противоопухолевые соединения

Формула изобретения

1. Соединение общей формулы I или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер,



где R_1-16 являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, C₁-C₂₄ алкила, С₂-С₂₄ алкенила, =O и OR_a, OCOR_a;

X и Y являются C₅-C₁₂ алкильными группами, которые замещены одной или несколькими C₁-С₆ алкильными группами, гидроксильными группами и/или тетрагидропираном, который необязательно может быть замещен алкилом и/или группой OR_a;

R_a независимо выбирают из водорода и C₁-C₁₂ алкила; и

пунктирная линия показывает присутствие двойной связи.

2. Соединение по п.1, где R_1-7 и R_9-15 являются группами, независимо выбранными из водорода, гидроксила, C₁-С ₆ алкила и OR_a.

3. Соединение по п.2, где R_1-7 и R_9-15 являются группами, независимо выбранными из водорода, гидроксила, метила и метокси.

4. Соединение по п.3, где R₁, R₅, R₉ и R₁₃ являются метилом.

5. Соединение по п.3, где R₂, R₄, R₇, R₁₀ ; R₁₂ и R₁₅ являются гидроксилом.

6. Соединение по п.3, где R₃ и R₁₁ являются водородом.

7. Соединение по п.3, где R₆ и R ₁₄ являются метокси.

8. Соединение по любому из пп.1-7, где R₈ и R₁₆ являются =O.

9. Соединение по любому из пп.1-7, где Х и Y являются

10. Соединение по п.8, где Х и Y являются

11. Соединение по п.1, имеющее следующую формулу:

12. Способ получения соединения, определенного по любому из предшествующих пунктов, включающий его экстракцию и выделение из организма вида Theonella swinhoei.

13. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая соединение по любому из пп.1-11 или его фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем.

14. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер для применения в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевой активностью.

15. Применение соединения по любому из пп.1-11 или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера для получения лекарственного средства, направленного на лечение рака.

Описание изобретения к патенту

Уровень техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым противоопухолевым соединениям, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению в качестве противоопухолевых агентов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было показано, что некоторые асимметричные димерные макролиды обладают противоопухолевыми, противовирусными и/или противогрибковыми свойствами. В частности, Kitagawa и др. (Chem. Pharm. Bull., 1994, 42(1), 19-26) выделили несколько асимметричных димерных макролидов из окинавской морской губки Theonella swinhoei:

Показано, что Swinholide А (1), В (2) и С (3) проявляют цитотоксическую активность против L1210 и КВ клеток со значением IC₅₀ 0,03, 0,30 и 0,14 мкг/мл (для L1210) и 0,04, 0,04 и 0,05 мкг/мл (для КВ), соответственно. Однако наблюдалось, что isoswinhokide A (4) показывал меньшую цитотоксичность [IC₅₀ 1,35 мкг/мл (L1210) и 1,1 мкг/мл (КВ)] по сравнению с другими, ранее указанными аналогами.

Kitagawa и др. также проверили цитотоксичность некоторых димеров, полученных из Swinholide А (1):

наблюдая, что оба димера (8 и 9) показывают слабую способность ингибирования роста КВ клеток (51,1% ингибирования при 50 мкг/мл и 19,3% ингибирования при 10 мкг/мл, соответственно).

Другие димерные макролиды, которые были получены из Swinholide А (1), были следующими:

Цитотоксичность данных соединений (10-13) против L1210 и КВ клеток является меньшей, чем цитотоксичность, показанная Swinholide A (1).

Помимо этого, Kitagawa и др. проверили противоопухолевый эффект Swinholide A (1) и его изомеров против Р388 лейкемии у CDF1 мыши. Неожиданно было обнаружено, что Swinholide А (1), isoswinholide А (4) и изомер 11 были токсичны и не показали многообещающей противоопухолевой активности.

Кроме этого, заявка на патент WO 88/00195 описывает следующие соединения (Misakinolide А (15) и производные (15)), которые были выделены из морской губки рода Theonella:

В указанной заявке на патент описывается противоопухолевая активность Misakinolide А (14) in vitro против Р388, НСТ-8, А549 и MDA-MB-231 раковых клеток. Также было описано, что кроме ярко выраженной цитотоксичности [IC ₅₀ 0,035 мкг/мл (L1210)], Misakinolide А также обладает противоопухолевой активностью [T/C 140% при дозе 0,1 мг/кг (мыши), против Р388 лейкемии] (Chem. Pharm. Bull., 1994, 42(1), 19-26).

