способы применения модифицированного вируса гриппа

Формула изобретения

1. Способ предупреждения вирусной инфекции гриппа А субтипа Н5 у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа Н5, где молекула НА включает аспарагин в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5.

2. Способ по п.1, где молекула НА является рекомбинантной молекулой НА, которая включает одну или более замен в аминокислотной последовательности по сравнению с встречающейся в природе молекулой НА, которая включает аминокислоту, отличную от аспарагина в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5.

3. Способ по п.2, где молекула НА в результате повышает иммуногенную активность иммуногенной композиции по сравнению с встречающейся в природе молекулой НА.

4. Способ по п.1, где иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант.

5. Способ по п.1, где иммуногенная композиция дополнительно включает иммуностимулирующую молекулу.

6. Способ по п.1, где иммуногенная композиция дополнительно включает микрокапсулы и/или мембранный носитель, потенцирующий иммунный ответ.

7. Способ по п.1, иммуногенная композиция дополнительно включает красные кровяные тельца (rbc), разрушенные красные кровяные тельца или антиген голубого языка.

8. Способ по п.1, где иммуногенная композиция вводится внутримышечно, перорально или через слизистую.

9. Способ по п.1, где вирусная инфекция вызвана вирусом гриппа H5N1.

10. Способ по п.2, где одна или более аминокислотных замен приводит к изменению сайта гликозилирования.

11. Способ по п.2, где встречающаяся в природе молекула НА выделена из вируса гриппа А человека.

12. Способ по п.2, где встречающаяся в природе молекула НА выделена из птичьего вируса гриппа.

13. Способ по п.2, где аспарагин в аминокислотном положении 223 молекулы НА изменяет специфичность рецепторов сиаловой кислоты.

14. Способ по п.2, где встречающаяся в природе молекула НА включает серин в аминокислотном положении, эквивалентном аминокислотному положению 223.

15. Способ по п.1, где молекула НА является частью рекомбинантного или ослабленного вируса.

16. Способ по п.1, где субъектом является человек.

17. Способ по п.1, где субъектом является млекопитающее или птица.

18. Способ определения эффективности вакцины вируса гриппа А субтипа Н5 у субъекта, где способ включает взаимодействие антисыворотки, полученной от вакцинированного субъекта, с вирусом гриппа, содержащим молекулу гемагглютинина (НА) Н5, где молекула НА включает аспарагин в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5 с последующим определением эффективности вакцины по титрам антител.

19. Способ по п.18, где вирус гриппа является рекомбинантным вирусом.

20. Способ по п.18, где молекула НА является рекомбинантной молекулой НА, которая включает одну или более замен в аминокислотной последовательности по сравнению с встречающейся в природе молекулой НА, которая включает аминокислоту, отличную от аспарагина в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5.

21. Способ по п.20, где молекула НА обладает повышенной реактивностью по отношению к антисыворотке, полученной от субъекта, который подвергнут воздействию вируса гриппа Н5 или вакцины вируса гриппа Н5, по сравнению с встречающейся в природе молекулой НА.

22. Способ определения, инфицирован ли субъект вирусом гриппа А субтипа Н5, где способ включает взаимодействие антисыворотки, полученной из организма субъекта, с вирусом гриппа, включающем молекулу гемагглютинина (НА) Н5, где молекула НА включает аспарагин в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5, с последующим определением, инфицирован ли субъект по титру антител.

23. Способ по п.22, где вирусом гриппа является рекомбинантный вирус гриппа.

24. Способ по п.22, где молекула НА является рекомбинантной молекулой НА, которая включает одно или более изменений в аминокислотной последовательности по сравнению с встречающейся в природе молекулой НА, которая содержит аминокислоту иную, чем аспарагин в аминокислотном положении, соответствующем аминокислотному положению 223 в НА Н5.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США N 60/705808, зарегистрированной 4 августа 2005 г., которая во всей полноте включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Заявление, касающееся исследования или разработки, субсидировавшихся за счет федеральных средств

Исследование, в результате которого было создано настоящее изобретение, проводилось в рамках гранта AI95357 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (National Institute of Allergy and Infectious Disease) и при поддержке Центра раковых исследований (Cancer Center Support (CORE)) в рамках гранта СА21765 Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health). В соответствии с этим правительство США обладает определенными правами на изобретение.

Ссылка на приложение, записанное на компактном диске

Не применимо.

Область техники, к которой относится изобретение

В целом настоящее изобретение относится к повышению антигенности и/или иммуногенности определенных подтипов группы вирусов гриппа.

Предпосылки создания изобретения

Вирусы гриппа

Вирусы гриппа, среди которых, прежде всего, следует отметить конкретные штаммы вирусов А и В, являются серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире в результате ежегодных вспышек заболевания. Периодически, но с нерегулярными интервалами возникают пандемии, приводящие к особенно высоким уровням заболеваемости и смертности. Исторически пандемии явились результатом возникновения новых подтипов вируса гриппа А, которые образовались путем перегруппировки сегментированного генома (антигенная изменчивость), в то время как ежегодные эпидемии, как правило, являются результатом эволюции поверхностных антигенов вируса гриппа А и В (антигенный дрейф). Вирусы гриппа человека часто происходят от птичьих штаммов вируса гриппа, так что в основе заражения гриппом лежит зооноз. Очевидно также, что свиньи могут служить в качестве промежуточного хозяина («смешивающиеся сосуды») при образовании новых происходящих от птиц штаммов, которые являются патогенными для человека (Scholtissek и др., Virology, 147, 1985, с.287). Вспышка заболевания в Гонконге в 1997 г., вызванного штаммом H5N1 вируса гриппа А, показала, что обладающие высокой патогенностью вирусы гриппа А могут передаваться также непосредственно от различных видов птиц человеку (Claas и др., Lancet, 351, 1998, с.472; Suarez и др., J.Virol., 72, 1998, с.6678; Subbarao и др., Science, 279, 1998, с.393; Shortridge, Vaccine, 17 (прил.1), 1999, сс.26-29). В 2003 г. штаммы вирусов H5N1 в Юго-Восточной Азии представляли собой различные сосуществующие генотипы, но в 2004 г. доминантным стал один генотип, известный как «Z-генотип» (Li и др.. Nature, 430, 2004, с.209). Современные данные свидетельствуют о том, что случаи смерти людей были обусловлены непосредственной передачей этого генотипа от птиц человеку и что этот генотип заражает также кошек путем непосредственной передачи от кошки к кошке (Kuiken и др., Science 2004, 306: 241). Это и другие доказательства изменения диапазона хозяев и широкое распространение этого вируса привело к пониманию того, что H5N1-вирусы могут приобретать свойства, позволяющие осуществлять перенос от человека к человеку. Люди не могут приобретать иммунитет к таким H5N1-вирусам, что может вызвать катастрофическую пандемию гриппа (Fouchier и др., Nature, 435, 2005, с.419). Способность вирусов гриппа А образовывать новые патогенные штаммы из огромного количества штаммов, циркулирующих в животных-носителях возбудителей вирусной инфекции, означает, что борьба с этим заболеванием требует осуществления мониторинга этих вирусов и разработки улучшенных противовирусных терапий и вакцин. Скорость, с которой развиваются новые штаммы вируса, требует особого внимания при осуществлении такого мониторинга, включая применение усовершенствованных методов оценки эффективности вакцин против новых штаммов.

Вирусы гриппа А, В и С семейства Orthomyxoviridae, все имеют сегментированный геном с негативной цепочкой РНК, который реплицируется в ядре инфицированной клетки, имеет суммарную кодирующую емкость, составляющую примерно 13 т.п.н., и содержит генетическую информацию для десяти вирусных белков. Конкретно вирусы гриппа имеют восемь генных сегментов антисмысловой РНК (nsPHK), которые кодируют по меньшей мере 10 полипептидов, включая белки РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА), мишенью которых является РНК, нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), гемагглутинин (НА, который после ферментативного расщепления образует ассоциацию субъединиц НА1 и НА2), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) (Krug и др., В: The Influenza Viruses, под ред. R.M.Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс.89-152).

Разработанные в последнее время обратные генетические системы должны дать возможность осуществлять манипуляции с геномом вируса гриппа (Palese и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, с.11354; Neumann и Kawaoka, Adv. Influenza Res., 53, 1999, с.265; Neumann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, с.9345; Fodor и др., J. Virol., 73, 1999, с.9679). Было продемонстрировано, например, что экспрессия восьми nsPHK, осуществляемая плазмидой под контролем промотора ро1 I, и коэкспрессия белков полимеразного комплекса приводит к образованию инфекционного вируса гриппа A (Hoffmann и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, с.6108).

Вирусная частица вируса гриппа имеет размер примерно 125 нм и состоит из ядра, включающего антисмысловую вирусную РНК, ассоциированную с ядерным белком, которое окружено вирусной оболочкой, имеющей двухслойную липидную структуру. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а наружный слой состоит в основном из липидного материала, происходящего из хозяина. Так называемые «поверхностные белки», нейраминидаза (NA) и гемагглютинин (НА) выступают в виде пиков на поверхности тела вируса. Инфективность новых вирусов гриппа зависит от расщепления НА специфическими протеазами хозяина, в то время как NA участвует в отделении вирионов-потомков от клеточной поверхности и предупреждает агглютинацию нового образовавшегося вируса.

Белки НА и NA, погруженные в вирусную оболочку, представляют собой основные антигенные детерминанты вируса гриппа (Air и др.. Structure, Function, and Genetics, 6, 1989, сс.341-356; Wharton и др. в: The Influenza Viruses, под ред. R.M.Krug, изд-во Plenum Press, New York, 1989, сс.153-174). Благодаря перегруппировке сегментированного генома вируса гриппа постоянно образуются новые варианты НА и NA, в отношении которых у только что зараженного организма не вырабатывается анамнестическая реакция (вторичный иммунный ответ). Гликопротеин НА представляет собой основной антиген для нейтрализующих антител и он участвует в связывании вирусных частиц с рецепторами на клетках-хозяевах.

Последовательности молекул НА из различных штаммов вируса обладают значительным сходством как на уровне нуклеиновых кислот, так и на уровне аминокислот. Степень сходства варьируется, когда сравнивают штаммы разных подтипов, при этом для некоторых штаммов характерны более высокие степени сходства, чем для других (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Степени сходства аминокислот варьируются между вирусными штаммами одного подтипа и вирусными штаммами других подтипов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.7643). Эта вариация достаточна для установления отдельных подтипов и направления эволюционной дифференцировки различных штаммов, однако можно довольно легко осуществлять сравнительный анализ первичной структуры ДНК и аминокислотных последовательностей различных штаммов с помощью обычных биоинформационных методов (Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, сс.7643; Suzuki и Nei, Mol. Biol. Evol., 19, 2002, с.501).

