестве экстрагирующего растворителя воды и/или низших спиртов.

3. Пищевой продукт, содержащий экстракт гриба Ganoderma atrum, полученный с использованием в качестве экстрагирующего растворителя воды и/или низших спиртов.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к ингибитору матриксных металлопротеиназ (ММР). Более конкретно, изобретение относится к ингибитору ММР, обладающему высокой степенью безопасности и, как полагают, оказывающему влияние на предупреждение, супрессию и ослабление симптомов различных ММР-активированных нарушений и заболеваний, таких как метастазы при раке, язва, ревматоидный артрит, остеопороз, периодонтит и старение кожи.

Предпосылки создания изобретения

Рак является одной из основных причин смерти в большинстве развитых стран. В Японии в 30% случаев рак является причиной смерти. Прогресс, наблюдаемый в хирургическом лечении и в лучевой терапии, часто позволяет удалить первичный очаг рака. Все еще высокую распространенность заболевания относят на счет метастатических свойств рака. В настоящее время рак с множественными метастазами чрезвычайно трудно поддается лечению. Таким образом, одной из важнейших задач при лечении рака, помимо обычной терапии первичного очага, является создание метода подавления метастаз. В этом случае механизм метастазирования при раке постепенно выясняется на молекулярном уровне. В качестве одного из метастатических процессов отмечается декомпозиционная система внеклеточных матриксов.

Метастазы рака представляют собой такое состояние, при котором раковые клетки, высвобождающиеся из первичного сайта, с кровотоком распространяются по всему телу, доставляются живыми к другому органу и начинают размножаться в ткани органа. Как правило, опухолевые ткани окружены плотным внеклеточным матриксом. Ферментативное разложение (энзимолиз) внеклеточного матрикса необходимо для распространения раковых клеток из первичного сайта. Внеклеточный матрикс состоит из различных макромолекул, включая коллаген, эластин, фибронектин, ламинин и протеогликан. ММР представляет собой группу первичных ферментов, участвующих в энзимолизе внеклеточных матриксов. ММР активируется и наблюдается повышенная экспрессия ферментов в процессе васкуляризации в раковой ткани или в процессе метастазирования рака, как описано в цитируемой ниже ссылке 1. Следовательно, ожидается, что уменьшение экспрессии ферментов и ингибирование ферментативной активности подавляют инвазию раковых клеток (прорастание опухолью) и, тем самым, метастазирование рака.

Ссылка 1

"Retinoid-Mediated Suppression of Tumor Invasion and Matrix Metalloproteinase Synthesis", Shoenermark M.P. et al., Annals New York Academy of Sciences, Vol.878, pp.466-486, 1999.

В процессе инвазии раковых клеток в макромолекулы коллагеноз является особенно важной стадией. Разложение коллагена типа IV, присутствующего на базилярной мембране кровеносного сосуда, необходимо для того, чтобы раковые клетки проникали в кровеносный сосуд или выделялись из кровеносного сосуда. Liotta et al. [ссылка 2] обнаружили, что действие типа IV коллагенолитического фермента, секретируемого раковыми клетками, является важным фактором при определении метастазирующей способности рака. Желатиназа, входящая в состав ММР, представляет собой фермент, продуцируемый фибробластами, эндотелиальными клетками и раковыми клетками, разлагающий матриксы типа IV коллагена, желатина и эластина. Полагают, что вещество, проявляющее ингибирующую активность, например, в отношении желатиназы, подавляет васкуляризацию в раковых тканях и в метастазах рака и является эффективньм средством для предупреждения и лечения различных видов рака и карцином.

Ссылка 2

"Metastatic potential correlates with enzymatic degradation of basement membrane collagen", Liotta L.A. et al. Nature, Vol.284, pp. 67-68, 1980.

В цитируемой ниже ссылке 3 сообщается, что ММР играет важную роль в разложении внеклеточного матрикса в вирусной патологии, включая различные виды рака, изъязвление, ревматоидный артрит, остеопороз и периодонтит. Активированный ММР под действием внешних раздражителей, таких как ультрафиолетовое излучение, разрушает важные для сохранения кожной структуры компоненты. Как недавно было специально отмечено, ММР является фактором, ускоряющим старение, активируемое УФ-излучением.

Ссылка 3

"Matrix metalloproteinases as tissue destructive proteinases", Mitsutoshi Nakata, Yasunori Okada., KOKYU (Respiratory) Vol 18, No. 4, pp 365-371, 1999.

