средство "лизолакт", потенцирующее противоопухолевую активность цитотоксических препаратов

Формула изобретения

1. Средство, потенцирующее противоопухолевую активность цитотоксических препаратов, характеризующееся тем, что оно содержит в одной дозе лизоцим или лизоцим хлорид или лизоцим гидрохлорид в количестве 0,5-2,0 г и лактулозу в количестве 2,5-10,0 г.

2. Средство по п.1, характеризующееся тем, что лактулоза применяется в виде лактусана 35-40%-ного сиропа, который добавляют к суточной дозе в количестве 7,1-28,6 мл на одну дозу.

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что лактулоза применяется в виде лактусана-концентрата 70% сухого или жидкого, который добавляют к суточной дозе лизоцима в количестве 3,6-14,2 г или 3,6-14,2 мл соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и пищевой промышленности может быть использовано в онкологии в качестве биологически активной добавки к лечебному питанию в комплексном лечении лейкозов и сóлидных (других) опухолей.

Известно применение цитотоксических препаратов в лечении пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями. К цитотоксическим препаратам, наиболее широко применяемым в схемах противоопухолевой полихимиотерапии (ПХТ), относится циклофосфамид (ЦФ) - активирующееся микросомальными оксидазами пролекарство, метаболиты которого обладают алкилирующим действием. Для усиления противоопухолевой активности и избирательности действия цитотоксические препараты часто применяют в сочетании с различными модуляторами, которые обычно не обладают самостоятельной противоопухолевой активностью или она слабо выражена. Вместе с тем, модуляторы способны повысить эффективность лечения за счет усиления противоопухолевой активности и избирательности действия цитотоксических препаратов. По своему действию модуляторы могут быть специфичны, т.е. нацеленно изменять активность определенных цитотоксических препаратов (например, фолаты в качестве модуляторов антифолиевых антиметаболитов и фторпиримидинов), или неспецифично влиять на активность различных цитотоксических средств (например, иммуномодуляторы). Среди последних особое место принадлежит лизоциму.

- Лизоцим белка куриного яйца (фермент ЕС 3.2.1.17, N-ацетил-мурамид-гликаногидролаза, =мурамидаза) широко применяется в медицинской практике в виде высокоочищенного инъекционного препарата, в составе лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД), а также для обогащения продуктов питания в виде лизоцима, лизоцима хлорида, лизоцима гидрохлорида [Баранов А.А., Дорофейчук В.Г. Лизоцим: теория и практика, - М. - Нижний Новгород, 1999, 126 с.; Щербакова Э.Г. Бифилиз: механизмы действия и клиническое применение // Российские медицинские вести, 2000, T.V, №2, с.43-53; Щербакова Э.Г. и др. Применение лизоцима и лизоцимсодержащих биосистем в пищевой промышленности: Метод, реком., М., 2003, 43 с.; Speijers G.J.A., van Apeldoorn M.E. Lysozyme. // Toxicological evaluation of certain food additives and naturally occuring toxicants.: WHO FAO Additives, 1993. - Ser.30. - p.25-31].

- Лизоцим является полифункциональным фактором неспецифической защиты живых организмов и обладает уникальным сочетанием ферментных, антибактериальных, иммунокорригирующих, противовоспалительных, антиоксидантных, антианемических, бифидогенных и многих других ценнейших для клиники свойств. Эндогенный лизоцим рассматривают как дополнительный фактор противоопухолевого иммунитета [Sava,G., et al. Lysozyme and cancer: Role of exogenous lysozyme as anticancer agent (Review). // Anticancer Res., 1989, V.9, p.583-592 и др.], его истощению отводят важную роль в патогенезе многих, в т.ч. онкологических заболеваний [Баранов А.А., Дорофейчук В.Г. Лизоцим: теория и практика. - М. - Нижний Новгород, 1999, 126 с.].

Описано противоопухолевое действие гомологичного и гетерологичного лизоцима при сóлидных и метастазирующих опухолях, тесно связанное с его иммуномодулирующими свойствами, индукцией эндогенных клеточных медиаторов, таких как интерферон, интерлейкины, фактор некроза опухоли и др. [Sava, G et al. Lysozyme stimulates lymphocyte response to ConA and IL-2 and potentiates 5-fluorouracil action on advanced carcinomas. // Anticancer Res., 1995, V.15 (5B), p.1883-1888]. Лизоцим при пероральном применении в суточной дозе 2 г (курсовая доза около 40 г) усиливал противоопухолевый иммунный ответ и способствовал подавлению химиопрепаратами роста карциномы легкого, уменьшению болевого синдрома у онкологических больных, обеспечивал улучшение состояния больных при опоясывающем лишае, осложняющем течение онкологической патологии [Sava, G.et al., // Anticancer Res, 1989, V.9, p.583-592].

