способ прогнозирования течения заболевания у детей при острых респираторных вирусных инфекциях

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения болезни у детей при острых респираторных вирусных инфекциях (ОРВИ) в первые дни заболевания, включающий определение методом иммуноферментного анализа иммунологических показателей спонтанного и индуцированного интерферона- in vitro (ИФН- ) и расчет его индекса стимуляции (ИС ИФН- ) путем деления показателей индуцированного уровня на спонтанный, расчет индекса активации лимфоцитов (ИАЛ ИФН- ) на 1000 лимфоцитов, путем деления показателя индуцированного интерферона на абсолютное число лимфоцитов пациента (ИАЛ ИФН- ), отличающийся тем, что в плазме крови дополнительно определяют содержание интерлейкина 10 (ИЛ-10), после чего делают заключение: при ИС ИФН- больше 3, ИАЛ ИФН- равном или больше 40, ИЛ-10 от 30 до 60 пг/мл - прогнозируют благоприятный исход заболевания при терапевтическом лечении без включения иммуномодуляторов; при ИС ИФН- меньше 3, ИАЛ ИФН- меньше 40, ИЛ-10 от 60 до 100 пг/мл - прогнозируют тяжелое течение заболевания и развитие осложнений, требующее срочного лечения путем иммунозаместительной терапии; причем при ИС ИФН- меньше 3, ИАЛ ИФН- меньше 30, ИЛ-10 больше 100 пг/мл - прогнозируют затяжное течение с развитием бронхолегочных осложнений и возможной хронизацией патологического процесса и повторных ОРВИ, что требует дополнительного включения иммуномодулирующих препаратов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и клинической лабораторной диагностике. Оно может быть использовано для прогнозирования течения заболевания, такого как острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ), у детей в возрасте от 1 месяца до 18 лет. Изобретение позволяет предсказать развитие осложнений у детей и на ранней стадии заболевания назначить терапевтические препараты, предотвращающие неблагоприятный ход болезни, в частности выбрать оптимальную иммуномодулирующую терапию.

Изобретение основано на способе оценки общей иммунореактивности организма детей по отдельным показателям интеферонового (ИФН) статуса и по содержанию интерлейкина-10 (ИЛ-10) в плазме крови больного в первые дни (1-й, 2-й день) заболевания ОРВИ.

Факторами, определяющими тяжесть течения, особенность клинических проявлений и исход ОРВИ, кроме свойств возбудителя, являются характеристики способности иммунной системы адекватно реагировать на инфекционный антиген. Острый воспалительный процесс, как правило, сопровождается нарушениями в иммунной системе, которые в большинстве случаев обратимы. Однако развитие осложнений может быть связано с изначальным дефектом в иммунной системе или с недостаточностью функций макрофагальных и иммунокомпетентных клеток.

В диагностике и прогнозе течения заболеваний изменения продукции цитокинов используют достаточно широко.

Известна работа:

Pitkäranta A., Nokso-Koivisto J., Jäntti V., Takala A., Kilpi Т., Hovi T. Lowered yields of virus-induced interferon production in leukocyte cultures and risk of recurrent respiratory infections in children. Journal of Clinical Virology. - Volume 14, Issue 3, December 1999, P. - 199-205.

В ней охарактеризовано, как снижение уровня продукции интерферонов лейкоцитами in vitro повышает риск повторных респираторных инфекций у детей. Недостатком данного способа прогнозирования является трудоемкость метода с использованием культур клеток и тест-вируса.

Известен патент РФ 2159936, G01N 33/68, Ариненко Р.Ю., Аникин В.Б., Иовлев В.И., Малиновская В.В. Способ выбора типа иммуномодулирующей терапии и определения прогноза исхода заболевания на основе анализа интерферонового статуса больного.

Это изобретение касается способа выбора иммуномодулирующей терапии и определения прогноза заболевания на основе интерферонового статуса больного. Способ включает определение активности общих сывороточных интерферонов (S-ИФН), продукции лейкоцитами in vitro интерферона- и интерферона- .

