аспартильные производные гистамина, способ их получения, фармацевтическая композиция и их применение в качестве модуляторов активности ферментов антиоксидантной защиты

Формула изобретения

1. Аспартильные производные гистамина общей формулы I

где при R=H,

или или

и их фармацевтически приемлемые соли.

2. Соединения по п.1, обладающие способностью модулировать активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы и каталазы.

3. Соединение по п.2, где при R=H,

обладающее способностью ингибировать каталазу, в том числе в интервале концентраций от 10^-12 M до 10 ^-4 М.

4. Соединение по п.1, где при R=H,

обладающее способностью активировать супероксиддисмутазу, в том числе в интервале концентраций от 10^-14 М до 10^-10 М, и каталазу, в том числе в интервале концентраций от 10^-8 М до 10^-4 М.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая способностью модулировать активность супероксиддисмутазы и каталазы, включающая в качестве активного агента эффективное количество соединения общей формулы I

где R представляет водород или ацетильную группу, Х представляет

или или

и их фармацевтически приемлемые соли, и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Применение соединений общей формулы I

где R представляет ацетильную группу, Х представляет

или или

и их фармацевтчески приемлемых солей для модуляции активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы.

7. Применение соединения по п.6, где

для ингибирования активности супероксиддисмутазы, в том

числе в интервале концентраций от 10^-6 М до 10^-7 М и от 10^-13 М до 10^-14 М.

8. Применение соединения по п.6, где

для активации супероксиддисмутазы, в том числе в интервале концентраций от 10^-10 М до 10^-14 М.

9. Применение соединения по п.6, где

для активации каталазы, в том числе в интервале концентраций от 10^-12 М до 10^-4 М.

10. Способ получения N-аспартильных производных гистамина общей формулы (I), заключающийся в том, что активированный пентафторфениловый эфир N -защищенного производного - или -бензилового эфира аспарагиновой кислоты вводят во взаимодействие с гистамином в органическом растворителе, а образующиеся продукты - N-защищенные производные - или - эфиров аспартилгистамина без отделения N-защищенного циклического сукцинимидного производного аспартилгистамина подвергают гидрогенолизу в присутствии катализатора палладия на активированном угле для отщепления защит с последующим отделением целевых продуктов H-Asp(HA)-OH или H-Asp(OH)-HA от

кристаллизацией из органического растворителя.

11. Способ по п.10, где в качестве N -защиты используют бензилоксикарбонильную или ацетильную группы.

12. Способ по п.10, где реакцию образования амидной связи проводят в диметилформамиде, а кристаллизацию линейных продуктов H-Asp(HA)-OH или H-Asp(OH)-HA осуществляют из изопропанола.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и касается новых соединений - N-аспартильных производных биогенного амина гистамина, а также способа синтеза новых и известных соединений, их биомедицинского применения в биологии и медицине в качестве модуляторов активности ферментов антиоксидантной защиты.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что нарушение окислительных и энергетических процессов в организме приводит к возникновению и развитию ряда заболеваний. Степень нарушения этих процессов коррелирует с глубиной патологии, а их нормализация - с развитием восстановительных функций в тканях и улучшением состояния пациентов.

В регуляции функционирования органов и тканей важная роль принадлежит активным формам кислорода, перекисным соединениям и веществам антиокислительного ряда, в частности ферментам антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазе (СОД) и каталазе. Эти ферменты в организме работают как сбалансированная и скоординированная система, в которой функционирование одного фермента соотносится с действием другого [Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p. P.171] При изменении активности и баланса этих ферментов может происходить повышение количества активных форм кислорода и перекисей, что, в свою очередь, может вызывать деструкцию белков, нуклеиновых кислот и липидов и нарушение стабильности клеточных мембран [Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p.; Болдырев A.A. // Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. / М.: Изд-во МГУ. 1998. 320 с.; Guilivi С., Cadenas E. The role of mitochondrial glutatione in DNA base oxidation. //Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1366. №3. P.265-274].

Известно, что умеренно повышенная экспрессия СОД в нормальных нейрональных клетках увеличивает продолжительность жизни мышей, а ингибирование СОД ведет к апоптозу нейронов [Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p. P.751]. В то же время гиперэкспрессия Zn/Cu СОД является одной их причин гибели клеток, повышения ПОЛ, разрушения нейронов мозга [Y.C., Hyeok Y.Kwon, O.B.Kwon, J.H.Kang. Hydrogen peroxide-mediated Cu, Zn-superoxide dismutase fragmentation: protection by carnosine, homocarnosine and anserine. // Biochem. Biophys. Acta. 1999. V.1472. P.651-657; Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p.].

Накопление Н₂O₂ в клетке может наблюдаться при активации СОД и при снижении активности каталазы.

Результатом такого дисбаланса может быть дезорганизация функционирования клетки, ее апоптоз и даже гибель, что недопустимо для здоровой клетки, но является целью противоопухолевой терапии. Так, повышенное содержание СОД в клетке может оказывать на них цитотоксическое действие, обусловленное фрагментацией нуклеиновых кислот под действием ОН^• , образующегося по реакции Фентона при разложении Н₂ O₂, катализируемом Zn,Cu-СОД [Dowja W., Kharatishvili M., Costa M. DNA and RNA strand scission by cooper, zinc and manganese superoxide dismutases. // Biometals. 1996. V.9. P.327-335].

