средство, обладающее антипсихотической активностью

Формула изобретения

Средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы

,

где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - OH; -ОСН ₃; -NH₂; -Gly-Pro.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и направлено на создание новых лекарственных препаратов, обладающих антипсихотической активностью. В качестве предложенного лекарственного препарата используют средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro.

Изобретение расширяет арсенал антипсихотиков нового поколения, эффективных в терапии негативных и позитивных расстройств психики. Может быть использовано для коррекции негативных, позитивных и когнитивных расстройств, наблюдаемых у больных шизофренией и другими психозами, а именно для восстановления и повышения уровня работоспособности, обучаемости, социальной адаптации значительного контингента больных с психическими расстройствами.

Известна группа антипсихотиков непептидной природы (Клозапин, Кветиапин, Оланзапин, Рисперидон, Запрасидон, Регистр лекарственных средств России «Энциклопедия лекарств», 2006 г.). Эти препараты обладают рядом побочных эффектов, а именно вызывают развитие метаболического синдрома, повышая уровень сахара, холестерина, липидов в крови, ожирение, пролактинемию и связанных с ней аменорею, бесплодие, гиперплазию молочных желез у женщин, снижение либидо, эректильную дисфункцию у мужчин. Перечисленные побочные эффекты часто являются препятствием к использованию этих препаратов в клинике.

Процесс производства существующих атипичных антипсихотиков непептидной природы требует значительных затрат и налажен лишь в нескольких крупных зарубежных фирмах. Отечественных аналогов не существует.

В настоящее время доказано, что пептидэргические системы в тесном взаимодействии с системами биогенных аминов вовлечены в патогенез шизофрении. Перспективным направлением является создание нейролептиков с пептидэргическим механизмом действия. Ранее было показано, что эндогенный пептид нейротензин Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, содержащий фрагмент -Pro-Tyr- (Tadashi Yoshimoto et al., J. Biol. Chem. 253(10), 3708-3716 (1978)), обладает некоторыми свойствами, характерными для нейролептиков. Он обнаруживает широкий спектр фармакологической активности, включая гипертензию, гипергликемию, увеличение проницаемости сосудов, секрецию гормона роста и гипотермические эффекты, имеет отношение к центральной регуляции поведенческих и соматических реакций организма (Carraway R. & Leeman S., 1973, Beadet A. et al., 1994).

Показано, что этот пептид, как и известные антипсихотики, является фармакологическим антагонистом дофаминомиметиков, что уровень этого пептида снижен в спинномозговой жидкости нелеченых больных шизофренией и повышается в результате терапии антипсихотиками.

Исследования, доказывающие вовлечение других нейромедиаторных систем в патогенез психических заболеваний, позволили расширить направление поиска новых антипсихотических препаратов. Вместе с тем до настоящего времени не существует пептидных препаратов с фармакологическим профилем антипсихотиков. Описанные в патенте С.Б.Середенина и соавторов (С.Б.Середенин, Т.А.Воронина, Т.А.Гудашева, Р.У.Островская и др., патент РФ 2091390, 1998 г.) Рrо-Tyr-содержащие соединения обладают сходными биологическими свойствами, но помимо вышеуказанной аминокислотной последовательности имеют в своей структуре химические заместители неприродного происхождения.

Техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения, является разработка пептидных антипсихотиков, более эффективных и дешевых, чем существующие антипсихотики, а также свободных от их побочных эффектов, где в качестве лекарственного препарата используют средство, обладающеее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы .

Указанный технический результат важен тем, что позволяет направленно синтезировать различные пептидные последовательности, отвечающие общей формуле , где Pro может представлять собой DPro, а также проводить направленный скрининг антипсихотической активности синтезированных пептидов по стандартной программе.

Указанный технический результат достигается тем, что используют средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro.

С целью реализации данного изобретения синтезированы тетрапептиды формулы Val-Pro-Tyr-Phe, Met-Pro-Tyr-Ala, Met-Pro-Tyr-Arg, Met-Pro-Tyr-Phe, Met-DPro-Tyr-Phe, Trp-Pro-Tyr-Phe, Tyr-Pro-Tyr-Phe, Met-Pro-Tyr-Phe-OMe, Met-Pro-Tyr-Trp-OMe и гексапептид Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro, отвечающие общей формуле , обладающие антипсихотической активностью, свойственной атипичным антипсихотикам. Приведенные аминокислотные последовательности, обладающие свойствами атипичных антипсихотиков, имеют общую закономерность, а именно наличие в структуре молекулы дипептида Pro-Туr в положениях 2, 3 вышеприведенных пептидов, где Pro может представлять собой DPro.

Впервые обнаружена закономерность, что средство, обладающее антипсихотической активностью и представляющее пептид общей формулы , где Pro может представлять собой DPro,

А выбирают из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

В выбирают из Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val;

X - ОН; -ОСН₃; -NH₂; -Gly-Pro,

проявляет свойства атипичных антипсихотиков. Эта закономерность подтверждена синтезом ряда пептидов, данными радиорецепторного анализа способности этих пептидов взаимодействовать с рецепторами - мишенями атипичных антипсихотиков - и поведенческими тестами.

Исходя из результатов проведенных исследований можно заключить, что пептиды, отвечающие общей формуле , где Pro может представлять собой DPro, могут быть использованы для создания новых лекарственных препаратов с антипсихотической активностью.

Некоторые пептиды общей формулы представлены в таблице 1.

Все представленные в таблице 1 пептиды обладают в разной степени выраженными свойствами атипичных антипсихотиков и могут быть использованы в качестве средства, обладающего антипсихотической активностью.

Ниже приведены примеры подтверждающие это.

Синтез пептидов общей формулы , где Pro может представлять собой DPro, осуществляли методами пептидной химии как в растворе, так и твердофазным методом синтеза с использованием L и D аминокислот, предварительно защищенных соответствующим образом, и свободных аминокислот. Синтез пептидов в растворе проводился как ступенчатым наращиванием пептидной цепи, так и фрагментной конденсацией с применением метода смешанных ангидридов, карбодиимидного метода с добавлением 1-оксибензотриазола в качестве нуклеофильной добавки, методом активированных эфиров. Все промежуточные и конечные продукты были выделены и охарактеризованы. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали, опрыскивая пластинки раствором нингидрина. Удельное вращение определяли на поляриметре марки «А1-ЕПО», элементный анализ - на анализаторе "Carlo-Erba" модель 1106.

Пептиды, синтезированные автоматическим твердофазным методом, синтезированы по Fmoc-схеме на полимере Ринка с использованием DEPCDI/HOBt метода активации аминокислот. Проверку гомогенности полученных пептидов проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном микроколоночном хроматографе «Миллихром А-02». Синтезированные пептиды были охарактеризованы при помощи масс-спектрометрии на масс-спектрометре фирмы Bruker (^®Bruker Daltonik GmbH). Растворители, используемые при синтезе пептидов, абсолютировали соответствующим образом.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей, использованные при синтезе пептидов в растворе:

(ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1); (бензол: этанол) (8:2); (хлороформ:метанол) (9:1); (хлороформ, насыщ. аммиаком: метанол) (9:1); (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25); (бутанол:уксусная кислота:вода) (4:1:1); (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1); (бутанол: уксусная кислота: пиридин: вода) (30:6:20:24); (гексан: ацетон) (3:2); (изо-пропанол:муравьиная кислота:вода) (20:5:1).

Принятые сокращения:

Ala - аланин; Arg - аргинин; Gly - глицин; Ile - изолейцин; Leu - лейцин; Lys - лиизин; Met - метионин; Phe - фенилаланин; Pro - пролин; Ser- серин; Туr - тирозин; Thr - треонин; Trp - триптофан; Val - валин.

