соединения на основе пептидов для направленной доставки к рецепторам интегринов

Формула изобретения

1. Соединение общей формулы (I)

или его фармацевтически приемлемая соль,

где G представляет собой глицин,

D представляет собой аспарагиновую кислоту,

R₁ представляет собой -(СН₂)_n- или -(СН₂)_n-С ₆Н₄-,

где n представляет собой положительное целое число от 1 до 10,

h представляет собой положительное целое число 1 или 2,

X₁ представляет собой аминокислотный остаток, причем указанная аминокислота имеет функциональную боковую цепь, такую как амин,

Х₂ и Х₄ независимо представляют собой аминокислотный остаток, способный к образованию дисульфидной связи,

Х₅ представляет собой гидрофобную аминокислоту, представляющую собой фенилаланин,

Х₆ представляет собой , и

X₇ отсутствует или представляет собой биомодифицирующую группировку, состоящую из монодисперсной ПЭГ-подобной структуры,

,

где n равен целому числу от 1 до 10, и где С-концевая единица представляет собой амидную группировку, либо представляющую собой от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Z₁ представляет собой хелатирующий агент или репортерную группировку, и W₁ отсутствует или представляет собой спейсерную группировку, полученную из глутаровой или янтарной кислоты.

2. Соединение по п.1, где любой из аминокислотных остатков находится независимо в D- или L-конформации.

3. Соединение по п.1, где R ¹ представляет собой -(CH₂)-.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где X₁ представляет собой лизин, гомолизин или диаминоалкиловую кислоту или их производные.

5. Соединение по п.1, где X ₂ и Х₄ независимо представляют собой цистеиновый или гомоцистеиновый остаток.

6. Соединение по п.1, где Х₃ представляет собой аргининовый остаток.

7. Соединение по п.1, где Х₇ представляет собой остаток глицина, лизина, аспарагиновой кислоты или серина, предпочтительно глицина.

8. Соединение по п.1, где Z₁ представляет собой хелатирующий агент формулы (III)

,

где R¹ представляет собой С_1-10алкил,

R² и R³ представляют собой атом водорода, и

R⁴ представляет собой С _1-10алкиламин.

9. Соединение по п.1, где Z ₁ содержит репортерную группировку.

10. Соединение по п.9, где репортерная группировка содержит металлические радионуклиды, ионы парамагнитных металлов, ионы флуоресцентных металлов, ионы тяжелых металлов или кластерные ионы.

11. Соединение по пп.9 и 10, где репортерная группировка содержит ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹ In, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶⁷ Cu, ¹⁶⁷Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb, ¹⁴¹ Ce или ¹⁸F.

12. Соединение по п.11, где репортерная группировка представляет собой ^99mTc.

13. Соединение по п.1, определенное следующими формулами

Соединение I

Соединение II

Соединение III

Соединение IV

14. Фармацевтическая композиция, обладающая сродством к v 3 интегрину, содержащая эффективное количество соединения общей формулы (I) или его соли вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым адъювантом, эксципиентом или разбавителем.

15. Применение соединения по любому из пп.1-13 в приготовлении контрастной среды для применения в способе диагностики, при котором указанную контрастную среду вводят в организм человека или животного и генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма.

16. Способ генерирования изображений организма человека или животного, при котором контрастный агент вводят в указанный организм и генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма, в котором указанный контрастный агент распределен, отличающийся тем, что указанный контрастный агент представляет собой соединение по любому из пп.1-13.

17. Способ генерирования улучшенных изображений организма человека или животного, которому предварительно ввели композицию контрастного агента, содержащую соединение по п.1, при котором генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма.

18. Способ мониторинга эффекта лечения организма человека или животного лекарством для борьбы с состоянием, ассоциированным с раком, при котором в указанный организм вводят соединение или композицию по любому из пп.1-14 и осуществляют детекцию поглощения указанного соединения или композиции клеточными рецепторами, причем указанные введение и детекцию возможно, но предпочтительно, осуществляют многократно, например до, во время и после лечения указанными соединением или композицией.

19. Применение соединения по любому из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства, обладающего сродством к v 3 интегрину.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым соединениям на основе пептидов и их применению в терапевтически эффективном лечении, а также для методик диагностической визуализации. Более конкретно данное изобретение относится к применению таких соединений на основе пептидов в качестве направляющих векторов, которые связываются с рецепторами, ассоциированными с ангиогенезом, в частности рецепторами интегринов, например рецептором интегрина v 3. Такие контрастные агенты могут, таким образом, быть использованы для диагностики, например, злокачественных заболеваний, болезней сердца, эндометриоза, заболеваний, относящихся к воспалительным, ревматоидного артрита и саркомы Калоши. Более того, такие агенты могут быть использованы при терапевтическом лечении этих заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Новые кровеносные сосуды могут образовываться с помощью двух различных механизмов: васкулогенеза или ангиогенеза. Ангиогенез представляет собой образование новых кровеносных сосудов путем ответвления от существующих сосудов. Первичным стимулом для этого процесса может быть неадекватная доставка питательных веществ и кислорода (гипоксия) к клеткам ткани. Клетки могут отвечать путем секреции ангиогенных факторов, которых существует множество; один пример, на который часто ссылаются, представляет собой сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Эти факторы инициируют секрецию протеолитических ферментов, которые разрушают белки базальной мембраны, а также ингибиторов, которые ограничивают действие этих потенциально вредных ферментов. Другим известным эффектом ангиогенных факторов является то, что они вызывают миграцию и деление эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки, которые прикреплены к базальной мембране, которая образует непрерывный слой вокруг кровеносных сосудов на контралюменальной стороне, не подвергаются митозу. Объединенным эффектом ослабления прикрепления и сигналов от рецепторов для ангиогенных факторов заключается в том, чтобы вызывать движение, размножение эндотелиальных клеток и их перегруппировку и, наконец, синтез базальной мембраны вокруг новых сосудов.

Ангиогенез является заметным при росте и реконструкции тканей, включая заживление раны и воспалительные процессы. Опухоли должны инициировать ангиогенез, когда они достигают миллиметрового размера, для того чтобы поддерживать свою скорость роста. Ангиогенез сопровождается характерными изменениями в эндотелиальных клетках и их окружении. Поверхность этих клеток реконструируется при подготовке к миграции, и криптические структуры обнажаются, когда базальная мембрана разрушается, в дополнение к множеству белков, которые вовлечены в осуществление и регуляцию протеолиза. В случае опухолей получающаяся сеть кровеносных сосудов обычно беспорядочна, с образованием острых узлов, а также артериовенозных шунтов. Подавление ангиогенеза также считается многообещающей стратегией для противоопухолевой терапии. Трансформации, сопровождающие ангиогенез, также очень многообещающи для диагностики, очевидным примером является злокачественное заболевание, однако данная концепция также дает большие надежды при воспалении и множестве заболеваний, относящихся к воспалительным, включая атеросклероз, причем макрофаги ранних атеросклеротических повреждений являются потенциальными источниками ангиогенных факторов. Эти факторы также вовлечены в реваскуляризацию омертвевших частей миокарда, что происходит, если стеноз развивается в течение короткого времени.

