уретановые производные азт - потенциальные противовирусные препараты

Формула изобретения

5'-Уретановые производные АЗТ, имеющие общую формулу



где X=-NH₂, -NHMe, -NHEt, , .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к новым производным нуклеозидов - уретановым производным АЗТ. Эти соединения обладают противовирусным действием и могут быть использованы для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.

В настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ. Среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ, Зидовудин®), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC, Зальцитабин®), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI, Диданозин®), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (d4T, Ставудин®) и 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин (3ТС, Ламивудин®) [De Clercq, Е., 2002. New development in anti-HIV chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta, 1587, 258-275].

Механизм действия перечисленных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Groschel, В., Cinatl, J.H., and Cinatl J. Jr., 1997. Viral and cellular factors for resistance against antiretroviral agents. Intervirology, 40, 400-407; Antonelli, G, Turriziani, O., Verri, A., Narciso, P., Ferri, F., D'Offizi, G.; and Dianzini, F., 1996. Long-term exposure to zidovudine affects in vitro and in vivo the efficiency of thymidine kinase. AIDS Res Hum Retrovir., 12, 223-228] и, следовательно, к необходимости смены препарата. К тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.

Следствиями токсичности АЗТ являются подавление деятельности клеток спинного мозга, нарушения функции печени и миопатия [Chariot, P., Drogou, I., De Lacroix-Szmania, I., Eliezer-Vanerot, M.C., Chazaud, В., Lombes, A., Schaeffer, A., arid Zafrani, E.S., 1999. Zidovudine-induced mitochondrial disorder with massive liver steanosis, myopathy, lactic acidosis, and mitochondial DNA depletion. J. Hepatol. 30, 156-160; Kellam, P., Boucher, C.A., and Larder, B.A., 1992. Fifth mutations in HIV reverse transcriptase contributes to the development of high level resistance to zidovudine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1934-1938; Ren, J., Esnouf, R.M., Hopkins, A.L., Jones, E.Y., Kirby, I., Keeling, J., Ross, C.K., Larder, B.A., Stuart, D.I., and Stammers, D.K., 1998. 3'-Azido-3'-deoxythymidine drug resistance mutations in HIV-1 reverse transcriptase can induce long range conformational changes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9518-9523]. Быстрое выведение АЗТ из организма требует частого приема препарата. Кроме того, при длительном применении АЗТ достаточно быстро образуются резистентные штаммы вируса и лечение теряет эффективность. Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, АЗТ по-прежнему остается наиболее широко применяемым анти-ВИЧ препаратом.

Известен Н-фосфонат АЗТ (Никавир®), одобренный в России для терапии СПИД, менее токсичен, чем АЗТ [Skoblov Yu., Karpenko I., Shirokova E., Popov K., Andronova V., Galegov G., Kukhanova M., 2004. Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5'-hydrohenphosphonate of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine, a prodrug of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine. Antiviral Reserch, 63, 107-113]. Действие Никавира основано на способности высвобождать АЗТ, который после внутриклеточного превращения в АЗТ-5'-трифосфат ингибирует репликацию ВИЧ. По данным фармакокинетических исследований клинические преимущества Никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации АЗТ в крови, чем при приеме собственно АЗТ; при этом С_макс АЗТ из Никавира<С _макс АЗТ из Зидовудина, а Т_1/2 АЗТ из Никавира>Т _1/2 АЗТ из Зидовудина. Тем не менее токсичность Никавира остается достаточно высокой. Другим недостатком является возникновение резистентности к Никавиру.

К настоящему времени описано много потенциальных депо-форм АЗТ, в частности 5'-эфирные и 5'-карбонатные производные [Parang К., Weibe L.I., Knaus Е.Е. Current Medical Chemistry. 2000. V.7. P.995-1039]. Наиболее близким аналогом заявляемых соединений является 5'-диэтиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин [Hammer К, Hatlelid J, Gritli М, Arukwe J, Klaveness J, Rise F, Undheim K. Ether, carbonate and urethane deoxynucleoside derivatives as prodrugs. Acta Chem Scand. 1996. 50(7):609-22], для которого была показана выраженная анти-ВИЧ активность в клеточной системе. Следует отметить, что фармакокинетические исследования не проводились.

Данным изобретением решается задача создания низкотоксичных производных АЗТ, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид - АЗТ. Это позволит поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата, достаточную для проявления терапевтического действия в течение длительного времени и, таким образом, снизить частоту приема и уменьшить побочные эффекты.

Задача решена созданием соединений, 5'-уретановых производных 3'-азидо-3'-дезокситимидина, общей формулы:

где X = остаток аммиака или амина (метиламина, этиламина, морфолина, пиперазина):

X=-NH₂ , -NHMe, -NHEt, , .

Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре клеток SEM SS (лимфобластоидная Т-клеточная линия), обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (Таблица). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50% токсические дозы на 3-4 порядка превышают 50%-ные ингибирующие дозы) в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток СЕМ SS. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS), определяемые как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравнимы с таковыми для Н-фосфоната АЗТ. Вирусологические тесты проведены в соответствии со стандартными протоколами.

Предлагаемые нами соединения обладают хорошей растворимостью в воде, чем выгодно отличаются от описанного ранее 5'-диэтиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидина [Hammer К, Hatlelid J, Graitli М, Arukwe J, Klaveness J, Rise F, Undheim K. Ether, carbonate and urethane deoxynucleoside derivatives as prodrugs. Acta Chem Scand. 1996. 50(7):609-22]. Показано также, что заявляемые 5'-уретаны АЗТ хорошо всасываются при пероральном приеме и являются метаболитическими предшественниками АЗТ в организме лабораторных животных (собаки).

Целевые уретановые производные получали по следующей схеме:

Вначале 3'-азидо-3'-дезокситимидин обрабатывают 1,1'-карбонилдиимидазолом, затем прибавляют водный аммиак или амин (метиламин, этиламин, морфолин, пиперазин и др.). Реакцию проводят в среде апротонного растворителя - диметилформамида, диоксана, ацетонитрила и т.д.

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1.

5'-Морфолинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (1а).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 2 часа при 18°С, добавляли морфолин (1,5 мл, 17 ммоль), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 10% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,91 г (82%) уретана (Ia). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): 11,23 с (3-NH) 7,40 с (1H, Н-6), 6,10 дд (1Н, J=6,2 Гц, 6,9 Гц, Н-1'), 4,45 м (1Н, Н-3'), 4,27 м (2Н, Н-5'), 3,98 м (1Н, Н-4'), 3,55 м, 3,36 м (8Н, морфолин), 2,39 м (2Н, Н-2'), 1,79 д (3Н, 5-СН₃ ). ¹³С ЯМР (DMSO-d6): 163,6 с (С4), 154,2 с (NC(O)O), 150,3 с (С2), 135,9 с (С6), 109,9 с (С5), 83,9 с (С1'), 80,9 с (С4'), 65,7 с (два С-O (морфолин)), 64,2 с (С3'), 60,1 с (С5'), 43,8 с (два C-N (морфолин)), 35,7 с (С2'), 11,9 с (5-Ме).

Пример 2.

5'-Пиперазинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Ib).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (1 г, 3,7 ммоль) в диоксане (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (97%, 1 г, 6 ммоль). Смесь перемешивали 1 час при 18°С, добавляли пиперазин (0,95 г, 11 ммоль) в диоксане (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на обращеннофазовой колонке (RP-8) с силикагелем (2,5×25 см). Элюировали в градиенте ацетонитрила в воде (от 0% до 40%). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,84 г (60%) уретана (Ib). ¹Н ЯМР (D₂O): 7,53 с (1Н, Н-6), 6,24 т (1Н, J=6,4 Гц, Н-1'), 4,52 м (2Н, Н-3' и Н-5'а), 4,42 дд (1Н, J=12 и 4,3 Гц, Н-5'b), 4,29 к (1H, J=4,4 Гц, Н-4'), 3,55 уш.с (4Н, 2 CH₂ -NCO), 2,90 уш.с (4Н, 2 CH₂-NH), 2,59 м (2Н, Н-2'), 1,99 с (3Н, 5-СН₃).

Пример 3.

5'-Аминокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (1 с).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 3 часа при 18°С, добавляли 32% водный аммиак (7 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 10% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,76 г (78%) уретана (Ic). ¹Н ЯМР (DMSO-d ₆): 11,3 с (1Н, 3-NH), 7,43 с (1H, Н-6), 6,62 уш.с (2Н, NH₂), 6,12 т (1Н, J=6,5 Гц, Н-1'), 4,40 м (1Н, Н-3'), 4,21 дд (1Н, J=11,8 и 3,4 Гц, Н-5'а), 4,08 дд (1Н, J=11,8 и 5,2 Гц, Н-5'b), 3,98 м (1Н, Н-4'), 2,47 м (1Н, Н-2'а), 2,30 м (1Н, Н-2'b), 1,79 с (3Н, 5-СН ₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,8 с (С4), 156,4 с (NC(O)O), 150,5 с (С2), 135,9 с (С6), 110,0 с (С5), 83,8 с (С1'), 81,4 с (С4'), 63,5 с (С3'), 60,9 с (С5'), 35,8 с (С2'), 12,2 с (5-Ме).

Пример 4.