Рак продолжает быть одной из главных причин смерти среди видов животных и человека. Были предприняты и продолжают предприниматься огромные усилия, направленные на поиск средств предохранения и новых эффективных противоопухолевых агентов, которые внесут вклад в увеличение терапевтического арсенала, необходимого для эффективного лечения пациентов с этим заболеванием. В этом смысле настоящее изобретение направлено на решение данной проблемы, предоставляя новые соединения, эффективные при лечении рака.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на асимметрические димерные макролиды с общей формулой I, а также на их соответствующие фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства и стереоизомеры,

где R_1-16 являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, замещенного или незамещенного С₁-С ₂₄ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С ₂₄ алкенила, замещенного или незамещенного С₂ -С₂₄ алкинила, =О, OR_a, OCOR_a , NR_aR_b, NR_aCOR_b, CONR_aR_b, COR_a, COOR_a и галогена.

X и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С₁-С ₂₄ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С ₂₄ алкенила, замещенного или незамещенного С₂ -С₂₄ алкинила, =О, OR_a, OCOR_a , NR_aR_b, NR_aCOR_b, CONR_aR_b, COR_a, COOR_a и галогена;

R_a и R_b являются группами, независимо выбранными из водорода, галогена, замещенного или незамещенного С₁-С₁₂ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С₁₂ алкенила, замещенного или незамещенного С₂-С₁₂ алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла; и пунктирная линия показывает необязательное присутствие двойной связи.

Изобретение также относится к выделению соединений формулы I из губок семейства Theonellidae, рода Theonella и вида swinhoei, и к образованию производных выделенных соединений.

Кроме этого, настоящее изобретение также относится к соединению общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, производному, пролекарству или стереоизомеру, для его применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение также направлено на применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, производного, пролекарства или стереоизомера для получения лекарственного средства для лечения рака.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I или его соответствующие фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства или стереоизомеры в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем.

Подробное описание изобретения

Соединения, являющиеся целью изобретения, относятся к асимметрическим димерным макролидам общей формулы I

где R_1-16 являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, замещенного или незамещенного С₁-С ₂₄ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С ₂₄ алкенила, замещенного или незамещенного С₂ -С₂₄ алкинила, =О, OR_a, OCOR_a , NR_aR_b, NR_aCOR_b, CONR_aR_b, COR_a, COOR_a и галогена.

X и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С₁-С ₂₄ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С ₂₄ алкенила, замещенного или незамещенного С₂ -С₂₄ алкинила, =О, OR_a, OCOR_a , NR_aR_b, NR_aCOR_b, CONR_aR_b, COR_a, COOR_a и галогена;

R_a и R_b являются группами, независимо выбранными из водорода, галогена, замещенного или незамещенного С₁-С₂₄ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С₂₄ алкенила, замещенного или незамещенного С₂-С₂₄ алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла; и пунктирная линия показывает необязательное присутствие двойной связи.

Группы или заместители в данных соединениях могут быть выбраны согласно следующим условиям.

Термин алкил обозначает линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 24 атомов углерода. Предпочтительными являются алкильные группы от 1 до 6 атомов углерода, и особенно предпочтительны те, которые состоят из 1, 2, 3 и 4 атомов углерода. В соединениях настоящего изобретения особенно предпочтительными алкильными группами являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, втор-бутильная и трет-бутильная группы. Также термин алкил, используемый в настоящем изобретении, относится как к циклической, так и нециклической группе, принимая во внимание, что циклические группы будут содержать, по крайней мере, три атома углерода в кольце. Другими предпочтительными алкильными группами являются такие, которые имеют от 5 до 12 атомов углерода, причем особенно предпочтительны такие, которые состоят из 6, 7, 8, 9 и 10 атомов углерода. В соединениях настоящего изобретения особенно предпочтительными алкильными группами являются гексильная, гептильная, 1,3-диметилпентильная, октильная, 1,3-диметилгексильная и нонильная группы.