AcN - ацетонитрил

Bzl - бензил

Воc - трет-бутилоксикарбонил

ДЦГК - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

ДМФА - диметилформамид

NH₂ - амид

ОБТ - 1-оксибензотриазол

OBzl - бензиловый эфир

ОМе или (ОСНз) - метиловый эфир

OPfp - пентафторфениловый эфир

PivCl - пивалоилхлорид

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТФА - трифторацетат

ТЭА - триэтиламин

На примере синтеза тетрапептидов Met-Pro-Tyr-Phe; Met-Pro-Tyr-Phe-OMe; Tyr-Pro-Tyr-Phe и гексапептида Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro показан общий подход при синтезе пептидов формулы (I) в растворе.

Пример 1.

Синтез тетрапептида Met-Pro-Tyr-Phe.

I. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

5,5 г (15 ммоль, избыток 1,1) Boc-Tyr(Bzl)-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (4,0 г) HCl·H-Phe-OBzl с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂ O, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO ₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз 20 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅ , КОН и парафином.

Выход 7,76 г (12,75 ммоль) (85%)

Т.пл. 74-76°С

[ ]_D ²²=-11,374 (с=1, метанол)

Rf: 0,706 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,843 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 608,71

Брутто-формула С₃₅Н₄₂N ₂О₈

II. Получение ТФА·Н-Тyr(Вzl)-Рhе-ОВzl.

К 7,0 г (11,5 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl прибавляли 28,8 мл хлористого метилена и 28,8 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный остаток сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 7,0 г (11,25 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,341 (бензол:этанол) (8:2)

0,138 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,544 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 622,6

Брутто-формула C₂HF ₃O₂·C₃₂H₃₂N₂ O₄

III. Получение Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

2,51 г (10 ммоль, избыток 1,1) Boc-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 50 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,6 г (12 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 2,7 г (12 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 9,1 ммоль (5,66 г) TФA·H·Tyr(Bzl)-Phe-OBzl с ТЭА (1,4 мл, 10 ммоль, избыток 1,1) в 20 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 100 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 10 мл Н₂О, 3 раза по 10 мл 10% раствором KHSO ₄, 3 раза по 10 мл H₂О, 3 раза по 10 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 10 мл H₂O, 1 раз 10 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 5,43 г (7,5 ммоль) (75%)

Т.пл. 98-100°С

[ ]_D ²²= -65,84 (с=1, метанол)

Rf: 0,614 (бензол:этанол) (8:2)

0,714 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,650 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

Мол. масса 723,83

Брутто-формула C ₄₂H₄₉N₃O₈

IV. Получение Boc-Pro-Tyr-Phe-OH.

5 г (7 ммоль) Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 0,1 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с эфиром, добавляли 10 мл эфира и заливали гексаном, при добавлении гексана выпадал осадок, гексан сливали, а осадок в колбе сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход 3,57 г (6,17 ммоль) (88,2%)

Т.пл. 90-92°С

[ ]_D ²²=- 76,94 (с=1, метанол)

Rf: 0,320 (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25)

Мол. масса 525,58

Брутто-формула С₂₈ Н₃₅N₃O₇

V. Получение ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 2,6 г (5 ммоль) Boc-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 12,5 мл хлористого метилена и 12,5 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅ , КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,56 г (4,89 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,287 (хлороформ:метанол:аммиак) (7:2,5:0,5)

0,145 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

Мол. масса 523,47

Брутто-формула С ₂НF₃O₂·С₂₃Н₂₇ N₃O₄

VI. Получение Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OH.

2,56 г (4 ммоль) ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OH растворяли в 30 мл диметилформамида, прибавляли 1,36 мл (8 ммоль) N,N'-диизопропилэтиламина и затем по каплям раствор Boc-Met-OPfp 1,83 г (4,4 ммоль, изб. 1,1) в 10 мл ДМФА (диметилформамида). Выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке 3 часа. Реакционную смесь упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали, промывая на фильтре гексаном. Полученный продукт отфильтровывали и сушили в эксикаторе под вакуумом над P₂O₅ , КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,37 г (3,62 ммоль); (90.5%)

Т.пл. 101-103°С

[ ]_D ²²=- 65,49 (с=1, метанол)

Rf: 0,687 (этилацетат:ацетон:уксусная кислота 50%) (2:1:1);

0,428 (хлороформ:метанол:аммиак) (8:1,75:0,25);

0,217 (бутанол: уксусная кислота:вода) (4:1:1).

Мол. масса 656,81

Брутто-формула C₃₃ H₄₄N₄O₈S

VII. Получение HCl·H-Met-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 1,97 г (3 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 4,5 мл 1 н. HCl/СН ₃СООН) и 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия Вос-группы реакционную смесь заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином. К высушенному осадку добавляли абс. этилацетат, упаривали на роторном испарителе, добавляли 5 мл абс. этилацетата и высаждали сухим эфиром не содержащего перекиси. При добавлении эфира выпадает осадок, который отфильтровывали. Осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином (белый в виде белого порошка).

Выход 2,37 г (2,67 ммоль); (89%)

Т.пл. 110-112°С

[ ]_D ²²=- 32,59 (с=1, метанол)

Rf: 0,465 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

Мол. масса 593,22

Брутто-формула НСl·С₂₈ Н₃₆N₄O₆S

Элементный анализ: С 56,50 (56,68); N 9,40 (9,44); Н 6,05 (6,11)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-C18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µ1, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄ +5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 26 мин.

Пример 2.

Синтез тетрапептида Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

I. Получение Boc-Tyr-Phe-OMe.

4,2 г (15 ммоль, избыток 1,1) Вос-Tyr-ОН помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (2,9 г) HCl·H-Phe-OMe с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂ О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO ₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз 20 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅ , КОН и парафином.

Выход 5,64 г (12,75 ммоль) (87%)

Т.пл. 85-87°С

[ ]_D ²²=- 61,88 (с=1, метанол)

Rf: 0,756 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,910 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 442,49

Брутто формула C₂₄H₃₀N ₂O₆

II. Получение ТФА-Tyr-Phe-OMe.

К 4,42 г (10 ммоль) Boc-Tyr-Phe-OMe прибавляли 25 мл хлористого метилена и 25 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 4,47 г (9,8 ммоль) (98%)

Rf: 0,450 (бензол:этанол) (8:2)

0,283 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,538 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 456,42

Брутто-формула С₂ НF₃O₂·С₁₉Н₂₂ N₂O₄

III. Получение Boc-Pro-Tyr-Phe-OMe.

2,07 г (9,36 ммоль, избыток 1,1) Boc-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,39 г (10,3 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 2,33 г (10,3 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 8,76 ммоль (4,0 г) ТФА·H-Tyr-Phe-OBzl с ТЭА (1,35 мл, 9,6 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂ О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 5% раствором NаНСО ₃, 3 раза по 20 мл H₂О, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂ O₅, КОН и парафином.