Известно, что ингибиторы СОД могут, повышая количество O ₂ ^-•, вызывать апоптоз опухолевых клеткок [Huang P., Feng L, Oldham E.A. et al. Superoxide dismutase as a target for the selective killing of cancer cells. // Nature. 2000. V.407. №6802. Р.390-395]. В этом случае механизм апоптоза связан также с образованием ОН^• из O₂ ^-• с последующей деструкцией им нуклеиновых кислот.

В связи с вышеуказанным, ферменты СОД и каталаза являются привлекательными мишенями для фармакологического воздействия, а модуляторы их активности, как активаторы, так и ингибиторы, могут найти применение в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний, сопровождающихся повышением уровня активных форм кислорода, например диабета, инфаркта миокарда, ишемии мозга, воспалительных и аутоиммунных заболеваний и др. Кроме того, регуляция активности ферментов антиоксидантной защиты с помощью биосовместимых низкомолекулярных соединений представляет собой новую стратегию в лечении опухолевых заболеваний.

Биосинтез N-аспартильных производных гистамина (II, III, IV) наблюдался в мозге крысы, причем биологические функции этих соединений неясны [Е.Kvamme, K.L.Reichelt, P.D.Edminson. Proceedings of the tenth FEBS meeting. // 1975. P.127]. Соединения II, III, IV были выделены из гомогената мозга. Для аспартильных поизводных гистамина отсутствуют литературные данные по их химическому синтезу, физико-химическим константам и биологической активности.

Известно применение неорганических соединений, главным образом солей, например сульфидов, цианидов, азидов, HOCI и др. [Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford. 963 p.] в качестве ингибиторов СОД и каталазы.

Кроме того, для этой цели используются органические соединения. Так, известен аминотриазол в качестве ингибитора каталазы, применявшийся in vitro и in vivo [Halliwell В. Gutteridge J. // Free radicals in biology and medicine. / 1999. University Press. Oxford, p.138, 381].

Наиболее часто используемым ингибитором СОД является диэтилдитиокарбаминовая кислота (DETCA), действующая при концентрации 10^-3 М [Kanie N., Kamata К. Contractile responses in spontaneously diabetic mice. I. Involvement of superoxide anion in enhanced contractile response of aorta to norepinephrine in C57BL/ KSJ (db/db) mice. // General Pharmacology. 2000. V.35. №6. P311-318]; триэтилентетрамин (ТЕТА) с той же действующей концентрацией [Weissmann N., Winterhalder S., Nollen M. et al. NO and reactive oxygen species are involved in biphasic hypoxic vasoconstriction of isolated rabbit lungs. // American J. Physiology. 2001. V.280. №4. P.638-645].; гидроксильные и гидроксиметильные производные эстрогена [Huang P., Feng L, Oldham E.A. et al. Superoxide dismutase as a target for the selective killing of cancer cells. // Nature. 2000. V.407. №6802. P.390-395]; ЭДТА [Somani B.L, Ambade V., Bulakh. P.M., Sharma Y.V. Elimination of superoxide dismutase interference in fructosamine assay. // Clinical biochemistry. 1999. V.32. №3. Р.185-188]; диэтилкарбамазин [Chen X., Catravas J.D. Release of a leukocyte activation inhibitor by staurosporine-treated pulmonary artery endothelial cells. // Amer. J. Physiology. 1999. V.275. P.184-192].

Основными недостатками известных ингибиторов являются их токсичность, неприродное или неэндогенное происхождение и высокие действующие концентрации, что ограничивает возможности их дальнейшего изучения для биомедицинского применения.

Целью изобретения является способ синтеза новых и известных аспартильных производных гистамина общей формулы I и их применение в качестве эффективных модуляторов активности ферментов антиоксидантной защиты СОД и каталазы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым аспартильным производным гистамина общей формулы I:

где R представляет водород, а Х представляет

и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим способностью модулировать активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы.

Настоящее изобретение относится также к применению соединений общей формулы I:

где R представляет ацетильную группу, а Х представляет

и их фармацевтически приемлемых солей, обладающих способностью модулировать активность ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы.

Далее, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей способностью модулировать активность СОД и каталазы, содержащей эффективное количество соединения общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, а также, если потребуется, фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение относится также к способу получения соединений общей формулы I.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Новые предпочтительные соединения (II, III, IV), известные предпочтительные соединения (V, VI, VII) общей формулы I представлены в табл.1.

