терапевтические композиции (ii)

Формула изобретения

1. Применение циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I)

или его комплекса с одним или несколькими катионами, или его соли для лечения болезненных состояний, опосредованных свободными радикалами, токсическими агентами, такими, как пептиды и белки, и генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами обмена глюкозы или состояниями, вызывающими дефект, ишемии, травмы головы, и/или для повышения эффективности работы клетки.

2. Применение по п.1, где один или несколько катионов выбраны из группы, включающей натрий, калий, магний и кальций, или где соединение является свободным олиголидом, не связанным в комплекс.

3. Способ лечения клетки с нарушением функций, обусловленным действием свободных радикалов, токсических агентов, таких, как пептиды и белки, и генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами обмена глюкозы, или состояниями, вызывающими дефект, ишемии, травмы головы, и/или для повышения эффективности работы клетки, отличающийся тем, что включает введение циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I).

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что циклический эфир (R)-3-гидроксибутирата формулы (I) действует в качестве нейронального стимулятора, например, способного стимулировать рост аксонов и/или дендритов нервных клеток, например клеток гиппокампа или субстанции нигра, in vivo или in vitro, в особенности при состояниях, когда нейродегенерация имеет серьезные клинические последствия.

5. Способ осуществления энтерального или парентерального питания, предпочтительно перорального способа питания, включающий введение циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I) в физиологически приемлемой форме необязательно в физиологически приемлемом носителе.

6. Способ продуцирования физиологически приемлемого кетоза у человека или животного, включающий пероральное введение циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I).

7. Способ по п.6, при котором человек или животное питается по диете, содержание жира в которой составляет менее 50 мас.% от ее калорического содержания.

8. Способ по п.6, при котором человек или животное питается по диете, содержание жира в которой составляет от 0 до 25 мас.% от ее калорического содержания.

9. Способ по п.5 или 6, используемый в отношении больного, нуждающегося в лечении одного или нескольких из следующих заболеваний: болезнь Альцгеймера, паркинсонизм, амилотропный латеральный склероз, эпилепсия, заболевание, опосредованное свободными радикалами, сердечная недостаточность, диабет II типа, недостаточность или блокада пируватдегидрогеназы, неспособность к осуществлению гликолиза в клетках одного или нескольких типов и мышечная дистрофия Дюшенна.

10. Способ обеспечения калорического замещения углеводов для снижения уровня глюкозы в крови, включающий введение композиции, содержащей циклический эфир (R)-3-гидроксибутирата формулы (I), человеку или животному, нуждающемуся в таком замещении.

11. Способ обеспечения калорического замещения углеводов для снижения содержания уровня липидов в организме, включающий введение композиции, содержащей циклический эфир (R)-3-гидроксибутирата формулы (I), человеку или животному, нуждающемуся в таком снижении.

12. Способ повышения эффективности образования энергии в митохондриях человека или животного, не страдающего хроническим или острым метаболическим заболеванием, включающий введение человеку или животному циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I) в количестве, достаточном для повышения уровня (R)-3-гидроксибутирата в крови до величины от 0,5 до 20 мМ.

13. Способ по п.12, при котором уровень повышается до величины от 1 до 10 мМ.

14. Применение циклического эфира (R)-3-гидроксибутирата формулы (I) при получении лекарства для лечения болезненных состояний, опосредованных свободными радикалами, токсическими агентами, такими, как пептиды и белки, генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами обмена глюкозы, или состояниями, вызывающими дефект, ишемии, травмы головы, или для повышения эффективности работы клетки.

15. Композиция для лечения болезненных состояний, опосредованных свободными радикалами, токсическими агентами, такими, как пептиды и белки, и генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами обмена глюкозы, или состояниями, вызывающими дефект, ишемии, травмы головы, и/или для повышения эффективности работы клетки, отличающаяся тем, что она содержит циклический эфир (R)-3-гидроксибутирата формулы (I) в физиологически приемлемой форме.

16. Композиция по п.15, отличающаяся тем, что она содержит физиологически приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к композициям, которые подходят для введения человеку и животным и которые характеризуются свойством повышать уровень (R)-3-гидроксибутират ((R)-3-гидроксимасляная кислота или D--гидроксибутират) при их введении, особенно, когда вводятся перорально, местно, подкожно или парентерально, но наиболее успешно - перорально.

Введение (R)-3-гидроксимасляной кислоты характеризуется рядом благоприятных воздействий на организм человека и животных. Среди прочего это включает повышение активности сердечной мышцы, например, при сердечной недостаточности, обеспечение альтернативного глюкозе источника энергии, например, при диабете и состояниях устойчивости к инсулину, и лечение нарушений, вызываемых повреждением нервных клеток, например клеток ЦНС, в частности, путем замедления или предотвращения поражения мозга, такого как наблюдаемое при болезни Альцгеймера и паркинсонизме, а также сходных заболеваний и состояний.

Установлено, что гидроксибутират натрия усиливает мозговое кровообращение и местные вазомоторные рефлексы на 40% включительно (Biull. Eksp. Biol. Med Vol 88 11, pp.555-557).

В патенте ЕР 0780123 А1 описано далее применение ацетоацетата, -гидроксибутирата, их эфиров с одноатомными, двухатомными и трехатомными спиртами, или линейных олигомеров, содержащих от 2 до 10 единиц -гидроксибутирата для подавления отека мозга, защиты мозговой деятельности, коррекции энергетического метаболизма мозга и уменьшения степени церебрального инфаркта.

Внутривенное вливание натриевых солей (R)-3-гидроксибутирата проводили здоровым людям и пациентам с рядом заболеваний, например, которых лечили от тяжелого сепсиса в палате интенсивной терапии, и было обнаружено, что оно не токсично и способно снижать концентрацию глюкозы, свободных жирных кислот и глицерина, но не эффективно в отношении снижения окисления лейцина.

В настоящем изобретении дополнительно установлено, что соединения и композиции, которые увеличивают уровень (R)-3-гидроксимасляной кислоты и/или ацетоацетата в крови также обладают полезностью для уменьшения свободных радикалов in vivo и, таким образом, имеют значение при лечении заболеваний, ассоциированных со свободнорадикальными процессами.

(R)-3-Гидроксибутират и ацетоацетат, обычно называемые кетоновыми телами, создают нормальную физиологическую альтернативу обычным веществам, продуцирующим энергию, глюкозе и жирным кислотам. При длительном голодании у человека жирные кислоты превращаются в печени в (R)-3-гидроксимасляную кислоту и ацетоацетат, которые могут использоваться большинством главных тканей организма за исключением печени. В таких условиях общее количество кетоновых тел крови увеличивается до приблизительно 7 мМ. Когда они увеличиваются в крови умеренно, внепеченочные ткани, такие как мозг, сердце и скелетные мышцы используют эти кетоновые тела в митохондриях для обеспечения восстановительной энергии в форме НАДН, который является первичным субстратом системы транспорта электронов и генератором энергии, требуемой для синтеза АТФ. В свою очередь, генерация кетонами НАДН митохондрий снижает соотношение свободных митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН] и соотношение цитозольных [НАДФ⁺]/[НАДФН], с которым связано соотношение митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН]. В то же время катаболизм кетонов смещает соотношение митохондриальных [НАД⁺]/[НАДН] в сторону восстановленной формы и он смещает соотношение митохондриальных [убихинона]/[убихинола], [Q]/[QH₂] в сторону окисленной формы. Семихинонная форма убихинола представляет собой главный источник образования перекиси, O₂ митохондриями. Путем снижения восстановленной формы QH₂ и его семихинона можно снижать образование свободных радикалов митохондриями, при этом увеличивая в то же время ловушки для свободных радикалов, связанные с системой НАДФ, такие как глутатион.

Таким образом, авторы настоящего изобретения установили, что свободнорадикальное поражение, возникающее из-за избытка восстановленного Q или торможения НАДН-дегидрогеназы, такое как возникающее при токсичности, индуцированной МРР, может быть снижено путем введения агентов, которые увеличивают уровень кетоновых тел in vivo.

Свободнорадикальные поражения задействованы в большом числе заболеваний, среди которых находятся неврологические заболевания: болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз, болезнь Альцгеймера и ишемия мозга. Кроме того, чрезмерные свободнорадикальные поражения вовлечены как играющие определенную роль при коронарной реперфузии, диабетической ангиопатии, воспалительном заболевании кишечника и панкреатите.

В параллельной заявке на патент WO 98/41201 описано введение линейных эфиров (R)-3-гидроксимасляной кислоты и/или ацетоацетата для продукции повышенного уровня свободных соединений in vivo. Было показано, что пероральное введение 4 мМ раствора олигомерного тетра-(R)-3-гидроксибутирата или его ацетоуксуного эфира повышает уровень кетоновых тел в крови, в результате чего этот измеренный уровень (R)-3-гидроксибутирата увеличивался от 1 до 2 мМ в течение периода, превышающего 2 часа.

В настоящее время авторы настоящей заявки обнаружили, что введение компонента (R)-3-гидроксимасляной кислоты такой композиции в виде циклического олигомера обеспечивает неожиданные преимущества. Эти преимущества могут включать среди прочего (а) повышенную эффективность в повышении уровня (R)-3-гидроксимасляной кислоты, в результате чего этот уровень может возрастать на более чем 2 мМ, включая достижение уровня, почти соответствующего уровню голодных и выше, (b) поддержание повышенного уровня в течение нескольких часов, (с) возможность введения без противоиона, такого как натрий или метилглюкамин, когда нежелательно увеличивать солевую нагрузку больному или когда предусматривают значительную дозировку и (d) относительную простоту производства чистого соединения из полимерных исходных материалов, получаемых с помощью биокультуры.

Настоящая заявка, в частности, касается проблемы нейродегенеративных заболеваний, в частности такого заболевания, когда нейроны подвергаются нейротоксическому действию патогенных агентов, таких как белковые бляшки и окислительное повреждение, и дополнительно относится к композиции для применения в лечении этих и указанных выше заболеваний.

В предпочтительных осуществлениях настоящее изобретение относится к повышению кетонов крови, необходимому для коррекции дефектов, описанных выше, и которое может достигаться с помощью парентерального или энтерального введения. В частности оно не требует введения потенциально токсичных фармакологических агентов. Улучшенная эффективность по настоящему изобретению в отношении повышения уровня, в особенности уровня в крови, кетоновых тел, обеспечивает терапевтические эффекты классической кетогенной диеты, которая, как обнаружено, сама по себе не является токсичной у детей, а у взрослых не вызывает побочных эффектов по сравнению с теми, кто не подвергается лечению. Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что параллельно с коррекцией указанных выше метаболических и токсических дефектов должно происходить снижение ответа цитокинов и повышение пептидов апоптоза в дегенерирующих клетках благодаря повышению энергетического статуса нейрональной клетки и повышению трофической стимуляции в результате повышения синтеза нейромедиатора, например ацетилхолина.