Выход 3,88 г (7,62 ммоль) (87%)

Т.пл. 108-110°С

[ ]_D ²²=-56,87 (с=1, метанол)

Rf: 0,320 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,520 (бензол:этанол) (8:2) 0,680 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 509,58

Брутто-формула С₂₈Н₃₅Н₃О₆

IV. Получение ТФА-Pro-Tyr-Phe-OMe.

К 3,56 г (7,0 ммоль) Boc-Pro-Tyr-Phe-OMe прибавляли 17,5 мл хлористого метилена и 17,5 мл ТФУ, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р ₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 4,47 г (7,72 ммоль) (96%)

Rf: 0,190 (бензол:этанол) (8:2)

0,250 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,345 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 523,5

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С₂₃Н ₂₇N₃O₄

V. Получение Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

2,6 г (5,0 ммоль) ТФА·H-Pro-Tyr-Phe-OMe растворяли в 30 мл диметилформамида, прибавляли 1,74 мл (10,0 ммоль, 2-кратный избыток) N,N'-диизопропилэтиламина и затем по каплям раствор Boc-Met-OPfp 2,5 г (6 ммоль, избыток 1,2) в 25 мл диметилформамида. Выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке 3 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, добавляли 150 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 15 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 15 мл), Н₂О (3 раза по 15 мл), 5% раствором NаНСО₃ (3 раза по 15 мл), Н₂О (3 раза по 15 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 15 мл). Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Продукт высаждали из этилацетата гексаном. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме над P₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,58 г (3,92 ммоль); (78,5%)

Т.пл.110-112°С

[ ]_D ²²=- 52,15 (с=1, метанол)

Rf: 0,710 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,244 (ацетон:бензол: уксусная кислота) (50:100:1),

0,763 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 657,77

Брутто-формула C₃₃H₄₄N ₄₀O₈S

VI. Получение HCl·H-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe.

К 2,0 г (3,0 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr-Phe-OMe прибавляли 4,5 мл 1н HCl/СН₃СООН, 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре. После снятия защитной группы реакционную смесь заливали гексаном, гексан сливали, а полученное вещество сушили в вакууме. Высушенное вещество растворяли в 5 мл абс. метанола и переосаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе под вакуумом, несколько раз меняя осушители (P₂O₅, КОН и парафин).

Выход 3,8 г (2,7 ммоль) (90%)

Т.пл.115-117°С

[ ]_D ²²=-16,12 (с=1; метанол)

Rf: 0,632 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

0,883 (бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода) (30:6:20:24)

Мол. масса 611,16

Брутто-формула HCl·C ₂₈H₃₆N₄O₉S

Элементный анализ: С 55,06 (55,02); N 9,08 (9,16); Н 5,87 (5,93)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-C18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µl, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 21,5 мин.

Пример 3.

Синтез тетрапептида H-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

I. Получение DiBoc-Tyr-Pro-OBzl.

4,7 г (12,32 ммоль) DiBoc-Tyr помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 100 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,0 г (14,78 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазол), охлаждали до 0°С и добавляли 3,34 г (14,78 ммоль) (N,N'-дициклогексилкарбодиимида) ДЦГК. Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор HCl·H-Pro-OBzl 13,6 г (14,78 ммоль; избыток 1,2) с ТЭА (2,1 мл, 14,78 ммоль) в 50 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO ₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р ₂О₅, КОН и парафином.

Выход 4,80 г (8,44 ммоль) (68,5%)

Т.пл. 98-100°С

[ ]_D ²²=- 61,88 (с=1, метанол)

Rf: 0,923 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,800 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,750 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 568,65

Брутто-формула C₃₁H₄₀N₂O₈

II. Получение DiBoc-Tyr-Pro-OH.

4,8 г (8,44 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,2 мл СН_зСООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с эфиром, добавляли 10 мл эфира и заливали гексаном, при добавлении гексана выпадал осадок, гексан сливали, а осадок в колбе сушили в эксикаторе над P₂O₅, KOH и парафином.

Выход 3,57 г (7,46 ммоль) (88,4%)

Т.пл. 101-103°С

[ ]_D ²²=-11,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,577 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,540 (бензол:этанол) (8:2)

0,545 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

Мол. масса 478,6

Брутто-формула C₂₄H₃₄N₂O₈

III. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl

5,5 г (15 ммоль, избыток 1,1) Boc-Tyr(Bzl)-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 75 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 2,16 г (18 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 4,06 г (18 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 13,6 ммоль (4,0 г) HCl·H-Phe-OBzl с ТЭА (2,1 мл, 15 ммоль) в 30 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 20 мл Н₂ О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO ₃, 3 раза по 20 мл H₂O, 1 раз (20 мл) насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из эфира гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над P₂O₅ , КОН и парафином.

Выход 7,76 г (12,75 ммоль) (85%)

Т.пл. 74-76°С

[ ]_D ²²=-12,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,706 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,843 (бензол: этанол) (8:2)

Мол. масса 608,71

Брутто-формула C₃₅H₄₂N ₂O₈

IV. Получение TФA·H-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

К 7,0 г (11,5 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl прибавляли 28,8 мл хлористого метилена и 28,8 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, упаренный остаток растворяли в минимальном объеме бензола и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 7,0 г (11,25 ммоль) (97,8%)

Rf: 0,341 (бензол:этанол) (8:2)

0,138 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,544 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 622,6

Брутто-формула C₂ HF₃O₂·C₃₂H₃₂ N₂O₄

V. Получение DiBoc-Tyr-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl.

3,0 г (6,26 ммоль, избыток 1,1) DiBoc-Tyr-Pro-OH помещали в плоскодонную колбу, растворяли в 50 мл ацетонитрила, к раствору добавляли 1,0 г (7,5 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 1,7 г (7,5 ммоль) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали 1 час на магнитной мешалке при температуре 0°С. Затем к реакционной смеси добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор 5,7 ммоль (3,55 г) TФA·H-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl с ТЭА (0,88 мл, 6,27 ммоль) в 20 мл ацетонитрила (рН раствора должен быть 8-9). Реакционную смесь перемешивали 1 час при 0°С и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, к упаренному остатку добавляли 150 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 3 раза по 15 мл Н₂ О, 3 раза по 15 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 15 мл Н₂О, 3 раза по 15 мл 5% раствором NaHCO ₃, 3 раза по 15 мл Н₂О, 1 раз 15 мл насыщенным раствором NaCl. Раствор этилацетата сушили в течение 30 минут над прокаленным MgSO₄. Высушенный раствор этилацетата отфильтровывали, упаривали. Остаток высаждали из этилацетата гексаном. Полученный продукт сушили в вакууме над Р₂ O₅, КОН и парафином.

Выход 4,65 г (4,8 ммоль) (85%)

Т.пл. 98-102°С

[ ]_D ²²=- 40,6 (с=1, метанол)

Rf: 0,360 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,620 (бензол:этанол) (8:2)

0,780 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 969,1

Брутто-формула C₅₆H₆₄N₄O₁₁

VI. Получение DiBoc-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

4,5 г (4,64 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-Tyr(Bzl)-Phe-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,1 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, 2 раза упаривали с бензолом, 1 раз с этилацетатом, добавляли 5 мл этилацетата и заливали гексаном, выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 3,54 г (4,3 ммоль) (93%)

Т.пл.115-116°С

[ ]_D ²²=-79,37 (с=1, метанол)

Rf: 0,351 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 820,87

Брутто-формула C₄₂H₅₂N ₄O₁₃

VII. Получение HCl·H-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH.

К 3,0 г (3,65 ммоль) DiBoc-Tyr-Pro-Tyr-Phe-OH прибавляли 1н HCl/СН₃СООН (11 мл, в пересчете на две Вос-группы в молекуле тетрапептида), выдерживали 45 минут при комнатной температуре. После снятия защитных групп реакционную смесь заливали гексаном, гексан сливали, а полученное вещество сушили в вакууме. Высушенное вещество растворяли в 5 мл абс. метанола и переосаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в эксикаторе под вакуумом, несколько раз меняя осушители P₂O ₅, КОН и парафин).

Выход 3,8 г (3,28 ммоль) (90%)

Т.пл. 103-105°С

[ ]_D ²²=-22,97 (с=1, метанол)

Rf: 0,214 (хлороформ:метанол:аммиак) (6,5:3,0:0,5)

0,932 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

0,180 (бутанол:уксусная кислота:вода) (5:2:1)

0,658 (бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода) (30:6:20:24)

Мол. масса 657,14

Брутто-формула НСl·С ₃₂H₃₆N₄О₉

Элементный анализ: С 58,57 (58,48); N 8,48 (8,53); Н 5,48 (5,52)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-С18 AQ, размер 2,0×0,75 мм; объем 2,0 µl, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 16 мин.

