синтез и способы применения производных пироглутаминовой кислоты

Формула изобретения

1. Способ получения, по существу, чистого стереоизомера соединения формулы I



в которой R₁ выбран из -ОН, -ORa, где Ra выбран из незамещенного С_1-8алкила;

R₂ представляет собой водород или -(O=)C-O-Ra, где Ra представляет незамещенный С_1-8алкил;

R ₃ и R₄ представляют собой водород;

X представляет собой фармацевтически приемлемый анион, такой как Br или Cl; a

Y является N-содержащей группой формулы VIa



в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует незамещенный 6-членный гетероарил, а X определен выше,

который включает:

а) взаимодействие соединения формулы IV в форме R- или S-изомера



в которой R₁ и R₂ определены выше;

с соединением формулы V



в которой R₄ представляет собой -(O=)S-(=O)-Ra, где Ra представляет собой толил;

в присутствии катализатора, выбранного из группы, включающей Cu(ft)₂ , где "ft" представляет собой фталоцианин, и Cu(асас) ₂, где "асас" представляет собой ацетоацетат,

с получением смеси стереоизомеров соединения формулы III



в которой R₁ выбран из -ОН, -ORa, где Ra выбран из незамещенного C_1-8алкила,

R₂ представляет водород или -(O=)C-O-Ra, где Ra представляет незамещенный С_1-8алкил, и

R₄ представляет собой -(O=)S-(=O)-Ra, где Ra представляет собой толил;

с последующим разделением стереомеров посредством хроматографии;

b) превращение указанного чистого стереоизомера соединения формулы III с азотсодержащим нуклеофилом формулы VIIIa



в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует незамещенный 6-членный гетероарил, в чистый стереоизомер соединения формулы II



в которой R₁, R₂ и R ₄ определены выше;

R₅ представляет отрицательный заряд; и

Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIa



в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует незамещенный 6-членный гетероарил;

с) взаимодействие указанного, по существу, чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей с кислотными средами, включающими кислоту формулы НХ, в которой X определен выше, с получением указанного чистого стереоизомера соединения формулы I или их смесей.

2. Способ по п.1, где соединение формулы IV представляет собой 1-трет-бутиловый 2-этиловый эфир 5R-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты или 1-трет-бутиловый 2-этиловый эфир 5S-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты.

3. Способ по п.1, где соединение формулы V представляет собой N-тозилиминобензилиодинан.

4. Способ по п.1, где указанное соединение формулы III находится в форме, по существу, чистого стереоизомера (3R,5R), (3S,5S), (3R,5S) или (3S,5R).

5. Способ по п.1, где указанный азотсодержащий нуклеофил формулы VIIIa представляет собой пиридин формулы IX



в которой n равно 0.

6. Способ по п.1, где превращение соединения формулы III в соединение формулы II проводят при нагревании, предпочтительно с помощью микроволн.

7. Способ по п.1, где кислота формулы НХ является неорганической кислотой, предпочтительно HCl или HBr.

8. Соединение формулы I, выбранное из группы, состоящей из

а) чистого соединения формулы Ia



в которой R₁ представляет собой -ОН;

R₂, R₃ и R₄ представляют собой водород;

X представляет собой фармацевтически приемлемый анион, такой как Br;

и

Y является N-содержащей группой формулы VIa



в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует незамещенный 6-членный гетероарил; X определен выше;

b) чистого соединения формулы Ib



в которой R₁, R₂, R ₃, R₄, X и Y определены выше;

с) чистого соединения формулы Ic



в которой R₁, R₂, R ₃, R₄, X и Y определены выше;

d) чистого соединения формулы Id



в которой R₁, R₂, R ₃, R₄, X и Y определены выше; и

е) любой смеси вышеуказанных чистых соединений формулы Ia, Ib, Ic и/или Id в любом молярном соотношении, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера,

(i) гидрохлорида 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида.

9. Соединение по п.8, выбранное из группы, состоящей из соединения формулы I а



в которой R₁, R₂ определены выше; и n=0;

соединения формулы I b



в которой R₁, R₂ определены выше; и n=0;

соединения формулы I с



в которой R₁, R₂ определены выше; и n=0;

соединения формулы I d



в которой R₁, R₂ определены выше; и n=0; и

их смесей.

10. Соединение по п.8, выбранное из группы, состоящей из гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида;

гидробромида 3R,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида;

гидробромида 3R,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида; и

гидробромида 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида.

11. Фармацевтическая композиция, ингибирующая рост опухоли или усиливающая иммунный ответ, включающая соединение, определенное по любому из пп.8-10, а также фармацевтически приемлемый носитель.