Предлагаемое в настоящем изобретении лечение выходит за пределы действия кетоновых тел на циркуляцию, поскольку предлагается лечение клеток, не способных функционировать из-за нейродегенерации и/или метаболических дефектов, в частности, в метаболизме глюкозы, например, вызванных нейротоксичными агентами, такими как пептиды, белки, повреждение свободными радикалами или результат генетической аномалии. Лечение включает действие самих кетоновых тел на клетки, а не на приток к ним крови.

Таким образом, в первом варианте настоящее изобретение относится к циклическому эфиру (R)-3-гидроксибутирата формулы (I)

где n равно целому числу от 1 или более,

или его комплексу с одним или несколькими катионами или его соли для применения в терапии или питании.

Для пероральной доставки может быть предпочтителен свободный циклический олигомер. Когда в комплексе присутствуют катионы, предпочтительными катионами являются натрий, калий, магний и кальций, и они уравновешены в предлагаемом солевом комплексе с помощью физиологически приемлемого противоиона.

Примеры типичных физиологически приемлемых солей следует выбирать из натриевых, калийных, магниевых, L-лизиновых и L-аргининовых или, например, более сложных солей, таких как соли метилглюкамина.

Предпочтительно, n является целым числом от 1 до 200, более предпочтительно, от 1 до 20, наиболее предпочтительно, от 1 до 10 и особенно удобным является 1, т.е. (R,R,R)-4,8,12-триметил-1,5,9-триоксадодека-2,6,10-трион, 2, 3, 4 или 5.

Циклические эфиры по изобретению, предпочтительно, применяют для лечения болезненных состояний, опосредуемых свободными радикалами, токсическими агентами, такими как пептиды и белки, генетическими дефектами, вредными для метаболизма нервной клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами метаболизма глюкозы, или состояниями, индуцирующими дефект, ишемией, травмой головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки, например эффективности деятельности клетки сердца, например, при сердечной недостаточности.

Во втором варианте изобретение относится к способам лечения клеток, страдающих функциональной недостаточностью из-за действия свободных радикалов, токсических агентов, таких как пептиды и белки, генетических дефектов, вредных для метаболизма клетки, устойчивости к инсулину или других дефектов метаболизма глюкозы, или состояний, индуцирующих дефект, ишемии, травмы головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки, характеризуемое тем, что они включают введение циклического олигомера формулы (I). Это может включать лечение таких болезненных состояний у человека и/или животных.

Этот вариант включает такое применение, как применение в качестве нейронального стимулятора, например, способного стимулировать рост аксона и/или дендритов и/или нервных клеток, например, в клетках гиппокампа или субстанции нигра, in vivo или in vitro, в частности, при условиях, когда нейродегенерация имеет серьезные клинические последствия, за счет повышения его эффекта на уровень (R)-3-гидроксибутирата и ацетоацетата в крови и плазме.

В третьем варианте изобретение относится к способу энтерального или парентерального питания, предпочтительно, пероральному способу питания, включающему введение циклического олигомера формулы (I).

В четвертом варианте изобретение относится к применению циклического эфира формулы I для получения лекарства для лечения болезненных состояний, опосредуемых свободными радикалами, токсическими агентами, такими как пептиды и белки, генетическими дефектами, вредными для метаболизма клетки, устойчивостью к инсулину или другими дефектами метаболизма глюкозы, или состояниями, индуцирующими дефект, ишемией, травмой головы и/или для повышения эффективности деятельности клетки.

В пятом варианте изобретение относится к композиции, характеризуемой тем, что она включает циклический олигомер формулы (I) в физиологически приемлемой форме, например, с физиологически приемлемым носителем.

В частности, композиция пригодна для парентерального или энтерального введения, в частности для перорального введения. Когда композиция предназначена для парентерального применения, она является стерильной и свободной от пирогенов. Композиция для перорального применения может включать пищевую основу и может находиться в форме эмульсии или простой смеси с твердой пищей.

В частности, циклический(ие) олигомер(ы) включает(ют) эффективное количество суммарной композиции, например, по меньшей мере, 2% или более, например, по меньшей мере, 5% композиции по весу, более предпочтительно 20% или более, и наиболее предпочтительно от 50% до 100%. Композиция может быть предназначена для пероральной, парентеральной или любой другой удобной формы введения.

В предпочтительных формах всех вариантов изобретения соединение формулы (I) вводят совместно с ацетоацетатом или метаболическим предшественником ацетоацетата в физиологическом соотношении. Термин его метаболический предшественник, в частности, относится к соединениям, которые включают ацетоацетильные части, такие как ацетоацетил-1,3-бутандиол, предпочтительно ацетоацетил-(R)-1,3-бутандиол, ацетоацетил-(R)-3-гидроксибутират и ацетоацетилглицерол. Имеются в виду также эфиры любых таких соединений с одноатомными, двухатомными или трехатомными или высшими, например, гликозильными, спиртами.

У больных диабетом данное применение циклических олигомеров позволяет поддерживать низкий уровень сахара крови без опасения осложнений гипогликемии. У здоровых, не страдающих диабетом субъектов, сахар крови с величины натощак от 80 до 90 мг % (4,4-5 мМ) возрастает до 130 мг % (7,2 мМ) после еды. У больных диабетом "тщательный контроль" диабета предлагался в течение длительного времени в качестве способа задержки сосудистых осложнений, но на практике врачи обнаружили, что трудно поддерживать сахар крови жестко контролируемым ниже 150 мг % (8,3 мМ) после еды из-за гипогликемических эпизодов. У здоровых субъектов регулярно наблюдается гипогликемическая кома при падении сахара до 2 мМ. Как обсуждалось ранее (62, 63), в присутствии 5 мМ кетоновых тел не наблюдается неврологических симптомов при падении сахара крови ниже 1 мМ.

В настоящем изобретении обнаружено, что получение больными диабетом типа II циклических олигомеров изобретения позволяет обеспечить лучший контроль сахара крови, тем самым предотвращая сосудистые изменения в глазах и почках, которые в настоящее время наблюдаются через 20 лет развития диабета и которые являются главной причиной тяжелого течения болезни и смертности при диабете.

Когда терапия предназначена для заболеваний, связанных с припадками, такими как не поддающаяся лечению эпилепсия, поскольку их лечат кетогенной диетой, терапия улучшается с помощью применения циклических олигомеров, благодаря снижению или исключению высокого содержания как липидов, так и углеводов. К таким больным относятся те, которые имеют генетические нарушения в системе транспорта глюкозы в мозг, в гликолизе или в самой ПДГ (пируватдегидрогеназе), такие как страдающие синдромом Лея, эндотоксическим шоком или состояниями тяжелого стресса.

Конкретные нарушения, которые лечат с применением этих лекарств, относятся ко всем состояниям, включающим блокаду ПДГ, включая состояния, имеющие место после травмы головы или включающие снижение или исключение обеспечения митохондрий ацетил-КоА, такие как инсулиновая кома и гипогликемия, дефекты транспорта глюкозы в мозг или куда-нибудь еще (80) или на стадиях ферментов гликолиза.

Когда лекарство или пищевая добавка включает ацетоацетат, предпочтительно, чтобы они не хранились в течение долгого времени или не подвергались действию температур, превышающих 40°С. Ацетоацетат нестабилен при нагревании и интенсивно разлагается при 100°С на ацетон и CO₂. В таких условиях предпочтительно, чтобы ацетоацетат генерировался композицией при взаимодействии с метаболическими процессами организма. Предпочтительно, чтобы композиция включала эфирный предшественник ацетоацетата.

В шестом варианте изобретение относится к способу лечения нейрональной клетки человека или животного, например клеток мозга, подвергнутых заболеванию, связанному с повреждением клетки, в частности, которое ведет к гибели клетки, что указано для второго и четвертого вариантов, в особенности нейродегенеративному заболеванию, например, такому, которое относится к нейротоксическим состояниям, таким как присутствие амилоидного белка, например заболеванию, связанному с памятью или движением, такому как болезни Альцгеймера или Паркинсона, или эпилептические припадки, причем этот способ включает введение субъекту, по меньшей мере, одного из материалов для применения в вариантах изобретения с первого по пятый.

Авторы настоящего изобретения далее обнаружили, что кетоновые тела, обеспечиваемые путем введения циклических олигомеров (R)-3-гидроксимасляной кислоты в количествах, достаточных для повышения общей концентрации кетоновых тел крови до повышенного уровня, приводят к более чем простому поддержанию клеточной жизнеспособности, но и действительно улучшают функционирование и рост клеток свыше нормального, т.е. контролируемых уровней путем, не связанным с током крови или питанием. В этом варианте в изобретении далее относится к применению циклических олигомеров в качестве агентов, способных вызывать нейрональную стимуляцию, т.е. активность, подобную фактору роста нервов, повышать скорость метаболизма и увеличивать степень функциональных характеристик нейрона, таких как аксоны и дендриты. Этот вариант настоящего изобретения относится к механизму улучшения нейрональной функции, а также полной задержки деградации.

В последней работе Hoshi с соавторами (77, 78) убедительно показали, что часть амилоидного белка, A _1-42, накопление которой является отличительной особенностью болезни Альцгеймера, действует в качестве стимулятора митохондриальной гистидин-протеинкиназы, которая фосфорилилирует и инактивирует мультиферментный комплекс пируват-дегидрогеназы. Комплекс ПДГ представляет собой митохондриальный фермент, обеспечивающий образование ацетил-КоА и НАДН из пирувата, образующегося при гликолизе в цитоплазме. Образованный в митохондриях ацетил-КоА вовлекается оксалоацетатом в цикл ТКК (трикарбоновых кислот) Кребса, полностью сжигающий пируват до СO₂ и обеспечивающий митохондрию восстановительной энергией, которая становится субстратом для системы транспорта электронов, благодаря которой производится энергия, необходимая для синтеза АТФ в митохондриях.

Утилизация кетоновых тел ограничена транспортом с меньшей утилизацией, происходящей в базальном ганглии при уровне в крови ниже 1 мМ (76). Однако при уровне 7,5 мМ, достигаемом у здорового человека в результате продолжительного голодания, скорость поступления кетоновых тел в мозг достаточна для обеспечения основных потребностей мозга в энергии и для предотвращения симптомов гипогликемии даже в случае уровня сахара в крови, который в нормальных условиях вызывает судороги или кому (63).