Таблица 1

№ соед.	X, название соединения	R
II		H
	-аспартилгистамин
III		H
	-аспартилгистамин
IV		H
	аминосукцинимидогистамин
V		СН3 -СО-
	N-ацетил- -аспартилгистамин
VI		СН3 -СО-
	N-ацетил- -аспартилгистамин
VII		СН3 -СО-
	N-ацетиламиносукцинимидогистамин

Синтез новых (II, III, IV) и известных (V, VI, VII) соединений общей формулы I может быть осуществлен с использованием методов пептидной химии в растворе [Гершкович А.А., Киберев В.К. // Химический синтез пептидов / Киев. Наукова думка. 1992. 360 с.]. Известно, что при синтезе пептидов, включающих аминокислотную последовательность Asp-His, может протекать реакция образования циклического сукцинимидного производного при действии кислот и оснований [Ondetti М.А., Deer A., Sheehan J.T., Pluscec J., Косу О. Side reaction in the synthesis of peptides containing the aspartylglycyi sequence. // J. Biochemistry. 1968. V.7. №11. P.4069-4075]. С целью исключения таких воздействий в ходе синтеза новых соединений общей формулы I, представляющих собой производные декарбоксилированного дипептида AspHis, для защиты NH2- и а- или Р-СООН групп аспарагиновой кислоты используют соответственно бензилоксикарбонильную (Z-) и бензильную (Bzl-) защитные группы, удаляемые гидрогенолизом. Амидную связь создают методом активированных пентафторфениловых эфиров как наиболее активных из известных. Реакцию активации свободной - или -карбоксильной группы защищенной аспарагиновой кислоты проводят в этилацетате действием N,N'-дициклогексилкарбодиимида в присутствии пентафторфенола при охлаждении. Пентафторфениловые эфиры соответствующих - или -защищенных производных аспарагиновой кислоты вводят в реакцию пептидообразования с эквивалентным количеством гистамина в безводном диметилформамиде. Гистамин получают из дигидрохлорида гистамина действием метилата натрия в метаноле. Судя по анализу реакционной смеси методом ТСХ и масс-спектрометрией, реакция протекает с высоким выходом, но с образованием на этой стадии двух соединений: целевого линейного продукта реакции (Z-II(OBzl) или Z-III-OBzl) и ˜30% побочного продукта, представляющего собой циклическое сукцинимидное производное Z-IV (m/z 450.8 и 342.7, соответственно).

Для исключения каких-либо воздействий на защищенные производные, смесь Z-II(OBzl) или Z-III-OBzl и Z-IV без разделения подвергают далее каталитическому гидрогенолизу. Отделение целевых продуктов II или III от примеси циклического производного IV проводят на конечной стадии, используя плохую растворимость синтезированных линейных соединений II или III в изопропаноле, в отличие от хорошо растворимого циклического производного IV. В результате использования такой схемы (схема 1) выходы -AspHA и -AspHA, считая на исходные Z-Asp(OBzl)-ОН или Z-Asp-(ОН)-OBzl, составляют около 40%. Данный выход является достаточно высоким, учитывая необычно легкую циклизацию Z-II(OBzl) или Z-III-OBzl в Z-IV, которая имеет место даже при хранении и в ходе очистки колоночной хроматографией.

Для синтеза известных ацетильных производных аспартилгистамина в качестве исходных соединений нами использовались - или -бензиловые эфиры аспарагиновой кислоты (схема 2). N -ацетилирование осуществлялось действием уксусного ангидрида на суспензию соответствующих аминосвободных бензиловых эфиров аспарагиновой кислоты в воде при соотношении АС₂ O: H₂O (4:1). Реакции активации карбоксильной группы и создания пептидной связи проводят в условиях, описанных выше для Z-защищенных производных (Z-Asp(OBzl)-ОН или Z-Asp-(ОН)-OBzl). При синтезе N -Ас-производных Asp-HA также наблюдается образование циклического производного VII. Анализ масс-и ПМР спектров подтвердил отсутствие бензильной защиты у соединения VII и присутствие в его ИК-Фурье спектре сильной полосы поглощения при 1700 см ^-1 и слабой - при 1779 см^-1, соответствующих валентным колебаниям карбонильных групп в составе сукцинимидных производных [Ondetti М.А., Deer A., Sheehan J.T., Pluscec J., Косу О. Side reaction in the synthesis of peptides containing the aspartylglycyi sequence. // J. Biochemistry. 1968. V.7. №11. P.4069-4075].

Вследствие повышенной склонности к циклизации N-Ac-Asp(OBzl)НА - и -строения, протекающей как при непродолжительном хранении, так и в ходе гидрирования на палладиевом катализаторе, гидрированию подвергают смеси - или -бензилзащищенных пептидов V(OBzl) или VI-OBzl с циклическим производным VII без выделения. Отделение дебензилированных линейных пептидов V или VI от циклического производного VII проводят путем переосаждения из органических растворителей, предпочтительно из смеси метанола с ацетоном. Использование данной схемы синтеза позволяет получить соединения V или VI с выходом около 50%, считая на исходные - или -бензиловые эфиры аспарагиновой кислоты.

Целенаправленный синтез циклических соединений IV и VII может быть осуществлен путем обработки реакционных смесей, получаемых после образования пептидной связи в соединениях Z-II(OBzl) или V(OBzl) триэтиламином (рН 8), с последующей сушкой в вакууме, с выходом от 37 до 41%. Циклическое строение получаемых таким образом веществ было подтверждено ИК-Фурье и ¹H-ЯМР спектроскопией, а также масс-спектрометрией.