Противогриппозные вакцины

Противогриппозные вакцины, разрешенные в настоящее время органами здравоохранения для применения в Соединенных Штатах и Европе, представляют собой инактивированные противогриппозные вакцины, а также живую ослабленную вакцину FLUMIST, применяемую в Соединенных Штатах. Вирусы, являющиеся представителями важных в эпидемиологическом отношении штаммов вируса гриппа А и вируса гриппа В, выращивают в оплодотворенных куриных яйцеклетках, и затем вирусные частицы очищают и инактивируют с помощью химических средств для получения биомассы вакцины. Каждый год ВОЗ отбирает подтипы, которые по прогнозу должны встречаться с наибольшей вероятностью, для создания вакцин.

Хотя противогриппозные вакцины применяют для вакцинации человека с начала 1940-х годов и для вакцинации свиней с конца 1960-х годов, существование многочисленных животных-носителей возбудителей вирусной инфекции в сочетании с угрозой возникновения нового вируса гриппа, способного вызвать пандемию, заставляет проводить исследования с целью разработки новых терапевтических методов борьбы с вирусом. За последние несколько лет в области борьбы с гриппом был достигнут ряд важных успехов (см. обзор Сох и Subbarao, Lancet, 354, 1999, сс.1277-1282). Например, было экспериментально установлено, что интраназальное введение живой ослабленной трехвалентной противогриппозной вакцины может обладать высокой эффективностью в отношении защиты детей младшего возраста от штамма вируса гриппа A H3N2 и вируса гриппа В. Другие подходы к повышению эффективности существующих (убитых) вакцин на основе вируса гриппа включают создание адаптированных для защиты от простуды и сконструированных генетическим путем вирусов гриппа, которые содержат ослабляющие мутации (см. обзор у Palese и др., J. Infect. Dis., 176 прил. 1, 1997. сс.45-49). Существует надежда, что такие измененные генетическим путем вирусы, в которые путем перегруппировки были интродуцированы гены НА и NA из циркулирующих штаммов, можно применять в качестве безопасных живых вакцин на основе вируса гриппа для индукции пролонгированного защитного иммунного ответа у человека. Хотя, по-видимому, адаптированные для защиты от простуды вакцины являются эффективными для детей и подростков, их можно ослаблять в достаточной степени для стимулирования идеального иммунного ответа у пожилых людей, которые представляют собой основную группу из числа 20000-40000 индивидуумов, умирающих каждый год в США в результате заражения гриппом.

Легко доступные вакцины должны стать наиболее эффективным инструментом для борьбы с неожиданно возникающей пандемией гриппа. После вспышки H5N1 в Гонконге в 1997 г. на людях были испытаны вакцины, получаемые с помощью двух различных подходов. Обычная вакцина на основе субъединицы (подтипа) Н5, полученной из A/duck/Singapore/3/97, обладала слабой иммуногенностью для человека даже против близкородственных по антигенным свойствам штаммов и даже после нескольких вакцинации (Nicholson и др., Lancet, 357, 2001, с.1937; Stephenson и др., Journal of Infectious Disease, 191, 2005, с.1210). Применение адъюванта MF59 повышало титр антител к указанной вакцине на основе Н5 (Stephenson и др.. Vaccine, 21, 2003, с.1687). Вакцинация с использованием инактивированной «расщепленной» вакцины, полученной на основе непатогенного вируса A/duck/HK/836/80 (H3N1) и модифицированного гемагглютинина Н5 из вируса А/НК/156/97 (H5N1), индуцировала слабо обнаруживаемые титры нейтрализующих антител (Takada и др.. Journal of Virology, 73, 1999, с.8303). Таким образом, хотя указанные вакцины на основе H5N1 хорошо переносились, оказалось, что они обладали слабой иммуногенностью. Существующий в настоящее время недостаток эффективных вакцин против штаммов вируса H5N1 повышает угрозу того, что эти вирусы могут вызвать пандемическое заболевание.

Иммуногенность противогриппозной вакцины

Методы определения титров антител в сыворотке являются суррогатными методами оценки иммунной защиты после вакцинации или вирусной инфекции. В качестве методов определения титров антител в сыворотке преимущественно применяют анализы титров вирус-нейтрализующих антител и анализы титров с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Эти анализы основаны на способности антител к вирусу гриппа из человеческой сыворотки вступать в перекрестную реакцию с антигенами в условиях in vitro. Методы анализа для конкретной ситуации выбирают не только на основе их способности давать непротиворечивые и применимые результаты, но также и на основе простоты их применения и требований к оборудованию, необходимому для осуществления каждого типа анализа.

В целом анализ на основе нейтрализации вирусов заключается в том, что оценивают способность антител из образца сыворотки блокировать заражение культивируемых клеток вирусом гриппа. Этот анализ осуществляют путем приготовления серийных разведений (титров) образца сыворотки и объединения каждого из этих разведений со стандартным количеством инфекционного вируса. Затем каждую смесь, полученную с использованием этих разведений, вносят в определенную культуру клеток и анализируют полученные коэффициенты заражения. Считается, что анализ титров вирус-нейтрализующих антител является чрезвычайно ценным и надежным тестом для оценки уровня иммунозащитных антител, присутствующих в организме конкретного индивидуума. Однако он зависит от характеристик специализированной культуры клеток, и поэтому не является полностью универсальным. Кроме того, методология является очень трудоемкой и требует большого количества времени, вследствие чего она плохо приспособлена для скрининга большого количества образцов.

При анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) также оценивают способность антител из образца сыворотки связываться со стандартизованным эталонным вирусом. Этот анализ основан на том факте, что вирусы гриппа должны связываться с эритроцитами и вызывать их агглютинацию. В HI-анализе серийные разведения образца сыворотки смешивают со стандартными количествами эталонного вируса и после ряда инкубации добавляют к эритроцитам. После этого визуально выявляют приводящую к образованию комплексов ассоциацию между эталонными вирусами и эритроцитами. Наибольшее разведение сыворотки, которое ингибирует гемагглютинацию, принимают за титр ингибирования гемагглютинации. Хотя HI-анализ не обладает такой же чувствительностью в отношении иммуногенности вакцины, как другие анализы, он находит широкое применение благодаря относительно простой технологии и невысоким требованиям к лабораторному оборудованию.

Принимая во внимание указанные выше ограничения существующих в настоящее время методов, пригодных для разработки и оценки противогриппозных вакцин, существует необходимость в усовершенствовании методов оценки иммуногенности для определения иммунного ответа после заражения, а также эффективности вакцины.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложены аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа А, которые могут изменять антигенность и иммуногенность НА. Эти замены могут приводить к изменению областей детерминанты путем изменения специфичности рецептора и/или связывания антитело-антиген. В различных вариантах осуществления изобретения повышенную антигенность, обусловленную заменой, можно использовать для повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) в образцах сыворотки, взятых у зараженных животных. Такая информация важна для создания предназначенных для диагностики эталонных вирусов и новых противогриппозных вакцин. Предпочтительно аминокислотная замена приводит к образованию молекул, которые обладают иммуногенными характеристиками, свойственными аминокислотной замене на аспарагин в положении 223 в НА Н5-подтипа.

Таким образом, определенные объекты настоящего изобретения относятся к молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющей одну или несколько аминокислотных замен в рецептором сайте связывания, что усиливает антигенность молекулы НА в отношении антител, обладающих специфичностью к молекуле НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайт связывания. Молекула НА с повышенной антигенностью вируса гриппа может содержать аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, которое инфицировано вирусом гриппа, несущим молекулу НА дикого типа. Повышенная антигенность молекулы НА вируса гриппа может быть обусловлена присутствием аминокислоты аспарагина в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03, и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная замена приводит к изменению сайта гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа А человека. Вирус гриппа А человека может являться, например, представителем подтипа Н5. Вирус гриппа А человека может представлять собой вирус гриппа A/Vietnam/1203/04 (H5N1). В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа В. Под объем изобретения подпадают молекулы НА вируса гриппа с повышенной антигенностью, полученные из вируса гриппа птиц.

Другие объекты изобретения относятся к рекомбинантному вирусу гриппа, имеющему молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА большую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания. Рекомбинантный вирус гриппа может включать модифицированную молекулу НА, полученную из вируса гриппа H5N1, в генетическом окружении вируса гриппа А. Вирус гриппа А может представлять собой исходный вакцинный штамм гриппа. Рекомбинантный вирус гриппа можно использовать в качестве диагностического эталонного вируса в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Рекомбинантный вирус гриппа можно включать в набор для анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

Другие объекты изобретения относятся к обратным генетическим системам, предназначенным для получения вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания.

Следующие объекты представленного в настоящем описании изобретения относятся к способам создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецептором сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют рекомбинантный вектор, который экспрессирует молекулу НА с повышенной антигенностью, в обратную генетическую систему.

Кроме того, родственными объектами изобретения являются способы определения эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, присутствующей в вакцине на основе вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА с повышенной антигенностью получают из изолята А/НК/213/03 человеческого H5N1, и включение аспарагина в положение, которое соответствует положению 223 в НА из вируса H5N1, приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма вакцинированного животного. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Другими родственными объектами настоящего изобретения являются способы создания вируса гриппа, который содержит молекулу гемагглютинина (НА), заключающиеся в том, что культивируют с помощью обратного генетического процесса обратную генетическую систему, в которой кодирующая НА ДНК кодирует одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецептором сайте связывания.

Кроме того, изобретение относится к способам повышения чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), которые заключаются в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного или инфицированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет одну или несколько аминокислотных замен в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 2-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). В некоторых вариантах осуществления изобретения способ повышения чувствительности HI-анализа приводит по меньшей мере к 4-кратному повышению чувствительности анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

Другим объектом изобретения являются способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с предназначенным для диагностики эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, приводящую к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Следующими объектами изобретения являются другие способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, при этом включение аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа с молекулой НА дикого типа, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотка. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа, заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом, который выведен из рассматриваемого вируса гриппа, но содержит модифицированную молекулу НА вируса гриппа, которая имеет аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное представляет собой человека. В других вариантах осуществления изобретения животное представляет собой хорька.

Под объем изобретения подпадают также предназначенные для получения вакцины вирусы гриппа, содержащие молекулу гемагглютинина (НА), имеющую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических для молекулы НА, в которой отсутствуют аминокислотные замены в ее рецепторном сайте связывания, и где модификация приводит к повышению иммуногенности вакцинного вируса.

Одним из объектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, содержащую аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула НА вируса гриппа, кодируемая выделенной нуклеиновой кислотой, содержит аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где молекула НА не выведена из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, зараженного вирусом гриппа.