Термины алкенил и алкинил обозначают линейную или разветвленную ненасыщенную алкильную цепь, содержащую от 2 до 24 атомов углерода, и включающую одно или несколько ненасыщенных положений. Предпочтительными являются алкенильные, алкинильные группы, имеющие от 2 до 6 атомов углерода, и особенно предпочтительны те, которые состоят из 2, 3 и 4 атомов углерода. Также термины алкенил и алкинил, используемые в настоящем изобретении, относятся как к циклическим, так и нециклическим группам, принимая во внимание, что циклические группы будут содержать, по крайней мере, три атома углерода в кольце. Другими предпочтительными алкенильными и алкинильными группами являются такие, которые имеют от 5 до 12 атомов углерода. В число арильных групп, которые могут присутствовать в соединениях изобретения, включены такие, которые содержат одно или несколько колец, включая множественные кольца с разделенными или конденсированными арильными или гетероарильными группами. Обычно арильные группы содержат от 1 до 3 колец и от 4 до 18 атом углерода в кольце(ах). Предпочтительными арильными группами являются фенил, нафтил, бифенил, фенантрил и антрацил, причем все они замещены или незамещены.

В число гетероциклических групп, которые могут присутствовать в соединениях изобретения, включены как гетероароматические, так и гетероалициклические группы. Гетероароматические группы содержат один, два или три гетероатома, выбранных из N, O и S, например, включая группы, такие как кумаринил, предпочтительно 8-кумаринил, хинолинил, предпочтительно 8-хинолинил, пиридил, пиразинил, пиримидил, фурил, пирролил, тиенил, тиазолил, оксазолил, имидазолил, индолил, бензофуранил и бензотиазолил. Гетероалициклические группы содержат один, два или три гетероатома, выбранных из N, O и, S, и, например, включая группы, такие как тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, пиперидинил, морфолин и пирролидинил. Гетероциклические группы могут быть как замещенными, так и незамещенными.

Ранее упомянутые группы, возможно, могут быть замещены по их одному или нескольким доступным положениям, независимо одним или несколькими подходящими заместителями, такими как OR`, =О, SR`, SOR`, SO<sub>2</sub>R`, NO₂, NHR`, N(R`)₂, =N-R`, NHCOR`, N(COR`) <sub>2</sub>, NHSO<sub>2</sub>R`, NR`C(=NR`)NHR`, CN, галоген, С(=O)R`, COOR`, OC(=O)R`, CONHR`, CON(R`)₂, замещенный или незамещенный С₁-С₂₄ алкил, замещенный или незамещенный С₂-С₂₄ алкенил, замещенный или незамещенный С₂-С₂₄ алкинил, замещенный или незамещенный арил и замещенный или незамещенный гетероцикл, где каждая группа R` независимо выбрана из Н, ОН, NO₂ , NH₂, SH, CN, галогена, =О, С(=O)Н, С(=O)алкила, СООН, замещенного или незамещенного С₁-С₁₂ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С₁₂ алкенила, замещенного или незамещенного С₂-С ₁₂ алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла. В число галогеновых заместителей, которые могут присутствовать в соединениях настоящего изобретения, включены F, Cl, Br и I. В случае таких групп, которые в свою очередь замещены, соответствующие заместители могут быть выбраны из указанного здесь списка заместителей.

Гидроксильная группа, возможно, может быть защищена. Существует огромное число гидроксильных защитных групп, и они хорошо известны специалисту в данной области техники. Для справки см. Protecting groups, Kocienski, 2004, 3-е изд.

Термин «фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства» относится к любой фармацевтически приемлемой соли, сложному эфиру, сольвату, гидрату или какому-либо другому соединению, которое после его введения пациенту способно (напрямую или опосредованно) дать соединение формулы I. Однако следует принимать во внимание, что не фармацевтически приемлемые соли также находятся в рамках изобретения, так как они могут быть пригодными при получении фармацевтически приемлемых солей. Получение солей, пролекарств и производных может быть осуществлено с помощью способов, известных в области техники.

Например, фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего изобретения получаются из соответствующих соединений, имеющих кислотные или основные части, с помощью традиционных химических методов. В основном указанные соли образуются, например, посредством реакции соответствующей основной или свободнокислотной формы указанного соединения со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде, органическом растворителе или в их смеси. Обычно предпочтительными неводными средами являются эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. В число солей, полученных добавлением кислоты, входят соли, полученные добавлением минеральных кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат и фосфат, и соли, полученные добавлением органических кислот, такие как ацетат, трифторацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, соль яблочной кислоты, соль миндальной кислоты, метансульфанат и паратолуолсульфанат. В число солей, полученных добавлением основания, входят неорганические соли, такие как натриевые, калиевые, кальциевые и аммонийные соли, и органические соли, такие как соли этилендиамина, этаноламина, N,N-диалкиленэтаноламина, триэтаноламина и основные соли аминокислот.