12. Соединение формулы II, выбранное из группы, состоящей из

а) чистого соединения формулы IIa



в которой R₁ представляет собой -ORa, где Ra представляет собой незамещенный С_1-8алкил;

R₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, где Ra представляет незамещенный С_1-8алкил, и

R₄ представляет собой -(O=)S-(=O)-Ra, где Ra представляет собой толил;

R₅ представляет собой отрицательный заряд;

Y является N-содержащей группой формулы VIIa



в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует незамещенный 6-членный гетероарил;

b) чистого соединения формулы IIb



в которой R₁, R₂, R ₄, R₅ и Y определены выше;

с) чистого соединения формулы IIc



в которой R₁, R₂, R ₄, R₅ и Y определены выше; и

d) чистого соединения формулы IId



в которой R₁, R₂, R ₄, R₅ и Y определены выше; и

е) любой смеси вышеуказанных чистых соединений формулы IIa, IIb, IIc и/или IId в любом молярном соотношении.

13. Соединение по п.12, где R₁ представляет собой -ORa, где Ra представляет собой незамещенную С_1-8алкильную группу;

R ₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, предпочтительно ВОС-группу;

R₄ представляет собой -(O=)S(=O)-Ra, предпочтительно тозил.

14. Соединение формулы III, выбранное из группы, состоящей из

а) чистого соединения формулы IIIa



в которой R₁ представляет собой -ORa, где Ra представляет собой незамещенный С_1-8алкил;

R₂ представляет -(O=)C-O-Ra, где Ra представляет незамещенный С_1-8алкил, и

R₄ представляет собой -(O=)S-(=O)-Ra, где Ra представляет собой толил;

b) соединения формулы IIIb



в которой R₁, R₂ и R ₄ определены выше;

с) соединения формулы IIIc



в которой R₁, R₂ и R ₄ определены выше;

d) соединения формулы IIId



в которой R₁, R₂ и R ₄ определены выше; и

е) смесь IIIa и IIIb или IIIc и IIId.

15. Способ получения соединения формулы I по п.8, включающий взаимодействие соединения формулы II по п.12 с кислотной средой, включающей кислоту формулы НХ, где X представляет собой фармацевтически приемлемый анион.

16. Применение соединения по любому из пп.8-10 для получения фармацевтической композиции, направленной на усиление иммунного ответа у субъекта, или для получения противоопухолевой фармацевтической композиции, или для получения фармацевтической композиции для лечения аутоиммунного заболевания.

17. Применение по п.16 для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака.

18. Применение по любому из пп.16 и 17 для получения фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, мастоцитомы, рака легких и рака почек.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому синтезу производных пироглутаминовой кислоты, их выделенным оптически активным стереоизомерам и их смесям, а также к способам их применения и к новым промежуточным соединениям для их синтеза. Настоящее изобретение также относится к применению в терапевтических целях указанных производных пироглутаминовой кислоты, их оптически активных стереоизомеров и их смесей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В европейском патенте ЕР 0768308 В1 описаны смеси стереоизомеров производных пироглутаминовой кислоты, предназначенные для стимуляции иммунного биологического ответа, имеющие следующую общую формулу:

в которой R₁, R₂ и R₃ могут являться водородом или -C(=О)Ме, а A может являться Cl-, CH₃COO- или HO-. Описанный в данном патенте способ получения указанных соединений включает взаимодействие L-серина с молярным избытком уксусного ангидрида и пиридина при высокой температуре. Таким образом, как описано в указанном документе, различные стереоизомеры никогда не выделялись, а описанные в данном патенте анализы in vivo и in vitro проводили со смесями, включающими все четыре возможных оптически активных стереоизомера вместе. Не было описано какого-либо признака относительно чистых или обогащенных смесей индивидуальных стереоизомеров. Кроме того, не приводили какого-либо признака относительно выделения различных оптически активных стереоизомеров из описанной смеси.

Квалифицированному специалисту известно, что различные оптически активные стереоизомеры соединения могут обладать различными или даже противоположными эффектами. Например, соединение может обладать терапевтическими эффектами, в то время как его энантиомер может быть токсичным. Примеры таких случаев известны квалифицированному специалисту. Декстрометорфан является противоотечным средством, тогда как левометорфан представляет собой сильнодействующий наркотик.

Декстрометорфан

Левометорфан

Также известно различное действие энантиомеров пергексилина in vivo.

S-Пергексилин	R-Пергексилин

Оба вещества являются модуляторами сердечного ритма, однако один из энантиомеров метаболизируется более медленно и накапливается в организме, что вызвало множество смертельных случаев в 80-е годы.