Определение проводят в образцах цельной крови, инкубированных в среде RPMI-1640, 100 мкл, с добавлением вируса болезни Ньюкасла (NDV) и фитогемагглютинина (ФГА) для индукции ИФН- и ИФН- соответственно. Его осуществляют посредством титрования исследуемых образцов на культуре клеток с последующей инкубацией с вирусом везикулярного стоматита. При этом используют перевиваемые культуры, чувствительные к действию ИФН. Данный способ позволяет прогнозировать течение заболевания, однако является длительным по времени, трудоемким и требует специального оборудования и навыков исполнителя, т.к.предполагает работу с культурой ткани и вирусами.

Известен патент РФ № 2169923, G01N 33/53, Сенько О.В. Способ прогнозирования частоты рецидивов инфекционных заболеваний дыхательных путей и стойкости эффекта оздоровления у дошкольников.

Авторы предлагают способ прогнозирования возможной частоты рецидивов инфекционных заболеваний дыхательных путей с использованием ряда биохимических показателей. Способ включает оценку качества и количества корреляционных связей между данными лабораторных показателей.

Известен патент РФ № 2008686, G01N 33/53, Сизякина Л.П., Чернышов В.Н., Андреева И.И., Болгаринов Н.К. Способ прогнозирования развития осложнений у детей, больных ОРВИ.

Этот способ основан на определении в ранний период заболевания количества нейтрофилов периферической крови, экспрессирующих рецепторы к Fcj фрагменту иммуноглобулина G (Fc jP) в реакции розеткообразования с эритроцитами барана. В случае увеличения процента нейтрофилов с FcjP выше 58% прогнозируют развитие осложнения.

Известен патент РФ № 2297003 G01N 33/68, Усейнова Н.Н., Шовкун В.А., Мизерницкий Ю.Л. Способ прогнозирования частоты повторных заболеваний у детей раннего возраста, страдающих острыми респираторными заболеваниями.

Способ осуществлялся следующим образом: у больного утром натощак производили забор венозной крови в количестве 5 мл, выделяли мононуклеарные клетки и культивировали в течение 24-48 часов при 37°С в присутствии 5% CO2 в культуральной среде RPMI1640 с 10% инактивированной телячьей сывороткой, 5×10,5 М2-меркаптоэтанола, 2-миллимоль глютамина, 10 миллимоль буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина с добавлением митогенов (липополисахарид-с для индукции фактора некроза опухоли-альфа и форболмиристиат ацетат для индукции интерферона-гамма). Параллельно определяли спонтанную продукцию, добавляя равный объем культуральной среды. Уровень цитокинов в супернатантах определяли иммуноферментным методом наборами фирмы «Протеиновый контур». Рассчитывали индекс соотношения индуцированной и спонтанной продукции данных цитокинов и при значении индекса соотношений для фактора некроза опухоли альфа ниже 0,85, а для интерферона гамма ниже 0,45 определяют возможность повторных респираторных заболеваний. Здесь идет речь только о предрасположенности к повторным ОРЗ.

Прототипом заявленного изобретения является способ, описанный в диссертации Образцовой Е.В. «Препараты интерферона и его индукторы в лечении гриппа и острых респираторных вирусных инфекций у детей» (Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2007. - 23 с).

Способ включает определение спонтанной и индуцированной продукции лейкоцитами in vitro ИФН- и ИФН- по методу С.С.Григорян. На основе полученных результатов производят расчет индекса соотношения индуцированной и спонтанной продукции данных цитокинов - индекс стимуляции (ИС) ИС ИФН- или - , индекс активации лимфоцитов (ИАЛ) - ИАЛ ИФН- или - .

Данные показатели дают представление об активности иммунокомпетентных клеток (ИКК), что характеризует резервные возможности интерферонпродуцирующих клеток. Это позволило автору разработать критерии назначения препаратов интерферона и его индукторов при различном течении ОРВИ у детей.

Система интерферона (ИФН) обеспечивает неспецифическую противовирусную резистентность организма и влияет на весь комплекс его специфических и неспецифических защитных реакций.