- В обычных терапевтических дозах (100-150 мг в сутки внутримышечно) лизоцим применяют для повышения противоинфекционной сопротивляемости больных в онкологической практике [Голосова Т.В. и др. Инфекция и естественный иммунитет при лейкозах. - М.: Медицина, 1980, 160 с.; Щербакова Э.Г. Лизоцим - новые аспекты клинического применения. // Новые лекарственные препараты, 1998. Выпуск 9, с.8-18 и др.]. Биопрепарат бифилиз, содержащий лизоцим и бифидобактерии, способствует улучшению переносимости ПХТ, стабилизации кишечного микробиоценоза, коррекции эластазоподобной, антипротеиназной и лизоцимной активности плазмы крови, снижению частоты и тяжести течения септических осложнений у больных лейкозами [Щербакова Э.Г. Бифилиз: механизмы действия и клиническое применение // Российские медицинские вести, 2000, T.V, №2, с.43-53].

Другим средством, нашедшим широкое применение в медицине, лечебном и диетическом питании, является лактулоза, которая выпускается в виде лекарственных препаратов (нормазе, дюфалак), биологически активной добавки «Лактусан» (сироп 35-40%, концентрат жидкий 70%, концентрат сухой 70%), в составе продуктов питания [Российская лактулоза - XXI век. // М., МИИТ, 2000, 108 с.].

- Лактулоза представляет собой синтезированный из лактозы дисахарид, который при пероральном применении практически не всасывается и не разлагается в желудке и тонком кишечнике из-за отсутствия соответствующих ферментов в организме человека и животных, в неизмененном виде попадает в толстую кишку, где расщепляется сахаролитическими ферментами бифидо- и лактобактерий и служит для них источником энергии. Лактулоза стимулирует рост этих представителей анаэробной нормофлоры, и образующиеся при этом непредельные жирные кислоты (в основном уксусная и молочная кислота) активизируют моторику кишечника, создают условия для элиминации и эвакуации условнопатогенных и энтеропатогенных микроорганизмов, токсических микробных и др. метаболитов, в первую очередь аммиака, что приводит к улучшению морфофункционального состояния печени и других органов. Показана эффективность лактулозы в лечении и профилактике синдромов эндогенного перепроизводства аммиака, главным образом хронической печеночной энцефалопатии, синдрома «избыточного роста микрофлоры толстого кишечника», гнилостной диспепсии у детей раннего возраста, упорных запоров. Лактулоза обеспечивает бифидо- и лактогенный эффект в модельных системах in vitro и in vivo, уменьшает морфофункциональные нарушения ткани печени, почек и кишечника при алкогольной и медикаментозной интоксикации, улучшает баланс микроэлементов [Российская лактулоза - XXI век. // М., МИИТ, 2000, 108 с.].

В литературе отсутствуют сведения о самостоятельной противоопухолевой активности лактулозы или ее способности модулировать активность цитостатиков. Имеются лишь единичные сведения о возможности получения защитного эффекта лактулозы, направленного на предупреждение рака толстой кишки [Van Berge Henegouwen G.P., van der Verf S.D.J., Ruben A.T. Effect of long term lactulose ingestion on secondary bile salt metabolism in man: potential tential protective effect of lactulose in colonic carcinogenesis. // Gut, 1987, В.28, S.675-680.].

В качестве ближайшего аналога заявляемого средства принят лизоцим JP 55033409 (EISAI CO LTD), 08.03.1980

- Известна способность лизоцима повышать противоопухолевую активность некоторых цитостатиков в эксперименте и клинике [Sava,G et al., 1995; Shionoya,H. et al., 1980], повышать неспецифическую резистентность организма и улучшать переносимость полихимиотерапии [Голосова Т.В. и др., 1980; Щербакова Э.Г., 2000].

Однако потенцирующая активность лизоцима выражена недостаточно, показана в отношении единичных цитостатиков при ограниченном числе солидных метастазирующих опухолей, и остается неизученной его эффективность в качестве модулятора противоопухолевого действия цитотоксических препаратов при лейкозах.

Задачей изобретения является создание высокоэффективного средства, позволяющего улучшить результаты цитостатической терапии при лейкозах и других онкологических заболеваниях.

Использование изобретения позволит получить следующий технический результат:

- повысить эффективность лечения онкологических больных;

- ускорить наступление ремиссии;

- увеличить длительность ремиссии;

- уменьшить частоту рецидивирования онкологического заболевания;

- улучшить переносимость полихимиотерапии;

- снизить частоту и тяжесть течения госпитальной инфекции, дисбиотических, инфекционных, деструктивных, геморрагических и других осложнений цитостатической терапии;

- повысить эффективность антибиотиков в лечении инфекционно-воспалительных осложнений у онкологических больных;

- уменьшить общие затраты на лечение онкологических больных.