Таким образом, полагали, что ингибиторы ММР оказывают влияние на лечение и симптоматическое облегчение вызываемых ММР нарушений и заболеваний, и их активно изучали с целью скрининга. Такие ингибиторы описаны в следующих ссылках:

JAPANESE PATENT LAID - OPEN GAZETTE No. 9-40552

JAPANESE PATENT LAID - OPEN GAZETTE No. 11-147833

PATENT LAID - OPEN GAZETTE No. 2000-226311

Целью настоящего изобретения является создание ингибитора ММР, обладающего ингибирующей активностью против активации ММР, продуцируемых штаммами клеток высокометастатического рака, и эффективно предупреждающего и облегчающего симптомы различных вызываемых активированными ММР нарушений и заболеваний, таких как метастазирование рака.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения в качестве целевых использовали в высшей степени безопасные растительные экстракты и проводили скрининг растительных экстрактов на ММР-ингибирующую активность. В результате интенсивных исследований заявители обнаружили, что экстракты (растворителем) грибов Ganoderma оказывают исключительное ММР-ингибирующее воздействие и в значительной степени подавляют метастазирование рака в опытах на животных моделях метастазирования рака в легкие.

Ранее в CN 1291511, 2001 г. было описано использование для предотвращения возникновения и уничтожения раковых клеток экстракта гриба Ganoderma lucidum.

В настоящем изобретении раскрывается использование в качестве ингибитора матриксных металлопротеиназ, лекарственных средств для подавления метастазирования и косметических средств экстракта гриба Ganoderma atrum, полученного с использованием в качестве экстрагирующего растворителя воды и/или низших спиртов.

Предлагается также введение этого экстракта в пищевые продукты.

Примеры осуществления изобретения

Далее обсуждаются варианты осуществления настоящего изобретения. Грибы Ganoderma класса Basidiomycetes, используемые в настоящем изобретении, применяются для галеновых препаратов "Рейши" и относятся к трутовым грибам Ganoderma, Ganodermataceae. Грибы Ganoderma включают Ganoderma lucidum (Reishi, Рейши), Ganoderma atrui-n и Ganoderma sinense (в соответствии с номенклатурой в цитируемой ссылке Acta Microbiologica Sinica, 19(3), 265-279, 1979), хотя эта классификация не является единственной возможной (ограничивающей). Грибы Ganoderma, применяемые по настоящему изобретению, представляют собой грибы Ganoderma atrum.

В качестве экстрагентов в изобретении используют воду или низшие одноатомные спирты (например, метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, 1-бутанол и 2-бутанол). В качестве экстрагента может выступать один растворитель, или смесь двух, или смесь обоих растворителей.

Содержание экстракта грибов Ganoderma специально в лекарственных средствах находится в интервале 0.03-10.0 вес.% - веса сухого препарата от общего веса лекарственных средств, а содержание сухого экстракта менее 0.03 вес.% не гарантирует достаточного эффекта по настоящему изобретению. С другой стороны, содержание сухого экстракта более 10 вес.% не повышает эффективность и, следовательно, не экономично. В пищевых продуктах это содержание специально не ограничивается.

Экстракт гриба Ganoderma можно использовать в виде раствора экстрагированного вещества (вытяжки) без какой-либо дополнительной обработки или с необходимой обработкой, такой как концентрирование, разведение, фильтрование или обесцвечивание и дезодорирование с помощью активированного угля или т.п. Экстрагированный раствор (вытяжку) можно упарить досуха, высушить, в зависимости от требований, методом распылительной сушки или с помощью лиофилизации.

Ингибитор ММР по данному изобретению может входить в состав различных лекарственных средств, которые применяются для предупреждения, подавления или симптоматического облегчения нарушений и заболеваний, вызываемых активированными ММР. Ингибитор ММР может содержать различные добавки, которые представляют собой компоненты, обычно добавляемые в лекарственные средства, фармацевтические и пищевые продукты в конкретном количественном интервале, не оказывающем вредного влияния на действие экстракта. Добавки включают наполнители, стабилизаторы, консерванты, связующие, вещества, способствующие измельчению, углеводороды, жирные кислоты, спирты, сложные эфиры, поверхностно-активные вещества, мыла, регуляторы рН, антисептики, вещества, придающие вкус и запах, вещества, удерживающие влагу, порошкообразующие агенты, УФ-абсорбенты, загустители, красители, антиоксиданты, отбеливатели, хелатирующие агенты, масла, жиры и воски.