Отражением функционального состояния системы ИФН является ИФН статус, оценка которого проводится по нескольким известным показателям [Вопросы общей вирусологии, под ред. О.И.Киселева, 2007, Санкт-Петербург], основные из которых:

1. Количество циркулирующего в крови ИФН- и - (сывороточный ИФН).

2. Уровень продукции ИФН- лейкоцитами (или лимфоцитами) in vitro при его индукции вирусными индукторами.

3. Уровень продукции ИФН- лейкоцитами (или лимфоцитами) - при его индукции митогенами in vitro.

Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа прогнозирования течения ОРВИ у детей на самых ранних стадиях заболевания с помощью определения показателей иммунореактивности организма пациента, практически применимого и экономически выгодного.

По результатам диагностики перспективным направлением терапии осложненного и затяжного течения ОРВИ становится использование методов иммунотерапии, направленных на усиление клеточных реакций иммунитета, в дополнение к комплексному терапевтическому лечению.

Предлагаемый способ прогнозирования легко воспроизводим, не требует специальных условий (например, стерильных боксов), связанных с работой с культурой ткани и тест-вирусами для проведения исследования. Он менее трудоемок по числу проводимых действий при анализе. Преимуществом является то, что для исследования не требуется сыворотка крови, что позволяет брать кровь в меньшем объеме, а это является важным условием при обследовании маленьких детей: от 1 месяца.

Цель - раннее прогнозирование тяжести течения заболевания и развития осложнений у детей, больных ОРВИ, и упрощение способа диагностики.

Из достаточно большого клинического материала были отобраны наиболее информативные показатели, позволяющие адекватно оценить функциональное состояние иммунной системы больного ребенка, а именно интерферон-гамма и интерлейкин-10. Ранее в таком сочетании эти показатели не использовали.

При определении изменения выбранных показателей можно оценить тяжесть патологического процесса и возможность развития осложнений ОРВИ, причем процент точности прогноза повышается по сравнению с известными комбинациями других показателей иммунореактивности ребенка.

Сущностью изобретения является установление цифровой закономерности в величинах определяемой in vitro спонтанной и индуцированной фитогемагглютинином продукции лейкоцитами ИФН- с расчетом индекса стимуляции (ИС), индекса активации лимфоцитов (ИАЛ), а также привнесение в точность прогноза значений уровня интерлейкина-10 в плазме крови. Учет взаимозависимости всех указанных показателей позволяет назначить адекватное терапевтическое лечение, предотвращающее возможные осложнения.

Авторами была показана возможность использования только данных СП ИФН- и ИП ИФН- in vitro. Дополнительное определение уровня ИЛ-10 в плазме крови позволяет оценить направление и интенсивность иммунного реагирования организма детей, больных ОРВИ.

ИЛ-10 вырабатывается Т-хелперами 2-го типа, ответственными за переключение на гуморальный антиген-специфический иммунный ответ, и играет роль антагониста ряда цитокинов, в том числе интерферона-гамма. Этот факт может являться неблагоприятным признаком, так как связан с проявлениями иммуносупрессии в виде подавления пролиферативного ответа Т-лимфоцитов и соответственно менее эффективной защитой при вирусной инфекции [Детские инфекции. 2003. № 3. с.58-61].

Известно, что система интерферонов относится к ранним цитокиновым реакциям при развитии инфекции. ИНФ- , продуцируемый преимущественно Т-хелперами I типа и цитотоксическими лимфоцитами, является мощным иммуностимулятором и индуктором неспецифической защиты, стимулирует фагоцитоз, а также активность нейтрофилов и естественных киллеров, способствует адгезии гранулоцитов к эндотелиальным клеткам, а так же регулирует силу иммунного ответа [Иммунология. 2002. № 2. - с.77-80].

Повышение спонтанной продукции интерферона-гамма происходит при развитии воспалительных процессов в верхних дыхательных путях (Acta Paediatrica. - 2008. - Volume 74. - Issue 1, P. - 118-121).