Таким образом, предложен способ синтеза семейства новых (II, III, IV) и известных (V, VI, VII) аспартильных производных гистамина исходя из Z-Asp(OBzl)ОН или Z-Asp(ОН)-OBzl и Ac-Asp(OBzl)ОН или Ac-Asp(ОН)OBzl.

Соединения общей формулы I также могут быть получены в виде фармацевтических приемлемых солей с нетоксичными кислотами, такими как фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, винная кислота и подобные, и основаниями, такими как гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат натрия и подобные.

Соединения общей формулы I обладают способностью модулировать активность ферментов СОД и каталазы и могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с нарушением окислительных процессов и изменением уровня активных форм кислорода.

Фармацевтические композиции содержат соединение по настоящему изобретению в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соединения настоящего изобретения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.

В качестве наполнителей могут быть использованы различные вещества, такие как сахариды, например глюкоза, лактоза или сахароза, манит или сорбит, производные целлюлозы и/или фосфаты кальция, например трикальцийфосфат или кислый фосфат кальция, в качестве связующего компонента могут быть использованы такие, как крахмальная паста, например кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал, желатин, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон. При необходимости могут быть использованы разрыхляющие агенты, такие как вышеупомянутые крахмалы и карбоксиметилкрахмал, поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Ядро драже обычно покрывают слоем, который устойчив к действию желудочного сока. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаридов, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, и подходящие органические растворители или их смеси.

В качестве добавок могут быть также использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.

В качестве мазевой основы могут быть использованы углеводородные мазевые основы, такие как вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции твердый парафин и воск; абсорбтивные мазевые основы - гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens); мазевые основы, смываемые водой - гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum); водорастворимые мазевые основы полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyethyleni). бентонитовые основы и другие.

В качестве основы для гелей могут быть использованы метил целлюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, тилоза.

В качестве основы для суппозитория могут быть использованы основы, не растворимые в воде - масло какао; основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой - желатино-глицериновые или полиэтиленоксидные; комбинированные основы - мыльно-глицериновые.

При приготовлении стандартной лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьироваться в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.

Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций, содержание активного агента в них составляет 0,01-100 мг, предпочтительно 1-10 мг. В качестве разбавителей могут быть использованы 0,9%-ный раствор хлорида натрия, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы. При введении в организм соединений настоящего изобретения в виде таблеток и суппозиториев, их количество составляет 1,0-100 мг на стандартную лекарственную форму.

Лекарственные формы настоящего изобретения получают по стандартным методикам, таким как, например, процессы смешивания, гранулирования, формирование драже, растворение и лиофилизация.

Следует отметить, что соединения настоящего изобретения проявляют модулирующую активность в концентрациях на порядки ниже по сравнению с известными препаратами. При исследовании токсичности при введении животным исследуемых соединений в дозе 1000 мг/кг перорально не наблюдалось гибели экспериментальных животных.

Детальное описание соединений настоящего изобретения, их получения и исследования фармакологической активности представлено в нижеследующих примерах, предназначенных для иллюстрации предпочтительных вариантов изобретения, и не ограничивающих его объем.

ПРИМЕРЫ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В качестве исходных соединений в синтезе использовали: Z-L-Asp(OBzl), Z-L-Asp-OBzl, L-Asp(OBzl)-ОН, L-Asp(ОН)-OBzl производства фирмы "Bachem" (Швейцария).

Индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинках на пластинках Kieselgel 60 F₂₅₄ (фирмы "Merck", Германия) в системах: хлороформ-метанол 9:1 (1), изопропанол-вода-аммиак 6:1:3 (2).

Электрофорез на бумаге (бумага для электрофореза Кондопожского ЦБК, 120×320 мм) проводят в буфере с рН 5.1 состава пиридин-метанол-вода 12:10:1000 в камере (150×320×150 мм) с градиентом 15 В/см в течение 2 часов.

Хроматограммы проявляли хлортолидиновым реактивом, реактивом Паули, нингидрином и по свечению в УФ-свете.

Углы оптического вращения измеряли на поляриметре "Perkin Elmer 341" (США).

¹Н-ЯМР регистрировали на приборе "АМХ-400 Bruker" (Германия).

ИК-Фурье спектры снимали в таблетках КВг на приборе "Мадпа 750" ("Nicolet" США).

Температуру плавления определяли на приборе "Boetius" (Германия).

Масс-спектры высокого разрешения получали на времяпролетном масс-спектрометре методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации, в качестве матрицы 2,5-дигидрооксибензойная кислота, на приборе и REFLEX III ("Bruker", Германия).

Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на приборах:

- хроматограф "Breeze", детектор "Waters" (США), детекция при 214 нм, скорость элюирования 1 мл/мин, в условиях (1): колонка Symmetry 300 C₁₈, 3,9×150 мм, 5 m, элюция 0,1%-ной водной TFA с градиентом ацетонитрила от 0 до 60% за 18 мин.