Пример 4.

Синтез гептапептида Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro.

I. Получение Boc-Pro-Gly-OH.

1. 10,75 г (50 ммоль) Boc-Pro-OH растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор H-Gly-OH.

Одновременно во второй колбе приготавливали раствор H-Gly-OH.

2. H-Gly-OH 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) ТЭА, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ~50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-кратным избытком NaHSO₄ (25 г) до рН=3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали Н₂О (50 мл), 10% раствором KHSO₄ (50 мл), Н₂О (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 5,97 г (32,75 ммоль); (65,5%)

Т.пл. 70°С

[ ]_D ²²=-87,8 (с=1, метанол)

Rf: 0,863 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,746 (бензол:этанол) (8:2)

0,903 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,847 (этилацетат:ацетон:50% уксусная кислота:вода) (2:1:1)

Мол. масса 271,32

Брутто-формула C₁₂H₂₀N₂O₅

II. Получение Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5,9 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор НСl·H-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор НСl·H-Pro-OBzl.

2. HCl·H-Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) ТЭА, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали H₂O (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO ₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂ О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ~100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, Р₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%)

Т.пл. 125-126°С

[ ]_D ²²= -101,18 (с=1, метанол)

Rf: 0,326 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,390 (гексан: ацетон) (3:2)

0,947 (хлороформ: метанол) (9:1)

0,620 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 459,54

Брутто-формула C₂₄H₃₃N₃O₆

Элементный анализ: С 62,89 (62,73); N 9,21 (9,14); Н 7,52 (7,24).

III. Получение ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

К 7,8 г (17,0 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 42,5 мл хлористого метилена и 42,5 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход 7,95 г (17,7 ммоль); 98%.

Rf: 0,043 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1),

0,247 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,018 (гексан: ацетон) (3:2)

Мол. масса 473,44

Брутто-формула С₂НF₃O₂·С ₁₉Н₂₅N₃O₄

IV. Получение Boc-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5,61 г (14,72 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (2,27 мл; 16,2 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (1,99 мл; 16,2 ммоль) пивалоилхлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор TФA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl.

2. TФA·H-Pro-Gly-Pro-OBzl 8,0 г (17,0 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,76 мл (34,0 ммоль; 2-кратный избыток до рН 8-9) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н ₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли ~30 мл этилацетата и высаждали гексаном. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P ₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Высушенный осадок переосаждали из эфира гексаном. Вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P ₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 8,6 г (12,07 ммоль); (82,0%)

Т.пл. 99-102°С

[ ]_D ²²= -52,6 (с=1, метанол)

Rf: 0,530 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1)

0,538 (бензол:этанол) (8:2)

0,707 (хлороформ:метанол) (9:1)

Мол. масса 712,81

Брутто-формула C₄₀H₄₈N₄O₈

V. Получение ТФА·H-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

К 8,0 г (11,2 ммоль) Boc-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 28 мл хлористого метилена и 28 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный остаток сушили в эксикаторе над Р₂O ₅/КОН и парафином.

Выход: 7,39 г (10,9 ммоль); (97,15%)

Rf: 0,095 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1),

0,550 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,510 (гексан: ацетон) (3:2)

0,333 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 678,7

Брутто-формула С₂НF₃O ₂·С₃₅H₄₀N₄O₃

VI. Получение Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

2,44 г (11,33 ммоль, избыток 1,1) Вос-Pro-ОН растворяли в 50 мл ацетонитрила, добавляли 1,84 г (13,6 ммоль; избыток 1,2) ОБТ (1-оксибензотриазола), охлаждали до 0°С и добавляли 3,07 г (13,6 ммоль; избыток 1,2) ДЦГК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида). Перемешивали на магнитной мешалке 1 час при температуре 0°С, добавляли ранее приготовленный и охлажденный раствор ТФА·H-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl 7,0 г (10,3 ммоль) с ТЭА 1,6 мл (11,33 ммоль; избыток 1,1) в 25 мл ацетонитрила, перемешивали 1 час при охлаждении и трое суток при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали, упаривали, добавляли 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 20 мл), 10% раствором KHSO ₄ (3 раза по 20 мл), Н₂О (3 раза по 20 мл), 5% раствором NаНСО₃ (3 раза по 20 мл), H₂ О (3 раза по 20 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 20 мл). Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Продукт высаждали из этилацетата эфиром. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме.

Выход 4,73 г (6,45 ммоль) (62,7%)

Т.пл. 98-100°С

[ ]_D ²²= -86,2° (с=0,5 СН₃СООН)

Rf: 0,375 (ацетон:бензол:уксусная кислота) (50:100:1),

0,670 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,573 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 733,82

Брутто-формула C₃₈H₄₉N ₆O₉

VII. Получение ТФА·Н-Pro-Тyr(Вzl)-Pro-Gly-Pro-ОВzl.

К 3,0 г (4,0 ммоль) Boc-Pro-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 10 мл хлористого метилена и 10 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в этилацетате и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный остаток сушили в эксикаторе над Р₂O₅, КОН и парафином.

Выход: 2,72 г (3,9 ммоль); (97,15%)

Rf: 0,23 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,142 (бензол:этанол) (8:2)

Мол. масса 757,82

Брутто-формула C₂HF₃O₂·C₄₀H ₄₇N₅₀O₁₀

VIII. Получение Boc-Met-Pro-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

2,20 г (3,0 ммоль) TФA·H-Pro-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 60 мл диметилформамида, прибавляли 1,05 мл (6,0 ммоль, 2-кратный избыток) N,N'-диизопропилэтиламина и затем по каплям раствор Boc-Met-OPfp 4,1 г (3,6 ммоль, избыток 1,2) в 15 мл диметилформамида. Выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке 3 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, добавляли 100 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂ О (3 раза по 10 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 10 мл), Н₂О (3 раза по 10 мл), 5% раствором NaHCO ₃ (3 раза по 10 мл), H₂O (3 раза по 10 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 10 мл). Раствор этилацетата сушили над MgSO₄, отфильтровывали, упаривали. Продукт высаждали из этилацетата эфиром. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме над Р₂O₅, КОН и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход 2,13 г (2,26 ммоль); (75,5%)

Т.пл. 85-87°С

[ ]_D ²²=- 51,6 (с=1, метанол)

Rf: 0,690 (хлороформ:метанол) (9:1)

0,266 (ацетон: бензол: уксусная кислота) (50:100:1),

0,855 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

Мол. масса 941,2

Брутто-формула С₅₀Н₆₄N ₉O₁₀S

IX. Получение Boc-Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro-OH.

1,88 г (2 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл метанола, прибавляли 0,1 мл СН₃ СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке, пропускали водород в течение 2 часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, два раза упаривали с бензолом, один раз с этилацетатом, добавляли 5 мл этилацетата и заливали гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали, промывая на фильтре гексаном. Полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O_5, КОН и парафином.

Выход 1,65 г (1,96 ммоль); (98,3%)

Т.пл. 134-136°С

[ ]_D ²²=- 61,2 (с=1, метанол)

Rf: 0,560 (хлороформ:метанол:аммиак) (6:4:1)

Мол. масса 842,94

Брутто-формула C₄₃H ₅₈N₆O₁₀S

X. Получение HCl·H-Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro-OH.

К 1,52 г (1,8 ммоль) Boc-Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro-OH прибавляли 2,7 мл 1н HCl/СН₃СООН) и 1% анизола, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия Вос-группы реакционную смесь заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅ , КОН и парафином. К высушенному осадку добавляли абс. этилацетат, упаривали на роторном испарителе, добавляли 10 мл абс. этилацетата и высаждали сухим эфиром. При добавлении эфира выпадает осадок, который отфильтровывали. Осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅, КОН и парафином. Белый кристаллический порошок.