В параллельной заявке WO 98/41201 "Терапевтические композиции" описана гипотеза изобретателя о том, что при болезни Альцгеймера, когда имеется блок ПДГ, который предотвращает нормальное образование энергии из глюкозы, если можно обеспечить повышенный, например нормальный для голодания уровень кетонов, можно обойти блокаду ПДГ, имеющуюся у этих больных, и тем самым предотвратить гибель клеток из-за исчерпания энергии или отсутствия холинэргической стимуляции и тем самым замедлить развитие потери памяти и деменции. Более того, применяя ростовые/стимулирующие эффекты кетоновых тел в отношении нервов, в особенности, (R)-3-гидроксибутирата или его физиологического соотношения с ацетоацетатом, можно вызвать улучшение состояния все еще живых клеток за пределы состояния, до которого они дегенерировали, и соответственно у больных должно наблюдаться некоторое улучшение функций.

У животных и человека после еды содержание ацетоацетата в печени, которое по существу соответствует содержанию в крови, очень низко, например 0,09 мМ, а содержание (R)-3-гидроксибутирата равно 0,123 мМ, но оно увеличивается через 48 часов голодания до, например, 0,65 мМ ацетоацетата и 1,8 мМ (R)-3-гидроксибутирата (84).

Кетоновые тела растут при голодании из-за вызванного снижением инсулина снижения реэтерификации жирных кислот до триглицеридов в жировой ткани, что вызывает выделение свободных жирных кислот в кровяное русло. Выделенные жирные кислоты могут быть затем захвачены и использованы в качестве источника энергии мышцей, сердцем, почками и печенью в процессе -окисления. Печень, однако, обладает способностью превращать свободные жирные кислоты в метаболический источник энергии, кетоны для использования органами, отличными от печени, включая мозг, в качестве альтернативы глюкозе во время периодов голодания. Синтез кетоновых тел в печени осуществляется из митохондриального ацетил-КоА, образующегося в процессе -окисления жирных кислот в печени.

Кетоновые тела поступают в ткани, отличные от печени, с помощью одного и того же переносчика, причем другие монокарбоксилаты могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов. Неприродные изомеры, такие как D-лактат или (S)-тригидроксибутират, также могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов транспорта кетоновых тел. Поскольку транспорт кетоновых тел через гематоэнцефалический барьер является лимитирующим фактором утилизации кетоновых тел в мозге (76), следует предпринять все усилия для сохранения концентрации этих нефизиологических энантиомеров в крови на низком уровне в процессе кетогенной терапии. Когда концентрация кетоновых тел в крови повышается до уровня, обнаруживаемого при голодании, сердце, мышцы, почки и мозг используют кетоновые тела в качестве предпочтительного энергетического субстрата.

В настоящем изобретении, таким образом, определено, что митохондриальный ацетил-КоА, возникающий из кетоновых тел, образованных из циклических олигомеров, указанных в настоящем изобретении, может, таким образом, возмещать недостаточность ацетил-КоА, которая имеет место при ингибировании многоферментного комплекса ПДГ в тканях, зависимых от метаболизма глюкозы, для обеспечения их метаболической энергией. Образующийся в митохондриях цитрат может также транспортироваться в цитоплазму транспортером три- или дикарбоновых кислот, где он может быть превращен в цитоплазматический ацетил-КоА, необходимый для синтеза ацетилхолина. Реакции цикла Кребса показаны на схеме 1 для дополнительной помощи в иллюстрации этих концепций.

Кетоновые тела в отличие от свободных жирных кислот не могут давать ацетил-КоА в печени. Поскольку ацетил-КоА является важным предшественником жирных кислот, он не может возникать в печени при повышенном синтезе либо жирных кислот, либо холестерина, что обычно обеспечивает более половины синтеза в организме этих двух потенциально патогенных материалов. Печень чувствительна к предоставляемому ей соотношению ацетоацетат/(R)-3-гидроксибутират и должна реагировать изменением соотношения свободных [НАД ⁺]/[НАДН] в митохондриях благодаря почти равновесному состоянию, устанавливаемому -гидроксибутиратдегидрогеназой (ЕС 1.1.1.30) (31).

Среди прочего, указанное выше также указывает на то, что можно предложить способ повышения эффективности образования энергии в митохондриях у человека или животного, которые не страдают хроническим или острым метаболическим заболеванием, который включает введение человеку или животному такого количества циклического олигомера формулы (I), которое достаточно для повышения уровня (R)-3-гидроксибутирата крови до уровня от 0,5 до 20 мМ.

Наиболее простым способом повышения кетонов в крови является голодание. При продолжительном голодании уровень кетонов в крови достигает 7,5 мМ (62, 63). Однако эта возможность не реальна на долговременной основе из-за смерти, обычно наступающей после 60 дней голодания.

Кетогенная диета, составленная преимущественно из липидов, применялась с 1921 года для лечения эпилепсии у детей, в особенности миоклонических и акинезических припадков (109), и была показана ее эффективность в случаях устойчивости к обычным фармакологическим средствам (71). Пероральное или парентеральное введение свободных жирных кислот или триглицеридов может повышать кетоны крови, обеспечивая тем самым низкий уровень углеводов и инсулина для предотвращения реэтерификации в жировой ткани. У крыс, которых кормили диетами, включающими 70% кукурузного масла, 20% гидролизата казеина, 5% целлюлозы, 5% солевой смеси МакКоллума, кетоновые тела в крови достигали уровня приблизительно 2 мМ. Замена свиного сала на кукурузное масло повышает кетоны крови до приблизительно 5 мМ (Veech, неопубликованное).

Обычно уровень кетоновых тел, достигаемый при таких диетах, составляет приблизительно 2 мМ (R)-3-гидроксибутирата и 1 мМ ацетоацетата, тогда как уровень свободных жирных кислот составляет приблизительно 1 мМ. Были опробованы другие варианты композиции, включая триглицериды со средней длиной цепей. В целом реакция на такие ограниченные диеты была плохой из-за их неаппетитности (56). Диеты с высоким содержанием липидов и низким содержанием углеводов также пытались применять в качестве терапевтических агентов у больных раком для снижения доступности глюкозы для опухолей (88), а также в качестве диет, снижающих вес у больных, страдающих или не страдающих от диабета (74, 112), и для улучшения устойчивости к тренировкам (83).

Многочисленными являются ограничения диет, которые относятся к липидам, для повышения кетонов крови до нейрологически эффективного уровня. Во-первых, уровень кетоновых тел при использовании основанных на липидах диет имеет тенденцию быть ниже 3 мМ, что значительно ниже уровня 7,5 мМ, достигаемого у тучных людей в процессе продолжительного голодания. Во-вторых, неоправданное кормление углеводами повышает секрецию инсулина и вызывает быстрое снижение превращения в печени свободных жирных кислот в кетоны с последующим падением уровня кетонов крови и направление липидов на этерификацию до триглицеридов жировой тканью. Многие анекдотические сообщения относятся к восстановлению судорог у детей, "диета которых уничтожалась именинным тортом". В-третьих, низкие вкусовые качества и необходимость избегать углеводов для поддержания высокого уровня кетоновых тел делает такие диеты с высоким содержанием липидов трудными для применения у взрослых и у больных вне стационара, в особенности в обществе, где потребляют традиционно много рафинированного сахара, хлеба, макарон, риса и картофеля. На практике традиционную высококетоновую диету нельзя навязать больным, кроме детей, за пределами возраста, когда всю пищу готовят дома под строгим наблюдением. В-четвертых, кормление такими большими количествами липидов взрослого населения должно было бы приводить к значительной гипертриглицеридемии и гиперхолестеринемии с патологическими осложнениями в виде повышенного поражения сосудов и спорадических заболеваний печени и поджелудочной железы и, следовательно, не могли быть предписаны с точки зрения медицины. Кормление диетами с высоким содержанием липидов и низким содержанием углеводов было популярным в 1970-х годах для снижения веса вопреки потреблению высококалорийной пищи, предлагаемой так, чтобы потребление углеводов было низким. Однако из-за роста понимания связи повышенного уровня липидов крови и атеросклероза популярность этой диеты резко упала.

Замещение глюкозы в липидной диете, когда глюкоза обеспечивала 47% содержания калорий, рацемическим 1,3-бутандиолом вызывала приблизительно 10-кратный рост концентрации кетонов крови до 0,98 мМ (R)-3-гидроксибутирата и 0,33 мМ ацетоацетата (107). Эти величины были немного ниже получаемых обычно после 48-часового голодания и были значительно ниже величины 7,5 мМ, полученной у голодающего человека. Рацемический 1,3-бутандиол превращается печенью в ацетоацетат, а также в неприродный L-- и природный D--гидроксибутират (соответственно, (S)-3-гидроксибутаноат и (R)-3-гидроксибутират). Хотя рацемический 1,3-бутандиол интенсивно исследовали в качестве дешевого источника калорий для корма животных и, даже хотя он был экспериментально применен в диетах для человека (81, 101), образование неприродного L-изомера, по-видимому, ведет, в конце концов, к индукции значительной токсичности, как это было показано для потребления человеком неприродного D-лактата (64). Одной из слабых сторон введения неприродного L-изомера является то, что он конкурирует с природным (R)-3-гидроксибутиратом за транспорт. Таким образом, кормление (R)-1,3-бутандиолом в качестве предшественника кетоновых тел является одной из возможностей, при которой нет необходимости введения или получения неприродного изомера.

Моно- и диацетоацетиловые эфиры рацемического 1,3-бутандиола являются, как было предположено, источником калорий и их тестировали на свиньях (67). Пероральное введение брикетированной диеты, содержащей 30% калорий в виде эфиров, вызывало кратковременный рост кетонов крови до 5 мМ, однако применение рацемического 1,3-бутандиола с образованием из него неестественного (S)-3-гидроксибутаноата не рекомендуется по причинам, указанным выше.

В то время, как рацемический 1,3-бутандиол в таких составах не рекомендуется, эфиры (R) 1,3-бутандиола могут применяться либо как таковые, либо в виде эфира с ацетоацетатом. Исследования на крысах показали, что скармливание рацемического 1,3-бутандиола вызывает снижение соотношения [НАД']/[НАДН] в цитозоле печени с 1500 до приблизительно 1000 (87). Для сравнения: введение этанола снижает [НАД-]/[НАДН] в печени до приблизительно 200 (106).

Свежеприготовленный ацетоацетат может быть применен в растворах для инфузии, в которых он может быть введен в физиологически нормальных соотношениях с (R)-3-гидроксибутиратом для достижения оптимального действия (95). Из-за требований производства, для которого в настоящее время необходимы длительный срок хранения и температурно-стерилизованные жидкости, ацетоацетат часто давали в форме эфира. Это делали для повышения срока хранения и стабильности к прогреванию в процессе стерилизации. Было установлено, что эстеразная активность в кровяном русле составляет приблизительно 0,1 ммоль/мин/мл, а в печени приблизительно 15 ммоль/мин/г (68). Кроме эфиров, объединяющих 1,3-бутандиол и ацетоацетат, проводилось также интенсивное изучение глицероловых эфиров ацетоацетата при парентеральном (59) и энтеральном кормлении (82). Сообщалось, что такие препараты снижают дистрофию кишечника благодаря высокому потреблению клетками кишечника ацетоацетата и могут быть использованы для лечения ожогов (85).