Возможные примеры лекарственных форм по данному изобретению включают порошки, пилюли, таблетки, инъецируемые растворы, суппозитории, эмульсии, капсулы, гранулы, жидкости (включая настойки, жидкостные экстракты, спиртовые настойки, суспензии и лимонады) и др. Пищевые продукты с экстрактом гриба могут быть также различного вида.

Некоторые примеры композиций по данному изобретению обсуждаются ниже. Эти примеры являются не ограничивающими, но лишь иллюстративными. В композициях в соответствующих примерах, если не указано иначе, термин "части" обозначает "весовые части.

Препарат 1: Водный экстракт Ganoderma atrum, полученный экстракцией горячей водой

К 20 г сухого Ganoderma atrum добавляют 400 мл очищенной воды, экстрагируют при температуре 95-100°С в течение 2 часов и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают и лиофилизируют, получают 1.4 г сухого водного экстракта Ganoderma atrum.

Препарат 2: 50% этанольный экстракт Ganoderma atrum (полученный экстракцией 50%-ным этанолом)

К 100 г сухого Ganoderma atrum добавляют 900 мл 50%-ного этанола, экстрагируют при комнатной температуре в течение 7 дней и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают досуха, получают 1.9 г экстракта Ganoderma atrum, полученного экстракцией 50%-ным этанольньм раствором.

Препарат 3: Этанольный экстракт Ganoderma atrum

К 100 г сухого Ganoderma atrum добавляют 900 мл этанола, экстрагируют при комнатной температуре в течение 7 дней и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают досуха, получают 1.5 г сухого этанольного экстракта Ganoderma atrum.

Препарат 4: Водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi), полученный экстракцией горячей водой

К 20 г сухого Ganoderma lucidum добавляют 400 мл очищенной воды, экстрагируют при температуре 95-100°С в течение 2 часов и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают и лиофилизируют, получают 2.0 г сухого водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi).

Препарат 5: Экстракт Ganoderma lucidum (Reishi), полученный экстракцией 50%-ным этанолом

К 100 г сухого Ganoderma lucidum (Reishi) добавляют 900 мл 50%-ного этанола, экстрагируют при комнатной температуре в течение 7 дней и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают досуха, получают 3.1 г экстракта Ganoderma lucidum (Reishi), полученного экстракцией 50%-ным этанольным раствором.

Препарат 6: Этанольный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi)

К 100 г сухого Ganoderma lucidum (Reishi) добавляют 900 мл этанола, экстрагируют при комнатной температуре в течение 7 дней и отфильтровывают раствор с экстрактом. Фильтрат упаривают досуха, получают 2.5 г этанольного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi).

Пример 1: Порошок 1

Рецептура	Содержание
1. Водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1)	2 части
2. Сухой маисовый крахмал	38.0
3. Микрокристаллическая целлюлоза	60.0

[Процесс получения]

Смешивают компоненты 1-3, получая порошок 1.

Пример 2: Порошок 2

Порошок 2 получают, заменяя водный экстракт Ganoderma atrum в Примере 1 на экстракт Ganoderma atrum 50%-ным этанолом (Препарат 2).

Пример 3: Порошок 3

Порошок 3 получают, заменяя водный экстракт Ganoderma atrum в Примере 1 водным экстрактом Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4).

Пример 4: Порошок 4

Порошок 4 получают, заменяя водный экстракт Ganoderma atrum в Примере 1 равным количеством смеси водного экстракта Ganoderma atrum (Препарат 1) и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4).

Сравнительный пример 1: Порошок А (Порошок без экстракта гриба Ganoderma). Порошок А готовят заменой водного экстракта Ganoderma atrum в Примере 1 на сухой маисовый крахмал.

Пример 5: Таблетки

Рецептура	Содержание
1. Этанольный экстракт Ganoderma atrum
(Препарат 3)	5.0 частей
2. Сухой маисовый крахмал	25.0
3. Кальция карбоксиметилцеллюлоза	20.0
4. Микрокристаллическая целлюлоза	40.0
5. Поливинилпирролидон	7.0
6. Тальк	3.0

[Процесс приготовления]

Смешивают компоненты 1-4 и в качестве связующего для образования гранул к смеси добавляют водный раствор компонента 5. Затем к гранулам добавляют компонент 6 и формуют таблетки. Вес каждой таблетки составляет 0.52 г.