Выход: 1,26 г (1,7 ммоль); (96,5%)

Т.пл. 139-140°С

Rf: 0,855 (хлороформ, насыщ. аммиаком:метанол) (9:1)

0,614 (изо-пропанол: муравьиная кислота:вода) (20:5:1)

[ ]_D ²²=- 87,8 (с=1; метанол)

Мол. масса 745,35

Брутто-формула НСl·С₃₁ Н₄₄N₆О₁₁S

Элементный анализ: С 50,01 (49,95); N 11,14 (11,27); Н 6,94 (7,3)

Результаты ВЭЖХ: колонка Prontosil 120-5-C18 AQ, размер 2,0х0,75 мм; объем 2,0 ц1, скорость подачи 100 мкл/мин; температура 35°С, давление 1,6 МПа; элюент А: 0,2 М LiClO₄+5 mM HClO ₄; элюент В: AcN; линейный градиент, время выхода 28 мин.

В таблице 2 приведены пептиды, относящиеся к общей формуле А-Pro-Tyr-В-Х (I), синтезированные методами пептидной химии в растворе.

Таблица 2
Пептиды, относящиеся к общей формуле , синтезированные методами пептидной химии в растворе
1	Met-Pro-Tyr-Phe
2	Met-Pro-Tyr-Arg
3	Tyr-Pro-Tyr-Phe
4	Met-Pro-Tyr-Phe-OMe
5	Met-Pro-Tyr-Trp-OMe
6	Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro

Пример 5.

Пептиды, относящиеся к общей формуле , синтезированные автоматическим твердофазным методом.

В таблице 3 приведены примеры синтеза пептидов, относящихся к общей формуле , синтезированных автоматическим твердофазным методом.

Таблица 3
Пептиды, относящиеся к общей формуле , синтезированные автоматическим твердофазным методом
1	Met-Pro-Tyr-Ala
2	Met-DPro-Tyr-Phe
3	Trp-Pro-Tyr-Phe
4	Val-Pro-Tyr-Phe

Пептиды, приведенные в таблице 3, синтезированы автоматическим твердофазным методом по Fmoc-схеме на полимере Ринка (4-(2,4-диметоксифенилфлуоренилметоксиаминометил)фенокси-полистирол, 0,5 ммоль аминогрупп на 1 г полимера) с использованием DEPCDI/HOBt метода активации аминокислот. Пептиды отщепляли от полимера и деблокировали смесью TFA:m-crezole (95:5). Очистку пептидов проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (колонка Jupiter Cis (10×250 мм) в следующем градиенте ацетонитрила: 5 мин при 2%, затем линейный градиент от 2 до 60% за 50 мин в 0,1% трифторацетатном буфере при скорости потока 4 мл/мин.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие биологическую активность пептидов.

Пример 6.

Радиорецепторное исследование взаимодействия пептидов, относящихся к общей формуле , с местами специфического связывания ³Н-спиперона во фронтальной коре (5-НТ₂ рецепторы) и стриатуме (D₂-рецепторы) головного мозга крыс в опытах in vitro.

Спиперон является неселективным лигандом серотониновых и дофаминовых рецепторов с профилем рецепторного связывания, характерным для ряда атипичных антипсихотиков. В данном исследовании была изучена способность Pro-Tyr - содержащих пептидов (в концентрации 50 мкМ) вытеснять ³H-спиперон из мест его специфического связывания с мембранной фракцией стриатума, где плотность D ₂-рецепторов превосходит плотность других рецепторов, с которыми взаимодействует этот лиганд, и фронтальной коры - отдела мозга, наиболее обогащенного 5-НТ₂ рецепторами.

В экспериментах использовали 20 беспородных белых крыс самцов весом 200±20 г, полученных из питомника РАМН «Крюково Центральное». Животных содержали в стандартных условиях по 5 штук в клетках MAC 4 при температуре 22°С, световом режиме 12:12 часов (свет с 8.00 ч до 20.00 ч), питьевом и пищевом режиме ad libitum. Крыс забивали декапитацией. Затем браншу ножниц вводили в большое затылочное отверстие и вскрывали черепную коробку в продольном направлении. Извлекали головной мозг, немедленно помещали его в чашку Петри на льду и выделяли фронтальную кору и стриатум.

Мембранную фракцию отделов головного мозга крыс для постановки радиорецепторного анализа получали модифицированным методом Nelson et al. (1981). После диссекции фронтальную кору гомогенизировали в ледяном 50 mM TRIS-HC1 буфере, рН 7,4 (соотношение вес/объем 1/20) в механическом гомогенизаторе типа Potter (стекло/тефлон). Гомогенат центрифугировали (30000 g, 30 min, 4°C). Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в том же объеме ледяного TRIS-HC1 буфера, рН 7,4. Описанную процедуру повторяли три раза. Полученный осадок замораживали и хранили при -70°С.

Радиорецепторный анализ проводили по методу Bymaster et al. (1996). Реакционная смесь для изучения связывания спиперона с рецепторами фронтальной коры головного мозга крыс (конечный объем 300 мкл) содержала 50 мМ Трис-НСl буфер, рН 7.4; мембранную фракцию фронтальной коры (0,15 мг белка/мл); 50 мкг/мл бацитрацина; аскорбиновую кислоту 0,1 мг/мл; 10 мкМ паргилина; 5 нМ ³H-спиперона (120 Ки/мМоль, Amersham), исследуемые пептиды в концентрации 100 мкМ.

Реакционная смесь для изучения связывания спиперона с рецепторами стриатума (конечный объем 300 мкл) содержала 50 мМ Трис-НСl буфер, рН 7.4; 120 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂ , мембранную фракцию стриатума (0,15 мг белка/мл); 50 мкг/мл бацитрацина; аскорбиновую кислоту 0,1 мг/мл; 10 мкМ паргилина; 0,7 нМ ³H-спиперона, исследуемые пептиды в концентрации 100 мкМ. Инкубацию проводили при 25°С в течение 40 мин. Отделение связавшейся и несвязавшейся метки проводили на харвестере Skatron (Швеция) на стекловолокнистых фильтрах GF-B (Whatman), предварительно замоченных в 0,1% растворе полиэтиленимина. Кетансерин, сульпирид и немеченый спиперон в концентрациях от 0,1 нМ до 1 мкМ использовали для построения контрольной калибровочной кривой вытеснения. Каждая точка определялась в трех параллелях в трех независимых экспериментах. Белок в пробах определяли по методу Лоури.

Полученные результаты представлены в таблице 4. Из таблицы видно, что четыре исследованных пептида, относящиеся к общей формуле , влияют на специфическое связывание ³H-спиперона с мембранами стриатума, т.е., возможно, обладают способностью взаимодействовать с D₂ рецепторами. Эта способность наиболее выражена у Met-Pro-Tyr-Phe-OMe и у Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro. Следует отметить, что селективный лиганд D₂ рецепторов сульпирид в насыщающих концентрациях (10 мкМ) вытесняет ³H-спиперон из его мест связывания в стриатуме лишь на 50%, что свидетельствует о наличии отличных от D₂ типов рецепторов к спиперону в этом отделе мозга.

Met-Pro-Tyr-Phe-OMe, Met-Pro-Tyr-Trp-OMe, Met-Pro-Tyr-Phe и Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro в концентрации 50 мкМ практически полностью ингибируют связывание ³H-спиперона с мембранами фронтальной коры крыс (таблица 4). Наиболее эффективным оказался Met-Pro-Tyr-Phe-OMe; судя по значению ЕС50, его сродство к 5-НТ₂ рецепторам сравнимо со сродством спиперона.