Для предпочтительных осуществлений настоящего изобретения при оптимальных условиях должно образовываться физиологическое соотношение кетонов при введении циклических олигомеров и ацетоацетата. Если этого не происходит, печень целого животного должна установить соотношение кетонов в соответствии с собственным соотношением свободных [НАД ⁺]/[НАДН] в митохондриях. Если дается отличное от нормы соотношение кетонов, то печень должна изменить это соотношение при одновременном изменении соотношения [НАД⁺]/[НАДН] в печени. Перфузия работающего сердца ацетоацетатом в качестве единственного субстрата быстро вызывает сердечную недостаточность (99) в отличие от сердец крыс, перфузируемых смесью глюкозы, ацетоацетата и (R)-3-гидроксибутирата, когда сердечная эффективность увеличивалась физиологическим соотношением кетоновых тел (95).

Циклические олигомеры для применения в настоящем изобретении удобно синтезировать с помощью микроорганизмов, продуцирующих полиэфиры. Природные полиэфиры (R)-3-гидроксибутирата являются твердыми как параграфы торгового соглашения, например такие, как полимеры с м.в. 530000 из Alcaligenes eutrophus (Sigma Chemical Co. St. Louis) или как полимеры с м.в. 250000 сахарной свеклы (Fluka, Швейцария). Бактерии образуют полимер в качестве источника запасенной пищи. Ферментация этих полимеров бактериями была разработана в 1970-е годы ICI в Великобритании и Solvay et Cie в Бельгии в виде потенциально биодеградируемого пластика для покрытия тампонов и других целей. Система, обеспечивающая синтез поли (R)-3-гидроксибутирата, к настоящему времени клонирована, и на основе предоставляемых бактериям субстратов получены вариации в составе полимера. Гены, ответственные за синтез полиалканоатов, были клонированы и экспрессированы в ряде микроорганизмов (93, 102, 113), что дает возможность получать этот материал во множестве организмов при крайне вариабельных условиях.

Предпочтительными формами циклического олигомерного (R)-3-гидроксибутирата являются такие, которые, по меньшей мере, отчасти легко перевариваются и/или метаболизируются у человека или животных. Предпочтительны олигомеры, содержащие от 2 до 200 повторов, обычно от 2 до 20, и наиболее подходящие олигомеры длиной от 3 до 10 повторов, в особенности из 3 повторов, т.е. триолид. Следует понимать, что можно с выгодой использовать смеси таких олигомеров, поскольку может быть получено ранжирование характеристик их захвата. Сходным образом могут быть предложены смеси с мономером или линейными олигомерами или полимерами для модификации формирующегося профиля уровня в крови.

Циклические олигомеры для применения в изобретении могут быть получены, среди прочего, с помощью способов, описанных Seebach et al. Helvetia Chimica Acta Vol 71 (1988) pages 155-167 и Seebach et al. Helvetia Chimica Acta Vol 77 (1994) pages 2007-2033. В некоторых случаях такие циклические олигомеры, состоящие из от 5 до 7 или более единиц (R)-3-гидроксибутирата, могут быть предпочтительными, поскольку они, возможно, легче разбиваются in vivo. Описанные здесь способы синтеза соединений включены здесь в качестве ссылки.

Поскольку печень не способна метаболизировать кетоновые тела, а может только изменять соотношение (R)-3-гидроксибутират/ацетоацетат, оказавшиеся в кровяном русле мономеры кетоновых тел транспортируются к экстрагепатическим тканям, где они могут быть утилизированы. Достигаемый уровень кетонов не меняется при несанкционированном приеме углеводов, как это имеет место в случае существующей кетогенной диеты. Напротив, кетоны должны быть просто добавкой к обычной диете, даваемые в количестве, достаточном для продолжительного поддержания их уровня в крови, обычно от 0,3 до 20 мМ, более предпочтительно от 2 до 7,5 мМ, на протяжении 24 часового периода, в зависимости от состояния, подвергаемого лечению. В настоящее время полагают, что в случае устойчивой эпилепсии у детей достаточным является уровень в крови 2 мМ. В случае болезни Альцгеймера могли бы быть даже предприняты попытки сохранять уровень в 7,5 мМ или выше, достигаемый в исследованиях на голодающих людях, для обеспечения альтернативным источником энергии и снабжения ацетил-КоА ткани мозга больных болезнью Альцгеймера, когда нарушена активность ПДГ из-за избытка A _1-42 амилоидного пептида (77, 78).

Обнаруженный авторами данного изобретения факт, что (R)-3-гидроксибутират и его смеси с ацетоацетатом действует в качестве стимулятора нервной системы, например, стимулятора роста нервов и/или стимулятора роста аксонов и дендритов, открывает возможность повышать уровень кетоновых тел в меньшей степени, чем требуется при поступлении с пищей, для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Композиции по изобретению являются преимущественно стерильными и свободными от пирогенов, особенно от эндотоксинов.

Во-вторых, их предпочтительно составляют таким способом, чтобы они могли быть приятными на вкус при применении в качестве добавки к обычной диете, для увеличения податливости больных в отношении приема таких добавок. Циклические олигомеры обычно не имеют запаха. Составы циклических олигомеров (R)-3-гидроксибутирата и его смесей с ацетоацетатом могут быть покрыты маскирующими агентами или могут быть направлены в кишечник с помощью покрытия их для рассасывания в кишечнике или инкапсулирования их другим способом, как это хорошо известно в фармацевтической и пищевой промышленности.

Так как кетоновые тела содержат приблизительно от 4 до 6 калорий/г, предпочтительно компенсаторно снижать количество других получаемых пищевых продуктов во избежание ожирения.

Особыми преимуществами применения циклических олигомеров, указанных в настоящем изобретении, являются следующие:

1) их можно есть с нормальной нагрузкой углеводами без снижения уровня кетоновых тел в крови, снижение которых должно ослаблять эффект лечения,

2) они не будут увеличивать ЛПОНП и холестерин в крови, что наблюдается при современных диетах, содержащих маргарин и сливки, снижая, таким образом, риск ускоренного возникновения сосудистых заболеваний, жирового перерождения печени и панкреатита,

3) они должны иметь широкую сферу применения при большом числе различных заболеваний, включая, но не ограничиваясь этим: диабет типа II для предотвращения приступов гипогликемии и комы, при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях для предотвращения смерти нервных клеток, например клеток гиппокампа, и при не поддающейся лечению эпилепсии, обусловленной либо снижением транспортеров глюкозы в мозге, дефектами гликолиза, либо так называемыми синдромами Лея с врожденными дефектами ПДГ.

Циклические олигомеры изобретения могут быть использованы для перорального и парентерального применения в эмульсиях, поскольку ацетоацетат в неэтерифицированном состоянии менее предпочтителен, так как он является субстратом спонтанного декарбоксилирования до ацетона с периодом полужизни при комнатной температуре приблизительно 30 дней. В том случае, когда композиции изобретения должны включать ацетоацетат, он может быть в форме предшественника. Удобно, чтобы ацетоацетат мог предлагаться в виде эфиров с (R)-3-гидроксибутиратом, как предлагается в параллельной заявке "терапевтические композиции".

Лечение может включать предоставление больным существенной части поступающих калорий в виде циклического олигомера (R)-3-гидроксибутирата или олигомеров, составленных для получения отставленного высвобождения так, чтобы поддерживать кетоны крови на повышенном уровне, колеблющимся, например, в диапазоне от 0,5 до 20 мМ, предпочтительно в диапазоне 2-7,5 мМ, в течение 24-часового периода. Секреция кетоновых тел в кровь может быть ограничена с помощью применения различной техники, такой как микроинкапсулирование, абсорбция и тому подобное, которые используются в современной практике при пероральном введении большого числа фармацевтических агентов. Формы, покрытые для рассасывания в кишечнике, для направленной доставки ниже желудка могут, в частности, применяться, когда материал не требует гидролиза или не подвержен ему в кислой среде. Когда такой гидролиз желателен, могут быть применены формы без покрытия. Некоторые формы могут включать ферменты, способные расщеплять эфиры для выделения кетоновых тел, такие как упоминаемые в Doi. Microbial Polyesters.

Предпочтительные циклические олигомеры, например триолид, могут быть просто добавлены как таковые к пищевым продуктам и/или могут быть дополнены в лечебной диете другими источниками образования кетоновых тел с иным профилем выделения, такими как мономерный (R)-3-гидроксибутират. Последний может быть представлен в виде водного раствора, например в виде соли, например соли натрия, калия, магния или кальция.

Для обеспечения диеты в 1500 калорий взрослый больной человек мог бы потреблять 198 г циклических эфиров (по настоящему изобретению) в день. Для диеты в 2000 калорий при тех же пропорциях он мог бы потреблять 264 г кетонов в день. При потреблении кетогенной диеты кетоны крови увеличиваются до приблизительно 2 мМ, что, как было доказано, в определенной мере эффективно для, по меньшей мере, 60% подвергающихся лечению детей. При потреблении кетоновой диеты уровень кетонов должен быть выше, поскольку кетоны замещают жир по калорическому эквиваленту, то есть 1,5 г кетона/г жира. Соответственно, кетоны крови должны составлять приблизительно 3 мМ, что является эффективным уровнем у детей, но что все еще ниже уровня 7,5 мМ, достигаемого у голодающего человека.

Существует несколько преимуществ применения соединений, которые прямо повышают уровень кетоновых тел крови, включая настоящие циклические олигомеры, которые сами по себе повышают уровень кетоновых тел крови. Во-первых, предоставление самих кетоновых тел не требует ограничения в углеводах, тем самым повышая вкусовые качества диетических составов, в особенности в сообществах, где диеты с высоким содержанием углеводов являются обычными. Во-вторых, кетоновые тела могут быть метаболизированы мышечной, сердечной и мозговой тканью, но не печенью. Следовательно, избегается жировое перерождение печени, которое может быть неблагоприятным побочным эффектом кетогенной диеты. В-третьих, возможность включения углеводов в диетические составы повышает шансы на согласие и открывает практические терапевтические подходы к больным диабетом типа II, у которых инсулин высок, делая известную кетогенную диету неприменимой.