Дополнительные примеры нежелательных состояний, которые связаны с неоваскуляризацией или ангиогенезом, развитием или пролиферацией новых кровеносных сосудов показаны ниже. Ссылка также сделана в этом отношении на WO 98/47541.

Заболевания и показания, ассоциированные с ангиогенезом, представляют собой, например, различные формы рака и метастазирования, например рак груди, кожи, ободочной и прямой кишки, поджелудочной железы, простаты, легкого или яичника.

Другие заболевания и показания представляют собой воспаление (например хроническое), атеросклероз, ревматоидный артрит и гингивит.

Дополнительные заболевания и показания, ассоциированные с ангиогенезом, представляют собой артериовенозные образования, астроцитомы, хориокарциномы, глиобластомы, глиомы, гемангиомы (детские, капиллярные), гепатомы, гиперпластический эндометрий, ишемический миокард, эндометриоз, саркому Капоши, дегенерацию желтого пятна, меланому, нейробластомы, окклюзионное заболевание периферической артерии, остеоартрит, псориаз, ретинопатию (диабетическую, пролиферативную), склеродерму, семиномы и язвенный колит.

В ангиогенез вовлечены рецепторы, которые уникальны для эндотелиальных клеток и окружающих тканей. Эти маркеры включают в себя рецепторы факторов роста, такие как VEGF-рецепторы, и рецепторы семейства интегринов. Иммуногистохимические исследования продемонстрировали, что множество интегринов, возможно, наиболее важно _v-класс, экспрессируется на апикальной поверхности кровеносных сосудов [Conforti, G., et al. (1992) Blood 80: 37-446] и они доступны в качестве мишени для циркулирующих лигандов [Pasqualini, R., et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 542-546]. Кроме того, 5 1 представляет собой важный интегрин в стимуляции сборки фибронектинового матрикса и инициации прикрепления клетки к фибронектину. Он также играет существенную роль в клеточной миграции [Bauer, J.S., (1992) J. Cell Biol. 116: 477-487], а также инвазии опухоли и метастазировании [Gehlsen, К. R., (1988) J. Cell Biol. 106:925-930].

Интегрин v 3 является одним из рецепторов, про которые известно, что они связаны с ангиогенезом. Стимулированные эндотелиальные клетки, по-видимому, зависят от этого рецептора для выживания во время критического периода ангиогенного процесса, поскольку антагонисты взаимодействия рецептор интегрина v 3/лиганд индуцируют апоптоз и подавляют рост кровеносных сосудов.

Интегрины представляют собой гетеродимерные молекулы, в которых - и -субъединицы пронизывают липидный бислой клеточной мембраны, -субъединица имеет четыре Са²⁺-связывающих домена на своей внеклеточной цепи, а -субъединица имеет ряд внеклеточных доменов, обогащенных цистеином.

Многие лиганды (например фибронектин), вовлеченные в клеточную адгезию, содержат трипептидную последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD). RGD-последовательность, по-видимому, действует как сайт первичного распознавания между лигандами, представляющими эту последовательность, и рецепторами на поверхности клеток. Обычно считается, что вторичные взаимодействия между лигандом и рецептором усиливают специфичность взаимодействия. Эти вторичные взаимодействия могут иметь место между группировками лиганда и рецептора, которые непосредственно примыкают к RGD-последовательности, или в сайтах, которые находятся на отдалении от RGD-последовательности.

Известно, что RGD-пептиды связываются с рядом рецепторов интегринов и имеют возможность регулировать множество клеточных событий важного применения в клинических условиях. (Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87: 1-5 (1991)). Возможно, наиболее широко изученный эффект RGD-пептидов и их миметиков связан с их применением в качестве противотромботических агентов, когда их мишенью является интегрин тромбоцитов Gpllbllla.

Подавление ангиогенеза в тканях путем введения либо v 3-, либо v 5 - антагониста, было описано, например, в WO 97/06791 и WO 95/25543, с использованием либо антител, либо RGD-содержащих пептидов. В ЕР 578083 описан ряд моноциклических RGD-содержащих пептидов, а в WO 90/14103 заявлены RGD-антитела. Haubner et al. в J. Nucl. Med. (1999); 40: 1061-1071 описывают новый класс меток для нацеливания на опухоли на основе моноциклических RGD-содержащих пептидов. Исследования по биораспределению с использованием авторадиографической визуализации всего организма выявили, однако, что ¹²⁵I-меченные пептиды имеют очень высокие степени клиренса из крови и преимущественно гепатобилиарные пути выведения, что приводит к высокому фону.

Циклические RGD-пептиды, содержащие множественные мостики, также описаны в WO 98/54347 и WO 95/14714. Пептиды, полученные от in vivo биопэннинга (WO 97/10507), были использованы для разнообразных применений направленной доставки. Последовательность CDCRGDCFC (RGD-4С) была использована для направленной доставки лекарств, таких как доксирубицин (WO 98/10795), нуклеиновые кислоты и аденовирусы, к клеткам (смотри WO 99/40214, WO 99/39734, WO 98/54347, WO 98/54346, US 5846782). Пептиды, содержащие множество цистеиновых остатков, действительно, однако, имеют недостаток, заключающийся в том, что может существовать множество дисульфидных изомеров. Пептид с 4 цистеиновыми остатками, такой как RGD-4C, имеет возможность образования 3 различных дисульфидных форм складчатой структуры. Изомеры будут иметь разное сродство к рецептору интегринов, поскольку RGD-фармакофор усилен в 3 различных конформациях.

Дополнительные примеры соединений на основе RGD-содержащих пептидов найдены в PCT/NO01/00146 и PCT/NO01/00390, содержание которых включено в данное описание путем ссылки.

Эффективная направленная доставка и визуализация рецепторов интегринов, связанных с ангиогенезом in vivo, требует, таким образом, селективного вектора на основе RGD с высоким сродством, который химически устойчив и стабилен. Более того, путь выведения является важным фактором при разработке агентов для визуализации, для того чтобы уменьшить проблемы с фоном. Этим строгим условиям удовлетворяют бициклические структуры, описанные в настоящем изобретении.

Описание изобретения

С точки зрения одного аспекта данного изобретения предложены новые соединения на основе пептидов формулы I, как определено в формуле изобретения. Эти соединения обладают сродством к рецепторам интегринов, например сродством к интегрину v 3.

Соединения формулы I содержат по меньшей мере два мостика, где один мостик образует дисульфидную связь, а второй мостик представляет собой тиоэфирную (сульфидную) связь и где эти мостики способствуют укладке пептидной группировки в «гнездовую» конфигурацию.

Соединения по настоящему изобретению имеют, таким образом, максимум один дисульфидный мостик на молекулярную группировку. Соединения, определенные настоящим изобретением, неожиданно являются стабильными in vivo и в условиях, используемых во время мечения, например во время мечения технецием.