ПРИМЕР 1

-Аспартилгистамин (II)

К раствору 2.0 г (5.6 ммоль) Z-Asp(OBzl)-ОН в 20 мл этилацетата при интенсивном перемешивании добавляли 1.10 г (5.9 ммоль) пентафторфенола, раствор охлаждали до 0° и прибавляли 1.22 г (5.9 ммоль) DCC. Перемешивали 2 часа при 0° и оставляли на 12 часов при +4°. Осадок DCU отфильтровывали.

Растворитель удаляли в вакууме. Маслообразный остаток растирали с гексаном. Образовавшийся белый твердый осадок отфильтровывали, промывали гексаном и сушили в вакууме над CaCl ₂. Получали 2.87 г (98%) Z-Asp(OBzl)-OPfp. R_f 0.59 (1). Т_пл 94-96°. Лит.[Гросс Э., Майенхофер И. // Пептиды. Основные методы образования пептидной связи. М.: Мир. 1983 г. с.422.] 95.5-96°.

Раствор 0.25 г (10.96 ммоль) металлического натрия в 4 мл безводного метанола при охлаждении прибавляли к раствору 1.0 г (5.48 ммоль) НА·2НСl в 11.5 мл безводного метанола и перемешивали 20 мин при 0° и 20 мин при +22°. Выпавший NaCl отфильтровывали, промывали метанолом. Растворитель из фильтрата удаляли в вакууме. Маслообразный остаток растворяли в 16 мл DMF. К полученному раствору при интенсивном перемешивании прибавляли 2.87 г (5.48 ммоль) Z-Asp (OBzl)-OPfp. Перемешивали 2 ч при +20° и оставляли на 12 ч при +4°. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растирали с безводным эфиром. Выдерживали под эфиром при +4° в течение 12 ч. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и сушили в вакууме над CaCl ₂. Получали 1.13 г (46%) смеси веществ с R_{f 1} 0.36 (1) Z-Asp (OBzl)-НА (Z-II(OBzl)); R_{f 2} 0.2 (1) N -бензилоксикарбонилиминосукцинимидогистамин (Z-IV). Масс-спектр, m/z: [М+1]⁺ 451.2 Z-II(OBzl); [M+1] ⁺ 343.1 (Z-IV). К раствору 1.13 г смеси продуктов в 12 мл метанола при интенсивном перемешивании прибавляли 0.80 г 10%-ного палладия на угле и гидрировали в токе водорода в течение 1.5 ч. Катализатор отфильтровывали. Растворитель из фильтрата удаляли в вакууме. Полученное белое кристаллическое вещество растирали с изопропанолом, отфильтровывали и сушили в вакууме над CaCl ₂. Получали 0.22 г (90%). Выход 40% при расчете на исходную Z-Asp(OBzl)-ОН. R_f 0.71 (2). Е_HA ^- 0.37. Т_пл 207-209°. Масс-спектр, m/z: [М+1] ⁺ 227.0. - 7,47 (С 0.35; МеОН-Н₂O (1:1)). ¹ H-ЯМР, D₂O . м.д.: 2.20-2.35 (м, 2Н, -СН₂-НА), 2.5 (т, J 6 Гц, 2Н, -СН₂-Asp), 3.0-3.15; 3.2-3.35 (м, 2Н, -СН₂-НА), 3.65 (т, J 6 Гц, Н, -CH-Asp), 6.7 (с, 1Н, 4-CH-lm), 7.6 (с, 1Н, 2-CH-lm). ИК-Фурье, , см^-1: 1669 (амид I); 1570 (амид II); 1081 (амид III). ВЭЖХ в условиях (1): индивидуальный пик, время удерживания 1.68 мин. Найдено, %: С 47.50; Н 6.20; N 24.32. С₉ Н₁₄N₄O₃. Вычислено, %: С 47.78; Н 6.24; N 24.76. ВЭЖХ в условиях 8: индивидуальный пик, время удерживания 2.00 мин.

ПРИМЕР 2

-Аспартилгистамин (III)