В настоящем изобретении обнаружено, что, несмотря на то, что может быть желательным любое повышение уровня кетоновых тел, предпочтительное количество вводимого циклического эфира с любым ацетоацетильным компонентом должно быть достаточным для повышения уровня кетоновых тел крови до величины от 0,5 до 20 мМ, предпочтительно до величины от 2 мМ до 7,5 мМ и выше, в особенности, когда пытаются приостановить гибель клеток мозга при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера и паркинсонизм. Хотя погибшие клетки не могут быть восстановлены, должны ожидаться приостановка дальнейшего повреждения и, по меньшей мере, некоторое восстановление функций.

Общее количество кетоновых тел, применяемых для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и паркинсонизм, должно предпочтительно повышать уровень кетоновых тел крови на величину от 0,5 мМ до 20 мМ. В настоящем изобретении установлено, что для достижения этого могло бы потребоваться от 200 до 300 г (0,5 фунтов) эквивалента кетоновых тел на больного в день. Когда лечение предназначено для защиты клеток от действия нейротоксина, этого можно достичь при уровне, достаточном для действия в качестве существенного источника калорий, например от 2 до 7,5 мМ в крови. Когда дело касается действия образующегося таким образом (R)-3-гидроксибутирата в качестве фактора, стимулирующего нервные клетки, количество вводимого препарата может быть более низким, например, для обеспечения увеличения на величину от 0,2 до 4 мМ, но, конечно, может быть большим при той или иной болезни.

Следует понимать, что лечение нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера или паркинсонизм, должно быть наиболее эффективным при назначении вскоре после выявления предрасположенности больного к развитию заболевания. Так, лечение болезни Альцгеймера наиболее эффективно после получения положительного результата теста на одно или более состояний, выбираемых из группы, (i) мутации гена белка-предшественника амилоида в хромосоме 21, (ii) мутации гена пресенилина в хромосоме 14, (iii) наличие изоформ аполипопротеина Е. Конечно, могут быть применены и другие тесты, для которых показано, что они являются показателями болезни Альцгеймера.

После такого положительного результата тестирования будет рациональным предотвратить развитие потери памяти и/или другой неврологической дисфункции путем повышения суммарной концентрации кетоновых тел, (R)-3-гидроксибутирата и/или ацетоацетата, в крови или плазме больного, скажем, между 1,5 и 10 мМ, более предпочтительно от 2 до 8 мМ, с помощью одного из следующих способов. Предпочтительно, больной получает диету, содержащую достаточное количество соединения формулы (I), необязательно парентерально, но предпочтительно и удобно, энтерально.

Следует понимать, что гипогликемическая дисфункция мозга должна также лечиться с применением вариантов лечения, композиций и соединений настоящего изобретения. Следующая отличительная черта, связанная с настоящим лечением, должна состоять в общем улучшении работоспособности мышцы.

Снабжению продуктами и медикаментами на основе циклического олигомера изобретения способствует легкая доступность ряда относительно дешевых или потенциально дешевых исходных материалов, из которых может быть получена циклическая (R)-3-гидроксимасляная кислота (смотри Microbial Polyesters Yoshiharu Doi. ISBN 0-89573-746-9, главы 1.1, 3.2 и 8). Наличие генов, пригодных для вставки в организмы, продуцирующие пищевые продукты, обеспечивает базу для создания продуктов, таких как йогурты и сыр, которые обогащены циклической олигомерной (R)-3-гидроксимасляной кислотой, или самим мономерным веществом после разрушения ферментами, способными расщеплять такие полимеры (смотри Doi. Глава 8).

Способы получения поли-(R)-3-гидроксибутирата специально не заявлены, поскольку они известны в науке. Например, Shang et al, (1994) Appli. Environ. Microbiol. 60: 1198-1205. Этот полимер имеется в продаже от фирмы Fluka Chemical Co. P1082, cat# 81329, 1993-94, 980. Second St. Ronkonkoma NY 11779-7238, 8003585287.

Настоящее изобретение далее описано только с целью иллюстрации отсылкой к следующим фигуре и экспериментальным примерам. В их свете для специалистов будут ясны последующие осуществления в объеме изобретения.

Чертеж представляет собой график, показывающий уровень (R)-3-гидроксимасляной кислоты в крови в зависимости от времени после скармливания крысам триолида (R)-3-гидроксимасляной кислоты, циклического олигомера, полученного в примере 1, в составе йогурта и у контрольных животных, получавших только йогурт.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение (R,R,R)-4,8,12-триметил-1,5,9-триоксадодека-2,6,10-триона: триолида (R)-3-гидроксимасляной кислоты

Синтез был описан в работе Angew, Chem. Int. Ed. Engl. (1992), 31, 434. Смесь поли[(R)-3-гидроксимасляной кислоты] (50 г) и моногидрата толуол-4-сульфокислоты (21,5 г, 0,113 моль) в толуоле (840 мл) и 1,2-дихлорэтане (210 мл) перемешивали и нагревали с обратным холодильником в течение 20 часов. Воду удаляли с помощью ловушки Дина-Старка в течение 15 часов, после чего коричневый раствор охлаждали до комнатной температуры, промывали сначала полунасыщенным раствором углекислого натрия, а затем насыщенным раствором хлористого натрия, сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Коричневый полутвердый остаток перегоняли с помощью аппарата Кугельрара (Kugelrohr) при 120-130°С / 0,15 мм рт.ст. (20 н/м²) с получением белого твердого вещества (18,1 г). При температуре выше 130°С воскообразное твердое вещество начинает отгоняться - в этот момент отгонку останавливали. Т.пл. отогнанного материала составляла 100-102°С (литературные данные т.пл. 110-110,5°С). Перекристаллизация из гексана давала бесцветные кристаллы с выходом 15,3 г. Т.пл.=107-108°С; [] _D-35,1 (с=1,005, СНСl₃), (литературные данные = -33,9). ¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃ ): =1,30 (д, 9Н, СН₃); 2,4-2,6 (м, 6Н, СН₂); 5,31-5,39 (м, 3Н, НС-O). ¹³С ЯМР (СDСl₃): =20,86 (СН₃), 42,21 (CH₂), 68,92 (СН), 170, 12 (СО). Элементный анализ: вычислено для C₁₂H₁₈ O₆: С 55,81; Н 7,02; обнаружено: С 55,67; Н 7,15.

Сравнительный пример 1: Получение олигомеров (R)-3-гидроксимасляной кислоты (R)-3-гидроксибутирата

(R)-3-гидроксимасляную кислоту (Fluka - 5,0 г: 0,048 моль), п-толуолсульфокислоту (0,025 г) и бензол (100 мл) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в устройстве с ловушкой Дина-Старка в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждали и бензол упаривали в вакууме (0,5 мм рт.ст. (66,66 н/м²) ). Было получено 4,4 г бесцветного масла, 20 мг образец которого был превращен в метиловый эфир для анализа количества мономерных повторов с помощью ЯМР. Это исследование показывает, что продукт представляет собой смесь олигомеров D--гидроксибутирата со средним количеством повторов 3,75, будучи преимущественно смесью гримеров, тетрамеров и пентамеров, причем единственный наиболее представленный материал является тетрамером. Смесь продуктов была растворима в 1 эквиваленте гидроокиси натрия.

Сравнительный пример 2: Получение ацетоуксусного эфира олигомерной (R)-3-гидроксимасляной кислоты

Другую партию бесцветного масляного продукта из примера 1 (4,5 г) нагревали в течение 1 часа при 60°С с дикетеном (3,8 г) и ацетатом натрия (0,045 г) в атмосфере азота. Дополнительно добавляли дикетен (3,8 г) и реакционную смесь нагревали еще в течение часа, затем охлаждали, разбавляли эфиром, промывали водой и экстрагировали насыщенным бикарбонатом натрия (5×100 мл). Объединенный экстракт промывали эфиром и затем подкисляли концентрированной НСl (добавляемой по каплям). После экстракции этилацетатом (3×50 мл) проводили сушку над сульфатом магния и упаривание в вакууме. Была получена желтая смесь твердого и масляного вещества (7,6 г), которую хроматографировали на колонке с силикагелем с помощью дихлорметана/метанола (98:2) для получения светло-янтарного масляного продукта. Были выделены примеси с большей подвижностью (1,6 г), и после повторной хроматографии с тетрахлоридом углеродом/метанолом (99:1) было получено 0,8 г масла, которое, как было показано с помощью ЯМР и массспектрометрии, является желаемой смесью ацетоацетилированных олигомеров (R)-3-гидроксибутирата. Смесь продуктов имела R_f 0,44 в системе дихлорметан/метанол (90:1) и была растворима в 1 эквиваленте гидроксида натрия.

Оба продукта сравнительных примеров 1 и 2 поддаются разделению на индивидуальные компоненты с помощью препаративной ВЭЖХ.

Пример 2

Пероральное введение крысам триолида (R)-3-гидроксибутирата примера 1

Способность перорально вводимого триолида повышать уровень кетонов в крови исследовали следующим образом. За день до начала эксперимента 12 крыс линии Вистар весом 316±10 г помещали в отдельные клетки. Им не давали доступа к пище в течение 15 часов перед предоставлением содержащих триолид композиций, но воду давали без ограничений.

На утро дня эксперимента смешивали 0,64 г триолида с 5 г йогурта Black Cherry с маркировкой Co-op в отдельных кормушках для 9 крыс. Остальные 3 крысы получали 5 г йогурта без триолида в качестве контроля. Содержащие йогурт кормушки помещали в клетки и фиксировали время поедания его крысами. Две из трех контрольных крыс съели весь йогурт, и четыре из шести крыс, получивших йогурт с триолидом, съели приблизительно половину от предложенного им. Остальные шесть крыс спали.

Контрольных крыс (n=2) забивали через 60 и 180 минут после приема йогурта, а крыс, которым скармливали триолид, забивали через 80, 140, 150 и 155 минут. Брали образцы крови для определения (R)-3-гидроксибутирата. Мозг замораживали с помощью раструба и позже экстрагировали хлорной кислотой, экстракты нейтрализовывали и анализировали. Уровень (R)-3-гидроксибутирата в крови измеряли с помощью NAD^- /EDTA анализа по Anal. Biochem (1983) 131, р478-482. В каждую кювету добавляли 1,0 мл раствора, приготовленного из 2-амино-2-метил-1-пропанола (100 мМ рН 9,9, 0,094 г/10 мл), NAD" (30 мМ, 0,199 г/10 мл) и EDTA (4 мМ, 0,015 г/10 мл), 4 мкл образца или контрольного (R)-3-гидроксибутирата.