Кроме того, изобретение относится к способам получения нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая содержит аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в ее рецепторном сайте связывания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что интродуцируют нуклеотидную последовательность в нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания, что приводит к аминокислотной замене в последовательности молекулу НА, придающей молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена.

Под объем настоящего изобретения подпадают эти и другие объекты изобретения, как это более подробно указано в разделах «Подробное описание изобретения» и «Примеры».

Описание чертежей

На чертежах показано:

На фиг.1 - график, иллюстрирующий HI-титры антител у хорьков, которым инокулировали вирусы гриппа H5N1, выделенные в 2003 г. и 2004 г. (A); HI-титры и титры вирус-нейтрализующих антител у хорьков, иммунизированных вирусами H5N1/03 и H5N1/04 (Б). Представленные на фиг.1А данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых в день 28 после инокуляции 10⁶ EID₅₀ (средняя инфицирующая доза для куриного эмбриона) вирусов H5N1, которые титровали против 4 гемагглютинирующих единиц (HAU) гомологичного вируса. Данные представляют собой репрезентативные значения, полученные для 2 или 4 образцов сыворотки. Представленные на фиг.1Б данные получены с использованием образцов сыворотки, взятых из организма хорьков, вакцинированных дважды с использованием каждый раз по 7 мкг НА вирусов H5N1/03 и H5N1/04, которые титровали против 4 HAU и 100 TCID ₅₀ (средняя цитопатогенная доза) гомологичного вируса соответственно.

На фиг.2 - график, иллюстрирующий вирусные титры в назальных смывах, полученных у вакцинированных и контрольных хорьков после контрольного заражения вирусом A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Хорькам, вакцинированным рекомбинантными вирусами H5N1/04 или Н5/04, интраназально инокулировали 10⁶ EID ₅₀ вируса A/Vietnam/1203/04. Титры представляют собой средние значения (log₁₀ EID₅₀/0,1 мл) ± С.К.О., определенные для назальных смывов у 3 хорьков.

Следует отметить, что различия в величинах титров для вакцинированной и контрольной групп являются статистически достоверными и характеризуются значениями р, составляющими 0,0028-0,0173 согласно неспаренному t-критерию.

На фиг.3 - модель молекулы полипептида НА Н5, на которой показано положение аминокислоты (положения 154 и 223) в трехмерной (3D-) структуре НА вируса A/duck/Singapore/3/97 (H5N3). На фиг.3А указаны рецепторный сайт связывания аминокислот в 3D-структуре. На фиг.3Б кружок обозначает поверхность раздела между представленным мономером и двумя другими мономерами (не показаны) в трехмерной молекуле НА. Аминокислота в положении 223 находится в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, который, как правило, присутствует в положении 222, и остатком глицина, который, как правило, присутствует в положении 224.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложены изменения в аминокислотной последовательности молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которые придают молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых, отсутствуют изменения. Такие изменения последовательности включают замены и делеции. Образовавшийся НА обозначают как «НА с повышенной антигенностью».

Молекулу НА с повышенной антигенностью можно применять для тестирования эффективности вакцины, поскольку изменение повышает чувствительность методов диагностики антител к вирусу гриппа в сыворотке. В конкретном варианте осуществления изобретения вирус представляет собой вирус гриппа А. В другом варианте осуществления изобретения вирус может представлять собой также вирус гриппа В, а еще в одном вариант осуществления изобретения он может представлять собой вирус гриппа С. В варианте осуществления изобретения, в котором вирус представляет собой вирус гриппа А, он может являться Н5-подтипом вируса гриппа А. В более конкретном варианте осуществления изобретения молекулу НА Н5-подтипа модифицируют с целью включения аминокислоты аспарагина в положение 223 (N₂₂₃), что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной от животного, инфицированного Н5-подтипом вируса гриппа. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула НА, предлагаемая в изобретении, не представляет собой молекулу НА А/НК/213/03, которая относится к встречающемуся в естественных условиях Н5-подтипу, содержащему аспарагин в положении 223. Вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа А человека Н5-подтипа, включая вирус A/Vietnam/1203/04 (H5N1).

Аминокислотные изменения, которые придают молекуле НА бóльшую антигенность, можно осуществлять в рецепторном связывающем домене НА, например, как показано на фиг.3А, прежде всего в области 220-петли рецепторного связывающего домена. Такое изменение может уменьшать связывание НА с рецепторами сиаловой кислоты на эритроцитах, повышая тем самым способность антител к НА ингибировать гемагглютинацию, что приводит к усилению способности связываться с антителом в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации. В альтернативном варианте аминокислотное изменение, которое придает молекуле НА бóльшую антигенность, можно осуществлять для того, чтобы изменить или удалить путем делеции сайт гликозилирования на белке НА, прежде всего сайт гликозилирования, который маскирует эпитопы на НА, распознаваемые специфическими в отношении НА антителами. Еще в одном варианте осуществления изобретения аминокислотное изменение можно осуществлять на аминокислотном остатке, соответствующем остатку 223 НА Н5-подтипа. Во всех вариантах осуществления изобретения аминокислотные модификации, которые придают молекуле НА бóльшую антигенность, можно легко идентифицировать с помощью иммуноанализов с использованием антител, специфических в отношении конкретного подтипа НА. Модификация, которая придает молекуле НА бóльшую антигенность, должна приводить к заметно более высокой связывающей активности в отношении титруемого антитела по сравнению со связывающей активностью в отношении молекулы НА, к которой вырабатываются антитела. К таким анализам относятся анализы с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

В конкретном варианте осуществления изобретения замена в молекуле НА Н5-подтипа остатка серина (который может представлять собой гликозилированный остаток) на аспарагин (который может быть либо негликозилированным, либо иметь другую схему гликозилирования) приводит к повышению антигенности. Однако другие замены также могут приводить к заметному повышению антигенности. Такие замены могут представлять собой консервативные замены, такие как замена треонина на серин или глутамина на аспарагин, но не обязательно консервативные замены. Они могут сохранять относительную полярность, например, замена аспарагина на серин или лизина на аспарагиновую кислоту, что сохраняет полярность, существовавшую до указанных изменений. Можно рассматривать также замену на такие остатки, как глицин и аланин, что приводит к устранению реактивной боковой цепи, не оказывая существенного влияния на структуру полипептида. И, наконец, можно осуществлять полностью неконсервативные изменения. И в этом случае с помощью простых иммуноанализов можно устанавливать, приводит ли конкретное изменение к повышению антигенности.

Некоторые H5N1-вирусы гриппа птиц, выделенные в Центральной и Южной Америке, несут основную аминокислоту аргинин в положении 223. Нейтральная аминокислота аспарагин обнаружена в положении 223 НА человеческого изолята А/НК/213/03. Этот аминокислотный остаток расположен в 220-петле рецепторного связывающего домена между остатком глутамина, как правило, присутствующим в положении 222, и. остатком глицина, как правило, присутствующим в положении 224 (фиг.3). Экспериментальные данные позволяют предположить, что более высокие HI-титры отражают изменение специфичности рецептора. Фактически глутамин, как правило, присутствующий в положении 222, и глицин, как правило, присутствующий в положении 224, связываются непосредственно с рецептором сиаловой кислоты. Аминокислоты, присутствующие в 220-петле, или смежные с ней играют важную роль в конформации рецепторного связывающего кармана (На и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, с.11181). Хотя в настоящем изобретении не утверждается какое-либо конкретное объяснение наблюдаемого эффекта, может оказаться возможным, что замена аспарагина на серии в положении 223 Н5 приводит к конформационным изменениям и изменяет специфичность рецептора.

Согласно следующему объекту изобретения молекулы НА, модифицированные в соответствии с изобретением с целью достижения большей антигенности, обладают также большей иммуногенностью. Такие молекулы в качестве компонента противогриппозной вакцины могут вызывать более сильный или эффективный иммунный ответ, что, в свою очередь, приводит к более эффективной защите от заражения гриппом.

Вирусы гриппа, источником которых являются птицы-носители возбудителей инфекции, имеют особое значения для общественного здравоохранения. Считается, что эти вирусы с наибольшей вероятностью способны вызывать вспышки пандемии гриппа в человеческой популяции. Поэтому молекула НА из птичьего подтипа с повышенной антигенностью и/или иммуногенностью может оказаться наиболее пригодной для применения в иммуноанализах, проводимых при разработке вакцины. Стратегию, проиллюстрированную в настоящем описании на примере Н5, можно применять для повышения титров в HI-анализе (ингибирование гемагглютинации) против других подтипов НА, что особенно важно для оценки иммунитета в отношении гриппа птиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекулу НА, имеющую аминокислотные замены в рецепторном сайте связывания, можно получать из вируса гриппа птиц, включая подтипы от HI до H16 включительно.

Одним из объектов настоящего изобретения является применение рекомбинантного вируса гриппа, содержащего молекулу НА с повышенной антигенностью, в качестве эталонного вируса в иммуноанализе, прежде всего HI-анализе, а также набор для осуществления такого анализа. Например, замена аминокислоты аспарагина в положении 223 в молекуле НА Н5 повышает связывание с рецепторами сиаловой кислоты эритроцитов (RBC), имеющими альфа-2,6-связь, такими, которые присутствуют в организме кур, но понижает связывание с рецепторами, имеющими N-гликозилсиаловую кислоту с альфа-2,3-связью, такими, которые присутствуют в организме лошади. Таким образом, один из объектов изобретения заключается в том, что в результате достигнутой пониженной способности к связыванию с рецепторами на лошадиных RBC должно требоваться меньшее количество антитела для ингибирования гемагглютинации. Этот принцип, заключающийся в интродукции аминокислотных замен, повышающих антигенность, что оценивают по связыванию с антителом, можно применять ко всем 16 подтипам НА, включая подтипы вирусов гриппа А птиц.

Под объем изобретения подпадают способы оценки эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животного. Этот способ заключается в том, что антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с вирусом гриппа, содержащим молекулу гемагглютинина (НА) с повышенной антигенностью. В некоторых вариантах способа оценки эффективности вакцины на основе вируса гриппа для животных, как это продемонстрировано с помощью примеров, антисыворотку, полученную из организма вакцинированного животного, подвергают взаимодействию с молекулой НА Н5-подтипа вируса гриппа, содержащей аминокислоту аспарагин в положении 223 (N₂₂₃), например, молекулой НА из изолята человеческого H5N1 А/НК/213/03. Присутствие аспарагина в положении 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного другим Н5-подтипом вируса гриппа. Вакцинированное животное может относиться к любому из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.