Таблица 4
Влияние пептидов, относящихся к общей формуле , на специфическое связывание 3H-спиперона с мембранами стриатума и фронтальной коры крыс (% специфического связывания 3H-спиперона в присутствии соответствующих пептидов в концентрации 50 мкМ)
Пептид	Стриатум	Фронтальная кора
Met-Pro-Tyr-Phe	65*	0** EC50=650nM
Trp-Pro-Tyr-Phe	72*	83
Met-Pro-Tyr-Trp-OMe	100	0** EC50=50nM
Met-Pro-Tyr-Phe-OMe	0** EC50=4nM	0** EC50=lnM
Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro	52**	0** EC50=800nM
Сульпирид (10 мкМ)	50**
Кетансерин (50 мкМ)		50**
*-р<0.05, **- р<0.01 - достоверность отличия от 100%

Пример 7.

Радиорецепторное исследование взаимодействия пептидов общей формулы c 5-HT₂ рецепторами головного мозга в опытах in vitro.

Радиорецепторное исследование взаимодействия пептидов с 5-HT₂ рецепторами головного мозга в опытах in vitro проводили также с использованием селективного меченого лиганда 5-НТ₂-рецепторов - ³H-кетансерина. Для постановки радиорецепторного анализа (РРА) использовали плоскодонные платы «Linbro» (Великобритания), которые, как показано в контрольных экспериментах, не сорбируют применяемый в РРА ³H-кетансерин. Растворы готовили на 50 mM TRIS-HCl буфере, рН 7,5 (20°С).

Инкубационная смесь объемом 300 мкл при проведении анализа вытеснения содержала ³ H-кетансерин в концентрации 2 нМ, мембранную фракцию головного мозга крыс 0,3 мг-эквивалент белка/мл, 0,1 мг/мл аскорбиновой кислоты. Величину специфического связывания определяли по разности связывания ³H-кетансерина в отсутствие (общее связывание) и в присутствии (неспецифическое связывание) избытка (100 мкМ) кетансерина. Она составила в среднем 65-75% от общей величины связывания.

При проведении анализа взаимодействия синтетических пептидов, относящихся к общей формуле , с местами специфического связывания ³H-кетансерина реакционная смесь содержала ³H-кетансерин в концентрации 2 нМ, изучаемые пептиды в концентрации 0,001-100,0 мкМ, 10 мкМ паргилина, мембранную фракцию головного мозга крыс 0,25 мг-эквивалент белка/мл, 0,1 мг/мл аскорбиновой кислоты, бацитрацин в концентрации 50 мкг/мл.

Пробы инкубировали 40 минут при температуре 20°С с постоянным перемешиванием. Связавшуюся метку отделяли от несвязавшейся путем фильтрации под вакуумом на стекловолокнистых фильтрах GF/B «Whatman» (Великобритания), используя клеточный харвестр «Skatron» (Норвегия). При этом лунки промывали 4,5 мл охлажденного 50 mM TRIS-HC1 буфера, рН 7,5 (4°С). После высушивания на воздухе в течение ночи фильтры помещали в 6 мл сцинтиллятора ЖС-8, выдерживали в течение суток и определяли уровень радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике «MiniBeta» (LKB-Wallak, Финляндия). Эффективность счета составляла 25%.

Определение содержания белка в пробах проводили по методу Bradford M.M. (1996) с использованием набора фирмы «Sigma» (США) на спектрофотометре фирмы «Perkin-Elmer» 555 UV-VIS Spektrophotometr. Калибровочную кривую строили по бычьему сывороточному альбумину.

В результате радиорецепторного исследования доказана способность ряда исследованных пептидов, относящихся к общей формуле и, в частности, Met-Pro-Tyr-Trp-ОМе и Met-Pro-Tyr-Phe-OMe вытеснять ³H-кетансерин из 5-НТ_2а рецепторов фронтальной коры. ЕС50 для двух указанных пептидов составляет 90±7 нМ и 1,1±0,3 мкМ соответственно.

Пример 8.

Исследования Оланзапина (Зипрекса) (фирмы «Эли Лили») и тетрапептида Trp-Pro-Tyr-Phe, относящегося к общей формуле , по способности снижать гиперактивацию дофаминовой системы.

Исследование фармакологической активности соединений проводилось в опытах на животных с использованием стандартных методов, применяемых для скрининга нейротропных препаратов с нейролептической активностью, согласно методическим рекомендациям, утвержденным Фармакологическим комитетом МЗ РФ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М., 2005).

Проводили сравнение известного препарата Оланзапина (Зипрекса) (фирмы «Эли Лили») и тетрапептида Trp-Pro-Tyr-Phe по способности снижать гиперактивацию дофаминовой системы.

Тестирование проводили на белых беспородных мышах-самцах весом 22-25 г, помещенных в специальные цилиндрические камеры с проволочной стенкой. Исследуемые препарат Оланзапин и тетрапептид Trp-Pro-Tyr-Phe вводили внутрибрюшинно за 30 мин до начала тестирования в 0,2 мл физиологического раствора. Феномен вертикализации вызывали подкожной инъекцией апоморфина гидрохлорида (фирма «Sigma») в дозе 5 мг/кг за 10 минут до начала тестирования. Поведение животных исследовали на протяжении часа. Уровень вертикальной активности оценивали по 4-бальной шкале: число баллов соответствовало числу лапок мыши на проволочной стене камеры. По окончании эксперимента подсчитывали суммарный балл для каждого животного за все время наблюдения.

Результаты, выраженные в % от контроля, представлены на фиг.1.

В результате эксперимента показано, что как тетрапептид Trp-Pro-Tyr-Phe, так и оланзапин в широком диапазоне доз (0,01-10,0 мг/кг) достоверно снижает уровень вызванной апоморфином вертикализации. Подавляющий вертикализацию эффект препарата сравнения оланзапина в дозах 0,001-0,1 мг/кг проявляется в меньшей степени, чем эффект тетрапептида Trp-Pro-Tyr-Phe, но с повышением доз становится гораздо более выраженным. Вместе с тем при использовании антипсихотика оланзапина в дозах 1 и 10 мг/кг наблюдается гибель отдельных животных. Так при введении 10 мг/кг оланзапина гибнет около 30% мышей, что свидетельствует о недопустимости использования оланзапина в данной дозе. Таким образом, эффект тетрапептида Trp-Pro-Tyr-Phe достоверен в широком диапазоне доз. Выраженность его практически не изменяется в диапазоне 0,01-10,00 мг/кг и сопоставима с эффектом терапевтических доз оланзапина. Побочных эффектов, вызывающих гибель животных, у исследуемого тетрапептида Trp-Pro-Tyr-Phe не обнаружено.

В аналогичных условиях способность снижать гиперактивацию дофаминовой системы проявили еще пять пептидов, относящихся к общей формуле и представленных в таблице 5.

Таблица 5
Влияние исследуемых пептидов, относящихся к общей формуле , и оланзапина на выраженность вызванной апоморфином "вертикализации" (в процентах к контролю - апоморфина гидрохлорид)
Пептиды	Используемые дозы (мг/кг)
0,001	0,01	0,1	1,0	10,0
Tyr-Pro-Tyr-Phe	98,2	90,6	82,7**	82,6*	81,9*
Trp-Pro-Tyr-Phe	100,1	80,0*	79,1*	77,7**	75,5*
Met-Pro-Tyr-Trp-OMe	101,5	95,4	80,4*	80,3**	83,1*
Met-Pro-Tyr-Phe-OMe	99,8	91,4	80,0*	87,4	80,9*
Met-Pro-Tyr-Arg	98,1	93,1	87,7	86,8*	85,5*
Met-Pro-Tyr-Ala	98,1	98,5	89,3	88,3*	81,6*
Оланзапин	97,2	92,0	86,7*	67,9**	1,9***
* - p<0.05, ** - p<0.01, *** - p<0.001 - достоверность отличия от контроля

Пример 9.