Эти новые соединения могут быть использованы в терапевтически эффективном лечении, а также для целей визуализации.

Новые соединения на основе пептидов, описанные в настоящем изобретении, определены формулой I:

или их физиологически приемлемые соли,

где G представляет собой глицин,

D представляет собой аспарагиновую кислоту,

R₁ представляет собой -(СН ₂)n- или -(СН₂)n-С ₆Н₄-, предпочтительно R ₁ представляет собой -(СН₃)-,

n представляет собой положительное целое число от 1 до 10,

h представляет собой положительное целое число 1 или 2,

X₁ представляет собой аминокислотный остаток, причем указанная аминокислота имеет функциональную боковую цепь, такую как кислота или амин, предпочтительно аспарагиновая или глутаминовая кислота, лизин, гомолизин, диаминоалициклическая кислота или диаминопропионовая кислота,

Х ₂ и Х₄ независимо представляют собой аминокислотный остаток, способный к образованию дисульфидной связи, предпочтительно цистеиновый или гомоцистеиновый остаток,

Х₃ представляет собой аргинин, N-метиларгинин или миметик аргинина, предпочтительно аргинин,

Х ₅ представляет собой гидрофобную аминокислоту или ее производные, предпочтительно тирозин, фенилаланин, 3-иод-тирозин или нафтилаланиновый остаток, и более предпочтительно фенилаланин или 3-иод-тирозиновый остаток,

Х₆ представляет собой тиол-содержащий аминокислотный остаток, предпочтительно цистеиновый или гомоцистеиновый остаток,

Х₇ отсутствует или представляет собой гомогенную биомодифицирующую группировку, предпочтительно на основе монодисперсного полиэтиленгликолевого (ПЭГ) структурного элемента, содержащего от 1 до 10 единиц указанного структурного элемента, причем указанный биомодификатор имеет функцию модификации фармакокинетики и степеней клиренса из крови указанных агентов. В дополнение Х₇ может также представлять собой от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно глицин, лизин, аспарагиновую кислоту или серин. В предпочтительном воплощении данного изобретения Х₇ представляет собой биомодифицирующую единицу, составленную из полимеризации монодисперсной ПЭГ-подобной структуры, 17-амино-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановую кислоту формулы II

где n равен целому числу от 1 до 10, и где С-концевая единица представляет собой амидную группировку,

W ₁ отсутствует или представляет собой спейсерную группировку и предпочтительно получен из глутаровой и/или янтарной кислоты и/или единицы на основе полиэтиленгликоля, и/или единицы формулы II

Z₁ представляет собой антинеопластический агент, хелатирующий агент или репортерную группировку, которая может быть представлена хелатирующим агентом формулы III

где каждый R¹, R ², R³ и R⁴ независимо представляет собой группу R;

каждая группа R независимо представляет собой Н или С_1-10 алкил, С_3-10алкиларил, С _2-10алкоксиалкил, С_1-10гидроксиалкил, С_1-10алкиламин, C_1-10 фторалкил, либо 2 или более чем 2 группы R вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют карбоциклическое гетероциклическое насыщенное или ненасыщенное кольцо,

либо может представлять собой хелатирующий агент, представленный формулами а, b, с и d

Предпочтительный пример хелатирующего агента представлен формулой е

Конъюгаты, содержащие хелатирующие агенты формулы III, могут быть меченными радиоактивным изотопом с получением хорошей радиохимической чистоты, RCP, при комнатной температуре, в водных условиях при почти нейтральном рН. Риск раскрытия дисульфидных мостиков пептидного компонента при комнатной температуре меньше, чем при повышенной температуре. Дополнительным преимуществом введения радиоактивного мечения конъюгатов при комнатной температуре является упрощенная процедура в клинической фармацевтике.

Роль спейсерной группировки W₁ заключается в дистанцировании относительно объемного хелатирующего агента от активного сайта пептидного компонента. Спейсерная группировка W₁ также применима для дистанцирования объемного антинеопластического агента от активного сайта пептида.

Обнаружено, что биомодификатор X₇ модифицирует фармакокинетику и степени клиренса из крови указанных соединений. Биомодификатор осуществляет меньший захват соединений в ткани, то есть мышце, печени и так далее, таким образом давая возможность лучшей диагностической визуализации вследствие меньшей фоновой интерференции. Секреция осуществляется главным образом через почки благодаря дополнительному преимуществу биомодификатора.

Однако соединения, определенные формулой I, могут также содержать хелатирующие агенты, Z1, как определено в Таблице I.

В некоторых аспектах данного изобретения Z₁ представляет собой репортерную группировку, причем указанная репортерная группировка содержит радионуклид. Дополнительные определения хелатирующих агентов перечислены в следующей ниже Таблице I.

Таблица I
Класс лиганда	Структура	Определения
Аминоксим		Y1-8 может представлять собой Н, алкил, арил или их комбинации, и Y4 или Y5 содержит подходящую функциональную группу, такую чтобы она могла быть конъюгирована с пептидным вектором, например предпочтительно алкиламин, алкилсульфид, алкокси, алкилкарбоксилат, ариламин, арилсульфид или -галогеноацетил, Х=С или N, когда m'=n'=1, Х=N, когда m'=n'=2
МАО3-тип		Р=защитная группа (предпочтительно бензоил, ацетил, ЕОЕ); Y1, Y 2 содержит подходящую функциональную группу, такую чтобы она могла быть конъюгирована с пептидным вектором; предпочтительно Н (MAG 3), либо боковая цепь любой аминокислоты, либо в L-, либо в D-форме

Класс лиганда	Структура	Определения
Лиганды G4-типа		Y1, Y 2, Y3 содержит подходящую функциональную группу, такую чтобы она могла быть конъюгирована с пептидным вектором; предпочтительно Н, либо боковая цепь любой аминокислоты, либо в L-, либо в D-форме
Тетрааминовые лиганды		Y1-6 может представлять собой Н, алкил, арил или их комбинации, где группы Y 1-6 содержат одну или более чем одну функциональную группировку, такую чтобы хелат мог быть конъюгирован с вектором, например, предпочтительно алкиламин, алкилсульфид, алкокси, алкилкарбоксилат, ариламин, арилсульфид или -галогеноацетил
Лиганды цилам-типа		Y1-5 может представлять собой Н, алкил, арил или их комбинации и где группы Y 1-5 содержат одну или более чем одну функциональную группировку, так чтобы хелат мог быть конъюгирован с вектором, например, предпочтительно алкиламин, алкилсульфид, алкокси, алкилкарбоксилат, ариламин, арилсульфид или -галогеноацетил

Класс лиганда	Структура	Определения
Диаминдифенол		Y1, Y 2 -Н, алкил, арил, где группы Y 1 или Y2 содержат функциональную группировку, так чтобы хелат мог быть конъюгирован с вектором, например, предпочтительно алкиламин, алкилсульфид, алкокси, алкилкарбоксилат, ариламин, арилсульфид или -галогеноацетил; W=С, N; m'=n'=1 или 2
HYNIC		V=линкер к вектору или вектор сам по себе
Амидтиолы		Р=защитная группа (предпочтительно бензоил, ацетил, ЕОЕ); Y1-5=Н, алкил, арил; либо Y3 представляет собой боковую цепь L-или D-аминокислоты либо глицин, и карбоксилат может быть использован для конъюгации с вектором через амидную связь. Альтернативно R1-5 группы могут содержать дополнительную функциональную группу, так чтобы хелат мог быть конъюгирован с вектором, например, алкиламин, алкилсульфид, алкокси, алкилкарбоксилат, ариламин, арилсульфид или -галогеноацетил

В некоторых аспектах данного изобретения группировка Z₁ формулы I содержит связь с ¹⁸F-изотопом или изотопом Cu, включенным в этот агент либо в качестве простетической группы, либо путем реакций замещения или присоединения. Полученное соединение может, таким образом, быть использовано при визуализации позитронно-эмиссионной томографией (PET).