Под объем настоящего изобретения подпадают также способы повышения чувствительности HI-анализа путем использования эталонного вируса, который содержит молекулу НА с повышенной антигенностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, таких, в которых молекула НА выведена из изолята штамма человеческого H5N1 А/НК/213/03, аминокислотная замена заключается в интродукции аспарагина в положение 223, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа Н5, имеющим другой аминокислотный остаток в этом положении, таким как A/Vietnam/1203/04. Такое повышение реактивности может достигать любого уровня, в том числе по меньшей мере 2-кратного или по меньшей мере 4-кратного повышения реактивности. 2-кратное или 4-кратное повышение чувствительности может оказаться особенно важным в ситуациях, когда конечные концентрации при использовании общепринятых методов титрования находятся ниже предела обнаружения.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является также применение в качестве диагностического эталонного вируса рекомбинантного вируса гриппа, который содержит модифицированную молекулу НА Н5-подтипа, имеющую аминокислоту аспарагин в положении 223, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа Н5. В конкретном варианте осуществления изобретения молекула НА Н5 в диагностическом эталонном вирусе выведена из изолята штамма человеческого H5N1 А/НК/213/03. В другом варианте осуществления изобретения остаток аспарагина (или глутамата) заменен в положение 223 молекулы Н5 из другого штамма вируса гриппа. Очевидно, что такой же подход можно применять для любой молекулы НА из любого штамма вируса гриппа. В различных вариантах осуществления изобретения животное может представлять собой любое из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.

Помимо применения в качестве обладающих повышенной чувствительностью эталонных вирусов в клинических опытах по изучению вакцины для человека, эти вирусы можно применять в сероэпидемиологических исследованиях. Получение данных, показывающих как много людей заражены вирусами H5N1, с помощью быстрых и простых методов обнаружения, таких как HI-анализы, позволяет получать важную информацию о распространенности вирусов H5N1 среди людей. Эти данные можно использовать для оценки вероятности передачи вирусов H5N1 от человека к человеку или от различных видов птиц к человеку.

К другим объектам изобретения относятся способы определения того, инфицировано ли животное вирусом гриппа, заключающиеся в том, что антисыворотку, полученную из организма животного, подвергают взаимодействию с диагностическим эталонным вирусом. Диагностический эталонный вирус получают из того же штамма вируса гриппа, что и инфицирующий вирус, но эталонный вирус содержит молекулу НА с повышенной антигенностью. В одном из вариантов осуществления изобретения эталонный вирус содержит молекулу НА, имеющую остаток аспарагина в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, где включение остатка аспарагина приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа, содержащим молекулу НА дикого типа, что приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки. В другом варианте осуществления изобретения эталонный вирус содержит молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющую аминокислоту аспарагин в положении, соответствующем положению 223 в НА Н5, и где молекула Н5 не происходит из изолята человеческого Н5 А/НК/213/03 и включение остатка аспарагина в положение 223 приводит к повышению реактивности в отношении антисыворотки, полученной из организма животного, инфицированного вирусом гриппа. В конкретном варианте осуществления изобретения инфицирующий вирус представляет собой вирус H5N1 и эталонный вирус представляет собой изолят человеческого H5N1 А/НК/213/03, который содержит остаток аспарагина в положении 223 аминокислотной последовательности, что приводит к повышению реактивности в отношении H5N1-специфической антисыворотки. В других вариантах осуществления изобретения животное может представлять собой любое из многочисленных видов животных, включая хорьков и человека.

Под объем изобретения подпадают также противогриппозные вакцины, содержащие молекулу НА с повышенной антигенностью. В конкретном варианте осуществления изобретения вирус представляет собой изолят человеческого H5N1. В более конкретном варианте осуществления изобретения НА получают из изолята А/НК/213/03. Еще в одном варианте осуществления изобретения НА представляет собой Н5, модифицированный путем включения аминокислоты аспарагина в положение 223.

Введение модификаций в молекулу НА требует осуществления манипуляций на генетическом уровне, как это хорошо известно в данной области и описано более подробно ниже. После создания модифицированного гена НА можно использовать ряд подходов, таких как обратные генетические методы, для интродукции модифицированной молекулы НА в вирус гриппа, в результате чего его можно применять в качестве эталонного вируса для тестирования эффективности вакцины или диагностического эталонного вируса для наблюдения за эпидемиями гриппа, включая передачу вируса от животного к человеку и передачу вируса от человека к человеку.

Некоторые объекты изобретения относятся к рекомбинантным вирусам гриппа, содержащим молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, имеющую по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, которое придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствуют изменения. Изменения в аминокислотной последовательности могут включать замену или делецию одной или большего количества аминокислот. Модифицированную молекулу НА можно получать из вируса гриппа H5N1 в генетическом окружении вируса гриппа А. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус гриппа А представляет собой исходный вакцинный штамм вируса. Рекомбинантные вирусы, содержащие модифицированную молекулу НА, обладающую повышенной антигенностью в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствует изменение в аминокислотной последовательности, можно применять в качестве диагностического эталонного вируса в анализе с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI). Рекомбинантный вирус можно также включать в состав набора для анализа с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI).

Другие объекты изобретения относятся к способам создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА). Например, одним из объектов изобретения является способ создания вируса, содержащего молекулу гемагглютинина (НА) вируса гриппа, которая имеет по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. Способ может заключаться в интродукции рекомбинантного вектора, экспрессирующего модифицированный НА в обратной генетической системе. Способ создания вируса гриппа, содержащего молекулу гемагглютинина (НА), может заключаться в культивировании с помощью обратного генетического метода обратной генетической системы, в которой ДНК, кодирующая НА, кодирует аминокислотную замену в рецепторном сайте связывания, что придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания.

Под объем изобретения подпадают также способы получения нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу гемагглютинина (НА). Молекула НА может иметь по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности, которое придает молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекул НА, в которых отсутствуют изменения. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что нуклеотидную последовательность интродуцируют в нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецепторном сайте связывания, что приводит к аминокислотной замене в последовательности молекулы НА, придающей молекуле НА бóльшую антигенность в отношении антител, специфических в отношении молекулы НА, в которой отсутствует аминокислотная замена.

Определения

В контексте настоящего описания понятие «вирус гриппа» относится к типам вируса, патогенные штаммы которых вызывают заболевание, известное под названием инфлюэнца или грипп.

Понятие «исходный вакцинный штамм вируса» обозначает штамм вируса, который применяют для создания используемых в вакцине штаммов, обладающих способностью к быстрому росту, или ослабленных штаммов. Такие исходные вакцинные штаммы, как правило, содержат шесть сегментов гена, используемых в вакцинном вирусе (РВ1, РВ2, PA, NP, NA, М и NS). Исходный вакцинный штамм вируса может представлять собой штамм, который применяют также в качестве компонента вакцины, в частности штамм вируса A/PR/8/34.

Понятие «полипептид» относится к полимеру аминокислот и не связано с конкретной длиной продукта; таким образом, под определение «полипептид» подпадают пептиды, олигопептиды и белки. Это понятие не относится или не включает посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п.

В контексте настоящего описания понятие «инфекционный» обозначает способность вируса размножаться в клетке и продуцировать вирусные частицы. Инфективность можно оценивать либо путем обнаружения вируса, т.е. вирусной нагрузки, либо путем выявления развития заболевания у животного.

Понятия «индивидуум» или «субъект», или «животное» в контексте настоящего описания относятся к позвоночным, которые подвержены инфекции, вызываемой вирусом с антисмысловой цепью РНК, конкретно инфекции, вызываемой вирусом гриппа, включая (но не ограничиваясь ими) птиц (таких как водоплавающие и куры) и представителей различных видов млекопитающих, таких как псовые, кошачьи, волки, хорьки, грызуны (крысы, мыши и т.д.), лошади, коровы, овцы, козы, свиньи и приматы, последние включают человека. В конкретном варианте осуществления изобретения субъект представляет собой хорька, который является пригодным модельным животным для изучения гриппа. В другом варианте осуществления изобретения субъект представляет собой человека.

В контексте настоящего описания понятие «иммуногенный» означает, что вирус или полипептид обладает способностью вызывать гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа. Иммуногенная субстанция является также антигенной. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа при введении животному.

Молекула является «антигенной», если она обладает способностью специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Антигенный полипептид содержит «эпитоп», состоящий по меньшей мере из примерно пяти и предпочтительно по меньшей мере из примерно 10 аминокислот. Антигенный фрагмент полипептида, который в настоящем описании обозначают также как «эпитоп», может представлять собой фрагмент, который является иммунодетерминантой для распознавания антителом или Т-клеточным рецептором, или он может представлять собой фрагмент, используемый для создания антитела к молекуле путем конъюгации антигенного фрагмента с полипептидом-носителем с целью иммунизации. Не является необходимым, чтобы антигенная молекула была сама по себе иммуногенной, т.е. обладала способностью вызывать иммунный ответ в отсутствии носителя.

В контексте настоящего описания понятие «аминокислотная замена» относится к встраиванию аминокислоты в конкретное положение в аминокислотной последовательности, рассматриваемой молекулы. Аминокислотная замена представляет собой замену конкретной аминокислоты на любую другую аминокислоту, которая может занимать рассматриваемое положение. Полипептид, образующийся в результате изменения аминокислотной последовательности, может содержать также изменения, представляющие собой посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, или любые другие аминокислотные модификации, а также аминокислотную замену.

В контексте настоящего описания понятие «обратная генетическая система» относится к методам создания частиц вируса гриппа, полипептидов, вирионов или нуклеиновых кислот с использованием методов генной инженерии. Такие методы включают (но, не ограничиваясь ими) «плазмидную систему», описанную у Hoffmann (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165; публикация патента США 2002/0164770 А1, 7 ноября 2002 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте). В целом, обратные генетические системы позволяют создавать вирусные частицы, полипептиды и/или нуклеиновые кислоты, содержащие специфические последовательности, с использованием методов генной инженерии, известных специалистам в данной области. Такие системы описаны также более подробно ниже.

В контексте настоящего описания понятие «рецепторный сайт связывания» относится к фрагменту молекулы НА, с которым связывается представляющий интерес рецептор, такой как рецептор сиаловой кислоты на эритроцитах. Структура молекулы Н5 A/duck/Singapore и положение рецепторного сайта связывания гемагглютинина вируса Н5-подтипа известны и описаны в литературе (На и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, с.11181). Модель молекулы указанного НА Н5, включая рецепторный сайт связывания, представлены на фиг.3.

Понятие «диагностический эталонный вирус» относится к вирусу, содержащему НА с повышенной антигенностью. Такой диагностический эталонный вирус можно применять в иммуноанализе, например, в анализе ингибирования гемагглютинина.