Оценка влияния на дофаминергическую передачу в нигростриатной системе головного мозга тетрапептида Tyr-Pro-Tyr-Phe, относящегося к общей формуле , на поведенческие проявления гиперфункции дофаминовой системы в тесте «стереотипии».

Для оценки влияния на дофаминергическую передачу в нигростриатной системе головного мозга изучен эффект тетрапептида Tyr-Pro-Tyr-Phe, относящийся к общей формуле , на поведенческие проявления гиперфункции дофаминовой системы в тесте «стереотипии». Тестирование проводили на белых беспородных крысах-самцах весом 200-250 г. Характеристики экспериментальных животных и условия их содержания описаны в примере 6. Исследуемый тетрапептид Trp-Pro-Tyr-Phe вводили внутрибрюшинно за 30 мин до начала тестирования в 0,2 мл физиологического раствора. Феномен стереотипии вызывали подкожной инъекцией апоморфина гидрохлорида (фирма «Sigma») в дозе 0,75 мг/кг за 10 минут до начала тестирования. Поведение животных исследовали на протяжении часа. Оценивали выраженность стереотипных реакций - грызения, лизания, принюхивания по трехбалльной шкале оценки: 1 балл - отдельные стереотипные движения (например, непостоянные принюхивания); 2 - интенсивная непродолжительная стереотипия (в том числе лизание, грызение); 3 - постоянная интенсивная стереотипия. Учитывали также общую продолжительность стереотипного поведения.

Вышеуказанный тетрапептид Tyr-Pro-Tyr-Phe достоверно уменьшал число стереотипных движений, вызванных апоморфином, при использовании относительно малой дозы 0,01 мг/кг (62,8%, р<0,01).

Пример 10.

Влияние пептидов, относящихся к общей формуле , на поведенческие проявления гиперфункции серотониновой системы в тесте «встряхивания головой».

Изучено влияние пептидов общей формулы на поведенческие проявления гиперфункции серотониновой системы в тесте «встряхивания головой». Тестирование проводили на полученных из питомника РАМН «Крюково-Центральное» белых беспородных мышах-самцах весом 22-25 г. Исследуемые пептиды вводили внутрибрюшинно за 30 мин до начала тестирования в 0,2 мл физиологического раствора. Феномен встряхивания головой вызывали внутрибрюшинной инъекцией 5-гидрокситриптофана (фирма «Sigma») в дозе 300 мг/кг непосредственно перед началом тестирования. Поведение животных исследовали на протяжении часа. Уровень гиперактивности серотониновой системы оценивали по количеству встряхиваний головой.

В результате исследований показано, что тетрапептид Met-DPro-Tyr-Phe в дозах 0,01-1,0 мг/кг на 20-60% значимо снижает количество встряхиваний животного головой, вызванных инъекцией 5-гидрокситриптофана (5-НТР). Полученные результаты представлены на фигуре 2. Аналогичное серотонинблокирующее действие в тех же условиях оказывают ряд других пептидов, приведенных в таблице 6.

Таблица 6
Влияние исследуемых пептидов, относящихся к общей формуле , и оланзапина на выраженность вызванного 5-гидрокситриптофаном "встряхивания головой" (в процентах от контроля - 5-гидрокситриптофан)
Пептиды	Используемые дозы (мг/кг)
0,01	0,1	1,0
Met-Pro-Tyr-Phe	93,4	81,5	48,0**
Met-DPro-Tyr-Phe	80,7	66,7*	42,5***
Met-Pro-Tyr-Trp-OMe	72,8	61,9*	50,2**
Met-Pro-Tyr-Phe-OMe	75,4	69,5	48,3**
Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro	86,3	87,2	67,5*
Met-Pro-Tyr-Arg	78,7	67,6*	53,7**
Met-Pro-Tyr-Ala	70,4*	48,2**	36,5***
Оланзапин	56,8**	25,8***	3,1***
* - p<0.05, ** - p<0.01, *** - p<0.001 - достоверность отличия от контроля

Пример 11.

Исследование синтезированных пептидов, относящихся к общей формуле , в тесте «Ареколиновый тремор».

Для выявления центрального М-холинергического действия синтезированных пептидов, относящихся к общей формуле , исследовали их эффекты в тесте «Ареколиновый тремор».

Тестирование проводили на полученных из питомника РАМН «Крюково-Центральное» белых беспородных мышах-самцах весом 22-25 г. Исследуемые пептиды вводили внутрибрюшинно за 30 мин до начала тестирования в 0,2 мл физиологического раствора. Феномен тремора вызывали подкожным введением ареколина (фирма «Sigma») в дозе 25 мг/кг непосредственно перед началом тестирования. Поведение животных наблюдали на протяжении часа. Регистрировали латентный период, продолжительность и выраженность тремора (по локализации и амплитуде) в баллах: 0 - отсутствие, 1 - локальный мелкоамплитудный тремор головы, передних лап или хвоста, 2 - локальный среднеамплитудный тремор, 3 - генерализованный мелко- или среднеамплитудный тремор всего тела.

В результате показано, что тетрапептиды Trp-Pro-Tyr-Phe, Met-Pro-Tyr-Ala и Met-Pro-Tyr-Phe в дозе 1 мг/кг достоверно уменьшают выраженность и продолжительность вызванного ареколином тремора (р<0,05). Полученные результаты представлены в таблице 7. Таким образом, указанные пептиды, относящиеся к общей формуле , способны снижать поведенческие проявления гиперфункции холинергической системы.

Таблица 7
Влияние исследуемых пептидов, относящихся к общей формуле , на выраженность и продолжительность тремора, вызванного ареколином (в процентах от контроля - ареколин 25 мг/кг, п/к)
	Выраженность	Продолжительность
Дозы (мг/кг)	0,01	0,1	1	0,01	0,1	1
Met-Pro-Tyr-Phe	100	93	63**	102	88	78*
Trp-Pro-Tyr-Phe	101	97	68*	105	92	73*
Met-Pro-Tyr-Ala	100	90	68*	87	83	71*
* - р<0.05, ** - р<0.01 - достоверность отличия от 100%

Пример 12.

Для существующих в настоящее время антипсихотических препаратов характерно наличие отрицательных побочных эффектов: токсичность при высоких дозах, экстрапирамидные расстройства, нарушение обмена веществ и некоторых гормональных функций, ожирение, седация и некоторые другие. Поэтому в работе была исследована возможность развития подобных эффектов в результате введения изучаемых пептидов, относящихся к общей формуле .

Защищаемые данным патентом соединения являются фрагментами природных белков, поэтому не должны обладать острой и хронической токсичностью. Действительно, при использовании всех исследованных пептидов в дозах до 100 мг/кг гибели животных не наблюдалось.

Изучение побочных эффектов веществ в тесте удерживания на параллельных стенках в опытах на мышах.

Для оценки побочных экстрапирамидных нарушений, каталепсии, использовался тест удерживания на параллельных стенках (Т.А.Воронина и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2005. С.295-308; К.С.Раевский и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2005. С.230-244; С.Morpurgo, Minerva Anestesiol., 1964, v.30, p.417-458) в опытах на мышах. Критерием появления у животного каталепсии считалось удерживание на параллельных стенках в течение 2 минут.