Для диагностики и прогноза в отличие от способа-прототипа проводилось только исследование индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) и спонтанной продукции (СП) ИФН- in vitro. Для этого анализа у пациента утром натощак брали кровь из вены или пальца в объеме 1,0 мл в пробирку с гепарином 10-15 ед./мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при +4°С без потери всех необходимых свойств.

Оставшуюся кровь центрифугировали и в плазме определяли уровень интерлейкина-10. Определение проводили методом ИФА стандартными наборами производства ООО «Цитокин», СПб.

Дальнейший учет результатов проводили автоматически с помощью ридера для иммуноферментного анализа при длине волны 490 нм. Уровень ИФН в анализируемом образце определяется с помощью калибровочной кривой в зависимости от оптической плотности. Это дает возможность получать воспроизводимый результат.

Авторами использовался показатель, названый - индекс стимуляции продукции ИФН- (ИС ИФН- ), дающий представление о степени активности ИКК, об их способности отвечать синтезом ИФН- на введение индуктора, характеризующий резервные возможности интерферон-продуцирующих клеток. ИС ИФН- определяли путем деления уровня индуцированной продукции ИП ИФН- на величину показателя спонтанной продукции СП ИФН- :

В связи с тем, что имеются возрастные особенности содержания интерферонпродуцирующих клеток, основными из которых являются лимфоциты, был введен следующий показатель - индекс активации лимфоцитов (ИАЛ ИФН) - показатель, дающий представление об индивидуальной ИФН продуцирующей активности лимфоцитов (в пересчете на тысячу лимфоцитов), который является частным от деления показателя ИП ИФН- на абсолютное число лимфоцитов пациента:

Статистическая обработка полученных результатов показала определенную закономерность. У 36 здоровых детей были получены уровни СП ИФН- 10-50 пг/мл, ИФН- - 150-450 пг/мл. ИС ИФН- =9-45. ИАЛ ИФН- >40. Уровень ИЛ-10=2-50 пг/мл.

При ОРВИ с отсутствием осложнений наиболее часто в начале заболевания встречались пациенты с высоким уровнем СП ИФН (в 61,6% случаях). У детей с исходно низкими уровнями СП ИФН- и ИС ИФН- , при уровне ИЛ-10>60 пг/мл чаще, чем в других группах, встречались больные с пневмонией и бронхитом, тогда как при высоких показателях СП ИФН- (>50 пг/мл) и ИС ИФН- (>4,0), уровне ИЛ-10<50 пг/мл в 90,9% случаях встречались дети с ОРВИ без бронхолегочных поражений и лишь в 9,1% - был выявлен бронхит.

Наиболее высокий уровень СП ИФН- в крови (58,3±4,3 пг/мл) и ИС ИФН- >4, при уровне ИЛ-10<50 пг/мл выявлены у детей при ОРВИ без осложнений, а наиболее низкие - при пневмонии (39,0±5,4 пг/мл, ИС ИФН- <3 при уровне ИЛ-10>60 пг/мл), различия показателей статистически значимы (р<0,05).

ИП ИФН- , а также ИАЛ ИФН- были достоверно более низкими у детей, переносящих ОРВИ с поражением нижних отделов респираторного тракта, что свидетельствует о сниженных способностях организма противодействовать возбудителю, то есть уровень поражения респираторного тракта в определенной степени зависит от активности ИКК пациента. Содержание ИЛ-10 в плазме крови у пациентов с тяжелым течением заболевания ОРВИ и с наличием осложнений было статистически значимо выше, чем у детей с течением средней тяжести и без осложнений.

При низкой активности ИКК (низкой СП ИФН и низком ИС) чаще встречается затяжное течение заболевания, чем при более высокой активности ИКК. Наличие высокой интерферонпродуцирующей активности клеток даже у лиц с низким уровнем СП ИФН способствует уменьшению продолжительности как синдрома интоксикации, так и всего заболевания в целом (Табл.1).