В одном аспекте настоящего изобретения Z₁ формулы I представлен антинеопластическим агентом. В этом аспекте соединение будет иметь в качестве мишени ангиогенный сайт, ассоциированный с раком, и доставлять этот антинеопластический агент к больной области.

Антинеопластический агент может быть представлен циклофосфамидом, хлорамбуцилом, бусульфаном, метотрексатом, цитарабином, фторурацилом, винбластином, паклитакселем, доксорубицином, даунорубицином, этопозидом, тенипозидом, цисплатином, амсакрином, доцетакселем, при этом широкий диапазон других антинеопластических агентов также может быть использован.

Пептидный компонент конъюгатов, описанных здесь, предпочтительно не имеет свободных амино- или карбокси-концов. Это придает данным соединениям значительное увеличение устойчивости против ферментативного разрушения, и, как результат, они обладают повышенной стабильностью in vivo по сравнению со многими известными свободными пептидами.

Термин "аминокислота", как он использован здесь, относится в его самом широком смысле к протеогенным L-аминокислотам, D-аминокислотам, химически модифицированным аминокислотам, миметикам N-метил, С -метил и боковой цепи аминокислот, и синтетическим аминокислотам, таким как нафтилаланин. Любая встречающаяся в природе аминокислота или миметики таких встречающихся в природе аминокислот являются предпочтительными.

Некоторые предпочтительные воплощения соединений формулы I проиллюстрированы ниже соединениями I-IV:

Соединение I

Соединение II

Соединение III

Соединение IV

В большинстве случаев предпочтительно, чтобы аминокислоты в пептиде все были в L-форме. Однако в некоторых воплощениях данного изобретения одна, две, три или более аминокислот в пептиде предпочтительно находятся в D-форме. Включение таких D-форм аминокислот может оказывать значительный эффект на стабильность соединения в сыворотке. В соответствии с настоящим изобретением любой из аминокислотных остатков, как определено в формуле I, может предпочтительно представлять собой встречающуюся в природе аминокислоту и независимо в любой из D-или L-конформаций.

Некоторые из соединений по данному изобретению представляют собой вектора с высоким сродством на основе RGD. Термин "вектор с высоким сродством на основе RGD", как он использован здесь, относится к соединениям, которые обладают Ki <10 нМ и предпочтительно <5 нМ, в анализе конкурентного связывания для интегрина v 3, и где величину Ki определяли путем сравнения с известным лигандом эхистатином с высоким сродством. Способы осуществления таких конкурентных анализов хорошо известны в данной области техники.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество (например, количество, эффективное для улучшения контраста изображения при in vivo визуализации) соединения общей формулы I или его соли вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым адъювантом, эксципиентом или разбавителем.

В данном изобретении дополнительно предложена фармацевтическая композиция для лечения заболевания, содержащая эффективное количество соединения общей формулы I или его соли присоединения кислоты вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым адъювантом, эксципиентом или разбавителем.

Другие репрезентативные спейсерные (Wi) элементы включают в себя полисахариды структурного типа, полисахариды запасающего типа, полиаминокислоты и их метиловые и этиловые эфиры, а также полипептиды, олигосахариды и олигонуклеотиды, которые могут содержать или могут не содержать сайты ферментативного расщепления.

Репортерные группировки (Z₁) в контрастных агентах по данному изобретению могут представлять собой любую группировку, способную к обнаружению либо непосредственно, либо опосредованно в процедуре диагностической визуализации in vivo. Предпочтительно контрастный агент содержит один репортер. Предпочтительны группировки, которые испускают или которые могут быть причиной испускания обнаружимого излучения (например путем радиоактивного распада).

Для магнитно-резонансной (МР) визуализации репортер должен либо представлять собой изотоп с ненулевым моментом ядра (такой как ¹⁹ F), либо материал, имеющий неспаренные электронные спины и, следовательно, парамагнитные, суперпарамагнитные, ферримагнитные или ферромагнитные свойства; для световой визуализации репортер должен представлять собой светорассеиватель (например окрашенную или неокрашенную частицу), светопоглотитель или светоизлучатель; для магнитометрической визуализации репортер должен иметь обнаружимые магнитные свойства; для визуализации электрического импеданса репортер должен обладать электрическим импедансом; и для гамма-топографии, SPECT (однофотонной эмиссионной компьютерной томографии), PET (позитронно-эмиссионной томографии) и тому подобного репортер должен представлять собой радионуклид.

Говоря в целом, репортер может представлять собой (1) хелатируемый металл или полиатомный металлсодержащий ион (то есть ТсО, и так далее), где металл представляет собой металл с высоким атомным числом (например атомным числом более 37), парамагнитный вид (например переходный металл или лантанид) или радиоактивный изотоп, (2) ковалентно-связанный неметаллический вид, который представляет собой неспаренный электронный сайт (например кислород или углерод в устойчивом свободном радикале), неметалл с высоким атомным числом, или радиоизотоп, (3) полиатомный кластер или кристалл, содержащий атомы с высоким атомным числом, отображающий кооперативное магнетическое поведение (например суперпарамагнетизм, ферримагнетизм или ферромагнетизм) или содержащий радионуклиды.

Примеры конкретных предпочтительных репортерных групп (Z₁) описаны более подробно ниже.

Хелатируемые металлы-репортеры предпочтительно выбраны из следующей группы: ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹In, ⁴⁷ Sc, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶⁷Cu, ¹⁶⁷ Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb и ¹⁴¹Ce.

Ионы металлов желательно хелатированы хелаторными группами на линкерной группировке. Дополнительные примеры подходящих хелаторных групп описаны в US-A-4647447, WO 89/00557, US-A-5367080, US-A-5364613.

Способы металлирования любых хелатирующих агентов находятся в пределах уровня знаний специалиста в данной области техники. Металлы могут быть включены в хелаторную группировку с помощью любого из трех общих способов: прямое включение, матричный синтез и/или переметаллирование. Прямое включение является предпочтительным.