К раствору 1.5 г (4.2 ммоль) Z-Asp (ОН) -OBzl в 8.5 мл этилацетата при интенсивном перемешивании добавляли 0.83 г (4.5 ммоль) пентафторфенола, затем раствор охлаждали до 0° и прибавляли 0.927 г (4.5 ммоль) DCC. Перемешивали 3 часа при 0° и оставляли на 48 часов при +4°. Осадок DCU отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме. Маслообразный остаток растирали с гексаном. Образовавшийся белый твердый осадок отфильтровывали и сушили в вакууме над CaCl₂. Получали 2.12 г (96.5%) Z-Asp-(OPfp)-OBzl. R_f 0.93 (1). Раствор 0.176 г (7.64 ммоль) Na в 3 мл безводного метанола при охлаждении прибавляли к раствору 0.704 г (3.82 ммоль) НА·2НСl в безводном метаноле и перемешивали 20 мин при 0° и 20 мин при +25°. Выпавший NaCl отфильтровывали, промывали метанолом. Растворитель из фильтрата удаляли в вакууме. Маслообразный остаток растворяли в 20 мл DMF. К полученному раствору при интенсивном перемешивании прибавляли 2.0 г (3.82 ммоль) Z-Asp(OBzl)-OPfp. Перемешивали 2 ч при 20° и оставляли на 20 ч при 4°. Растворитель удаляли в вакууме, остаток затирали с сухим эфиром. Выдерживали при +4° в течение 3 дней. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и сушили в вакууме над CaCl₂ и P₂O ₅. Получили белое кристаллическое вещество. Выход 0.86 г (50%). R_{f 1} 0.54 (11) Z-Asp(HA)-OBzl (Z-III-OBzl); R_{f 2} 0.2 (11) (Z-IV). Масс-спектр, m/z: [М+1]⁺ 451.2 (Z-III-OBzl); [M+1]⁺ 343.1 (Z-IV). К раствору 0.86 г смеси продуктов в 11 мл метанола при интенсивном перемешивании прибавляли 0.40 г 10%-ного палладия на угле гидрировали в токе водорода в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывали. Растворитель из фильтрата удаляли в вакууме. Образовавшееся белое кристаллическое вещество растирали с изопропанолом, отфильтровывали и сушили в вакууме над CaCl₂. Выход 0.20 г (90%). Общий выход синтеза 41%. R_f 0.67 (2). E_HA ^- 0.34. Т_пл 196-198°. Масс-спектр, m/z: [M+H]⁺ 227.1. , - 10,52 (С 0.29; МеОН-Н₂О (1:1)). ¹H-ЯМР, , м.д., D₂O: 2.20-2.35 (м, 4Н, -CH₂-Asp, -CH₂-HA), 3.12 (т, J 5 Гц, 2Н, -СН₂-НА), 3.61 (дд, J 4 Гц, J 6 Гц, 1Н, -CH-Asp), 6.65 (с, Н, 4-CH-lm), 7.45 (с, Н, 2-CH-lm). ИК-Фурье, , см^-1: 1641 (амид I); 1528 (амид II); 1087 (амид III). ВЭЖХ в условиях (I): индивидуальный пик, время удерживания 1.90 мин. Найдено, %: С 47.78; Н 6.35; N 24.83. C₉ H₁₄N₄O₃. Вычислено, %: С 47.78; Н 6.24; N 24.76.

ПРИМЕР 3

N-Аминосукцинимидогистамин (IV)

К раствору 0.40 г смеси Z-III-OBzl (R_f 0.54 (1)) и Z-IV (R_f 0.2 (1)) (см. методику синтеза -аспартилгистамина) в 5 мл хлороформ-метанол 8:2 добавляли триэтиламин до рН 8, растворитель удаляли в вакууме и сушили в вакууме над безводным CaCl₂ в течение 2 часов. Получали циклический Z-IV с Rf 0.76 (2). E_HA ^- 0.60. ИК-Фурье, , см^-1: 1700, 1779 (вал. С=O в циклическом имиде); 1250 (амид III). К раствору 0.20 г (0.56 ммоль) циклического Z-Asp-(НА) в 7 мл безводного метанола, добавляли 0.14 г 10%-ного палладия на угле при интенсивном перемешивании гидрировали в токе водорода в течение 1.5 ч. Катализатор отфильтровывали. Растворитель из фильтрата удаляли в вакууме. Образовавшийся маслообразный остаток растирали с эфиром. Твердый белый осадок отфильтровывали и сушили в вакууме над CaCl₂. Получали 0.056 г (41%). R_f 0.76 (2). Т_пл 150-152° - 42.72 (С 0.32; МеОН-Н₂O (1:1)). ¹H-ЯМР, CD₃OD, , м.д.: 1.26 (дд, J=5 Гц, Н, -CH₂-Asp), 1.85 (т, J=5 Гц, 2Н, -СН₂-НА), 2.0 (дд, J=10 Гц, J=20 Гц, Н, -СН₂-НА), 3.0 (т, J=5 Гц, Н, -CH-Asp), 7.21 (с, Н, CH-4-Jm), 8.14 (с, Н, CH-2-Jm). ИК-Фурье, , см^-1: ИК-Фурье, , см^-1: 3449, 3338 (вал. NH₂); 1781, 1701 (вал. С=O в циклическом имиде); 1250 (амид III);. Найдено, %: С 51.05; Н 5.67; N 26.00. C₉H₁₂N ₄O₂. Вычислено. %: С 51,92; Н 5.81; N 26,91.

ПРИМЕР 4

N-Ацетил- -аспартилгистамин (V)