Понятие «инфицирующий вирус» относится к вирусу, который инфицирует конкретное животное. Такая инфекция может осуществляться в процессе повседневной деятельности, такой как контакт с инфицированным субъектом, например, приводящий к инфицированию человека инфекционным вирусом гриппа. Такая инфекция может являться результатом специального клинического контрольного заражения, например, при проведении лабораторных опытов, например, когда лабораторное животное, такое как хорек, специально инфицируют вирусом. Такая инфекция может быть осуществлена при иммунизации с использованием противогриппозной вакцины.

Понятие «фармацевтически приемлемый» относится к молекулам и композициям, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, при введении человеку не вызывают аллергическую или аналогичную неблагоприятную реакцию, такую как желудочное расстройство, головокружение и т.п. В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый» предпочтительно означает «утвержденный» регулирующим органом Федерального правительства или правительства штата или «разрешенный» Фармакопеи США или другими общепризнанными фармакопеями для применения на животных и более конкретно для человека.

Понятие «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, вместе с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая масла, полученные из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей, прежде всего для инъекционных растворов, предпочтительно используют воду или водные физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Пригодные фармацевтические носители описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» под ред. E.W.Martin, 18-е изд.

В контексте настоящего описания понятие «адъювант» относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфатической системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood и др., Immunology, 2-изд., изд-во Benjamin/Cummings, Menio Park, СА, 1984, с.384). Часто первичное контрольное заражение с использованием только антигена в отсутствии адъюванта не может вызывать гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ. Адъюванты включают (но не ограничиваясь ими) полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масло или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки и потенциально пригодные для человека адъюванты, такие как N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин, БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно адъювант является фармацевтически приемлемым.

В контексте настоящего описания понятие «выделенный» означает, что рассматриваемый материал удален из его нативного окружения, например, из клетки или вируса. Так, выделенный биологический материал может быть свободен от некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых нативный материал встречается в естественных условиях (например, цитоплазматического или мембранного компонента). Следует считать, что материал выделен, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. В случае молекул нуклеиновой кислоты к выделенным нуклеиновым кислотам относится ПЦР-продукт, выделенная мРНК, кДНК или полученный путем рестрикции фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота предпочтительно «вырезана» из хромосомы, в которой она может присутствовать, и более предпочтительно не связана с некодирующими областями и не находится в непосредственной близости от них (однако она может быть связана с ее нативными регуляторными областями или их фрагментами), или с другими генами, расположенными против хода или по ходу транскрипции относительно гена, содержащегося в выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, когда она присутствует в хромосоме. Еще в одном варианте осуществления изобретения в выделенной нуклеиновой кислоте отсутствует один или несколько интронов. К выделенным молекулам нуклеиновой кислоты относятся последовательности, встроенные в плазмиды, космиды, искусственные хромосомы и т.п., т.е. когда они представляют собой часть химерной рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты. Так, в конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками или нуклеиновыми кислотами, с которыми он связан в клетке, или ими обоими, или с клеточными мембранами, если он представляет собой ассоциированный с мембраной белок. Выделенную органеллу, клетку или ткань удаляют из анатомической области, в которой она присутствует в организме. Выделенный материал может быть очищен, но это не является обязательным.

В контексте настоящего описания понятие «очищенный» относится к материалу, который был выделен в условиях, которые позволяют уменьшить или исключить присутствие не имеющих отношения к нему материалов, т.е. загрязнителей, включая нативные материалы, из которых получен рассматриваемый материал. Например, очищенный вирион предпочтительно практически свободен от компонентов клетки-хозяина или культуры, включая тканевую культуру или белки яйцеклетки, неспецифические патогены и т.п. В контексте настоящего описания понятие «практически свободен от» используют в конкретном контексте аналитического определения чистоты материала. Предпочтительно очищенный материал, практически свободный от загрязнителей, имеет по меньшей мере 50%-ную степень чистоты, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную степень чистоты, и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%-ную степень чистоты. Степень чистоты можно оценивать с помощью хроматографии, гель-электрофореза, иммуноанализа, анализа состава, биологического анализа и других методов, известных в данной области.

Методы очистки хорошо известны в данной области. Вирусные частицы можно очищать с помощью ультрафильтрации или ультрацентрифугирования, предпочтительно непрерывного центрифугирования (см. Furminger, выше). Можно применять другие методы очистки, которые рассмотрены в настоящем описании. Очищенный материал может содержать менее, чем примерно 50%, предпочтительно менее, чем примерно 75%, и наиболее предпочтительно менее, чем примерно 90% клеточных компонентов, сред, белков или других нежелательных компонентов или примесей (смотря по контексту), с которым он был ассоциирован в исходном состоянии. Понятие «практически чистый» означает наибольшую степень чистоты, которую можно достичь с помощью общепринятых методов очистки, известных в данной области.

В конкретном варианте осуществления изобретения понятие «примерно» или «приблизительно» означает, что величина находится в статистически определенном диапазоне значений. Такой диапазон может составлять по порядку величин предпочтительно 50%, более предпочтительно 20%, еще более предпочтительно 10%, и еще более предпочтительно 5% от указанного значения или диапазона. Допустимые вариации, подпадающие под понятие «примерно» или «приблизительно», зависят от конкретной рассматриваемой системы и обычный специалист в данной области легко может оценить их.

Гемагглютинин

Гемагглютинин (НА) представляет собой основной оболочечный гликопротеин вирусов гриппа А и В. Гемагглютинин-эстераза (НЕ) вирусов гриппа С представляет собой гомолог НА этих вирусов. Новые подтипы молекул НА, источником которых, как правило, являются водоплавающие птицы, которые, как известно, представляют собой естественные носители вирусов гриппа, приводят к возникновению пандемий гриппа (см. Suzuki и Nei, Mol. Biol. Evol., 19(4), 2002, сс.501-509).

НА имеет две полипептидные цепи, НА1 и НА2, кодируемые одним геном и образующиеся в результате протеолиза из одной молекулы-предшественника, включающего потерю сигнального пептида (Suzuki и Nei, выше; Air, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(12), 1981, сс.7639-7643). НА1 содержит примерно 320-аминокислот и представляет собой белок, связывающий рецептор, который является основной мишенью иммунных ответов. НА2 содержит примерно 220 аминокислот и обеспечивает «заякоривание» на вирусной оболочке (Suzuki и Nei, выше).

Гены НА из вируса гриппа А подразделяют на 16 подтипов в соответствии с их антигенными свойствами. Гены НА (НЕ) вирусов гриппа В и С не подразделяют на подтипы. Последовательности подтипов H1-H15 вируса гриппа и НА (НЕ) вирусов гриппа В и С представлены в статье Suzuki и Nei, выше, на фиг.1, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Сравнение последовательностей НА подтипов H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, H11 и H12 вируса гриппа А, включая консервативные аминокислотные остатки из всех двенадцати подтипов, представлено на фиг.1 в статье Air, выше, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. В обеих ссылках описаны штаммы, из которых были получены эти последовательности.

Новые молекулы НА, предлагаемые в изобретении, создают путем интродукции таких изменений в аминокислотную последовательность молекулы НА, которые приводят к повышению антигенности. Выделение нуклеиновых кислот, кодирующих такие молекулы НА, является стандартной процедурой (см. Air, выше), также как и модификация нуклеиновой кислоты с целью интродукции изменений в аминокислотную последовательность, которую осуществляют, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза.

В альтернативном варианте осуществления изобретения молекулы НА одного из штаммов конкретного подтипа НА уже содержат аминокислотную последовательность, которая усиливает антигенность по сравнению с молекулами НА того же подтипа из других штаммов, что проиллюстрировано в настоящем описании на примере штамма А/НК./213/03, родственного, например, штамму A/Vietnam/1203/04. В этом случае штамм вируса гриппа, содержащий молекулу НА с большей антигенностью, может служить в качестве диагностического эталонного штамма. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотные остатки из НА с большей антигенностью можно интродуцировать или осуществлять с их использованием замену в последовательности молекулы НА с меньшей антигенностью, придавая тем самым молекуле НА бóльшую антигенность.

К повышению антигенности могут приводить различные изменения последовательности молекулы НА. Как указано выше, цепью, в которой можно осуществлять такие изменения, является цепь НА1, которая представляет собой рецепторный связывающий домен и служит основной мишенью иммунного ответа. Изменения могут повышать аффинность антитела к молекуле НА, например, в результате удаления сайта гликозилирования, который образует эпитоп, или в результате образования более благоприятной конформации, обладающей повышенной аффинностью к связыванию с антителом. В альтернативном варианте изменение может приводить к уменьшению связывания с рецептором НА, например, рецептором сиаловой кислоты на эритроцитах, в результате чего антитела, специфические в отношении молекулы НА, становятся более эффективными конкурентами в реакции гемагглютинации. Различные иммуноанализы, позволяющие выявлять такие изменения, включая анализ с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI), хорошо известны в данной области.

В HI-анализе используют целые частицы вируса гриппа, которые применяют в настоящее время в вакцинах. Таким образом, в изобретении предложены вирусы гриппа, содержащие молекулы НА с повышенной антигенностью. Такие вирусы наиболее удобно создавать с помощью «обратного генетического метода», хотя можно применять также классический метод перегруппировки.

Обратные генетические методы

Разработанные в настоящее время обратные генетические методы позволяют осуществлять манипуляции с геномом вируса гриппа (Palese и др., Ргос.Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996, с.11354; Neumann и Kawaoka, Adv. Гриппа Res., 53, 1999, с.265; Neumann и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1999, с.9345; Fodor и др., J. Virol., 73, 1999, с.9679; заявка на патент США 20040029251). Например, было продемонстрировано, что обеспечиваемая плазмидой экспрессия восьми вРНК под контролем промотора polI и всех мРНК под контролем промотора polII приводит к образованию инфекционного вируса гриппа A (Hoffmann и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, с.6108; публикация патента США N 20020164770, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в части, касающейся описания минимальной плазмидной обратной генетической системы и описания методов генной инженерии). Такие методы рекомбинации позволяют осуществлять специфическое создание типов вируса гриппа со специфическими изменениями аминокислотной последовательности полипептида. Молекула НА, содержащая требуемую замену, может представлять собой часть рекомбинантного вируса гриппа. Рекомбинантный вирус гриппа можно создавать также любыми методами, известными специалистам в данной области, включая такой метод генной инженерии, как метод, основанный на использовании «только плазмидной» системы (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165). Рекомбинантный вирус гриппа можно получать из вируса H5N1. Рекомбинантный вирус может находиться в генетическом окружении вируса H1N1, применяемого для создания вакцины, такого как вирус A/PR/8/34 или любой вирус гриппа А, включая адаптированные для защиты от простуды штаммы A/Leningrad/134/17/57, A/Leningrad/134/47/57 и A/Ann Arbor/6/60. Нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности молекулы НА, можно выделять из вируса и секвенировать.