Две контрольные крысы съели 5,2±0,1 г йогурта и концентрация (R)-3-гидроксибутирата в их плазме составляла приблизительно 0,45 мМ через 60 и 180 минут. Четыре съевшие триолид крысы потребили 0,39±0,03 г триолида и 2,6 ± 0,2 г йогурта. Концентрация (R)-3-гидроксибутирата в их плазме составляла 0,8 мМ через 80 минут и 1,1 мМ в группе, забитой через приблизительно 150 минут. У всех крыс не наблюдалось вредного воздействия потребления триолида. Таким образом, было обнаружено увеличение (R)-3-гидроксибутирата в сыворотке на 0,65 мМ после поедания всего лишь 0,4 г триолида. Следует отметить, что, поскольку крысы были голодными, исходный уровень (R)-3-гидроксибутирата повышался после кормления с 0,1 мМ до приблизительно 0,45 мМ.

Таким образом, у тестируемых крыс показано увеличение (R)-3-гидроксибутирата в плазме на протяжении, по меньшей мере, 3 часов при отсутствии вредных воздействий. Следует отметить, что у двух других крыс, потребивших приблизительно по 1,5 г триолида каждая в составе печенья ‘Hob-Nob^’ , не было обнаружено вредных воздействий через две недели.

Следует отметить, что повышенный уровень (R)-3-гидроксибутирата должен отражаться и на уровне ацетоацетата, который здесь не измеряли, поскольку in vivo происходит быстрое установление равновесия между этими соединениями, так что уровень ацетоацетата должен находиться между 40 и 100% от уровня (R)-3-гидроксибутирата.

Сравнительный пример 3: пероральное введение крысам (R)-3-гидроксибутирата, олигомеров (R)-3-гидроксибутирата и олигомеров ацетоуксусного эфира (R)-3-гидроксибутирата

Способность перорально вводимых (R)-3-гидроксибутирата и линейных олигомеров сравнительных примеров 1 и 2 повышать уровень кетоновых тел крови исследовали следующим образом. Крысы голодали в течение ночи и затем им скармливали по 100 мкл/100 г веса тела 4 М (R)-3-гидроксибутирата с рН, доведенным до 7,4 с помощью метилглюкамина. Измеренный в плазме уровень (R)-3-гидроксибутирата через 30 минут составил 0,62 мМ, тогда как при применении 9 М (R)-3-гидроксибутирата он равнялся 3 мМ.

Эту процедуру повторили с 2 М растворами смесей олигомеров (R)-3-гидроксибутирата и их ацетоуксусных эфиров, описанных в сравнительных примерах 1 и 2. Величину рН олигомера (R)-3-гидроксибутирата (19/1) и ацетоуксусного эфира (20/4) доводили до 7,6 с помощью метилглюкамина и уровень (R)-3-гидроксибутирата крови отслеживали с помощью упомянутой выше процедуры тестирования. Было показано повышение (R)-3-гидроксибутирата крови с 0,2 до 0,5 мМ на 60 и 120 минуте после скармливания.

Пример 5

Пример кетогенной диеты на 1500 калорий (6280,2 Дж) с применением циклического олигомера (I) изобретения. Было принято, что содержание циклического олигомера соответствует 6 ккал/г жира (25,12 кдж/г), 9 ккал/г углеводов (37,68 кДж/г) и 4 ккал/г белка (16,75 кДж/г). Олигомеры замещали для получения равного количества калорий (см. таблицу).

Пример 6: Действие (R)-3-гидроксибутирата на клетки гиппокампа

Методы

Культуральная среда и химикаты

Использовавшаяся с 0 по 4 день бессывороточная среда содержала Нейробазальную среду с добавлением В47, разведенную 50-кратно (Life Technology, Gaithersburg, MD), к которой добавляли: 0,5 мМ L-глутамина, 25 мкМ Na L-глутамата, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. После 4 дня применяли среду DMEM/F12 (модифицированную по Дульбекко среду игла), содержащую 5 мкМ инсулина, 30 нМ l-тироксина, 20 нМ прогестерона, 30 нМ селенита Na, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Микроостровковые культуры гиппокампа

Первичные культуры гиппокампа получали от эмбрионов крыс линии Вистар на 18 день развития и диспергировали легким встряхиванием в пипетке. Суспензию центрифугировали при 1500 × g в течение 10 мин и супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в новой среде при конечной концентрации клеток 0,4-0,5×10⁶ клеток/мл. Десять мкл этой суспензии наносили в центр покрытых поли-D-лизином культуральных лунок и чашки инкубировали при 38°С в течение 4 час, после чего добавляли 400 мкл свежей нейробазальной среды. Через 2 дня инкубации половину среды меняли на свежую среду и инкубацию продолжали в течение еще 2 дней. После 4 дня среду меняли на среду DMEM/F12, содержащую 5 мкМ инсулина, 30 нМ 1-тироксина, 20 нМ прогестерона, 30 нМ селенита Na, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Лунки делили на 4 группы: к половине лунок добавляли (R)-3-гидроксибутират до конечной концентрации 8 мМ, а к другой половине лунок добавляли 5 нМ амилоида _1-42 (Sigma). Эту среду меняли через 2 дня (день 8) и клетки фиксировали на 10 день и окрашивали с помощью анти-МАР2 (Boehringer Manheim, Indianapolis IN) для визуализации нейронов и виментина, а также с помощью GFAP (Boehringer) для визуализации глиальных клеток.

Результаты

Подсчет клеток

Добавление (R)-3-гидроксибутирата в инкубационную систему приводило к увеличению количества нейрональных клеток в микроостровке в среднем от 30 до 70 клеток на микроостровок. Добавление амилоида _1-42 к культурам снижало количество клеток с 70 до 30 клеток на микроостровок, что подтверждают наблюдения Hoshi et al., о том, что амилоид _1-42 является токсичным для нейронов гиппокампа. Добавление (R)-3-гидроксибутирата к культурам, содержащим амилоид _1-42, повышало количество клеток в среднем от 30 до 70 клеток на микроостровок. На основании этих данных мы заключаем, что добавление (R)-3-гидроксибутирата в субстратных количествах к среде, основными питательными веществами которой являются глюкоза, пируват и L-глутамин, замедляет скорость гибели клеток в культуре. Заключается далее, что (R)-3-гидроксибутират может снижать повышенную скорость гибели клеток гиппокампа, вызванной добавлением к культуре амилоида _1-42.

В присутствии (R)-3-гидроксибутирата наблюдалось как увеличение количества дендритных отростков, так и длины аксонов, независимо от присутствия _1-42. Это указывает на свойства, подобные свойствам фактора роста нервов.

Источники информации

1. Cheung, J.Y., С. Conover, D.M. Regen, C.F. Whitfield, H.E. Morgan. Effect of insulin on kinetics of sugar transport in heart muscle. Am J Physiol 1978; 234: E70-E78.

2. Simpson, I.A., S.W. Cushman. Hormonal regulation of mammalian glucose transport. Annu Rev Biochem 1986; 55:1059-1089.

3. Larner, J., J.C.Lawrence, R.J.Walkenbach, P.J.Roach, R.J.Hazen, L.C.Huang. Insulin control of glycogen synthesis. Adv Cyclic Nucleotide Res 1978; 9: 425-439).

4. Denton, R.M.. P.J.Randle. B.J.Bridges, R.H.Cooper, A.L.Kerbey, H.T.Pask, D.L.Severson, D.Stansbie, S.Whitehouse. Regulation of mammalian pyruvate dehydro-genase. Mol Cell Biochem 1975; 9: 27-53).

5. Mukherjee, C., R.L.Jungas. Activation of pyruvate dehydrogenase in adipose tissue by insulin. Evidence for an effect of insulin on pyruvate dehydrogenase phosphate phosphatase. Biochem J. 1975; 148: 229-235.

6. Randle, P.J., R.M.Denton, H.T.Pask, D.L.Severson. Calcium ions and the regulation of pyruvate dehydrogenase. Biochem Soc Symp 1974; 75-88.

7. Sodi-Pallares, D., M.R.Testelli, B.L.Fishleder, A.Bisteni, G.A.Medrano, C.Friedland, A.D.Micheli. Effects of an intravenous infusion of potassium-glucose-insulin solution on the electrographic signs of myocardial infarction. Am J Cardiol 1962; 9: 166-181.

8. Rackley, C.E., R.O.Russell, Jr., W.J.Rogers, J.A.Mantle, H.G.McDaniel, S.E.Papapietro. Clinical experience with glucose-insulin-potassium therapy in acute myocardial infarction. Am Heart J 1981; 102: 1038-1049.

9. Muller, J.E., S.Mochizuki, J.K.Koster, Jr, J.J.Collins, Jr., L.H.Cohn, S.R.Neely. Insulin therapy for depressed myocardial contractility after prolonged ischemia. Am J Cardiol 1978; 41:1215-1221.

10. Oliver, M.F., L.H.Opie. Effects of glucose and fatty acids on myocardial ischaemia and arrhythmias. Lancet 1994; 343: 155-158.

11. Taegtmeyer, H. The use of hypertonic glucose, insulin, and potassium (GIK) in myocardial preservation. J Appi Cardiol 1991; 6: 255-259.

12. McDaniel, H.G., S.E.Papapietro, W.J.Rogers, J.A.Mantle, L.R.Smith, R.O.Russell, Jr., C.E.Rackley. Glucose-insulin-potassium induced alterations in individual plasma free fatty acids in patients with acute myocardial infarction. Am Heart J 1981; 102: 10-15.

13. Cross, H.R., К.Clarke, L.H.Opie, G.K.Radda. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate, J Mol Cell Cardiol 1995; 27: 1369-1381.

14. Cahill, G.F. Jr. Starvation in man. N Engi J Med 1970; 282: 668-675.

15. Sato, К., Y.Kashiwaya С.А.Кеоn, N.Tsuchiya, M.T.King, O.K.Radda, B.Chance. K.Clarke, R.L.Veech. Insulin, ketone bodies, and mitochondrial energy transduction. FASEB J 1995; 9: 651-658.

16. Kashiwaya, Y., К.Sato, N.Tsuchiya, S.Thomas, D.A.Fell, R.L. Veech, J.V.Passonneau. Control of glucose utilization in workina perfused rat heart. J Biol Chem 1994; 269: 25502-25514.

17. Clarke, К., Y.Kashiwaya, M.T.King, D.Gates, C.A.Keon, H.R.Cross, G.K.Radda, R.L.Veech. The / peak height ratio of ATP: a measure of free [Mg²⁺] using ³¹P NMR. J Biol Chem 1996; 271: 21142-21150.

18. Veloso, D., R.W.Guynn, M.Oskarsson, R.L.Veech. The concentrations of free and bound magnesium in rat tissues. Relative constancy of free Mg²⁺ concentrations. J Biol Chem 1973; 248: 4811-4819.