Таким образом, желательно, чтобы ион металла легко образовывал комплекс с хелатирующим агентом, например, путем простого воздействия или смешивания водного раствора группировки, содержащей хелатирующий агент, с солью металла в водном растворе, предпочтительно имеющем рН в диапазоне от примерно 4 до примерно 11. Данная соль может представлять собой любую соль, но предпочтительно данная соль представляет собой растворимую в воде соль металла, такую как, например, галогенид, и более предпочтительно такие соли выбраны так, чтобы они не препятствовали связыванию иона металла с хелатирующим агентом.

Группировка, содержащая хелатирующий агент, предпочтительно находится в водном растворе при рН между примерно 5 и примерно 9, более предпочтительно между рН примерно 6 и примерно 8. Группировка, содержащая хелатирующий агент, может быть смешана с буферными солями, такими как цитрат, карбонат, ацетат, фосфат и борат, для получения оптимального рН. Предпочтительно буферные соли выбраны таким образом, чтобы они не препятствовали последующему связыванию иона металла с хелатирующим агентом.

Следующие изотопы или пары изотопов могут быть использованы как для визуализации, так и для терапии, без необходимости изменения методологии радиоактивного мечения или хелатора: ⁴⁷Sc ₂₁, ¹⁴¹Ce₅₈ , ¹⁸⁸Re₇₅, ¹⁷⁷Lu₇₁, ¹⁹⁹ Au₇₉, ⁴⁷Sc ₂₁, ¹³¹I₅₃, ⁶⁷Cu₂₉, ¹³¹I₅₃ и ¹²³ I₅₃, ¹⁸⁸Re ₇₅ и ^99mTc₄₃ , ⁹⁰Y₃₉ и ⁸⁷Y₃₉, ⁴⁷Sc ₂₁ и ⁴⁴Sc₂₁ , ⁹⁰Y₃₉ и ¹²³I₅₃, ¹⁴⁶ Sm₆₂, и ¹⁵³Sm ₆₂, и ⁹⁰Y₃₉ и ¹¹¹In₄₉.

Предпочтительные неметаллические атомные репортеры включают в себя радиоизотопы, такие как ¹²³I, ¹³¹I и ¹⁸F, а также атомы с ненулевым моментом ядра, такие как ¹⁹F, и тяжелые атомы, такие как I.

В дополнительном воплощении данного изобретения применение радиоизотопов иода или фтора рассматривается особо. Например, если пептид или линкер состоит из заместителей, которые могут быть химически замещены иодом или фтором в реакции образования ковалентной связи, таких как, например, заместители, содержащие гидроксифенильную или пара-нитробензоильную функциональную группировку, такие заместители могут быть мечены способами, хорошо известными в данной области техники, радиоизотопом иода или фтора соответственно. Эти виды могут быть использованы в терапевтическом применении и в применении для диагностической визуализации. Однако в то же время металл, присоединенный к хелатирующему агенту на том же самом пептиде-линкере, может быть также использован либо в терапевтическом применении, либо в применении для диагностической визуализации.

Предпочтительное воплощение данного изобретения относится к агенту общей формулы (I), меченному радиоактивным изотопом, особенно для применения при визуализации опухоли.

Диагностические агенты по данному изобретению можно вводить пациентам для визуализации в количествах, достаточных для получения желаемого контраста с помощью конкретной методики визуализации. Когда репортер представляет собой металл, обычно дозировки от 0,001 до 5,0 ммоль хелатируемого иона металла для визуализации на килограмм массы тела пациента, являются эффективными для достижения адекватных улучшений контраста. Когда репортер представляет собой радионуклид, дозировки от 0,01 до 100 мКю, предпочтительно от 0,1 до 50 мКю, обычно должны быть достаточны на 70 кг массы тела.

Дозировка соединений по данному изобретению для терапевтического применения будет зависеть от состояния, которое лечат, но в общем должна быть порядка от 1 пмоль/кг до 1 ммоль/кг массы тела.

Соединения по данному изобретению могут, следовательно, быть приготовлены в виде препаратов для введения с использованием физиологически приемлемых носителей или эксципиентов способом, известным в данной области техники. Например, соединения, возможно, с добавлением фармацевтически приемлемых эксципиентов, могут быть суспендированы или растворены в водной среде, с последующей стерилизацией полученного раствора или суспензии.

Соединения формулы (I) могут быть терапевтически эффективными при лечении болезненных состояний, а также обнаружимыми при in vivo визуализации. Таким образом, например, вектор на репортерных группировках может обладать терапевтической эффективностью, например, благодаря радиотерапевтическому эффекту радионуклидного репортера векторной группировки.

Таким образом, применение соединений формулы 1 в производстве терапевтических композиций (лекарственного средства) и в способах терапевтического или профилактического лечения, предпочтительно лечения рака, организма человека или животного, рассматриваются в качестве дополнительных аспектов данного изобретения.

Дополнительные примеры репортеров, которые могут быть использованы в контексте настоящей заявки, даны на страницах 63-66 и 70-86 W098/47541, и описания, сделанные на этих страницах, включены здесь путем ссылки во всей полноте. Таким образом, утверждается, что каждый и любой репортер или его часть, раскрытые на вышеупомянутых страницах, считают частью описания изобретения, содержащегося в данной заявке.

С точки зрения дополнительного аспекта данного изобретения предложено применение соединения формулы I для производства контрастной среды для применения в способе диагностики, при котором указанную контрастную среду вводят в организм человека или животного и генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма.

С точки зрения еще одного дополнительного аспекта данного изобретения предложен способ генерирования изображения организма человека или животного, при котором контрастный агент вводят в указанный организм, например в сосудистую систему, и генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма, в котором указанный контрастный агент распределен с использованием гамма-топографии, PET или SPECT модальностей, причем в качестве указанного контрастного агента используют агент формулы I.

С точки зрения еще одного дополнительного аспекта данного изобретения предложен способ генерирования улучшенных изображений организма человека или животного, которому предварительно ввели композицию контрастного агента, содержащую соединение формулы I, при котором генерируют изображение по меньшей мере части указанного организма.

С точки зрения еще одного дополнительного аспекта данного изобретения предложен способ мониторинга эффекта лечения организма человека или животного лекарством для борьбы с состоянием, ассоциированным с раком, предпочтительно ангиогенезом, например цитотоксическим агентом, при котором в указанный организм вводят агент формулы I и осуществляют детекцию поглощения указанного агента клеточными рецепторами, предпочтительно рецепторами эндотелиальных клеток, и в частности v 3-рецепторами, причем указанные введение и детекцию возможно, но предпочтительно, осуществляют многократно, например до, во время и после лечения указанным лекарством.

Соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием всех известных способов химического синтеза, но особенно полезна твердофазная методология по Меррифилду, использующая автоматический пептидный синтезатор (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964)). Пептиды и пептидные хелаты могут быть очищены с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии и аналитической ВЭЖХ перед тестированием в in vitro отборе.

Настоящее изобретение далее будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не являются ограничивающими.