Пример 6: Пищевые таблетки

Рецептура	Содержание
1. 50.0% Этанольный экстракт (Препарат 3)	5.0 частей
2. Сухой маисовый крахмал	50.0
3. Эритритол	20.0
4. Лимонная кислота	40.0
5. Сложный эфир жирной кислоты и сахарозы	7.0
6. Ароматизатор	Адекватное количество
7. Вода	Адекватное количество

[Процесс приготовления]

Смешивают компоненты 1-4 и 7 и получают гранулы. Затем к гранулам добавляют компоненты 5 и 6 и формуют таблетки. Вес каждой таблетки составляет 1.0 г.

Пример 7: Напиток

Рецептура	Содержание
1. Этанольный экстракт Ganoderma lucidum
(Препарат 6)	1.0 часть
2. Посконник крапиволистный	0.05
3. Яблочная кислота	5.0
4. Корригент	0.1
5. Вода до общего количества	100 частей

[Процесс приготовления]

Растворяют компоненты 2 и 3 в небольшом количестве воды и смешивают компоненты 1, 4 и 5 с раствором.

Далее описываются экспериментальные примеры с целью подробного обсуждения настоящего изобретения.

Эксперимент 1: Тест на ингибирование ММР.

Экстракты грибов Ganoderma подвергают тестированию на ингибирование желатиназной активности методом зимографии с желатином. Готовят 10% SDS-PAGE гель (толщиной 1 мм), содержащий 0.6 мг/мл желатина, и получают 0.014 мл культурального супернатанта клеток В 16 мышиной меланомы, подвергнутых гель-электрофорезу в невосстанавливающих условиях. Затем для удаления SDS гель в течение 30 минут последовательно дважды отмывают 2.5% раствором Тритона Х-100 (Triton X-100, Sigma Chemical Co.) при комнатной температуре и отмытый гель инкубируют в 30 мМ буферном растворе tris-HCl (pH 7.6), содержащем 200 мл хлористого натрия, 5 мМ хлорида кальция и 0.01% brij-35 (Sigma Chemical Co.) при 37°С в течение 24 часов. К буферному раствору, которым пропитан гель, добавляют каждый из следующих экстрактов: водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1), водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) и смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi). По завершении реакции гель окрашивают 0.2% раствором Кумасси бриллиантового голубого R и обесцвечивают раствором 5% метанола-7.5% уксусной кислоты. Желатиназную активность определяют как неокрашенную полосу на окрашенном в голубой цвет геле с помощью денситометра (Atto Densitograph AE-6905, Atto Co.) и рассчитывают скорость ингибирования. Скорость ингибирования (%) рассчитывают по нижеприведенному уравнению (1), исходя из показаний денситометра. Результаты приведены в Таблице 1. Экстракты грибов Ganoderma ингибируют желатиназу, продуцируемую клетками мышиной меланомы В 16, в зависимости от концентрации.

А: Значение, показываемое денситометром, при добавлении экстракта грибов Ganoderma.

В: Значение, показываемое денситометром, без добавления экстракта грибов Ganoderma.

Таблица 1
Образцы	Конечная концентрация реакционного раствора [%]	Скорость ингибирования [%]
S1	0.25	38
	0.50	64
	1.0	99
S2	0.25	9
	0.50	49
	1.0	96
S3	0.25	26
	0.50	58
	1.0	98
S1: Водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1) S2: Водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) S3: Смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi)

Эксперимент 2: Тест на ингибирование ММР.

50% Этанольный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 5), этанольный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 6), 50% этанольный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 5) и этанольный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 3) также подвергаются вышеописанному испытанию. Результаты приведены в Таблице 2. Конечные концентрации этих четырех экстрактов в соответствующих реакционных растворах во всех случаях были чрезвычайно низкими, а именно 0.03%. Однако этанольные экстракты грибов Ganoderma при этой низкой концентрации более эффективно ингибируют желатиназу, продуцируемую клетками В 16 мышиной меланомы, по сравнению с их водными экстрактами.