Вероятно, наиболее трагичным и известным примером является талидомид, который вводили в форме рацемической смеси беременным женщинам для снятия утреннего недомогания.

S-талидомид	R-талидомид

В то время как R-талидомид был эффективен, тератогенный эффект S-талидомида был обнаружен позже.

Поэтому при поиске новых соединений с ценными терапевтическими свойствами обычно нужно проводить испытание с использованием энантиомерно чистых стереоизомеров, чтобы выбрать наиболее активные энантиомеры и/или отказаться от потенциально токсичных. Таким образом, существует потребность в обеспечении выделенных стереоизомеров производных пироглутаминовой кислоты.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения производных пироглутаминовой кислоты, их оптически активных стереоизомеров и их смесей. Способ включает использование оптически активного стереоизомера-предшественника производного пироглутаминовой кислоты, который может быть легко выделен и впоследствии изменен с получением требуемого оптически активного стереоизомера.

В частности, авторы настоящего изобретения предложили синтез, в котором различные промежуточные соединения выделяют, в случае необходимости, с требуемой стереохимией. Указанные промежуточные продукты могут быть дополнительно изменены с целью получения требуемого производного пироглутаминовой кислоты в форме требуемого по существу чистого стереоизомера либо в форме смеси стереоизомеров. Авторы настоящего изобретения исходят из энантиомерно чистого соединения формулы IV, получая затем диастереомерные промежуточные соединения и конечные продукты, которые могут быть легко выделены и очищены. Используя соединение формулы IV с требуемой стереохимией можно получить промежуточные соединения в форме по существу чистых стереоизомеров или в форме смеси стереоизомеров. Указанное соединение формулы IV может быть синтезировано с использованием энантиомерно чистой глутаминовой кислоты.

Таким образом, согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по существу чистого стереоизомера соединения формулы I или их смесей, который включает реакцию соединения формулы IV и соединения формулы V с получением по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смесей; превращение указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смесей в по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси; и, наконец, взаимодействие указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей с соединением формулы HX, в результате чего получают требуемое производное пироглутаминовой кислоты формулы I в виде по существу чистого стереоизомера или их смеси.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к по существу чистому стереоизомеру соединения формулы I (то есть Ia, Ib, Ic или Id). Некоторые композиции, включающие смеси по существу чистых стереоизомеров соединения формулы Ia, Ib, Ic и/или Id, составляют следующий аспект настоящего изобретения, например композиция, включающая стереоизомеры формулы Ia, Ib, Ic и/или Id, при условии, что указанная композиция не содержит одновременно смеси всех четырех стереоизомеров следующих соединений:

(i) гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида или

(ii) гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к по существу чистому стереоизомеру соединения формулы III или их смесям. Способ получения указанного соединения составляет дополнительный аспект настоящего изобретения.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу получения по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или по существу чистого стереоизомера указанного соединения формулы I. По существу чистый стереоизомер соединения формулы II (то есть IIа, IIb, IIc или IId) составляет дополнительный аспект настоящего изобретения. Некоторые композиции, включающие смеси по существу чистых стереоизомеров формулы IIа, IIb, IIc и/или Iid, также составляют следующий аспект настоящего изобретения.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к некоторым фармацевтическим композициям, включающим соединение, выбранное из группы соединений формулы Ia, Ib, Ic, Id и их смесей, а также фармацевтически приемлемый наполнитель.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к применению соединения, выбранного из группы соединений формулы Ia, Ib, Ic, Id и некоторых из их смесей, в получении композиции для профилактики или лечения опухолей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлен график, показывающий ингибирующий эффект изомеров (1-4), оцененный по росту опухолевых клеток Renca по сравнению с плацебо (P.S.) [пример 6], выраженный в средних значениях площади поверхности опухолей.

На фиг. 2 представлен график, показывающий ингибирующий эффект изомеров (1-4), оцененный по росту опухолевых клеток Renca по сравнению с плацебо (P.S.) [пример 6], выраженный в средних значениях объема опухолей.

На фиг. 3 представлен график, показывающий ингибирующий эффект изомеров (1-4), оцененный по росту опухолевых клеток Renca по сравнению с плацебо (P.S.) [пример 6], выраженный в средних значениях площади поверхности опухолей.

На фиг. 4 представлен график, показывающий ингибирующий эффект изомеров (1-4), оцененный по росту опухолевых клеток Renca по сравнению с плацебо (P.S.) [пример 6], выраженный в средних значениях объема опухолей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В целях облегчения понимания настоящего изобретения значения некоторых понятий и выражений, используемых в контексте изобретения, включены в настоящее описание.