Пример 1:

Синтез дисульфида [Cys^2-6 ] тиоэфира цикло[СН₂СО-Lys(сРn216-глутарил)-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH ₂

1а) синтез сРn216 хелата

Для деталей синтеза хелата технеция сРn216 смотри заявку GB0116815.2.

1б) синтез промежуточного соединения сРn216-глутаровой кислоты

cPn216 (100 мг, 0,29 ммоль) растворяли в диметилформамиде (ДМФ) (10 мл) и добавляли порциями глутаровый ангидрид (33 мг, 0,29 ммоль) при перемешивании. Реакционную смесь перемешивали в течение 23 часов для получения полного превращения в желаемый продукт. Чистую кислоту получили после ВЭЖХ с обращенной фазой с хороший выходом.

1в) синтез тетрафтортиофенилового эфира сРn216-глутаровой кислоты

К сРn216-глутаровой кислоте (300 мг, 0,66 ммоль) в ДМФ (2 мл) добавляли HATU (249 мг, 0,66 ммоль) и NMM (132 мкл, 1,32 ммоль). Смесь перемешивали в течение 5 минут, затем добавляли тетрафтортиофенол (TFTP) (0,66 ммоль, 119 мг). Раствор перемешивали в течение 10 минут, затем реакционную смесь разбавляли 20% ацетонитрилом в воде (8 мл) и продукт очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, получая 110 мг желаемого продукта после замораживания-высушивания.

1г) синтез CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH ₂

Пептид синтезировали на ABI 433A автоматическом пептидном синтезаторе, начиная с Rink Amide AM смолы, на 0,25 ммоль шкале, с использованием 1 ммоль аминокислотных картриджей. Аминокислоты предварительно активировали с использованием HBTU перед сочетанием. N-концевые аминогруппы подвергали хлорацетилированию с использованием раствора хлоруксусного ангидрида в ДМФ в течение 30 минут.

Одновременное удаление пептида и защитных групп боковой цепи (за исключением tBu) со смолы осуществляли в TFA-содержащем TIS (5%), Н₂O (5%) и феноле (2,5%) в течение двух часов.

После обработки получили 295 мг неочищенного пептида (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=CH ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,42 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1118,5, обнаружено при 1118,6).

1д) синтез тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH ₂

295 мг CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-NH ₂ растворяли в воде/ацетонитриле. Значение рН смеси доводили до рН 8 раствором аммиака и перемешивали в течение 16 часов.

После обработки получили 217 мг неочищенного пептида (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н ₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,18 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1882,5, обнаружено при 1882,6).

1е) синтез дисульфида [Cys ^2-6] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH ₂

217 мг тиоэфира цикло[CH₂ CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-NH ₂ обрабатывали раствором анизола (500 мкл), ДМСО (2 мл) и TFA (100 мл) в течение 60 минут, после чего TFA удаляли в вакууме и пептид осаждали путем добавления диэтилового эфира.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 10 мкл С 18 (2) колонка 250×50 мм) неочищенного материала (202 мг) осуществляли с использованием 0-30% В, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, в течение 60 минут при скорости потока 50 мл/мин. После лиофилизации получили 112 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=CH₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 5,50 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 968, обнаружено при 971).

1ж) синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys(cPn216-глутарил)-Cys² _-Arq-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH ₂

9,7 мг дисульфида [Cys^2-6 ] тиоэфира цикло[СН₂СО-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-NH ₂, 9,1 мг cPn216 хелата активного эфира и 6 мкл N-метилморфолина растворяли в ДМФ (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов.

Очистку реакционной смеси путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 10 мкл С18 (2) колонка 250×21,20 мм) осуществляли с использованием 0-30% В, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, в течение 40 минут при скорости потока 10 мл/мин. После лиофилизации получили 5,7 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 0-30% В в течение 10 минут, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 7,32 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1407,7, обнаружено при 1407,6).

Пример 2:

Синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[СН₂СО-Lys(сРn216-глутарил)-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=1

2а) синтез 17-(Fmoc-амино)-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановой кислоты

Этот структурный элемент связывали с твердой фазой с использованием Fmoc-химии. Связанную форму этого структурного элемента будут называть в краткой форме как (ПЭГ) _n, где n представляет собой положительное целое число.

1.11-Диазидо-3,6,9-триоксаундекан

Раствор сухого тетраэтиленгликоля (19,4 г, 0,100 моль) и метансульфонилхлорида (25,2 г, 0,220 моль) в безводном ТГФ (100 мл) хранили в атмосфере аргона и охлаждали до 0°С в бане лед/вода. В колбу добавляли по каплям в течение 45 минут раствор триэтиламина (22,6 г, 0,220 моль) в безводном ТГФ (25 мл). Через 1 час охлаждающую баню удаляли и перемешивание продолжали в течение 4 часов. Добавляли воду (60 мл). К данной смеси добавляли гидрокарбонат натрия (6 г, до рН 8) и азид натрия (14,3 г, 0,220 ммоль) в таком порядке. ТГФ удаляли путем перегонки и водный раствор кипятили с обратным холодильником в течение 24 часов (образовывалось два слоя). Смесь охлаждали и добавляли эфир (100 мл). Водную фазу насыщали хлоридом натрия. Фазы разделяли и водную фазу экстрагировали эфиром (4×50 мл). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором (2×50 мл) и сушили (MgSO₄). Фильтрованием и концентрированием получили 22,1 г (91%) желтого масла. Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

11-Азидо-3,6,9-триоксаундеканамин

К механически энергично перемешиваемой суспензии 1,11-диазидо-3,6,9-триоксаундекана (20,8 г, 0,085 моль) в 5%-ной соляной кислоте (200 мл) добавляли раствор трифенилфосфина (19,9 г, 0,073 моль) в эфире (150 мл) в течение 3 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 24 часов. Фазы разделяли и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (3×40 мл). Водную фазу охлаждали в бане лед/вода и рН доводили до значения примерно 12 путем добавления КОН. Продукт экстрагировали в дихлорметан (5×50 мл). Объединенные органические фазы сушили (MgSO ₄). Фильтрованием и упариванием получили 14,0 г (88%) желтого масла. Анализ с помощью MALDI-TOF масс-спектроскопии (матрица: -циано-4-гидроксикоричная кислота) показал наличие М+Н пика при 219, как ожидалось. Дальнейшая характеристика с использованием H₁ (500 МГц) и ¹³ С (125 МГц) ЯМР-спектроскопии подтвердила данную структуру.