К суспензии 2.4 г (10.75 ммоль) L-Asp (OBzl) -ОН в 3 мл воды при интенсивном перемешивании и нагревании до 40° прибавляли 10 мл уксусного ангидрида. Через 30 мин к реакционной массе добавляли 5 мл воды, растворитель удаляли в вакууме, маслообразный остаток сушили в вакууме над NaOH, перекристаллизовали из смеси 5 мл этанола и 0.5 мл воды, сушили над CaCl₂. Выход 2.24 г (80%). Далее синтез проводили исходя из 1.0 г (3.77 ммоль) Ac-L-Asp(OBzl)-ОН в соответствии с методикой, приведенной для соединения II. Выход 0.54 г (54%) при расчете на L-Asp(OBzl)-ОН. R_f 0.65 (2). E _HA ^- 0.08. Т_пл 112-114° (С 1; Н₂O). ¹H-ЯМР (CD₃ OD) : 1.75 (с, 3Н, Ас), 2.40 (д, J 8 Гц, 2Н, -СН₂-Asp), 2.6 (т, J 8 Гц, 2Н, -СН₂-НА), 3.10-3.20 (м, 2Н, -СН₂-НА), 4.31 (т, J 8 Гц, 1Н, -CH-Asp), 6.9 (с, 1Н, 4-CH-lm), 8,05 (с, 1Н, 2-CH-lm). ИК-Фурье, , см^-1 (в пленке): 3319 (вал. NH); 1662 (амид I); 1570 (амид II). Найдено, %: С 49.29; Н 6.32; N 23.80. C ₁₁H₁₆N₄O₄. Вычислено, %: С 49.25; Н 6.01; N 23.86. ВЭЖХ в условиях (1): время удерживания 3.35 мин.

ПРИМЕР 5

N-Ацетил- -аспартилгистамин (VI)

Ацетилирование проводили в соответствии с методикой, приведенной для соединения VII, далее синтез осуществляли исходя из 0.24 г (0.9 ммоль) Ac-L-Asp(ОН)-OBzl по методике для соединения III. Выход 0.12 г (54%) при расчете на L-Asp(OBzl)-OH. R_f 0.65 (2). E_HA ^- 0.10. Гигроскопичное, (С 0.27; МеОН-Н₂O (1:1)). Масс-спектр, m/z: [M+H]⁺ 269.0. ¹H-ЯМР (CD₃ OD) : 1.90 (с, 3Н, Ac), 2.45-2.70 (м, 2Н, -CH₂-Asp), 2.85 (т, J 6 Гц, 2Н, -CH₂-HA), 3.36-3.48 (м, 2Н, -СН₂-НА), 4.38-4.42 (м, 1Н, -CH-Asp), 7.20 (с, 1Н, 4-CH-lm), 8,50 (с, 1Н, 2-CH-lm). ИК-Фурье, /см^-1: 3271 (вал. NH), 1654 (амид I), 1551 (амид II). Найдено, %: С 46.48; Н 6.37; N 19.64. C₁₁H ₁₆N₄O₄-H₂O. Вычислено, %: С 46.15; Н 6.34; N 19.57. ВЭЖХ в условиях (I): время удерживания 4.00 мин.

ПРИМЕР 6

N-Ацетиламиносукцинимидогистамин (VIII)

Синтез проводили исходя из 1.0 г (3.77 ммоль) Ac-L-Asp(OBzl)-ОН в соответствии с методикой, приведенной для соединения IV. Выход 0.32 г (37%) при расчете на L-Asp (OBzl)-ОН. R_f 0.80 (2). E_HA ^- 0.40. Т_пл 226-228°. (С 0.41; МеОН-Н₂O (1:1)). Масс-спектр, m/z: [М+Н]⁺ 251.0. ¹H-ЯМР (CD₃ OD+DMSO-d₆) : 2.20 (с, 3Н, Ас), 2.80-2.95 (м, 1Н, -CH₂-Asp), 3.08 (т, J 9 Гц, 2Н, -CH₂-HA), 3.25 (дд, J 10 Гц, J 22.5 Гц, 1Н, -CH₂-Asp), 3.95 (т, J 9 Гц, 2Н, -CH₂-HA), 4.65-4.75 (м, 1Н, -CH₂-Asp) 7.15 (с, 1Н, 4-CH-lm), 7.90 (с, 1Н, 2-CH-lm). ИК-Фурье, /см^-1: 3266 (вал. NH); 1779, 1700 (вал. С=O в циклическом имиде); 1659 (С=O ацетил); 1584 (деф. NH). Найдено, %: С 52.67; Н 5.45; N 22.40. С₁₁Н₁₄O ₃. Вычислено, %: С 52.79; Н 5.64; N 22.39. ВЭЖХ в условиях (I): время удерживания 4.30 мин.

ТЕСТЫ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

Установлено модулирующее влияние полученных по заявленному способу соединений производных аспартилгистамина, соответствующих общей формуле I, на активность ферментов антиоксидантной защиты, которое было изучено по известным методикам (фиг.1, 2, табл.2, 3).

ПРИМЕР 7

Влияние соединений общей формулы 1 на активность Zn/Cu СОД

Для оценки влияния на активность Cu/Zn-СОД соединений in vitro использован коммерческий препарат фермента ("Sigma", США) - Cu/Zn-SOD (из бычьих эритроцитов). Активность СОД оценивалась спектрофотометрически при 550 нм по ингибированию восстановления окисленного цитохрома с в ходе генерации супероксидного анион-радикала в системе ксантиноксидаза - ксантин (50 мМ КН₂PO₄ буфер, рН 7.8, 10 мМ ЭДТА, 0.01 мМ Fe³⁺-цит.с, 0.05 мМ ксантин). Количество вносимой в систему ксантиоксидазы должно вызывать скорость восстановления цитохрома с 0.025 оп.ед./мин. За единицу активности СОД принимается активность количества фермента, содержание которого вызывает уменьшение на 50% скорости восстановления цитохрома с при данных условиях. Влияние модификатора оценивалось после предварительной инкубации в течение 15 мин при 25° [McCord J.M., Fridovich I. Superoxide Dismutase. // J.Biol.Chem. 1969. V.244. P.6049-6053].

ПРИМЕРЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ.

ПРИМЕР 8

А. Таблетированная форма

Таблетированную форму получают, используя приведенные ниже ингредиенты:

Соединение, соответствующее общей формуле (I)	0.5-500 мг
Крахмал картофельный	20-50 мг
Магния стеарат	3 мг
Аэросил	1 мг
Лактоза	до 300 мг

Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток весом 300 мг каждая.

Б. Суппозитории

Пример состава суппозитория:

Соединение, соответствующее общей формуле (I)	0.5-500 мг
Масло какао	количество, необходимое для получения
	суппозитория.

При необходимости возможно изготовление ректальных, вагинальных и уретральных суппозиториев с соответствующими наполнителями.

В. Мази

Пример состава мази:

Соединение, соответствующее общей формуле (I)	0,05-0,5 г
Вазелин	10 г

Мази изготавливают по общеизвестной технологии.

Г. Гели

Пример состава геля:

Соединение, соответствующее общей формуле (I)	5-500 мг
тилоза	200 мг
бензиловый спирт	0.3 мг
этиловый спирт	300 мг
вода	до 10 г

РЕЗУЛЬТАТЫ

Введение в инкубационную среду, содержащую Cu, Zn-СОД, эффектора соединения V, соответствующего общей формуле I, вызывает высокодостоверное ингибирование активности фермента (50÷90%) в интервале концентраций эффектора 10^-5-10^-7 М и 10^-13 -10^-14 М. Родственное соединение VI с другим типом амидной связи, наоборот, значительно повышает активность Cu, Zn-СОД - на 50÷70%, в интервале концентраций эффектора 10 ^-10-10^-14 М.

Циклическое сукцинимидное производное VII слабо влияет на активность Cu, Zn-СОД, но значительно активирует каталазу (на 60%) в широком интервале концентраций 10^-12-10^-4 M эффектора.

Дезацетилированные соединения, соответствующие общей формуле 1 (R=H), в существенно меньшей степени влияют на активность Cu, Zn СОД и каталазы - эффекты не превышают 30%. Для этих соединений также наблюдается разнонаправленный эффект в отношении каталазы: соединение II слабо ингибирует каталазу в широком интервале концентраций (10 ^-4-10^-12 М), а соединение III - активирует ее, а также СОД при концентрации эффектора 10^-8-10 ⁴ М.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Новые и известные соединения, соответствующие общей формуле I, обладают модулирующим действием на ферменты антиоксидантной защиты - Cu, Zn СОД и каталазу, причем достигается высокий процент их ингибирования (или активации), в том числе при весьма низких концентрациях и/или в широком диапазоне концентраций эффектора.

Данные свойства предлагаемого ряда новых и известных соединений, соответствующих общей формуле I, могут иметь широкое применение, в том числе в онкологии (противоопухолевое действие), иммунологии (модуляция иммунных реакций, радиопротекторное действие), в кардиологии (противоишемическое и противогипоксическое действие), в офтальмологии (лечение катаракт), для коррекции последствий диабета, нарушений деятельности ЦНС, а также в качестве антигипоксантов в том числе при использовании гипербарической оксигенации, ранозаживляющих средств; в косметологии - в качестве добавок, предотвращающих деструкцию и старение клеток кожи.

Таким образом, предложены эффективные модуляторы активности ферментов антиоксидантной защиты - Cu, Zn СОД и каталазы, соответствующие общей формуле I, включающие новые и известные производные аспартилгистамина, в том числе в виде фармацевтически приемлемых солей, а также простой способ их получения.

Таблица 2 Влияние соединения VI на активность СОД in vitro (базовая активность СОД 7.8±0.14 Ед/мг)
Концентрация препарата (М)	Активность СОД, Ед/мг белка
1	2
10 -4	6.8±0.10
10-5	5.8±0.16
10-6	7.8±0.12
10 -7	7.8±0.14
10-8	8.8±0.10
10-9	7.8±0.11
10 -10	13.6±0.12
10-11	11.7±0.12
10-12	11.7±0.10
10 -13	11.7±0.10
10-14	11.7±0.10
10-15	8.8±0.12
10 -16	10.7±0.10
10-17	12.8±0.12

Таблица 3 Влияние соединения VII на активность каталазы in vitro (базовая активность каталазы 262±11 Ед/мг)
Концентрация препарата (М)	Активность каталазы, Ед/мг белка
10-3	304±11
10-4	399±11
10-5	420±14
10-6	451±13
10-7	441±12
10-8	430±10
10-9	430±11
10-10	315±10
10-11	462±11
10-12	283±12
10-13	304±11
10-14	252±14
10-15	220±10
10-16	367±11
10-17	304±10

Схема 1

Синтез соединений II, III, IV

Схема 2

Синтез соединений V, VI, VII