Таблица 2
Образцы	Конечная концентрация реакционного раствора [%]	Скорость ингибирования [%]
Т1 Т2 Т3 Т4	0.03 0.03 0.03 0.03	67 78 85 96
Т1: 50% Этанольный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 5) Т2: Этанольный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 6) Т3: 50% Этанольный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 2) Т4: Этанольный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 3)

Эксперимент 3: Тест на супрессию (подавление) метастазов рака

Каждый из следующих экстрактов: водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1), водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) и смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi) в количестве 100 мг/кг вводят в брюшную полость одной группе мышей C57BL/6 один раз в день в течение 1 недели. Контрольной группе в брюшную полость вводят физиологический раствор. В этом примере в каждую группу входит 8 мышей. Затем в хвостовую вену каждой мыши инъецируют клетки В 16 мышиной меланомы при плотности 1×10⁵ клеток на мышь. После инъекции продолжают повторное введение каждого образца. Через 3 недели после инокуляции раковых клеток из каждой мыши извлекают легкие и фиксируют в 10%-ном растворе формалина. Фиксированное в формалине легкое делят на 5 долей и считают число гнезд метастазирующих клеток на поверхности долей. Результаты приведены в Таблице 3. Введение экстракта грибов Ganoderma в значительной степени подавляет образование гнезд метастазирующих клеток по сравнению с контрольной группой. Следовательно, экстракт грибов Ganoderma обладает достаточной устойчивостью к метастазированию.

Таблица 3
Образцы	Среднее число гнезд метастазирующих клеток
U1	49
U2	8
U3	25
U4	14
U1: Физиологический раствор U2: Водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1) U3: Водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) U4: Смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi)

Согласно вышеприведенным результатам водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1), водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) и смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi) в весьма значительной степени ингибируют ММР и подавляют метастазирование рака. 50% Этанольные экстракты и этанольные экстракты Ganoderma atrum и Ganoderma lucidum (Reishi) (Препараты 2, 3, 5 и 6) также подвергаются вышеописанному тестированию супрессии. Результаты показывают, что 50% этанольные экстракты и этанольные экстракты этих грибов Ganoderma также в очень значительной степени ингибируют ММР и подавляют метастазирование рака.

Эксперимент 4: Тест на супрессию (подавление) метастазов рака

Питательный корм (продукты питания) для эксперимента готовят, добавляя каждый из порошков 1-4 (Примеры 1-4) по настоящему изобретению, которые содержат, соответственно, водный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 1), 50% этанольный экстракт Ganoderma atrum (Препарат 2), водный экстракт Ganoderma lucidum (Reishi) (Препарат 4) и смесь равных количеств водного экстракта Ganoderma atrum и водного экстракта Ganoderma lucidum (Reishi) с концентрацией 5.0%, в продажный питательный корм (MF для кормления мышей и крыс: Oriental Yeast Co., Ltd.). Группа мышей ест без ограничения соответствующий корм (продукты питания). Другая группа мышей ест без ограничения экспериментальный корм, содержащий 5.0% порошка А (Сравнительный пример 1) без добавления какого-либо экстракта грибов Ganoderma (контрольная группа). В данном примере в каждой группе по 8 мышей. Как и в Эксперименте 2, в данном примере раковые клетки инокулируют через 2 недели после начала кормления питательным кормом с добавкой порошка. Считают число гнезд метастазирующих клеток. Результаты приведены в Таблице 4. Добавление в питательный корм каждого порошка, содержащего экстракт грибов Ganoderma, заметно подавляет образование гнезд метастазирующих клеток по сравнению с контрольной группой (Сравнительный пример). То есть экстракты грибов Ganoderma эффективно подавляют метастазирование рака.

Таблица 4
Образцы	Среднее число гнезд метастазирующих клеток
V1	62
V2	35
V3	33
V4	47
V5	41
V1: Сравнительный пример V2: Порошок 1 (Пример 1) V3: Порошок 2 (Пример 2) V4: Порошок 3 (Пример 3) V5: Порошок 4 (Пример 4)

Все таблетки из Примера 5 и таблетированный корм из Примера 6 размалывают в порошок в ступке. Порошки образцов подвергают вышеописанному испытанию супрессии для порошков. Что касается напитка из Примера 7, то 0.3 мл образца вводят перорально каждой мыши один раз в день через желудочный зонд и изучают действие образца на метастазирование рака. Образцы из Примеров 5-7 также эффективно подавляют метастазирование рака.

Промышленная применимость

Как описано выше, экстракты грибов Ganoderma ингибируют активацию ММР, продуцируемых раковыми клетками, а также подавляют метастазирование рака, связанное с активированными ММР. Ингибитор ММР по данному изобретению, предпочтительно, применим для предупреждения, подавления и симптоматического облегчения различных расстройств и заболеваний, вызываемых активированными ММР, таких как метастазирование рака, язвы, ревматоидный артрит, остеопороз, периодонтит и старение кожи.