17-Азидо-5-оксо-6-аза-3.9.12.15-тетраоксагептадекановая кислота

К раствору 11-азидо-3,6,9-триоксаундеканамина (10,9 г, 50,0 ммоль) в дихлорметане (100 мл) добавляли дигликолевый ангидрид (6,38 г, 55,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. ВЭЖХ-анализ (колонка Vydac 218TP54; растворители: А=вода/0,1% TFA, и В=ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 4-16% В в течение 20 минут; скорость потока 1,0 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 284 нм) показал полное превращение исходного материала в продукт с временем удерживания 18,3 мин. Раствор концентрировали с получением количественного выхода желтого сиропа. Продукт анализировали с помощью ЖХ-МС (ES (электроспрей) ионизация), с получением [МН]+ при 335, как ожидалось. ¹Н (500 МГц) и ¹³С (125 МГц) ЯМР-спектроскопия подтвердила данную структуру. Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

17-Амино-5-оксо-6-аза-3.9.12.15-тетраоксагептадекановая кислота

Раствор 17-азидо-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановой кислоты (8,36 г, 25,0 ммоль) в воде (100 мл) восстанавливали с использованием Н₂(г) -Pd/C (10%). Реакцию продолжали до тех пор, пока ЖХ-МС-анализ не показал полное превращение исходного материала (колонка Vydac 218TP54; растворители: А=вода/0,1% TFA, и В=ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 4-16% В в течение 20 минут; скорость потока 1,0 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 284 нм, ES-ионизация с получением М+Н при 335 для исходного материала и 309 для продукта). Раствор фильтровали и использовали непосредственно на следующей стадии.

17-(Fmoc-амино)-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановая кислота

К водному раствору 17-амино-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановой кислоты из указанного выше (соответствует 25,0 ммоль аминокислоты) добавляли бикарбонат натрия (5,04 г, 60,0 ммоль) и диоксан (40 мл). Раствор Fmoc-хлорида (7,11 г, 0,275 моль) в диоксане (40 мл) добавляли по каплям. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Диоксан выпаривали (роторный испаритель) и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Водную фазу подкисляли добавлением, соляной кислоты и осажденный материал экстрагировали в хлороформ. Органическую фазу сушили (MgSO₄), фильтровали и концентрировали с получением 11,3 г (85%) желтого сиропа. Данную структуру подтвердили с помощью ЖХ-МС-анализа (колонка Vydac 218TP54; растворители: А=вода/0,1% TFA, и В=ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 40-60% В в течение 20 минут; скорость потока 1,0 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ES-ионизация с получением М+Н при 531, как ожидалось для пика продукта на 5,8 мин). Данный анализ показал очень низкое содержание побочных продуктов, и этот материал использовали без дополнительной очистки.

2б) синтез CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=1

ПЭГ-единицу связывали вручную с Rink Amide AM смолой, начиная на 0,25 ммоль шкале, опосредованно HATU-активацией. Оставшийся пептид собирали на ABI 433A автоматическом пептидном синтезаторе с использованием 1 ммоль аминокислотных картриджей. Аминокислоты предварительно активировали с использованием HBTU перед сочетанием. N-концевые аминогруппы подвергали хлорацетилированию с использованием раствора хлоруксусного ангидрида в ДМФ в течение 30 минут.

Одновременное удаление пептида и защитных групп боковой цепи (за исключением tBu) со смолы осуществляли в TFA-содержащем TIS (5%), Н₂O (5%) и феноле (2,5%) в течение двух часов.

После обработки получили 322 мг неочищенного пептида (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=СН ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,37 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1409, обнаружено при 1415).

2в) синтез тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=1

322 мг CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ)n-NH ₂ растворяли в воде/ацетонитриле. Значение рН смеси доводили до рН 8 раствором аммиака и перемешивали в течение 16 часов.

После обработки получили неочищенный пептид (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=H ₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,22 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1373, обнаружено при 1378).

2г) синтез дисульфида [Cys^2-6 ] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=1

Тиоэфир цикло[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂ обрабатывали раствором анизола (200 мкл), ДМСО (2 мл) и TFA (100 мл) в течение 60 минут, после чего TFA удаляли в вакууме и пептид осаждали путем добавления диэтилового эфира.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 5 мкл С18 (2) колонка 250×21,20 мм) 70 мг неочищенного материала осуществляли с использованием 0-30% В, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, в течение 40 минут при скорости потока 10 мл/мин. После лиофилизации получили 46 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 0-30% В в течение 10 минут, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН₂CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С 18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,80 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1258,5, обнаружено при 1258,8).

2д) синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[СН ₂СО-Lys(cPn216-глутарил)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys ⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH₂, где n=1

13 мг [Cys^2-6] цикло[CH ₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, 9,6 мг cPn216 хелата активного эфира и 8 мкл N-метилморфолина растворяли в ДМФ (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 2 часов 30 минут.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 5 мкл С18 (2) колонка 250×21,20 мм) реакционной смеси осуществляли с использованием 0-30% В, где А=Н ₂O/0,1% TFA, и В=CH₃CN/0,1% TFA, в течение 40 минут при скорости потока 10 мл/мин. После лиофилизации получили 14,2 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 0-30% В в течение 10 минут, где А=Н₂О/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С 18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 7,87 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1697,8, обнаружено при 1697,9).

Пример 3:

Синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[СН₂СО-Lys(cPn216-глутарил)-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2

3а) синтез CICH₂ CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2

Сборка пептида, как для примера 26), обе ПЭГ-единицы связывали вручную.

После обработки получили неочищенный пептид (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=H₂О/0,1% TFA, и В=СН ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,40 мин).

36) синтез тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2

CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2, растворяли в воде/ацетонитриле. Значение рН смеси доводили до рН 8 раствором аммиака и перемешивали в течение 16 часов.

После обработки получили 380 мг неочищенного пептида (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,28 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1663, обнаружено при 1670).

3в) синтез дисульфида [Cys ^2-6] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2

380 мг тиоэфира цикло[CH₂ CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=2, обрабатывали раствором анизола (500 мкл), ДМСО (2 мл) и TFA (100 мл) в течение 60 минут, после чего TFA удаляли в вакууме и пептид осаждали путем добавления диэтилового эфира.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 10 мкл С18 (2) колонка 250×50 мм) неочищенного материала (345 мг) осуществляли с использованием 0-30% В, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, в течение 60 минут при скорости потока 50 мл/мин. После лиофилизации получили 146 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 0-30% В в течение 10 минут, где А=H₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, колонка Phenomenex Luna 3 мкл С 18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 7,42 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1548,6, обнаружено при 1548,8).

3г) синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys(cPn216-глутарил)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys ⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH₂, где n=2

146 мг [Cys^2-6] цикло[CH ₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(ПЭГ) ₂-NH₂, 110 мг cPn216 хелата активного эфира и 76 мкл N-метилморфолина растворяли в ДМФ (6 мл). Смесь перемешивали в течение 9 часов.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 10 мкл С18 (2) колонка 250×50 мм) реакционной смеси осуществляли с использованием 0-30% В, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН₃ CN/0,1% TFA, в течение 60 минут при скорости потока 50 мл/мин. После лиофилизации получили 164 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 0-30% В в течение 10 минут, где А=Н ₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С 18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 8,13 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось М+Н при 1988,0, обнаружено при 1988,0).

Пример 4:

Синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys(cPn216-глутарил)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys ⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH₂, где n=4

4а) синтез CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=4

Сборка пептида, как для примера 26), все четыре ПЭГ-единицы связывали вручную.