Таблица 1
Прогностическая ценность двух способов прогнозирования уровня поражения респираторного тракта у детей с ОРВИ
Показатель	ИС ИФН-	ИЛ-10	Заявленный способ ИС ИФН- + ИЛ-10 (абс./%)	Способ -прототип ИС ИФН- + ИС ИФН- (абс./%)
2,0; >50	>2,0; 50	2,0; 2,0	>2,0; >2,0
ОРИ, n=298	4,5±0,4	30,5±1,3	56/19,0	242/81,0	71/24,0	227/76,0
ОРИ, бронхит, + осложнения, n=93	2,6±0,7*	55,9±2,1*	81/87,0#	12/24,0#	32/34,0	61/66,0
ОРИ, пневмония, затяжное течение, n=42	1,2±0,4*	76,4±1,9*	37/88,0#	5/12,0#	27/64,0	15/36,0
* - р<0,05 - по отношению к ОРИ без бронхолегочных поражений # - р<0,05 - по отношению к способу-прототипу

Чувствительность заявленного способа - 87%, что значительно выше, чем у способа-прототипа - 66,0%.

Специфичность заявленного способа 81,0%, а у способа-прототипа - 76,0%.

Таким образом, заявленный способ значительно точнее прогнозирует развитие осложнений и затяжного течения заболевания ОРВИ у детей, что позволит своевременно назначить иммуномодулирующую терапию с учетом иммунного реагирования пациента.

Выявлена зависимость ИФН продуцирующей активности ИКК пациентов от содержания у них абсолютного числа лимфоцитов и их способности к выработке ИФН- (Табл.2).

Таблица 2
Характеристика ИАЛ ИФН- у детей с ОРВИ в зависимости от уровня поражения респираторного тракта
Показатель	ИАЛ ИФН- (абс.%)
30,0, n=118	>30,0, n=294
ОРИ, n=317	69/21,8	248/78,2#
ОРИ, бронхит, n=73	35/47,9	38/52,1
ОРИ, пневмония, n=22	14/63,6*	8/36,4*
Абс. число лимфоцитов, 109/л	4,6±0,5	2,5±0,3#
ИАЛ ИФН- (10-3 пг)	21,1±1,2	51,1±2,9#
*р<0,05 - по отношению к ОРИ без бронхолегочных поражений # - к детям с ИАЛ ИФН- 30,0·10-3 пг

При содержании абсолютного числа лимфоцитов в крови >2,0×10⁹/л у детей, ИАЛ ИФН- >30,0 заболевание протекает более легко с достоверным уменьшением продолжительности лихорадочного периода и синдрома интоксикации, реже развиваются осложнения.

Характер течения заболевания также зависит от индивидуальной интерферонпродуцирующей активности ИКК. Так, затяжное течение заболевания наиболее часто встречается у пациентов с низкой ИАЛ ИФН- ( 30 пг 10^-3).

По способу, заявляемому в изобретении, были обследованы 578 детей от 1 мес до 18 лет. Достоверность результатов и выводов приведена в таблице 3.

Выводы:

Выявленная закономерность в сочетании показателей иммунореактивности при разных характерах течения заболевания статистически достоверна.

Таким образом, при определении СП ИФН- и ИП ИФН- в первые дни заболевания ОРВИ, вычислив ИС ИФН- и ИАЛ ИФН- , определив уровень интерлейкина 10 в плазме крови, можно правильно оценить состояние иммунореактивности организма больного ребенка и с достаточной степенью уверенности прогнозировать характер течения заболевания.

Авторы впервые установили, какой минимум характеристик иммунитета необходим и достаточен для адекватной оценки иммунного реагирования детей, больных ОРВИ.

Варианты иммунного ответа неразрывно связаны с клиническими особенностями течения заболевания. Использованный авторами комплекс показателей иммунитета позволил с высокой степенью точности - до 87%, осуществить краткосрочное прогнозирование осложненного и затяжного течения ОРВИ.

Определение содержания в плазме крови ИЛ-10 способствует более точной и ранней оценке степени тяжести заболевания, развития осложнений, а также возможных повторных заболеваний ОРВИ.