Методы выделения и модификации конкретных нуклеиновых кислот и белков хорошо известны специалистам в данной области. Согласно настоящему изобретению можно применять общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Sambrook, Fritsch и Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (в настоящем описании цитируется как «Sambrook и др., 1989»); DNA Cloning: A Practical Approach, тома I и II, под ред. D.N.Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J.Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, под ред. B.D.Hames и S.J.Higgins, 1985; Transcription And Translation, под ред. B.D.Hames и S.J.Higgins, 1984; Animal Cell Culture, под ред. R.I.Freshney, 1986; Immobilized Cells And Enzymes, изд-во IRL Press, 1986; В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel, P.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 1994, Эти методы включают сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов с измененными нуклеотидами для получения ПЦР-продуктов, содержащих мутации (например, с помощью набора «Quikchange», производимого фирмой Stratagene).

Иммуноанализы

Для обнаружения связывания и повышенной антигенности, создаваемой согласно настоящему изобретению, можно применять разнообразные методы обнаружения иммуноспецифического связывания антитела с антигеном, известные в данной области. Один из первых методов обнаружения взаимодействия между антигеном и антителом был основан на обнаружении и анализе комплекса с помощью преципитации в гелях. Другой метод обнаружения связанной пары анализируемая субстанция-идентифицирующее антитело основан на использовании меченного радиоактивным йодом идентифицирующего антитела или меченного радиоактивным йодом белка, обладающего реактивностью в отношении IgG, такого как протеин А. Эти первые методы хорошо известны специалистам в данной области, и обзор этих методов дан в Methods in Enzymology, 70, 1980, сс.166-198.

Более поздние методы определения присутствия анализируемой субстанции в образце с использованием только одного антитела основаны на применении анализов конкурентного связывания. В этом методе антитело, которое чаще всего должно быть иммобилизовано на твердой подложке, приводят в контакт с образцом, который, как предполагают, содержит анализируемую субстанцию, в сочетании с известным количеством меченой анализируемой субстанции. После этого две анализируемые субстанции, а именно, меченая анализируемая субстанция и анализируемая субстанция, содержащаяся в образце, должны конкурировать за сайты связывания антитела. Определяют количественно либо свободную меченую анализируемую субстанцию, либо связанную меченую анализируемую субстанцию и по результатам этого измерения определяют количество конкурирующей анализируемой субстанции в образце. Более подробно этот метод описан в «Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction» (у Labat, Methods in Enzymology, 70, 1980, сс.3-70). В этом случае меченая анализируемая субстанция может нести либо радиоактивную, либо ферментную метку.

В более современных иммуноанализах применяют метод двойных антител для обнаружения присутствия анализируемой субстанции. Эти методы также описаны в процитированном томе Methods in Enzymology. Так, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения присутствие индивидуальных маркеров определяют с использованием пары антител для каждого из предназначенных для обнаружения маркеров. В контексте настоящего описания одно из указанной пары антител обозначают как «идентифицирующее антитело», а второе из указанной пары антител обозначают как «иммобилизованное антитело». Так, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют сэндвич-метод с использованием двух антител для обнаружения анализируемой субстанции в образце биологической жидкости. В этом методе анализируемую субстанцию помещают между идентифицирующим антителом и иммобилизованным антителом, причем иммобилизованное антитело необратимо иммобилизовано на твердой подложке. Идентифицирующее антитело должно нести обнаруживаемую метку для того, чтобы идентифицировать присутствие сэндвича антитело-анализируемая субстанция и тем самым присутствие анализируемой субстанции.

Первые обычные твердые подложки находились в форме полистироловых пластин, трубок или гранул, которые все хорошо известны в области радиоиммунного анализа и иммуноферментного анализа. В последние годы в качестве твердых подложек применяют многочисленные пористые материалы, такие как нейлон, нитроцеллюлоза, ацетат целлюлозы, стекловолокно и другие пористые полимеры.

Можно применять различные методы и соответствующие сенсорные устройства. Автоматизированные устройства для анализа включают устройства для анализа с непрерывной/произвольной выборкой. Примерами таких систем являются OPUS фирмы РВ Diagnostic System, Inc. и анализатор IMX , созданный фирмой Abbott Laboratories of North Chicago, I11. Приборы для автоматизированного анализа фирмы РВ Diagnostic Systems, Inc. описаны в U.S. 5051237; 5138868; 5141871 и 5147609.

Другими классами систем для иммунохимического анализа, которые можно использовать при осуществлении на практике настоящего изобретения, являются оптические иммуносенсорные системы. В целом, оптический иммуносенсор представляет собой устройство, в котором используются принципы оптики для количественного превращения представляющих интерес химических или биохимических концентраций или активностей в электрические сигналы. Эти системы можно сгруппировать в четыре основные категории: устройства для измерения отражения; устройства для измерения резонанса поверхностного плазмона; волоконные оптические (световодные) устройства и интегрально-оптические устройства. Устройства для измерения отражения включают эллипсометрические устройства, устройства для множественной интегральной отражательной спектроскопии и капиллярные устройства с флуоресцентным заполнением. Волоконные оптические устройства включают устройства для измерения флуоресценции в быстро изменяющемся поле, оптические волоконные капиллярные трубки и волоконные оптические флуоресцентные сенсоры. Интегрально-оптические устройства включают устройства для измерения флуоресценции в плоском быстро изменяющемся поле, иммуносенсор с градирующим устройством ввода, интерферометр Маха-Цендера, интерферометр Хартмана и разностные (дифференциальные) интерферометрические сенсоры. Голографическое обнаружение реакций связывания осуществляют путем обнаружения присутствия голографического изображения, которое создают в заранее назначенном положении изображения, когда один реагент связывающейся пары связывается с иммобилизованным вторым реагентом связывающейся пары (см. U.S. N 5352582, выданный 4 октября 1994 г. на имя Lichtenwalter и др.). Примеры оптических иммуносенсоров описаны в целом в обзорной статье G.A.Robins, Advances in Biosensors, 1, 1991, сс.229-256. Более конкретное описание этих устройств можно найти, например, в U.S. 4810658; 4978503 и 5186897; у R.A.Brady и др. в Phil. Trans. R. Soc. Land. В., 316, 1987, сс.143-160 и у G.A.Robinson и др. в Sensors and Actuators, изд-во Elsevier, 1992).

Для установления диагноза гриппа, а также в поисковых исследованиях, касающихся эпидемиологии и антигенности вирусных штаммов, широко применяют серологические анализы. В частности, широко применяют анализ с использованием реакции торможения гемагглютинации (HI) благодаря минимальным требованиям к лабораторному оборудованию и простоте применения. Предполагается, что настоящее изобретение должно повысить применимость HI-анализа благодаря повышению его чувствительности. HI-анализ можно применять также для выявления антигенности модифицированной молекулы НА и для облегчения характеризации модифицированной молекулы НА в качестве молекулы, обладающей большей или меньшей антигенностью, чем немодифицированные молекулы.

HI-анализ позволяет определять способность антител из образца сыворотки связываться со стандартизованным эталоном. В HI-анализе серийные разведения (титры) образца сыворотки смешивают со стандартными количествами эритроцитов и визуально выявляют их ассоциацию в комплексы. Результатом анализа является установление нижнего предела титра сыворотки, при котором можно визуально обнаружить комплекс.

Как указано выше, в настоящем изобретении предложен улучшенный способ получения и валидации вакцин для лечения или предупреждения инфекций, вызываемых вирусом гриппа. В частности, настоящее изобретение применимо к вакцинам, которые получают с помощью обратных генетических методов. Предполагается, что изобретение должно найти применение для валидации и проверки иммунного ответа после вакцинации. В частности, благодаря повышенной антигенности модифицированной молекулы НА изобретение позволяет проводить (но, не ограничиваясь этим) более эффективное обнаружение антител после того, как индивидуум был инфицирован вирусом гриппа. Эта повышенная антигенность обеспечивает повышенную чувствительность анализа, применяемого для обнаружения иммунного ответа, такого как HI-анализ.

Создание вакцины

Как показано ниже на примерах, модифицированный вирус, содержащий молекулу НА с повышенной антигенностью, сам по себе обладает большей иммуногенностью, что, в свою очередь, приводит к более сильному иммунному ответу и более высокому потенциалу вакцины.

Стратегии повышения эффективности вакцины включают применение адъювантов (Wood и Williams, выше), совместное введение иммуностимулирующих молекул (Salgaller и Lodge, J. Surg. Oncol., 68, 1998, с.122) и стратегий вакцинации через слизистую оболочку. Стратегии иммунизации через слизистую оболочку включают инкапсуляцию вируса в микрокапсулы (U.S. 5075109, 5820883 и 5853763) и использование иммунопотенциирующего мембранного носителя (WO 98/0558). Кроме того, иммуногенность вводимых оральным путем иммуногенов можно повышать путем использования эритроцитов (RBC) или гемолизированных RBC (U.S. 5643577), или путем использования антигена «синего языка» (blue tongue antigen) (U.S. 5690938). Хотя эти подходы являются многообещающими для разработки будущих стратегий вакцинации, их применение в конкретных ситуациях требует валидации и наблюдения для гарантии эффективности вакцины. Предполагается, что представленное в настоящем описании изобретение должно улучшить эти стратегии, в том числе путем повышения способности обнаруживать их терапевтические действия.

Примеры

Ниже различные объекты изобретения проиллюстрированы на примерах, не ограничивающих его объем.

Пример 1: Титры антитела в сыворотке инокулированных хорьков

Обладающие высокой патогенностью вирусы H5N1 получали от находящихся в Азии лабораторий, сотрудничающих с Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ). Всю работу с этими вирусами проводили на оборудовании BL3+ в Детском исследовательском госпитале Св. Иуды (St. Jude Children's Research Hospital). При создании изобретения для сравнения иммуногенности вирусов гриппа Z-генотипа, выделенных в 2003 г., который стал преобладающим в 2004 г., с вирусами, выделенными в 2004 г., осуществляли инокуляцию хорьков вирусом H5N1, выделенным из организма погибшего человека (А/НК/213/03) (Guan и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2004, с.8156), и четырьмя вирусами H5N1, выделенных из организма человека, куриц и соколов в 2004 (фиг.1А). Самцов и самок выведенных путем аутбридинга хорьков получали в рамках специальной программы селекции Центра ресурсов животных при St. Jude Children's Research Hospital. Животные имели возраст 3-5 месяцев и при проведении HI-анализов они давали отрицательную серологическую реакцию (были серонегативными) в отношении заражения циркулирующими в настоящее время вирусами гриппа A H1N1, H3N2 и H5N1 и вирусов гриппа В. Вирусы размножали в аллантоидных полостях 10-дневных оплодотворенных куриных яйцеклеток при 35°С в течение 48 h. Аллантоидную жидкость, собранную после одного пассажа оплодотворенных куриных яйцеклеток, замораживали при -80°С и использовали в экспериментах. Сывороточные антитела при проведении HI-анализа титровали и осуществляли контрольное заражение вирусами через 28 дней после инокуляции. Вирус А/НК/213/03 индуцировал высокие титры антитела (от 1:640 до 1:1280), в то время как четыре штамма 2004 г. индуцировали очень низкие HI-титры (от 1:20 до 1:40).