После обработки получили неочищенный пептид (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,50 мин).

4б) синтез тиоэфира цикло[CH ₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=4

CICH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-(ПЭГ) ₄-NH₂ растворяли в воде/ацетонитриле. Значение рН смеси доводили до рН 8 раствором аммиака и перемешивали в течение 16 часов.

После обработки получили неочищенный пептид (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н₂О/0,1% TFA, и В=СН ₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 6,37 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось [(М+2Н)/2] при 1122,0, обнаружено при 1122,5).

4в) синтез дисульфида [Cys ^2-6] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=4

Тиоэфир цикло[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-(ПЭГ) ₄-NH₂ обрабатывали раствором анизола (100 мкл), ДМСО (1 мл) и TFA (50 мл) в течение 60 минут, после чего TFA удаляли в вакууме и пептид осаждали путем добавления диэтилового эфира.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 5 мкл С18 (2) колонка 250×21,20 мм) неочищенного материала (345 мг) осуществляли с использованием 5-50% В, где А=H ₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA, в течение 40 минут при скорости потока 10 мл/мин. После лиофилизации получили 12 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=CH₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 4,87 мин).

4г) синтез дисульфида [Cys^2-6] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys(cPn216-глутарил)-Cys ²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-(ПЭГ)n-NH ₂, где n=4

12 мг дисульфида [Cys^2-6 ] тиоэфира цикло[CH₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-(ПЭГ) ₄-NH₂ 5,2 мг cPn216 хелата активного эфира и 2 мкл N-метилморфолина растворяли в ДМФ (0,5 мл). Смесь перемешивали в течение 7 часов.

Очистку путем препаративной ВЭЖХ (Phenomenex Luna 5 мкл С18 (2) колонка 250×21,20 мм) реакционной смеси осуществляли с использованием 5-50% В, где А=Н₂O/0,1% TFA, и В=СН₃ CN/0,1% TFA, в течение 40 минут при скорости потока 10 мл/мин. После лиофилизации получили 8 мг чистого материала (аналитическая ВЭЖХ: градиент 5-50% В в течение 10 минут, где А=Н ₂O/0,1% TFA, и В=СН₃CN/0,1% TFA; колонка Phenomenex Luna 3 мкл С 18 (2) 50×4,6 мм; скорость потока 2 мл/мин; детекция УФ, 214 нм; время удерживания продукта 5,17 мин). Дальнейшую характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии: ожидалось [(М+2Н)/2] при 1284,6, обнаружено при 1284,9).

Пример 5:

Экспериментальное исследование соединения примера 2д (соединения NC100692), меченного ^99mТс, на пациентах с опухолью молочной железы

Эксперименты были проведены на пациентах Karolinska Institute и Norwegian Radiumhospital со средним возрастом 58 лет (от 40 до 76 лет), средним весом 65 кг (от 53 до 150 кг) и с предварительным диагнозом: опухоль молочной железы, основанном на рентгеновской маммографии (ХММ). В настоящем исследовании рак молочной железы был выбран в качестве модельной опухоли, так как раннее выявление и хирургическое удаление, предоставляющее возможность для гистологической проверки, являются общепринятыми.

^99mTc-NC100692 вводили однократной болюсной инъекцией с максимальным содержанием NC100692, составляющим 75 мкг, и средним значением активности 694 МБк (диапазон: 561-747 МБк). Пациентам вводили 1 виалу NC100692, меченного радиоактивным изотопом, в 3,5 мл стерильного солевого раствора, а затем 10 мл солевого раствора. Посредством бумажной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии перед инъекцией агента осуществляли контроль его качества (требование по радиохимической чистоте более 85%). После инъекции выполняли визуализацию опухоли посредством сцинтимаммографии (SMM) и "оценку безопасности" препарата. Сразу после сцинтимаммографии пациентов подвергали биопсии молочной железы. Результаты исследований пациентов приведены в таблице III.

Таблица III Характеристики злокачественных очагов*
№	Патология	Размер очага, MM	Визуальная классификация
			ХММ**	SMM при введении соединения 99mTc-NC100692
1	IDC***	7	5	3
2	IDC	8	5	3
3	IDC (+DCIS)	10 (+12)	5	3
4	Л: DCIS	10	1	3
	П: IDC	25	5	3
5	IDC (+DCIS)	14 (+10)	5	3
6	IDC×2	12, 14	5,5	3,3
7	IDC	20	5	3
8	ILC×2	20,23	5,5	3,3
9	ILC	20	5	3
10	IDC	28	5	3
11	IDC	35	5	3
12	IDC (+DCIS)	40	5	3
13	IDC (+DCIS)	40	5	3
14	IDC (+DCIS)	40	5	3
15	IDC	40	5	3
	ILC	40	4	3
* соответствующее поглощение было видно во всех обнаруженных злокачественных очагах и не было какого-либо явного различия в результатах, полученных через 45 и 105 минут после введения 99mTc-NC100692; ** рентгеновская маммография (2 - доброкачественность, 3 - вероятная доброкачественность, 4 - подозрение на аномалию (следует использовать биопсию), 5 - сильное подозрение на злокачественность), сцинтимаммография (трехбалльная шкала: 1 - нет очевидного поглощения, 2 - неопределенное/гетерогенное поглощение, 3 - поглощение в очаговом поражении); *** IDC - инфильтративная протоковая карцинома,

DCIS - протоковая карцинома in situ,

ILC - инвазивная лобулярная карцинома;

Достоверность злокачественных очагов была подтверждена гистологическим диагнозом после хирургического удаления опухоли. Кроме того, у некоторых пациентов со злокачественными опухолями посредством гистологического исследования лимфатических узлов были обнаружены метастазы более 20 мм, и очаговое поглощение в этой подмышечной области также можно было легко увидеть посредством сцинтиграфии с использованием ^99mTc-NC100692.

В первой фазе исследования, когда 99mTc-NC100692 вводили здоровым волонтерам, была обнаружена экскреция препарата почками, при этом фоновая активность головного мозга наблюдалась только в минимальном количестве.

Контролирование состояния пациента для "оценки безопасности" включало регистрацию неблагоприятных явлений после введения ^99mТс-NC100692, медицинский осмотр пациента (внешнего вида, сердечно-сосудистой системы, легких и брюшной полости), неврологический осмотр, электрокардиограмму, биохимический анализ, определение основных показателей состояния организма (систолического и диастолического кровяного давления, частоты дыхания, сердечного ритма, температуры тела) и анализ мочи. Все пациенты поддерживали связь с исследователями в течение 24 часов после инъекции на случай возможных неблагоприятных явлений. В течение 2,5 часов контролирования состояния организма после введения препарата у пациентов наблюдалось стабильность всех параметров, не было отмечено ни одного какого-либо клинически важного сигнала, ни одного серьезного неблагоприятного явления или смертельного случая. Только у пяти пациентов наблюдались легкие неблагоприятные явления (например, металлический вкус в течение короткого периода времени), которые исчезали в течение 24 часов.