Если у здоровых детей уровни СП ИФН- 10-50 пг/мл, ИФН- -150-450 пг/мл, ИС ИФН- =9-45, ИАЛ ИФН- >40, уровень ИЛ-10=2-50 пг/мл, то при заболевании ОРВИ при установлении следующих показателей - СП ИФН- =50-75 пг/мл, ИП ИФН- 150 пг/мл, ИС ИФН- >3, а также ИАЛ ИФН- 40, уровень ИЛ-10=30-60 пг/мл - прогнозируют благоприятный исход заболевания.

При СП ИФН- =50-75 пг/мл, ИП ИФН- =90-100 пг/мл, ИС ИФН- 3, а также ИАЛ ИФН- 40, уровень ИЛ-10=60-100 пг/мл - прогнозируют тяжелое течение и развитие осложнений, требующих иммунозаместительной терапии.

При СП ИФН- =20-35 пг/мл, ИП ИФН- =60-100 пг/мл и ИС ИФН- <3, а также ИАЛ ИФН- 30, уровень ИЛ-10>100 пг/мл - прогнозируют затяжное течение с развитием бронхолегочных осложнений и возможной хронизацией патологического процесса и повторных ОРВИ.

Настоящий способ оценки иммунного реагирования пациентов с диагнозом ОРВИ позволяет своевременно предсказать развитие затяжного и осложненного течения заболевания и вовремя провести необходимую противовирусную и иммуномодулирующую терапию, направленную на усиление клеточных реакций иммунитета. Способ может быть использован в работе инфекционных отделений детских больниц.

Клинический пример.

1. Девочка М., 5,7 г., формализованная карта обследования № 152, обследована при поступлении в первый день инфекционного заболевания дыхательных путей.

СП ИФН- - 55 пг/мл; ИП ИФН- - 190 пг/мл; лейкоциты (абсолютное количество) 5,8×10 ⁹/л; лимфоциты - 45%. ИС ИФН- =3,5, ИАЛ ИФН- =72,9; ИЛ-10=32,4 пг/мл. Данные показатели позволили предположить гладкое течение заболевания, что в дальнейшем подтвердилось клинико-лабораторными данными. Поставлен диагноз ОРВИ. Продолжительность заболевания 6 дней. Умеренные изменения иммунологических показателей соответствовали быстрому клиническому выздоровлению от ОРВИ и подтвердили правильность прогноза и выбора методов лечения.

2. Мальчик И., 4,6 г., формализованная карта обследования № 120, обследован при поступлении в первый день инфекционного заболевания дыхательных путей.

СП ИФН- - 50 пг/мл; ИП ИФН- - 90 пг/мл; лейкоциты (абсолютное количество) 7,4×10 ⁹/л; лимфоциты - 36%. ИС ИФН- =1,8, ИАЛ ИФН- =33,8; ИЛ-10=73,6 пг/мл. Полученный результат позволил предположить затяжное течение с развитием осложнений, что подтвердилось клинико-лабораторными данными. Поставлен диагноз острый бронхит. Кроме симптоматической была назначена заместительная терапия препаратами интерферона (виферон или аналоги). Продолжительность заболевания 10 дней.

3. Мальчик В., 6,5 г., формализованная карта обследования № 128, обследован при поступлении в первый день инфекционного заболевания дыхательных путей. В анамнезе частые острые респираторные заболевания.

СП ИФН- - 35 пг/мл; ИП ИФН- - 70 пг/мл; лейкоциты (абсолютное количество) 5,2×10 ⁹/л; лимфоциты - 36%. ИС ИФН- =2,0, ИАЛ ИФН- =37,4; ИЛ-10=138,5 пг/мл. Данные показатели позволили предположить затяжное течение с развитием осложнений, что подтвердилось клинико-лабораторными данными. Поставлен диагноз пневмония, правосторонний катаральный отит. Заключение: низкая иммунная реактивность, неблагоприятный прогноз течения заболевания. Дополнительно была назначена иммуномодулирующая терапия. Продолжительность заболевания 16 дней. Таким образом, предварительный прогноз после проведения лабораторного обследования предложенным способом оказался верным.