"Алкил" относится к радикалу c линейной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему из атомов углерода и водорода, не содержащему какой-либо ненасыщенности, содержащему 1-12, предпочтительно от одного до восьми атомов углерода и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил и т.д. Алкильные радикалы необязательно могут быть замещены одним или более заместителями, такими как галоген, гидрокси, алкокси, O-пропил, O-бензил, О-бензоат, карбокси, циано, карбонил, ацил, алкоксикарбонил, амино, имино, нитро, меркапто и алкилтио.

"Алкенил" относится к радикалу c линейной или разветвленной углеводородной цепью, состоящему из атомов углерода и водорода, содержащему, по меньшей мере, одну ненасыщенную связь, содержащему 1-12, предпочтительно от одного до восьми атомов углерода и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил и т.д. Алкильные радикалы необязательно могут быть замещены одним или более заместителями, такими как галоген, гидрокси, алкокси, O-пропил, O-бензил, О-бензоат, карбокси, циано, карбонил, ацил, алкоксикарбонил, амино, имино, нитро, меркапто и алкилтио.

"Алкокси" относится к радикалу формулы O-алкил, где алкил определен выше, например метокси, этокси, пропокси и т.д.

"Арил" относится к ароматическому углеводородному радикалу, такому как фенил, нафтил или антрацил. Арилзамещенный радикал необязательно может быть замещен одним или более заместителями, такими как гидрокси, меркапто, галоген, алкил, фенил, алкокси, галогеналкил, нитро, циано, диалкиламино, аминоалкил, ацил и алкоксикарбонил, определенными в настоящем описании.

"Арилокси" относится к радикалу формулы -О-арил, где арил был определен выше. Некоторыми примерами арилоксисоединений являются -О-фенил, -O-п-толил, -O-м-толил, -O-o-толил или -O-нафтил.

"Амино" относится к радикалу формулы -NH₂ , -NHRa, -NRaRb, где Rа и Rb независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкенила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного аралкила или замещенного или незамещенного гетероциклила; или Rа и Rb вместе образуют замещенный или незамещенный гетероцикл, замещенный или незамещенный циклоалкил или замещенный или незамещенный циклоалкенил.

"Аралкил" относится к арилзамещенной группе, связанной с алкильной группой, такой как бензил и фенетил.

"Карбоксиэфир" относится к -CO₂Ra, где Rа выбран из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкенила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного аралкила или замещенного или незамещенного гетероциклила.

"Циклоалкил" относится к насыщенному карбоциклическому кольцу, содержащему от 3 до 8 атомов углерода.

"Циклоалкенил" относится к карбоциклическому кольцу, содержащему от 3 до 8 атомов углерода и, по меньшей мере, одну ненасыщенную связь.

"Гетероциклил" относится к стабильному 3-15-членному кольцу, которое состоит из атомов углерода и одного-пяти гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, предпочтительно 4-8-членному кольцу с одним или более гетероатомами, более предпочтительно 5- или 6-членному кольцу с одним или более гетероатомами. В соответствии с целями настоящего изобретения гетероцикл может быть моноциклической, бициклической или трициклической кольцевой системой, которая может включать конденсированные кольцевые системы; при этом атомы азота, углерода или серы в гетероциклическом радикале могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно четвертичным; а гетероциклический радикал может быть частично или полностью насыщенным или ароматическим. Примеры соответствующих гетероциклов включают, помимо прочих, азепины, бензимидазол, бензотиазол, фуран, изотиазол, имидазол, индол, пиперидин, пиперазин, пурин, хинолин, тиадиазол, тетрагидрофуран.

"Гетероарил" относится к гетероциклической группе, в которой, по меньшей мере, одно из колец является ароматическим кольцом.

"Защитная группа" относится к группе, которая блокирует органическую функциональную группу и может быть удалена в контролируемых условиях. Защитные группы, их относительная реакционная способность и условия, в которых они остаются инертными, известны квалифицированному специалисту. В данной связи приведена ссылка на Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.