19. Chance, В., J.S.J.Leigh, J.Kent, K.McCully, S.Nioka, B.J.ark, J.M.Mans, T.Graham. Multiple controls of oxidative metabolism in living tissues as studied by phosphorus magnetic resonance. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 9458-9462.

20. Veech, R.L., J.W.R.Lawson, N.W.Comell, H.A.Krebs. Cytosoiic phosphorylation potential. J Biol Chem 1979; 254: 6538-6547.

21. Passonneau, J.V., J.P.Schwartz, D.A.Rottenberg. The partial purification and properties of pig brain glycogen synthase. J Biol Chem 1975; 250: 2287-2292.

22. Michaelis, L., M.L.Menten. Die Kinetik der Invertin-wirkung. Biochem Z 1913; 49: 333-369.

23. Haldane, J.B.S., Enzymes. London: Longmans, Green and Co. 1930: 74-92.

24. Kacser, H., J.A.Burns. The control of flux. Symp Soc Ecp Biol 1973; 27: 65-104.

25. Purich, D.L., H.J.Fromm, F.B.Rudolph. The hexokinases: kinetic, physical, and regulatory properties. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1973; 39: 249-326.

26. Casazza, J.P., R.L.Veech. The interdependence of glycolytic and pentose cycle intermediates in ad libitum fed rats. J Biol Chem 1986; 261: 690-698.

27. Randle, P.J. Metabolic fuel selection: general integration at the whole-body level. Proc Nutr Soc 1995; 54: 317-327.

28. Williamson, J.R., H.A.Krebs. Acetoacetate as fuel of respiration in the perfused rat heart. Biochem J 1961; 80: 540-547.

29. Taegtmeyer, H., R.Hems, H.A.Krebs. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J 1980; 186: 701-711.

30. Halestrap, A.P., R.M.Denton. The specificity and metabolic implications of the inhibition of pyruvate transport in isolated mitochondria and intact tissue preparations by K-Cyano-4-hydroxycinnamate and related compounds. Biochem J 1975; 148: 97-106.

31. Williamson, D.H., P.Lund, H.A.Krebs. The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver. Biochem J 1967; 103: 514-527.

32. Krebs, H.A., R.L.Veech. The energy and metabolic control in mitochondria. Adriatica Editrice: Bari, 1969: 329-382.

33. Ozawa, К., Н.Aoyama, К.Yasuda, Y.Shimahara, T.Nakatani, J.Tanaka, M.Yamamoto, Y.Kamiyama, T.Tobe. Metabolic abnormalities associated with postoperative organ failure. A redox theory. Arch Surg 1983; 118: 1245-1251.

34. Tanaka, A., T.Kitai, A.Tokuka, T.Inomoto, H.J.Kirn, K.Tanaka, Y.Yamaoka, K.Ozawa. Increased span of oxido-reduction states between pyridine nucleotide and cytochrome С oxidase in the regenerating rabbit liver as measured by arterial ketone body ratio and near-infrared spectroscopy. Res Exp Med (Beri) 1993; 193: 353-359.

35. Veech, R.L., D.N.Gates, C.W. Crutchfield, W.L.Gitomer, Y.Kashiwaya, M.T.King, R. Wondergem. Metabolic hyperpolarization of liver by ethanol: The importance of Mg²⁺ and H ⁺ in determining impermeant intracellular anionic charge and energy of metabolic reactions. Alcohol Clin Exp Res 1994; 18: 1040-1056.

36. Lawson, J.W.R., R.L.Veech. Effects of pH and free Мg²⁺ on the Keq of the creatine kinase reaction and other phosphate hydrolyses and phosphate transfer reactions. J Biol Chem 1979; 254: 6528-6537.

37. Hochachka, P.W., C.M.Clark, J.E.Holden, C.Stanley, K.Ugurbil, R.S.Menon. ³¹P magnetic resonance spectroscopy of the Sherpa heart: a phosphocreatine/adenosine triphosphate signature of metabolic defense against hypobaric hypoxia. Proc Nail Acad Sci USA 1996; 93: 1215-1220.

38. Klingenberg, M. Metabolite transport in mitochondria: an example for intracellular membrane function. Essays Biochem 1970; 6: 119-159.

39. Coty, W.A., P.L.Pedersen. Phosphate transport in rat liver mitochondria. Kinetics and energy requirements. J Biol Chem 1974; 249: 2593-2598.

40. Masuda, Т., G.P.Dobson, R.L.Veech. The Gibbs-Donnan near-equilibrium system of heart. J Biol Chem 1990; 265: 20321-20334.

41. Romani, A., A.Scarpa. cAMP control of Mg²⁺ homeostasis in heart and liver cells. Magnes Res 1992; 5: 131-137.

42. Veech, R.L., Y.Kashiwaya, M.T. King. The resting potential of cells are measures of electrical work not of ionic currents. Int Physiol Behav Sci 1995; 30: 283-306.

43. Denton, R.M., J.G.McCormack, P.J.Midgley, G.A.Rutter. Hormonal regulation of fluxes through pyruvate dehydrogenase and the citric acid cycle in mammalian tissues. Biochem Soc Symp 1987; 54: 127-143.

44. Saladin, R, P. De Vos, M.Guerre-Millo, A.Leturque, J.Girard, B.Staels, J.Auwerx. Transient increase in obese gene expression after food intake or insulin administration. Nature 1995; 377: 527-529.

45. Apstein, C.S., F.N.Gravino, C.C.Haudenschild. Determinants of a protective effect of glucose and insulin on the ischemic myocardium. Effects on contractile function, diastolic compliance, metabolism, and ultra-structure during ischemia and reperfusion. Circ Res 1983; 52: 515-526.

46. Mantle, J.A., W.J.Rogers, L.R.Smith, H.G.McDaniel, S.E.Papapietro, R.O.Russell Jr., C.E.Rackley. Clinical effects of glucose-insulin-potassium on left ventricular function in acute myocardial infarction: results from a randomized clinical trial. Am Heart J 1981; 102: 313-324.

47. Owen, O.E., A.P.Morcran, H.G.Kemp, J.M.Sullivan, M.G.Herrera, G.F.Cahill, Jr.Brain metabolism during fasting. J Clin Invest 1967; 46: 1589-1595.

48. Veech, R.L. The toxic impact of parenteral solutions on the metabolism of cells: a hypothesis for physiological parenteral therapy. Am J Clin Nutr 1986; 44: 519-551.

49. Chan, L., J.Slater, J.Hasbargen, D.N.Herndon, R.L.Veech, S.Wolf. Neurocardiac toxicity of racemic D, L-lactate fluids. Integr Physiol Behav Sci 1994; 29: 383-394.

50. ISIS4. A randomised factorial trial assessing early oral captopril, oral mononitrate, and intravenous magnesium sulphate in 58,050 patients with suspected acute myocardial infarction. Lancet 1995; 345: 669-685.

51. Seelig, MS., R.J.Elin. Is there a place for magnesium in the treatment of acute myocardial infarction. Am Heart J 1996; 132: 471-477.

52. McLean, RM. Magnesium and its therapeutic uses: a review. Am J Med 1994; 96: 63-76.

53. Ma, J., A.R.Folsom, S.L.Melnick, J.H.Eckfeldt, A.R.Sharrett, A.A.Nabulsi, R.G.Hutchinson, P.A.Metcalf. Associations of scrum and dietary magnesium with cardiovascular disease, hypertension, diabetes, insulin, and carotid arterial wall thickness: the ARIC study. Atherosclerosis Risk in Communities Study. J Clin Epidemiol 1995; 48: 927-940.

54. Ozono, R., T.Oshima, H.Matsuura, Y.Higashi, T.Ishida, M.Watanabe, M.Yoshimura, H.Hiraga, N.Ono, O.Kajiyama. Systemic magnesium deficiency disclosed by magnesium loading test in patients with essential hypertension. Hypertens Res 1995; 18: 39-42.

55. Rasmussen, H.S., P.McNair, L.Goransson, S.Balslov, O.G.Larsen, P.Aurup. Magnesium deficiency in patients with ischemic heart disease with and without acute myocardial infarction uncovered by an intravenous loading test. Arch Intern Med 1988; 148: 329-332.

56. Amari, A., N.C.Grace, W.W.Fisher. Achieving and maintaining compliance with the ketogenic diet. J Appi Behav Anal 28: 341-342, 1995.

57. Bartus, R.T., R.L.Dean, 3d, B.Beer, A.S.Lippa. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science 217: 408-414, 1982.

58. Beylot, M., D.Chassard, С.Chambrier, M.Guiraud, M.Odeon, В.Beaufrere, P.Bouletreau. Metabolic effects of a (R)-3-hydroxybutyrate infusion in septic patients: inhibition of lipolysis and glucose production but not leucine oxidation. Crit Care Med 22: 1091-1098, 1994.

59. Birkhahn, R.H., J.R.Border. Intravenous feeding of the rate with short chain fatty acid esters. II Monoacetoacetin. Am J Clin Nutr 31: 436-441, 1978.

60. Brashear, A., G.A.Cook. A spectrophotometric, enzymatic assay for D-3-hydroxybutyrate that is not dependent on hydrazine. Anal Biochem 131: 478-482, 1983.

61. Brion, J.P. The neurobiology of Alzheimer's disease. Acta Clin Beig 51: 80-90, 1996.

62. Cahill, G.F., Jr. Starvation in man. N Engi J Med 282: 668-675, 1970.

63. Cahill, G.F., Jr., Т.Т.Aoki. Alternative Fuel Utilization in Brain. In: Cerebral metabolism and neural function, edited by J.V.Passonneau, R.A.Hawkins, W.D.Lust, and F.A.Welsh, Baltimore, Williams & Wilkins, 1980, p.234-242.

64. Chan, L., J.Slater, J.Hasbargen, D.N.Herndon, R.L.Veech, S.Wolf. Neurocardiac toxicity of racemic D, L-lactate fluids, Integr Physiol Behav Sci 29: 383-394, 1994.

65. Chartier-Harlin, M.C., F.Crawford, H. Houlden, A. Warren, D.Hughes, L.Fidani, A.Goate, M.Rossor, P.Roques, J.Hardy Early-onset Alzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein gene. Nature 353: 844-846, 1991.

66. Corder, E.H., A.M.Saunders, W.J.Strittmatter, D.E.Schmechel, P.C.Gaskell, G.W.Small, A.D.Roses, J.L.Haines, M.A.Pericak-Vance. Gene dose of apolipo-protein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families (see comments). Science 261: 921-923, 1993.

67. Desrochers, S., P.Dubreuil, J.Brunet, M.Jette, F.David, B.R.Landau, H.Btunengraber. Metabolism of (R,S)-1, 3-butanediol acetoacetate esters, potential parenteral and enteral nutrients in conscious pigs. Am J Physiol 286: E660-7, 1995.