Как видно из таблицы 8, галоперидол в малой терапевтической дозе 0,5 мг/кг вызывал у мышей выраженный каталептогенный эффект, который характеризовался удерживанием на параллельных стенках до 80% мышей. Пептиды общей формулы при внутрибрюшинном введении (внб) в дозе 10 мг/кг, в 10 раз превышающей терапевтическую, не вызывали у мышей каталепсию. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние пептидов общей формулы и галоперидола на показатель удерживания на параллельных стенках в течение 2 минут
Вещество	Количество животных	Дозы в мг/кг, внб	Количество животных с каталепсией (в %) через
30 мин	60 мин	90 мин	120 мин	150 мин	180 мин
Галоперидол	10	0,5	10	40	60	80	50	20
Trp-Pro-Tyr-Phe	10	10	0	0	0	0	0	0
Met-Pro-Tyr-Trp-OMe	10	10	0	0	0	0	0	0
Met-Pro-Tyr-Phe-OMe	10	10	0	0	0	0	0	0
Tyr-Pro-Tyr-Phe	10	10	0	0	0	0	0	0
Met-Pro-Tyr-Phe	10	10	0	0	0	0	0	0

Пример 13.

Радиорецепторное исследование взаимодействия пептидов, относящихся к общей формуле с 5-НТ_2с рецепторами головного мозга в опытах in vitro.

Известно, что 5-НТ_2с рецепторы являются одной из мишеней для действия атипичных антипсихотиков. При этом именно эти рецепторы опосредуют один из основных побочных эффектов антипсихотиков - патологическое ожирение.

Исследование проведено методом, незначительно модифицированным по сравнению с описанным в примерах 6 и 7. Радиорецепторный анализ (РРА) проводили с использованием селективного меченого лиганда 5-НТ_2с-рецепторов ³H-мезулергина (удельная активность 77 Ки/ммоль, фирма «Amersham»). Для постановки РРА использовали плоскодонные платы «Linbro» (Великобритания), которые, как показано в контрольных экспериментах, не сорбируют применяемый в РРА ³H-мезулергин. Растворы готовили на 50 mM TRIS-HCl буфере, рН 7,4 (20°С).

Инкубационная смесь объемом 300 мкл содержала ³H-мезулергин в концентрации 3 нМ, мембранную фракцию головного мозга крыс 0,25 мг-эквивалент белка/мл, 0,1 мг/мл аскорбиновой кислоты. Величину специфического связывания определяли по разности связывания ³H-мезулергина в отсутствие (общее связывание) и в присутствии (неспецифическое связывание) избытка (100 мкМ) оланзапина. Она составила в среднем 50-60 % от общей величины связывания.

При проведении анализа взаимодействия синтетических пептидов с местами специфического связывания ³H-мезулергина реакционная смесь содержала ³H-мезулергин в концентрации 3 нМ, исследуемые пептиды в концентрации 0,001-100,0 мкМ, паргилин (53 МЕ/мг) фирмы «Sigma» (США) в концентрации 10 мкМ, мембранную фракцию головного мозга крыс 0,25 мг-эквивалент белка/мл, 0,1 мг/мл аскорбиновой кислоты, бацитрацин (53 МЕ/мг) фирмы «Sigma» (США) в концентрации 50 мкг/мл.

В результате проведенного исследования доказано, что в отличие от препарата сравнения оланзапина, исследуемые пептиды в концентрациях до 10 мкМ не влияют на уровень специфического связывания ³ H-мезулергина. Результаты представлены в таблице 9. То есть исследуемые пептиды не могут вызвать побочные эффекты, связанные с патологическим ожирением и обусловленные взаимодействием с 5-НТ_2с рецепторами.

Таблица 9
Влияние пептидов, относящихся к общей формуле , на специфическое связывание 3H-мезулергина с мембранами фронтальной коры крыс (приведен % специфического связывания 3H-мезулергина в присутствии соответствующих пептидов в указанных концентрациях)
Пептид	10 нМ	100 нМ	1 мкМ	10 мкМ	100 мкМ
Met-Pro-Tyr-Phe	94	86	90	84	140*
Met-DPro-Tyr-Phe	-	94	98	99	98
Tyr-Pro-Tyr-Phe	-	96	92	108	94
Val-Pro-Tyr-Phe	-	104	102	100	99
Trp-Pro-Tyr-Phe	-	95	98	97	94
Met-Pro-Tyr-Trp-OMe	90	110	115	108	79*
Met-Pro-Tyr-Phe-OMe	108	109	122	107	68*
Met-Pro-Tyr-Pro-Gly-Pro	-	95	85	87	84
Met-Pro-Tyr-Arg	-	80	104	104	93
Оланзапин	72*	54**	30**	0**	0**
* - p<0,05 - достоверность отличия от 100%

Пример 14.

Сравнительное исследование хронического введения атипичного антипсихотика оланзапина и тетрапептида Met-Pro-Tyr-Trp-OMe, относящегося к общей формуле , на вес беспородных белых мышей самцов.

Проведено сравнительное исследование хронического введения атипичного антипсихотика оланзапина и тетрапептида Met-Pro-Tyr-Trp-OMe на вес беспородных белых мышей самцов. Количество животных в каждой из экспериментальных и контрольных групп 12 штук. В результате введения оланзапина (1 мг/кг внутрибрюшинно, один раз в день на протяжении 30 дней) наблюдалось достоверное (на 6%, р<0,05) повышение массы крыс по сравнению с массой как интактных, так и контрольных животных (введение физраствора). Вместе с тем введение тетрапептида Met-Pro-Tyr-Trp-OMe в той же дозе и в том же режиме не приводило к изменению веса животных по сравнению с весом крыс контрольной и интактной групп. Таким образом, хроническое введение тетрапептида Met-Pro-Tyr-Trp-OMe в эксперименте не приводит к ожирению.

Никаких других отрицательных побочных эффектов типа смертности, заболеваемости, необычных форм поведения ни в одной из исследованных групп животных обнаружено не было.

Пример 15.

Сравнительный анализ влияния острого и хронического введения Met-Pro-Tyr-Trp-OMe, относящегося к общей формуле , и оланзапина на поведение мышей в «открытом поле».

В вышеупомянутом эксперименте по влиянию хронического введения Met-Pro-Tyr-Trp-OMe и оланзапина на массу белых беспородных мышей-самцов было изучено их поведение в «открытом поле» после первой инъекции препаратов и по завершении курса инъекций.

В результате исследования было обнаружено, что стресс от инъекций физраствора (как острых, так и хронических) вызывает у мышей этой популяции реакцию замирания, выражающуюся в снижении горизонтальной двигательной активности (фиг.3). На этом фоне оланзапин в малых дозах (до 0,1 мг/кг) не влияет, а в дозе 1 мг/кг усиливает эту реакцию и/или вызывает дополнительную седацию. Пептид в обеих дозах как при остром, так и при хроническом введении нормализует горизонтальную двигательную активность до уровня таковой у интактных животных. Горизонтальная двигательная активность мышей, получавших пептид, во всех случаях была выше, чем у мышей, получавших ту же дозу оланзапина.

Вертикальная двигательная активность животных не изменялась под влиянием инъекций физраствора (фиг.4). На этом фоне оланзапин в дозе 1 мг/кг практически полностью подавлял этот вид активности у мышей как при остром, так и при хроническом введении. Напротив, количество стоек, осуществляемых животными в «открытом поле», после введения им Met-Pro-Tyr-Trp-OMe, возрастало в 1,5 раза. Если рассматривать вертикальную двигательную активность животных в «открытом поле», как отображение их исследовательской активности, можно утверждать, что Рrо-Tyr-содержащие пептиды, в отличие от известных антипсихотиков, могут оказывать положительное влияние на когнитивные функции больного, обладать ноотропным действием.

Приведенные данные радиорецепторного анализа и поведенческих исследований дают основание рассматривать некоторые из синтезированных пептидов, относящихся к общей формуле , в качестве средства, обладающего антипсихотической активностью, и перспективных для создания на их основе новых лекарственных препаратов с антипсихотической активностью, способных редуцировать позитивную и негативную симптоматику шизофрении и других психозов.