Соединения настоящего изобретения могут быть в кристаллической форме как в виде свободных соединений, так и сольватов (например, гидратов), причем обе формы включены в объем настоящего изобретения. Способы сольватации в основном хорошо известны в области техники.

Любое соединение, которое является пролекарством соединения общей формулы I, включено в объем настоящего изобретения. Термин «пролекарство» используется в широком смысле и включает все производные, которые могут быть превращены in vivo в любые соединения изобретения. Специалист в области техники знает, какие это производные могут быть, и они включают, например, соединения, в которых свободная гидроксильная группа превращена в сложноэфирное производное, или сложный эфир модифицирован посредством переэтерификации или образования подходящего амида.

Соединения настоящего изобретения, представленные общей формулой I, имеют более чем один стереогенный центр, так что изобретение в равной степени относится к каждому и любому из возможных энантиомеров и диастериомеров, которые могут быть получены, а также к возможным Z и Е стереоизомерам, которые могут быть образованы при наличии в молекуле двойной связи. В рамках настоящего изобретения находятся как чистые изомеры, так и смеси изомеров указанных соединений.

Предпочтительными соединениями настоящего изобретения являются такие, у которых R_1-16 являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, OR_a , OCOR_a, =О, NR_aR_b, NR_a COR_b, галогена и замещенного или незамещенного С ₁-С₂₄ алкила, где R_а определен выше. Особенно предпочтительными являются такие соединения, в которых R_1-7 и R_9-15 являются группами, независимо выбранными из водорода, гидроксила, С₁-С₆ алкила и OR_а; и среди них предпочтительными являются водород, гидроксил, метил и метокси. Также особенно предпочтительно, чтобы R₈ и R₁₆ группы были =О.

Предпочтительно Х и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С₅-С₁₂ алкила и замещенного или незамещенного С₅-С₁₂ алкенила. Особенно предпочтительно, чтобы они были независимо замещены одним или несколькими подходящими заместителями, и, в частности, замещены одним или несколькими следующими заместителями: ОН, OR`, NHCOR` и замещенным или незамещенным гетероциклом, где R` определен ранее. Более предпочтительно, чтобы X и Y были С ₅-С₁₂ алкильными группами, замещенными одной или несколькими гидроксильными группами и/или замещенными гетероциклами. Особенно предпочтительно, когда X и Y являются

В данных участках структуры предпочтительно наличие двойных связей, показанных пунктирной линией в общей формуле I.

Следующие соединения являются особенно предпочтительными соединениями настоящего изобретения:

Соединение А

Соединение А является природным продуктом, выделенным из морской губки, а именно из губки вида Theonellaswinhoei (Класс: Demosponhiae, Подкласс: Tetractinomorpha, Отряд: Lithistida, Подотряд: Triaenosina, Семейство: Theonellidae). Указанный организм был собран на Островах Глорьез (северо-запад Мадагаскара).

Данные виды губок обычны для запада Тихого Оокеана, в Индийском Океане и в Красном Море, причем располагаются по побережью на глубине до 48 метров. Образцы были найдены:

- Кения, Момбаса, Shelly Beach, на внешнем откосе рифа, на глубине 12-16 метров.

- North Kenya Banks (02° 25,`ю.ш. - 40° 42,5` в.д., на глубине 48 метров)

- Tulear, область Ifaty (Мадагаскар)

- Острова Albadra (северо-запад Мадагаскара)

- Ternate, Celebes, Ambon, Manila, Formosa (Филиппины), Тайвань.

Кроме этого, аналоги указанных соединений могут быть синтезированы специалистом в данной области техники с помощью, например, кислотного или основного гидролиза, окисления, этерификации, альдолльной конденсации, озонолиза, реакции Виттига, реакции Хорнера-Эммонса, эпоксидирования по Шарплессу или реакции Пиктеда-Спенглера. Соединение А и его аналоги могут быть синтезированы, например, посредством описанных синтезов подходящим образом защищенных мономерных единиц Swinholide A и Misakinolide A, последующего проведения реакций макролактонизации, которые позволяют получить Соединение А и его аналоги (см. K-S. Yeung и I. Paterson. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 4632-4653).