Сравнительно низкие HI-титры вирусов H5N1 2004 г. могли являться результатом общей иммуносупрессии, индуцированной вирусом. Однако результаты вакцинации с использованием вакцин H5N1-A/PR/8/34 (6+2), которые содержали НА и нейраминидазу из А/НК/213/03 и A/Vietnam/1203/04, показали, что основной вклад в этот эффект может быть обусловлен различиями в Н5 (фиг.1Б). Вакцинация с использованием двух доз вакцины H5N1/03 по 7 мкг индуцировала высокие уровни антител в сыворотке, которые можно было обнаруживать как с помощью HI-анализа, так и теста по нейтрализации вируса (фиг.1Б). После такой же вакцинации с использованием H5N1/04 при HI-анализе были обнаружены очень низкие (примерно 1:20) титры, в то время как нейтрализующие титры были намного выше (они составляли примерно половину от титров, индуцированных H5N1/03). В проведенных ранее исследованиях было установлено, что инактивированная вакцина, полученная на основе A/duck/Singapore/3/97 (H5N3), индуцировала низкие или необнаруживаемые уровни антитела в сыворотке (Nicholson и др., Lancet, 357, 2001, с.1937; Stephenson и др., Vaccine, 21, 2003, с.1687). Взятые в совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что некоторые изоляты Н5 могут обладать необычными иммуногенными и/или антигенными свойствами. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей Н5 позволил установить, что НА из вирусов А/НК/213/03 и A/Vietnam/1203/04 гриппа различаются 10 аминокислотами в НА 1-области (таблица 1б). Вирус A/Vietnam/1203/04 имеет потенциальный сайт гликозилирования на остатке аспарагина N₁₅₄ (N*₁₅₄-S ₁₅₅-T₁₅₆, N-X-S/T, Х Р). Сравнение последовательностей позволило выявить три аминокислоты (S₁₂₀, K₁₈₉ и S₂₂₃ ), которые присутствовали во всех вирусах 2004 г, но не присутствовали в А/НК/213/03. Для вируса A/Vietnam/1203/04 отличительной особенностью было присутствие K₂₁₂.

Пример 2: Создание рекомбинантных вирусов Н5-A/PR/8/34 и определение их антигенных характеристик

Для оценки влияния идентифицированных аминокислот на иммуногенность и защиту от контрольного заражения вирусом (введения провокационной пробы) при создании изобретения использовали 8-плазмидную обратную генетическую систему для создания рекомбинантных вирусов, несущих семь сегментов гена A/PR/8/34 и сегмент гена НА A/Vietnam/1203/04, содержащий одиночные точковые мутации (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165). Рекомбинантные вирусы, лишенные патогенности в результате модификации НА Н5 в сайте расщепления, создавали с помощью ДНК-трансфекции (Hoffmann и др., Vaccine, 20, 2002, с.3165). Точковые мутации встраивали в НА с помощью ПЦР с использованием набора для сайтнаправленного мутагенеза QuikChange® (фирма Stratagene, Цедар Крик, шт.Техас, США) и набора специфических для НА Н5 праймеров. Перегруппированные вирусы содержали ген НА или гены НА и нейраминидазы (NA) из вирусов H5N1 в генетическом окружении вируса A/PR/8/34 (H1N1) (см. таблицу 1а, в которой представлены вирусы, сконструированные при создании настоящего изобретения, и указаны их сокращенные обозначения). Аллантоидную жидкость, собранную после одного пассажа оплодотворенных куриных яйцеклеток, замораживали при -80°С и использовали в экспериментах. Гены НА рекомбинантных вирусов амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и секвенировали с целью проверки того, что присутствуют только указанные мутации. Изменение аминокислотной последовательности проверяли путем секвенирования сегмента НА рекомбинантных вирусов (таблица 1а).

Для оценки антигенных свойств и разнообразия рекомбинантных НА при создании изобретения проводили HI-анализы с использованием панели из шести моноклональных антител к НА (таблица 2). Моноклональные антитела (МАт) СР24, СР46, СР58 и 406/7 к НА вируса A/chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N3) создавали в Отделении инфекционных заболеваний St.Jude Children's Research Hospital. МАт VN04-6 к НА вируса A/Vietnam/1203/04 и МАт НК03-3 к НА вируса А/НК/213/03 создавали с помощью модифицированного метода, описанного у Kohler и Milstein (Kaverin и др., Journal of Virology, 78, 2004, с.240; Koher и др., European Journal of Immunology, 6, 1976, с.5.11). Пять МАт вступали в реакцию при относительно высоких титрах с вирусом H5N1/03, но только 3 вступали в реакцию с НА Н5/04. Схемы реактивности вирусов H5_{S155 N, T156 A}/04, H5_{S120 N}/04 и H5_{R212 K}/04 в целом были сходными со схемой реактивности вируса Н5/04. Реакции вируса H5_{S120 N, S155 N, Т156 А}/04 были сходными с реакциями вируса H5N1/03. Четыре МАт распознавали Н5/04 НА, несущий мутацию S₂₂₃ N ( H5_{S223 N}/04). Обратная мутация N₂₂₃ S в НА вируса 2003 г. ( H5N_{223 S}/03) приводила к существенному уменьшению HI-титров или к утрате способности распознаваться МАт.

Пример 3: HI-анализы с использованием куриных и лошадиных эритроцитов

Другой интересный результат был получен в HI-анализе с использованием куриных и лошадиных эритроцитов (RBC). Интересно отметить, что рекомбинантный вирус H5_{S223 N}/04 обладал слабой способностью вызывать агглютинацию 1%-ных лошадиных RBC, но приводил к агглютинации куриных RBC при высоких титрах (1:1024). Ни для одного из остальных рекомбинантных вирусов реакции с куриными и лошадиными RBC не различались между собой в такой степени.

Пример 4: Вакцинация хорьков мутантными рекомбинантными вирусами Н5-подтипа

При создании изобретения оценивали иммуногенность и защитную эффективность инактивированных вакцин путем вакцинации групп, включающих по 3 хорька, которую осуществляли путем внутримышечной инъекции препаратов вирусов H5N1/04, Н5/04, H5_{S155 N, T156 A}/04, H5_{S120 N}/04 и H5_{S223 N}/04, стандартизованных в отношении содержания их НА. Для стандартизации H5N1/03 применяли метод простой радиальной имунодиффузии (Webby и др., Lancet, 363, 2004, с.1099). Остальные рекомбинантные вирусы разделяли путем электрофореза в 12%-ном ДСН-полиакриламидном геле, окрашенные гели анализировали с помощью денситометрии на анализаторе люминесцентных изображений типа LAS-1000plus фирмы FUJIFILM и количественно оценивали НА путем сравнения с препаратом эталонного белка. После осуществления двух инъекций по 7 мкг НА каждому животному инокулировали A/Vietnam/1203/04 (H5N1), Группы по 3 хорька вакцинировали путем внутримышечной инъекции 250 мкл стерильного ЗФР, содержащего 7 мкг НА из инактивированных очищенных вирусов. Вакцинные вирусы инактивировали, концентрировали, очищали согласно описанному в литературе методу (Liu и др. Virology, 314, 2003, с.580; Webby и др., Lancet, 363, 2004, с.1099). Трем контрольным животным вводили путем инъекции 250 мкл только одного стерильного ЗФР. В день 21 после вакцинации брали образцы сыворотки и осуществляли вторую внутримышечную инъекцию 7 мкг НА. Через две недели снова брали образцы сыворотки и осуществляли контрольное заражение путем инокуляции вируса.

Вакцинированных и контрольных животных инокулировали как описано выше интраназально 10⁶ средних инфицирующих доз для куриного эмбриона (EID₅₀) вируса A/Vietnam/1203/04 (Govorkova и др.. Journal of Virology, 79, 2005, с.2191). В течение двух недель ежедневно осуществляли мониторинг клинических признаков инфекции, измерение веса тела и температуры. Хорьков, у которых были выявлены признаки серьезного заболевания, умерщвляли. Для оценки постинфективного иммунного ответа дополнительные группы хорьков инокулировали 10⁶ EID₅₀ изолятов А/НК/213/03, A/Vietnam/3046/04, A/Vietnam/3062/04, A/chicken/Vietnam/39/04 и A/falcon/HK/D0028/04 человеческого и птичьего H5N1. В день 28 после инокуляции у животных брали образцы сыворотки. Для определения титров вируса в верхних дыхательных путях в дни 3, 5 и 7 брали образцы с помощью назального лаважа (Govorkova и др., Journal of Virology, 79, 2005, с.2191). Содержащийся в образцах вирус титровали в 10-дневных оплодотворенных куриных яйцеклетках и выражали в виде log₁₀ EID ₅₀ на 0,1 мл. Титры вируса в назальных смывах у всех вакцинированных животных составляли от 2,5 до 4,5 log₁₀ EID₅₀ в день 3, от 0,5 до 2,5 log10 EID₅₀ в день 5 и 0,25 log₁₀ EID₅₀ или менее в день 7 (фиг.2). У невакцинированных хорьков средний титр составлял 4,0 log ₁₀ EID₅₀ спустя одну неделю после заражения. У двух из трех контрольных хорьков были выявлены признаки серьезного заболевания (большая потеря веса и паралич) и они были умерщвлены, а один умер от инфекции. Среди вакцинированных хорьков только у одного развилось серьезное заболевание. У этого хорька, вакцинированного вирусом H5_{S120 N}/04, были выявлены серьезные неврологические признаки и он был умерщвлен в день 7 после инокуляции. У этого хорька в день 4 был выявлен серьезный вирусный конъюнктивит с последующим распространением вируса в головной мозг. По-видимому, вирус был занесен в глаза в процессе осуществления назального лаважа в день 3 и быстрое распространение по нейронам в головной мозг вызвало энцефалит. У остальных вакцинированных хорьков в течение первых трех дней после контрольного заражения вирусом была выявлена пониженная активность, потеря веса тела и повышенная температура тела. Эти признаки исчезли к пятому дню, и все животные быстро вернулись к норме. Таким образом, все протестированные вакцинные вирусы защищали хорьков от смертельного заражения A/Vietnam/1203/04. Вакцинация приводила к понижению титров вируса в верхних дыхательных путях и уменьшала продолжительность выделения вируса в среду.