5'-Метиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Id).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диоксане (15 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 4 часа при 18°С, добавляли 40% водный метиламин (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте метанола в хлороформе (от 3% до 7% метанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,66 г (65%) уретана (Id). ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): 11,34 с (1Н, 3-NH), 7,43 д (1H, J=0,9 Гц, Н-6), 7,20 кв (2Н, J=4,7 Гц, MeNH), 6,12 т (1Н, J=6,8 Гц, Н-1'), 4,42 м (1Н, Н-3'), 4,24 дд (1H, J=11,8 и 3,4 Гц, Н-5'а), 4,10 дд (1Н, J=11,8 и 5,2 Гц, Н-5'b), 3,98 м (1Н, Н-4'), 2,59 д (2Н, J=4,4 Гц, MeN), 2,45 м (1Н, Н-2'а), 2,29 м (1Н, Н-2'b), 1,78 д (3Н, J=0,9 Гц, 5-СН ₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,7 с (С4), 156,3 с (NC(O)O), 150,4 с (С2), 135,9 с (С6), 109,9 с (С5), 83,6 с (С1'), 81,2 с (С4'), 63,8 с (С3'), 60,8 с (С5'), 35,8 с (С2'), 27,0 с (Me-N), 12,1 с (5-Ме).

Пример 5.

5'-Этиламинокарбонил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Iе).

К раствору 3'-азидо-3'-дезокситимидина (0,8 г, 3 ммоль) в диметилформамиде (15 мл) добавляли 1,1'-карбонилдиимидазол (0,81 г, 5 ммоль). Смесь перемешивали 4 часа при 18°С, добавляли 70% водный этиламин (5 мл), перемешивали 18 часов. Упаривали реакционную массу и хроматографировали на колонке с силикагелем (2×15 см). Элюировали в градиенте этанола в хлороформе (от 0% до 10% этанола). Целевые фракции упаривали, растворяли в воде и лиофилизовали, получали 0,76 г (72%) уретана (Ie). ¹ Н ЯMP (DMSO-d₆): 11,29 с (1H, 3-NH), 7,43 с (1Н, Н-6), 7,24 т (2Н, J=5,3 Гц, EtNH), 6,12 дд (1Н, J=6,9 и 6,5 Гц, Н-1'), 4,41 м (1Н, Н-3'), 4,23 дд (1Н, J=11,8 и 3,7 Гц, Н-5'а), 4,10 дд (1Н, J=11,8 и 5,0 Гц, Н-5'b), 3,99 м (1Н, Н-4'), 3,03 м (2Н, СН₂СН₃), 2,48 м (1Н, Н-2'а), 2,30 м (1Н, Н-2'b), 1,79 с (3Н, 5-СН ₃), 1,02 т (3Н, J=7,2 Гц, СН₂СН₃). ¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 163,6 с (С4), 155,6 с (NC(O)O), 150,4 с (С2), 135,8 с (С6), 109,8 с (С5), 83,7 с (С1'), 81,3 с (С4'), 63,7 с (С3'), 60,8 с (С5'), 35,6 с (С2'); 35,1 с (СН₂(Et)), 14,9 с (СН ₃(Et)), 12,1 с (5-Ме).

Пример 6.

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфобластоидных Т-клеток СЕМ SS в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ).

Оценка цитотоксичности соединений.

Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии СЕМ SS, помещенной в лунки 96-луночного планшета («Cel-Cult», England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 4 суток. Посевная концентрация составляет 0,5×106 клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток МТТ). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки СЕМ SS в эффективных концентрациях. Следует также отметить, что 50% токсичные дозы на 3-4 порядка превышают эффективные дозы в отношении ВИЧ-1 дозы (таблица).

Влияние исследуемых соединений на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток СЕМ SS исследовано по известной методике.

Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе (результаты представлены в таблице). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемых соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации ВИЧ-1 в культуре-клеток СЕМ SS, сравнимой с эффективностью Никавира.

Таблица 1
Противовирусная активность уретановых производных АЗТ против ВИЧ-1:
Соединение	CD 50, µM	ID50, µМ	IS
Iа	236,6	0,3154	750
Ib	6060	0,632	9583
AZT	29	0,0011	26896

Пример 7.

Собаке весом 12 кг вводили исследуемое вещества орально (в смеси с творогом). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. Пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. Из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). Полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. Супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 40°С, к остатку добавляли воду (1 мл). Аликвоты (20 мкл) анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Gynkotec, Германия; аналитическая колонка Ultrasphere ODC «Beckman» USA. Элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% Н₃РO₄ (рН 2,1) в присутствии 0,15% триэтиламина. Детекция при _max 265 нм, температура 30°С. Фармакокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в таблице 2.

Таблица 2
Фармакокинетические параметры азидотимидина после введения собаке внутрь 250 мг АЗТ, 250 мг Никавира, 630 мг 1а.
соединение	Основные фармакокинетические параметры по наблюдаемому в плазме крови АЗТ
	Cмакс мг/л	Тмакс час	Т1/2, час	AUC мг. ч/л
Ia	1,0	8,0	12	5,2
никавир	1,89	4,0	7,2	16,6
АЗТ	9,77	2,5	5,2	58,8

Таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток СЕМ SS и генерировать АЗТ в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.