Важным аспектом соединений настоящего изобретения является их биологическая активность и, в частности, их цитотоксическая активность. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает новые фармацевтические композиции соединений общей формулы I, имеющих цитотоксический эффект, а также их применение в качестве противоопухолевых агентов. Кроме этого, настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение настоящего изобретения или фармацевтически приемлемую соль, производное, пролекарство или стереоизомер в смеси с фармацевтически приемлемым наполнителем или разбавителем.

Фармацевтические композиции, включенные в качестве примеров, являются любыми твердыми (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и т.п.) или жидкими (растворы, суспензии или эмульсии) композициями для орального, топического или парентерального введения. Фармацевтические композиции, содержащие соединения настоящего изобретения, также могут быть получены в форме липосом или наносфер, составов замедленного высвобождения или любых других традиционных систем высвобождения.

Введение соединений или композиций настоящего изобретения может быть осуществлено с помощью любых обычных способов, таких как внутривенное вливание, составы для орального введения и/или внутрибрюшинного и внутривенного введения. Предпочтительно, чтобы используемые времена вливания не превышали 24 часа, предпочтительно были от 1 до 12 часов и еще более предпочтительно от 1 до 6 часов. Короткие времена вливания особенно желаемы, так как это позволяет проводить лечение без необходимости проводить ночь в госпитале. Однако времена вливания от 12 до 24 часов и включая большие, при необходимости могут быть использованы. Вливание может быть проведено с подходящими интервалами, такими как от 1 до 4 недель.

Правильная доза соединений меняется в зависимости от типа используемого состава, формы применения и местоположения, хозяина и опухоли, которую необходимо лечить. Также должны приниматься во внимание другие факторы, такие как возраст, вес тела, пол, режим питания, время введения, скорость выведения, состояние здоровья хозяина, комбинация активных ингредиентов, чувствительность с точки зрения реакций и серьезности заболевания. Введение может быть проведено непрерывно или периодически с максимально переносимой дозой.

Соединения и композиции настоящего изобретения могут быть использованы вместе с другими активными ингредиентами в комбинированной терапии. Другие активные ингредиенты могут быть частью той же композиции или могут быть введены посредством другой композиции, причем одновременно или в различное время.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: ОПИСАНИЕ ОРГАНИЗМА И МЕСТО СБОРА

Несколько образцов губки Theonella swinhoei были собраны при погружении на Островах Глорьез (северо-запад Мадагаскара, запад Индийского Океана) на глубине 18 метров в ноябре 2003 г. Координаты места сбора образцов являются следующими: широта 11° 34` 995`` с.ш. и долгота 47° 16` 829`` в.д. Дно моря было скалистым и песчаным, и подложка образцов была скалистой.

Описание организма: массивная губка. Верхняя поверхность покрыта несколькими округлыми отверстиями (поры). Поверхность является гладкой и консистенция твердая, однако выдержанные образцы являются хрупкими. Цвет живой губки коричневый и ее внутренность светло-бежевого цвета. Дермальная мембрана равномерно пористая. Данные образцы легко характеризуются посредством скелетных элементов. Скелет образован неправильными узлами стронгилидов, направленных по касательным к поверхности, и помощью малоразветвленных спикул (кремнистая спикула губок неправильной формы). Внутренний скелет состоит из тетразоновых спикул, которые могут быть гладко или слабо покрыты бугорками.

ПРИМЕР 2: ВЫДЕЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ А

Замороженный образец (604 г) губки Примера 1 нарезают на кусочки и экстрагируют Н₂О (3×500 мл) и затем смесью МеОН:CH₂Cl₂ (50:50, 3×500 мл). Объединенные органические экстракты концентрируют, получая остаток (7,48 г), который разделяют вакуумной жидкостной хроматографией на Lichroprep RP-18 с градиентом от Н₂О:МеОН до CH₂Cl ₂. Соединение А (5,8 мг) выделяют из фракции, элюированной с МеОН, которую очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ (SymmetryPrep C-18, 7 мкм, 7,8 мм×150 мм, градиент Н₂О:CH ₃CN, УФ-детектирование), получая фракцию, содержащую Соединение А, и которую снова очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ (SymmetryPrep C-18, 7 мкм, 19 мм×150 мм, градиент Н₂О:CH ₃CN, УФ-детектирование).