Для решения поставленной задачи и достижения технического результата предложено средство, потенцирующее противоопухолевую активность цитотоксических препаратов, которое содержит в одной дозе лизоцим (лизоцим гидрохлорид, лизоцим хлорид) в количестве 0,5-2,0 г, и дополнительно содержит лактулозу в количестве 2,5-10 г.

Технический результат средства достигается за счет синергизма антиоксидантного, детоксицирующего, гепатопротективного эффектов входящих в его состав лизоцима и лактулозы, их корригирующего влияния на микробиоценоз и морфофункциональное состояние иммунной и пищеварительной систем.

- Авторами впервые экспериментально установлены новые свойства и эффекты сочетания лизоцима с лактулозой при длительном пероральном применении после однократного парентерального введения цитостатика:

- увеличение продолжительности жизни и повышение выживаемости животных при асцитной форме лимфомы EL4 (табл.1);

- индукция и накопление в первичном очаге опухоли клеток, ответственных за противоопухолевую резистентность организма (лимфоцитов и макрофагов) (табл.2);

- резкое, а у части животных полное подавление размножения опухолевых (лейкозных) клеток в первичном очаге (асцит, злокачественный выпот) (табл.2);

- замедление распространения опухолевых клеток из первичного очага в органы и ткани (т.е. усиление противоинвазивного и антиметастатического эффектов цитостатика);

- снижение токсического влияния цитостатика ЦФ на органы и ткани организма: уменьшение атрофии иммунокомпететных органов, дистрофических изменений сердца и органов пищеварительной системы; ослабление угнетающего эффекта ЦФ на функциональное состояние фагоцитирующих клеток;

- предотвращение дисбиотических изменений микробиоценоза кишечника.

Заявляемое средство «ЛИЗОЛАКТ» предполагается к выпуску в виде биологически активной добавки к детскому и лечебному питанию, пищевого модуля или перорального лекарственного препарата.

Формы выпуска: 1) - бурая сладкая, вязкая жидкость в стеклянных или пластиковых флаконах емкостью от 100 мл (для индивидуального применения) до 500 мл (для обогащения продуктов лечебного питания в условиях производства); 2) - аморфный или кристаллический порошок с наполнителем (например, молоко сухое обезжиренное) в упаковке из пищевой фольги или других материалов, разрешенных для продуктов детского питания, по 10-30 г для индивидуального применения и по 500-1000 г - an gro для производственных условий.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Заявляемое средство «Лизолакт» включает следующие ингредиенты из расчета на одну суточную дозу:

	Лизоцим гидрохлорид	0,5 г
A.	Лактусан (70% концентрат сухой)	3,6 г (около 2,5 г лактулозы)
	Молоко сухое обезжиренное	5,9 г
	Лизоцим гидрохлорид	2,0 г
Б	Лактусан (70% концентрат сухой)	14,3 г (около 10 г лактулозы)
	Молоко сухое обезжиренное	13,7 г
В.	Лизоцим гидрохлорид	1,0 г
	Лактусан (70% концентрат жидкий)	14,3 мл (около 10 г лактулозы)
Г.	Лизоцим гидрохлорид	2,0 г
	Лактусан (35% сироп)	28,6 мл (около 10 г лактулозы)
Д.	Лизоцим гидрохлорид	0,5 г
	Лактусан (35% сироп)	7,1 мл (около 2,5 г лактулозы)

Пример 2. Заявляемое средство «Лизолакт» достоверно усиливает избирательное потенцирующее влияние лизоцима (лизоцима гидрохлорида) на противоопухолевую активность циклофосфамида (ЦФ), что показано в серии экспериментов на модели острого лимфобластного лейкоза (Т-клеточная лимфома EL4) у самцов мышей-гибридов (C 57 B1/6J×DBA/2)F1 (B6D2F1) 2-3-месячного возраста массой тела 22-24 г. Мыши привиты внутрибрюшинно по 5×10⁴ асцитных опухолевых клеток в день 0. ЦФ вводили внутрибрюшинно, однократно, в день 0 в низкой дозе - 100 мг/кг (контрсупрессорная терапия). Лизоцим гидрохлорид (Лиз) и лактулозу (Лакт) в дозах 100 мг/кг и 115 мг/кг соответственно вводили через рот интрагастрально 1 раз в день, 5-дневными курсами с 2-х суточным интервалом, начиная с третьих суток и до гибели подопытных мышей (примеры 2.1.-2.2.) или в течение 12 дн., начиная со дня 0, через 1 час после введения ЦФ (примеры 2.3 и 2.4.). Разовая доза лизоцима составляла 100 мг/кг; лактулозы - 115 мг/кг. Сроки наблюдения за животными составляли 90 дней.