Пример 5: Оценка с помощью HI-анализов и тестов по нейтрализации иммуногенности рекомбинантных вирусов H5-A/PR/8/34

Полученную от вакцинированных хорьков сыворотку тестировали в отношении присутствия рекомбинантных вирусов с помощью HI-анализа и анализа нейтрализации вируса (таблицы 3 и 4 соответственно). Образцы сыворотки, взятые у хорьков, обрабатывали в течение ночи ферментом, разрушающим рецептор холерного вибриона (Vibrio cholerae) (фирма Denka-Seiken, Токио, Япония), инактивировали тепловой обработкой при 56°С в течение 30 мин и абсорбировали 0,5%-ной суспензией куриных эритроцитов (CRBC). Стандартный HI-анализ и анализ нейтрализации вируса в клетках MDCK осуществляли согласно описанному в литературе методу (Palmer и др., Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, изд-во US Department of Health, Education and Welfare, 1975; Kida и др., Virology, 122, 1982, с.38).

В каждом HI-анализе использовали по четыре гемагглютинирующие единицы (HAU) вируса и в каждом анализе нейтрализации вируса использовали по 100 средних цитопатогенных доз (TCID₅₀). Для сыворотки, полученной из организма хорьков, вакцинированных псевдовирионом дикого типа с одним геном ( Н5/04, эталонный вирус) HI-титры составляли 1:20. Конструкция, в которой был удален сайт гликозилирования ( H5_{S155 N; T156 A}/04), индуцировала HI-титры, составляющие от 1:10 до 1:20. Для мутантного Н5 HA_{S120 N}/04 HI-титры составляли от 1:20 до 1:80. В отличие от этого вакцинация с использованием H5_{S223 N}/04 приводила к HI-титру, составляющему 1:640, а другие протестированные иммунные сыворотки вступали в реакцию с вирусом H5_{S223 N}/04 при высоких HI-титрах (от 1:160 до 1:320). Таким образом, хотя вакцинация индуцировала защитный иммунитет, уровни обнаруживаемого антитела были различными.

Все вирусы Н5/04 после вакцинации индуцировали высокие титры нейтрализующих вирус антител (от 1:320 до 1:1280) (таблица 4). Не было выявлено существенных различий между гомологичными и гетерологичными нейтрализующими титрами. Следовательно, выявленные различия между сыворотками в отношении распознавания НА не отражают способности антител нейтрализовать вирус.

Пример 6: Реактивность рекомбинантных вирусов

При создании изобретения с целью дополнительной оценки реактивности рекомбинантных вирусов использовали HI-анализ для тестирования гипериммунной сыворотки мыши и куриц, полученной после вакцинации с использованием вирусов H5N1/03 и /НК/213/03, против рекомбинантных вирусов с измененными НА (таблица 5). Средние HI-титры против гомологичного вируса H5N1/03 составляли 1:2560. HI-титры против Н5/04 составляли 1:160. HI-титры против рекомбинантного вируса H5_{S223 N}/04 превышали по меньшей мере в два раза титры против других мутантов.

Для получения дополнительной информации о вкладе аминокислоты, присутствующей в положении 223, в серологическую реактивность при создании изобретения был сконструирован рекомбинантный вирус, в котором Н5 был получен из А/НК/213/03, имеющий только точковую мутацию N₂₂₃ S (таблица 1а). Этот рекомбинантный вирус H5T_{N223 S}/03 характеризовался более низкими HI-титрами в куриных и лошадиных RBC, чем вирус H5N1/03. Для дополнительной оценки влияния аминокислоты в положении 223 на распознавание антигена антителом при создании изобретения был сконструирован рекомбинантный вирус, который содержал НА дикого типа и имел НА из A/duck/Singapore/3/97 с мутацией S₂₂₃ N (см. таблицу 1а). Эти вирусы тестировали с помощью HI-анализа с использованием панели антисыворотки к Н5 и МАт (таблица 6). Замена S₂₂₃ N в НА приводила к резкому повышению HI-титров (в 4 раза и более). Однако эта мутация не приводила к значительному изменению схемы реактивности НА A/duck/Singapore/3/97, прежде всего в реакциях с МАт: ни исходный, ни мутантный НА не вступал в реакцию с МАт, представляющими собой НК03-3 и СР46, и оба вступали в реакцию с СР46 с низкими титрами (таблица 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что замена S223 N в НА повышает чувствительность HI-анализа.

Пример 7: Второе поколение диагностических эталонных вирусов, которые должны повышать чувствительность HI-анализа

Выше в примере 3 уже было продемонстрировано, что в результате замены аминокислоты в положении 223 НА Н5 на аспарагин повышалась чувствительность HI-анализа с использованием куриных эритроцитов. При создании изобретения было доказано, что основой этого эффекта на молекулярном уровне является измененная рецепторная специфичность. Мутантный вирус с повышенной чувствительностью не вызывает агглютинацию лошадиных эритроцитов, в которых присутствует только альфа-2,3-связь. Следовательно, аминокислотные замены, которые приводят к потере способности вызывать агглютинацию лошадиных эритроцитов, являются кандидатами для повышения потенциала чувствительности HI-анализа с использованием куриных эритроцитов. Этот принцип можно применять ко всем 16 подтипам НА, прежде всего вирусов гриппа А птиц, которые обладают специфичностью в отношении 2,3-связи.

Обратные генетические методы позволяют создавать рекомбинантные вирусы, которые имеют минимальные изменения своих антигенных структур, но являются «оптимизированными» с точки зрения распознавания различных клеточных субстратов. Предпочтительно подвергают мутации аминокислоты (91, 130-134, 149, 151, 179, 186, 190-191, 220-225 в Н5-подтипе), которые расположены вблизи от сайта связывания рецептора или представляют собой его часть. Можно создавать плазмиды содержащие сконструированные генетическим путем НА, и путем котрансфекции создавать вирусы. Рекомбинантные вирусы можно тестировать путем анализа НА с использованием параллельно куриных эритроцитов и лошадиных эритроцитов. Вирусы, которые вызывают агглютинацию куриных эритроцитов и не вызывают агглютинацию лошадиных эритроцитов, являются кандидатами для тестирования с помощью HI-анализов. С помощью дополнительных экспериментов создают вирусы, которые вызывают агглютинацию лошадиных эритроцитов и не вызывают агглютинацию куриных эритроцитов. Использование комбинации кандидатов, имеющих одиночные аминокислотные замены, может еще более повысить чувствительность. Следует ожидать, что выявление кандидатов может привести к выявлению диагностических эталонных вирусов со специфической реактивностью к рецепторам, обладающим специфичностью в отношении 2,3-связи.

11-недельных серонегативных в отношении вируса гриппа хорьков вакцинировали дважды с 3-недельными интервалами путем внутримышечной инъекции инактивированного очищенного и концентрированного препарата, содержащего 7 мкг НА в 250 мкл ЗФР. Данные представляют собой HI-титры, представленные индивидуально для 3 хорьков. В HI-анализах применяли 0,5%-ные куриные RBC.

Таблица 4.
Нейтрализующие вирус титры сыворотки хорьков после вакцинации с использованием вирусов, содержащих модифицированный НА вируса A/Vietnam/1203/04.
Вирус	Нейтрализующие титры антитела после иммунизации с использованием:
H5N1/04	Н5/04	HS155 N, T156 A/04	H5S223 N/04	конт роль
H5N1/03	1280	1280	320	640	320	640	1280	1280	320	640	640	640	<80
H5N1/04	2560	1280	640	1280	640	640	1280	1280	640	640	1280	1280	<80
Н5/04	1280	1280	640	1280	640	640	1280	1280	640	640	1280	1280	<80
H5S155 N, Т156 А/04	1280	1280	640	1280	640	640	1280	1280	640	1280	1280	1280	<80
H5S223 N/04	1280	1280	1280	1280	120	640	1280	1280	320	1280	1280	1280	<80
H5S223 NN1/04	1280	1280	640	1280	640	640	1280	1280	640	1280	1280	1280	<80

Анализ нейтрализации осуществляли в клетках MDCK. Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений, которые полностью ингибируют 100 TCID₅₀ вируса. Гомологичные титры подчеркнуты. Величины представляют собой нейтрализующие титры, указанные индивидуально для каждого из 3 хорьков.

Таблица 5.
HI-анализы антисыворотки к H5N1 2003 г. в отношении мутантных вирусов
Поликлональная антисыворотка к:
Вирус	вакцина AH5N1/03	A/HK/213/03 (H5N1)
H5N1/03	2560	2560
Н5/04	160	160
H5S155 N; T156 A	80	320
H5S120 N/04	320	320
H5S223 N/04	1280	640

HI-анализ проводили в титрационных микропланшетах, содержащих 0,5%-ные куриные RBC (см. Palmer и др. в: Immunology series no. 6. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention, изд-во US Department of Health, Education and Welfare, 1975). Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений сыворотки, которые ингибируют гемагглютинин 4 HAU вируса.

Таблица 6.
Анализ антигенности вирусов Н5/97 и H5S223 N/97 с использованием поликлональных и моноклональных антител.
Вирус	HI-титр поликлональной антисыворотки:	НI-титр МАт:
	A/ck/Hidalgo/94	A/HK/156/97	A/Gs/HK/497-4/97	A/ck/HK/YU22/02	A/HK/2 13/03	ДН5/03	VN04-6 *	НК03-3	СР58	СР24	СР46	СР406/7
АН5/03	20	320	5120	12800	160	5120	25600	6400	1600	12800	<100	1600
Н5/97	40	640	640	320	<10	10	3200	<100	3200	1600	<100	3200
H5 S223 N/97	320	10240	10240	2560	80	1280	25600	<100	25600	51200	200	25600
* МАт к НА вируса A/Vietnam/1203/04;
МАт к НА вируса A/HK/213/03;
МАт к НА вируса A/chicken/Pennsylvania/13 70/83.

HI-анализ проводили в титрационных микропланшетах, содержащих 0,5%-ные куриные RBC (14). Титры представляют собой обратные величины наименьших разведений сыворотки, которые ингибируют гемагглютинин 4 HAU вируса.

Объем настоящего изобретения не ограничен представленными в настоящем описании конкретными вариантами осуществления изобретения. Фактически специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и прилагаемыми чертежами должны быть очевидны различные модификации изобретения помимо тех, которые представлены в настоящем описании. Следует считать, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, следует иметь в виду, что все величины являются приблизительными и приведены с целью иллюстрации.

Все патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, включены в описание в качестве ссылки во всей полноте.