Соединение А: MS (ESI)=1362 (M+). MS (APCI)=1345(M+1-H₂O)+. ¹ Н и ¹³С ЯМР см. Таблицу 1.

Соединение А

Таблица 1 Данные 1Н и 13С ЯМР (CD 3OD) соединения А
	1 Н, мультиплетность, J=Гц	13C	COSY	HMBC
1/32	-	170,7/171,1	-	-
2	5,91, д, 16,0	116,1	H-3	C-1, C-4
3	7,50, д, 16, 0	152,4	H-2	C-1, C-2, C-4, 4-Мe, C-5
4/33	-	135,6/129,9	-	-
4-Мe/33-Мe	1,86, с/1,89, с	12,7/13,22	H-5/H-34	C-3, 4-Мe, C-5/C-32, C-33, C-34
5/34	6,16, т, 7,0/6,99, т, 6,0	140,9/142,1	4-Мe, H-6/33-Мe, H-35	C-3, C-4, C-6, C-7/C-32, 33-Мe, C-35, C-36
6/35	2,44, м/2,38, м	38,8/38,6	H-5, H-7/H-34, H-36	C-4, C-5, C-7/C-33, C-34, C-36
7/36	4,02, м/4,08, м	68,4/67,8	H-6, H-8/H-35, H-37	C-8/C-37
8/37	1,38, м/1,80, мa	41,58/41,63b	H-7, H-9/H-36, H-38	-
9/38	4,49, д, 10,5	70,60/70,64с	H-8/H-37, H-40	C-10/C-39
10/39	5,68, м	131,1	H-11, H-13/H-40, H-41	C-9, C-11, C-12/C-38, C-40, C-41
11/40	5,83, м	125,05/125,20 d	H-10, H-12/H-38, H-39	C-10/C-39
12/41	2,00, м	32,37/32,44е	H-11, H-13/H-39, H-42	C-10, C-11/C-39, C-40
13/42	3,57, м	65,5/65,7 f	H-10, H-12, H-14/H-41, H-43	-
14/43	1,58, м/1,82, мg	37,1/37,4 h	H-13, H-15/H-42, H-44	C-13/C-42
15/44	3,78, м	79,04/79,05i	H-14/H-43	-/C-45
15-ОМе/44-ОМе	3,33, с	57,1/57,2j	-	C-15/-
16/45	1,58, м	43,6/43,8k	16-Мe/45-Мe	C-15, C-18, C-19/C-47, C-48
1б-Ме/45-Ме	0,84, д, 5,5/0,86, д, 5,5l	9,05/9,40m	H-16/H-45	C-15, C-16, C-17/C-46, C-44, C-45
17/46	3,65, м/3,66, м11	73,8/74,2°	H-18/H-47	-
18/47	1,62, м/1,68, мp	39,0/39,2 кв.	H-17, H-19/H-46, H-48	C-19/C-48
19/48	3,94, м	70,9/70,8 r	H-18/H-47	-
20/49	1,90, м	40,2/40,5	H-21, 20-Мe/H-50, 49-Мe	C-21/C-50
20-Ме/49-Ме	0,92, д, 7,5/0,95, д, 7,5с	9,4/9,5t	H-20/H-49	С-19, С-20, С-21/С-48, С-49, С-50
21/50	5,41, м	76,5/76,0	H-20/H-49	С-19, С-20, С-22, 22-Ме, С-23, С-32/С-1, С-48, С-49, 51-Мe, C-51, С-52
22/51	2,03, м	38,5/38,3	22-Мe/51-Мe	22-Ме, С-23/51-Ме, С-52
22-Ме/51-Ме	0,97, м	10,1/9,9	H-22/H-51	С-22, С-23/С-51, С-52
23/52	3,13, дд, 2,0, 8,0	77,7/77,6 U	-	-
24/53	1,73, м	34,7	24-Мe/53-Мe	-
24-Ме/53-Ме	0,98, д, 7,0/0,99, д, 7,0v	18, 0/18,1w	H-24/H-53	С-24, С-25/С-53, С-54
25/54	1,23, м/1,43, мx	25,30/25,35	H-26/H- 55	С-24, С-26/С-53, С-55
26/55	1,94, м	30,0	H-25, H-27/Н-54, Н-56	С-24, С-29/С-53, С-58
27/56	4,01, м	73,03/73,06 y	Н-26, Н-28/Н-57, Н-55	-
28/57	1,52, м/1,88, м z	36,1	Н-27, Н-29/Н-56, Н-58	С-26, С-27, С-29, С-ЗО/С-55, С-56, С-58, С-59
29/58	3,62, м	74,5	Н-28, Н-ЗО/Н-57, Н-59	-
29-ОМе/58-ОМе	3,36, с	55,6	-	С-29/С-58
30/59	1,11, кв., 12,5/2,03, мaz	40,0	Н-29, Н-31/Н-58, Н-60	С-28, С-29, С-31/С-57, С-58, С-60
31/60	3,76, м	66,0	Н-30/Н-59	-
31-Ме/О-Ме	1,21, д, 6,5	22,1	-	С-29, С-30, С-31/С-58, С-59, С-60
a-az верхний индекс в ячейке означает, что значения химического сдвига могут быть взаимозаменяемыми.