Пример 2.1. В экспериментах на 137 мышах показано, что без цитостатика ни лизоцим, ни лактулоза, ни их сочетание существенно не влияли на выживаемость мышей при асцитной форме лимфомы. Лизоцим, в отличие от лактулозы, потенцировал противоопухолевую активность ЦФ: выживаемость животных на 90-й день эксперимента составила 11%. Сочетание лактулозы с лизоцимом достоверно усиливало потенцирующий эффект лизоцима в отношении противоопухолевой активности ЦФ: достоверно возросла продолжительность жизни мышей, павших в результате развития лейкоза, и к концу срока наблюдения выжило 33,3% животных (пережили 90 суток без признаков лейкоза).

Результаты трех экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние лизоцима, лактулозы и их сочетания на противоопухолевую активность циклофосфамида при асцитной форме лимфомы EL4 у мышей линии BDF1.
Группа	n	СПЖ сутки	Ранж сутки	УПЖ %	Вылечено	ЛГ
Без лечения - контроль роста опухоли (КРО.)	30	24,7	18-30
ЦФ	29	33,3	10-59	35	0(0%)	1(3%)
Лиз	19	24,8	19-33	0,4	0(0%)	0(0%)
ЦФ + Лиз	19	35,7	24-75	>45	2(11%)	0(0%)
Лакт	10	24,7	24-30	-0,4	0(0%)	0(0%)
ЦФ + Лакт	10	31,1	27-42	26	0(0%)	0(0%)
Лиз + Лакт	10	25,4	18-34	3	0(0%)	0(0%)
ЦФ + Лиз + Лакт	10	37,3	28-51	>51	3(33,3%)	0(0%)
Примечание: n - количество мышей; СПЖ - средняя продолжительность жизни; СПЖпреп - средняя продолжительность жизни леченых мышей; СПЖРО - средняя продолжительность жизни нелеченых мышей; ЛГ - лекарственная гибель; УПЖ - увеличение продолжительности жизни:

Пример 2.2. В опыте на 70 животных противоопухолевый эффект оценивали по нарастанию асцита к 20-м суткам опыта; величина асцита отражалась на увеличении массы тела. Сочетание лизоцима с лактулозой достоверно тормозило развитие опухолевого асцита, способствовало накоплению клеток, участвующих в иммунном ответе, (лимфоцитов, макрофагов) и несколько потенцировало активность циклофосфамида (табл.2).

В опыте 3 в группе ЦФ+ЛМ+ЛЛ на каждую опухолевую клетку приходилось в 6 раз больше макрофагов, чем у нелеченых мышей, и в 4 раза больше, чем у мышей, получавших только ЦФ.

Пример №2.3. Морфологическими исследованиями в экспериментах на 30 мышах показано, что 12-кратное применение лизоцима в сочетании с лактулозой, начиная со дня 0 через 1 час после применения циклофосфамида, значительно усиливало противоопухолевую активность цитостатика. На 17-е сутки эксперимента у животных, получавших указанное сочетание, резко снижалась обсемененность опухолевыми клетками лимфоидных органов (селезенка, тимус, лимфатические узлы), ткани сердца, стенки желудка, брыжейки тонкой кишки и прилегающей к органам жировой клетчатки. Сочетание лактулозы с лизоцимом эффективнее, чем только лизоцим, уменьшало проявления токсического действия циклофосфамида, снижая до минимума морфологические проявления острого лекарственного миокардита, обеспечивая более быстрое восстановление поврежденной цитостатиком и опухолевым процессом структуры ткани лимфоидных органов и эпителия тонкой кишки, хотя и не предотвращало атрофических изменений этих органов.

Пример 2.4. В экспериментах на 110 мышах с помощью теста локального адоптивного переноса показано, что у мышей, которым проводили противоопухолевую контрсупрессорную терапию малой дозой ЦФ (100 мг/кг) в сочетании с лизоцимом и лактулозой, на 12-е сутки значительно возрастало число клеток селезенки, участвующих в обеспечении противоопухолевой резистентности организма. У здоровых мышей-реципиентов, которым вводили внутрибрюшинно взвесь селезеночных клеток от этих мышей-доноров в смеси с клетками лимфомы EL4 (10 ⁴) в соотношении 50:1, выживаемость составила 66,7% при 16,7% в группах животных, которым вводили клетки селезенки от нелеченых мышей-доноров с лимфомой или доноров, получавших только ЦФ. Это свидетельствует об усилении сочетанием лизоцима с лактулозой индукции клеток селезенки с высокой противоопухолевой реактивностью, угнетающих развитие лимфомы.

Таким образом, на экспериментальной модели лимфобластного лейкоза мышей показано, что заявленное средство - сочетание лизоцима с лактулозой «Лизолакт» достоверно потенцирует противоопухолевую активность цитотоксического препарата циклофосфамида.