68. Desrochers, S., К.Quinze, H.Dugas, P.Dubreuil, C.Bomont, F.David, K.C.Agarwal, A.Kumar, M.V.Soloviev, L.Powers, B.R.Landau, H. Brunengraber. (R.S.) 1,3 butandiol acetoacetate esters, potential alternatives to lipid emulsions for total parenteral nutrition. J Nutr Biochem 6:109-116, 1995.

69. Feany, M.B., D.W.Dickson. Neurodegenerative disorders with extensive tau pathology: a comparative study and review. Ann Neurol 40: 139-148, 1996.

70. Fox, N.C., E.K.Warrington, P.A.Freeborough, P.Hartikainen, A.M.Kennedy, J.M.Stevens, M.N.Rossor. Presymptomatic hippocampal atrophy in Alzheimer's disease. A longitudinal MRI study. Brain 119: 2001-2007, 1996.

71. Freeman, J.M., E.P.G.Vining. Intractable epilepsy. Epilepsia 33: 1132-1136, 1992.

72. Goate, A., M.C.Chartier-Harlin, M.Mullan, J.Brown, F.Crawford, L.Fidani, L.Giuffra, A.Haynes, N.Irving, L.James. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease (see comments). Nature 349: 704-706, 1991.

73. Graham, D.I., S.M.Gentleman, J.A.Nicoll, M.C.Royston, I.E.McKenzie, G.W.Roberts, W.S.Griffin. Altered beta-APP metabolism after head injury and its relationship to the aetiology of Alzheimer's disease. Ada Neurochir Suppi (Wien). 66: 96-102, 1996.

74. Gumbiner, В., J.A.Wendel, M.P.McDermott. Effects of diet composition and ketosis on glycemia during very-low-energy-diet therapy in obese patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Clin Nutr 63: 110-115, 1996.

75. Halestrap, A.P. The mitochondrial pyruvate carrier. Kinetics and specificity for substrates and inhibitors. Biochem J 148: 85-96, 1975.

76. Hawkins, R.A., J.F.Biebuyck. Regional brain utilization of ketone bodies. In: Cerebral metabolism and neural function, edited by J.V.Passonneau, R.A.Hawkins, W.D.Lust, and F.A.Welsh. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980, p.255-263.

77. Hoshi, M., A.Takashima, M.Murayama, K.Yasutake, N.Yoshida, K.Ishiguro, T.Hoshino, K.Imahori. Nontoxic amyloid p peptide_1-42 suppresses acetylcholine synthesis. J Biol Chem 272: 2038-2041, 1997.

78. Hoshi, M., A.Takashima, K.Noguchi, M.Murayama, M.Sato, S.Kondo, Y.Saitoh, K.Ishiguro, T.Hoshino, K.Imahori. Regulation of mitochondrial pyruvate dehydro-genase activity by tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3beta in brain. Proc Nati Acad Sci USA 93: 2719-2723, 1996.

79. Hutton, M., F.Busfield, M.Wragg, R.Crook, J.Perez-Tur, R.F.Clark, G.Prihar, C.Talbot, H.Phillips. K.Wright, M.Baker, C.Lendon, K.Duff, A.Martinez, H.Houlden, A.Nichols, E.Karran, G.Roberts, P.Roques, M.Rossor, J.C.Venter, M.D.Adams, R.T.Cline, C.A.Phillips, A.Goate. Complete analysis of the presenilin I gene in early onset Aizheimer's disease. Neuroreport. 7: 801-805, 1996.

80. Kashiwaya, Y., K.Sato, N.Tsuchiya, S.Thomas, D.A.Fell, R.L.Veech, J.V.Passonneau. Control of glucose utilization in working perfused rat heart. J Biol Chem 269: 25502-25514, 1994.

81. Kies, C., R.B.Tobin, H.M.Fox, M.A.Mehlman. Utilization of 1,3-butanediol and nonspecific nitrogen in human adults. J. Nutr. 103: 1155-1163, 1973.

82. Kripke, S.A., A.D.Fox, J.M.Berman, J.DePaula, R.H.Birkhahn, J.L.Rombeau, R.G.Settle. Inhibition of TPN-associated intestinal mucosal atrophy with mono-acetoacetin. J Surg Res 44: 436-444, 1988.

83. Langfort, J., W.Pilis, R.Zarzeczny, K.Nazar, H.Kaciuba-Uscilko. Effect of low-carbohydrate-ketogenic diet on metabolic and hormonal responses to graded exercise in men. J Physiol Pharmacol 47: 361-371, 1996.

84. Lawson, J.W.R., R.W.Guynn, N.W.Cornell, R.L.Veech. Gluconeogenesis, Its regulation in mammalian species. In: edited by R.W. Hanson and M.A. Mehlman, John Wiley & Sons: New York, 1976, p. 481-514.

85. Maiz, A., L.L.Moldawer, B.R.Bistrian, R.H.Birkhahn, C.L.Long, G.L.Blackburn. Monoacetoacetin and protein metabolism during parenteral nutrition in burned rates. Biochem J 226: 43-50, 1985.

86. Masuda, Т., G.P.Dobson, R.L.Veech. The Gibbs-Donnan near-equilibrium system of heart. J. Biol. Chem 265: 20321-20334, 1990.

87. Mehlman M.A., R.L.Veech. Redox and phosphorylation states and metabolite concentrations in frozen clamped livers of rats fed diets containing 1,3-butanediol and DL-carnitine. J Nutr 102: 45-51, 1972.

88. Nebeling, L.C., E.Lerner. Implementing a ketogenic diet based on mediumchain triglyceride oil in pediatric patents with cancer. J Am Diet Assoc 95: 693-697, 1995.

89. Nebeling, L.C., F.Miraldi, S.B.Shurin, E.Lerner. Effects of a ketogenic diet on tumor metabolism and nutritional status in pediatric oncology patents: two case reports. J Am Coil Nutr 14: 202-208, 1995.

90. Oster-Granite, M.L., D.L. McPhie, I.Greenan, R.L.Neve. Age-dependent neuronal and synaptic degeneration in mice transgenic for the С terminus of the amyloid precursor protein. J Neurosci 16: 6732-6741, 1996.

91. Owen, O.E., A.P.Morgan, H.G.Kemp, J.M.Sullivan, M.G.Herrera, G.F.Cahill, Jr. Brain metabolism during fasting. J Clin Invest 46: 1589-1595, 1967.

92. Paradis, E., H.Douillard, M.Koutroumanis, С.Goodyer, A. LeBlanc. Amyloid beta peptide of Alzheimer's disease downregulates Bcl-2 and upregulates bax expression in human neurons. J Neurosci 16: 7533-7539, 1996.

93. Rhie, H.G., D.Dennis. Role of fadR and atoC(Con) mutations in poly(3-hydroxy-butyrate-co-3-hydroxy-valerate) synthesis in recombinant pha-Escherichia coli. Appi Environ Microbiol 61: 2487-2492, 1995.

94. Rossor, M.N. Catastrophe, chaos and Alzheimer's disease. The FE Williams Lecture. J R Coil Physicians Lond 29: 412-418, 1995.

95. Sato, К., Y.Kashiwaya С.А.Кеоn, N.Tsuchiya, M.T.King, G.K.Radda, B.Chance, K.Clarke, R.L.Veech. Insulin, Ketone bodies, and mitochondrial energy transduction, FASEB J 9: 651-658, 1995.

96. Selkoe, D.J. Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments. Science 275: 630-631, 1997.

97. Sheng, J.G., К.Ito, R.D.Skinner, R.E.Mrak, C.R.Rovnaghi, U.Van Eldik, W.S.Griffin. In vivo and in vitro evidence supporting a role for the inflammatory cytokine interleukin-1 as a driving force in Alzheimer pathogenesis. Neurobiol Aging 17: 761-766, 1996.

98. Strittmatter, W.J., A.D.Roses. Apolipoprotein E and Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4725-4727, 1995.

99. Taegtmeyer, H., R.Hems, H.A.Krebs. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J 186: 701-711, 1980.

100. Talbot, С., H.Houlden, H.Craddock, R.Crook, M.Hutton, C.Lendon, G.Prihar, J.C.Morris, J.Hardy, A.Goate. Polymorphism in AACT gene may lower age of onset of Alzheimer's disease. Neuroreport. 7: 534-536, 1996.

101. Tobin, R.B., M.A.Mehlman, C.Kies, H.M.Fox, J.S.Soeldner. Nutritional and metabolic studies in humans with 1,3-butanediol. Fed Proc 34: 2171-2176, 1975.

102. Valentin, H.F., D.Dennis. Metabolic pathway for poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) formation in Nocardia corallina: inactivation of mutB by chromosomal integration of a kanamycin resistance gene. Appi Environ Microbio 62: 372-379, 1996.

103. Veech, R.L. The toxic impact of parenteral solutions on the metabolism of cells: a hypothesis for physiological parenteral therapy. Am J Clin Nutr 44: 519-551, 1986.

104. Veech, R.L. The untoward effects of the anions of dialysis fluids. Kidney Int 34: 587-597, 1988.

105. Veech, R.L., W.L.Gitomer. The medical and metabolic consequences of administration of sodium acetate. Adv Enzyme Regui 27: 313-343, 1988.

106. Veech, R.L., R.W.Guynn, D.Veloso. The time-course of the effects of ethanol on the redox and phospho-rylation states of rat liver. Biochem J 127: 387-397, 1972.

107. Veech, R.L., R.L.Harris, M.A.Mehlman. Brain meta-bolite concentrations and redox states in rats fed diets containing 1,3-butanediol and ethanol. Toxicol Appi Phamacol 29: 196-203, 1974.

108. Wang, J.Z., I.Grundke-Iqbal, K.Iqbal. Restoration of biological activity of alzheimer abnormally phospho-rylated tau by dephosphoryulation with protein phosphatase-2A, -2B and -I. Brain Res Mol Brain Res 38: 200-208, 1996.

109. Wilder, R.M.Effect of ketonuria on the course of epilepsy. Mayo Clin Bull 2: 307-ff, 1921.

110. Williamson, D.H., P.Lund, H.A.Krebs. The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver. Biochem J 103: 514-527, 1967.

111. Williamson, D.H., J.Mellanby, H.A.Krebs. Biochem j 82: 90-96, 1962.

112. Wing, R.R., H.A.Vazquez, C.M.Ryan. Cognitive effects of ketogenic weight-reducing diets. Int J Obes Relat Metab Disord 19: 811-816, 1995.

113. Zhang, H., V.Obias, К.Gonyer, D.Dennis. Production of polyhydroxylakanoates in sucrose-utilizing recom-binant Escherichia coil and Klebsiella strains. Appi Environ Microbiol 60: 1198-1205, 1994.