ПРИМЕР 3: БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ

Анализ противоопухолевой активности позволяет обнаруживать выделения или соединения с цитотоксической активностью (клеточной гибелью) или цитостатической активностью (ингибирование роста) в in vitro культурах опухолевых клеток человеческого происхождения.

ЛИНИИ КЛЕТОК

Название	№ В Американской коллекции типовых культур	Виды	Ткани	Характеристики
А549	CCL-185	Человек	Легкое	NSCL рак легкого
НТ29	НТВ-38	Человек	Толстая кишка	Аденокарцинома толстой кишки, аденокарцинома молочной железы
MDA-MB-231	HTB-26	Человек	Молочная железа	Her2/neu+ (плевральный выпот)

ИССЛЕДОВАНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО РОСТА С ПОМОЩЬЮ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Измерение клеточного роста in vitro проводилось с помощью колориметрического анализа с сульфородомином В (SRB) (следуя адаптации, ранее описанного способа Philip Skehan и др. 1990, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112).

В данном типе анализа используется 96-луночные микроплашки культур (Mosmann, 1983, Faircloth, 1988). Большинство использованных линий клеток получено из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и от различных типов человеческих опухолей.

Культуры клеток поддерживались в культурной среде DMEM (с добавлением 10% эмбриональной бычий сыворотки (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин 1% глутамин) при 37°С, 5% СО₂ и 98% влажности.

Для анализов, клетки трипсинизируются и высеваются в 96-луночные микроплашки при различной концентрации в зависимости от линии клеток и инкубируются в течение 24 часов в активной среде без ингредиента с целью их стабилизации. Затем культуры обрабатываются (конечная концентрация изменяется в зависимости от типа анализа) носителем (DMSO:DMEM, 1:1) или активным ингредиентом. После 48 часов экспонирования активному ингредиенту противоопухолевый эффект измеряют посредством указанного ранее SRB способа, который по существу состоит из: фиксации клеток 1% раствором глутарового альдегида (30 минут, комнатная температура), промывки фиксированных клеток фосфатно-буферным солевым раствором (3 промывки, комнатная температура), окрашивания культур 0,4% раствором SRB (30 минут, комнатная температура), промывки красящего агента в 1% уксусной кислоте (3 промывки, комнатная температура), сушки планшетов на воздухе и окончательной экстракции красящего агента Трис-буфером. Количественное измерение анализа проводят с помощью показаний оптической плотности планшетов в спектрофотометрическом планшет-ридере при одной длине волны 490 нм.

Для определения клеточного роста из полученных значений оптической плотности применялся алгоритм (эквивалентный алгоритму, применяемому в программе противоопухолевого скрининга NCI), который позволяет рассчитывать проценты роста по отношению к нулевому времени (начало эксперимента) как в отсутствии, так и в присутствии активного ингредиента в исследовании. Рассчитанные параметры клеточного ответа по отношению к активному ингридиенту являются следующими: GI₅₀=концентрация, вызывающая 50% ингибирования роста, TGI=концентрация, вызывающая полное ингибирование роста (цитостатический эффект) и LC₅₀=концентрация, вызывающая 50% клеточной гибели (цитотоксический эффект).

В Таблице 2 представлены данные биологической активности Соединения А.

Таблица 2 Данные противоопухолевой активности (Молярные)
	Толстая кишка	Молочная железа	NSCL (легкое)
HT29	MDA-MB-231	A549
Соединение А	GI 50	3,38E-7	8,08E-7	2,28E-7
TGI	8,81E-7	2,35E-6	2,28E-7
LC50	2,20E-6	4,77E-6	5,29E-7