Ссылки, приведенные в настоящем описании по поводу замещенных групп в соединениях настоящего изобретения, относятся к определенной молекуле, которая может быть замещена по одному или нескольким доступным положениям одним или несколькими подходящими группами, например галогеном, таким как фтор, хлор, бром и йод; циано; гидроксил; нитро; азидо; алканоилом, таким как C₁-C₆ алканоильная группа, такая как ацил и т.п.; карбоксамидо; алкильными группами, включая группы, содержащие от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода, а более предпочтительно 1-3 атома углерода; алкенильными и алкинильными группами, включая группы, содержащие одну или более ненасыщенных связей и от 2 до приблизительно 12 атомов углерода или от 2 до приблизительно 6 атомов углерода; алкоксигруппами, содержащими одну или более кислородных связей и от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода; арилоксигруппами, такими как феноксигруппы; алкилтиогруппами, включая группы, содержащие одну или более тиоэфирных связей и от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода; алкилсульфинильными группами, включая группы, содержащие одну или более сульфинильных связей и от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода; алкилсульфонильными группами, включая группы, содержащие одну или более сульфонильных связей и от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода; аминоалкильными группами, такими как группы, содержащие один или более атомов N и от 1 до приблизительно 12 атомов углерода или от 1 до приблизительно 6 атомов углерода; карбоциклическим арилом, содержащим 6 или более атомов углерода, в частности фенилом или нафтилом и аралкилом, таким как бензил. Если не указано иное, необязательно замещенная группа может иметь заместитель в каждом замещаемом положении группы, причем каждая замена независима от другой.

Понятие "фармацевтически приемлемый анион" относится к любому аниону, который способен образовывать фармацевтически приемлемую соль в присутствии соответствующего противоположно заряженного катиона. Примеры фармацевтически приемлемых анионов включают Cl^-, Br^-, I^- , F^-, SO₄ ^2-, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, анион яблочной кислоты, анион миндальной кислоты, метансульфонат, п-толуолсульфонат и т.д. Другие примеры фармацевтически приемлемых анионов могут быть известны квалифицированному специалисту.

Понятие "фармацевтически приемлемые соли" относится к любой фармацевтически приемлемой соли, которая при введении реципиенту способна к образованию (прямому или косвенному) соединения, описанного в настоящем документе. Однако следует понимать, что фармацевтически неприемлемые соли также включены в объем изобретения, так как могут использоваться при получении фармацевтически приемлемых солей. Получение солей может быть осуществлено способами, известными в уровне техники.

Например, фармацевтически приемлемыми солями соединений, приведенных в настоящем описании, могут являться соли присоединения кислот, соли присоединения основания или соли металлов, а также они могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основную или кислую группу, обычными химическими способами. Обычно такие соли получают, например, путем взаимодействия свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в смеси обоих. Обычно предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Примеры солей присоединения кислот включают соли присоединения минеральных кислот, такие как, например, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат, фосфат, а также соли присоединения органических кислот, такие как, например, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, соль яблочной кислоты, соль миндальной кислоты, метансульфонат и п-толуолсульфонат. Примеры солей присоединения оснований включают неорганические соли, такие как, например, аммониевые, а также органические основные соли, такие как, например, этилендиамин, этаноламин, N,N-диалкиленэтаноламин, триэтаноламин, глюкамин и основные соли аминокислот. Примеры солей металлов включают, например, соли натрия, калия, кальция, магния, алюминия и лития.

Термин "Энантиомерно обогащенный" применяется к смеси энантиомеров, которая относится к смеси энантиомеров соединения, в котором один из энантиомеров присутствует в большем количестве, чем другой энантиомер. Таким образом, энантиомерно обогащенные смеси имеют энантиомерный избыток больше 0% по отношению к одному из энантиомеров смеси, предпочтительно больше 20%, предпочтительно больше 40%, предпочтительно больше 70%, более предпочтительно больше 80%, более предпочтительно больше 90% и более предпочтительно больше 95%.

"Энантиомерно чистое" соединение можно рассматривать как смесь двух энантиомеров, имеющих энантиомерный избыток больше 95%, предпочтительно больше 98%, более предпочтительно больше 99%, более предпочтительно больше 99,5%.

"По существу чистое" соединение в настоящей заявке на патент можно отнести к соединению, имеющему чистоту выше 95%, предпочтительно выше 98%, более предпочтительно выше 99%, более предпочтительно выше 99,5%.

"Стереоизомер" в настоящей заявке на патент можно отнести к соединениям, состоящим из тех же атомов и связанным той же последовательностью связей, но имеющим различные пространственные структуры, которые не являются эквивалентными.

"Азотсодержащий нуклеофил" относится к молекуле, содержащей, по меньшей мере, один атом азота, по меньшей мере, с одной свободной парой электронов, причем указанная пара электронов способна к образованию связи с электрофильной (электронодефицитной) группой другой молекулы или внутри одной и той же молекулы. Примеры азота, содержащего нуклеофилы - первичные, вторичные или третичные амины, незамещенные атомы азота, являющиеся частью гетероцикла, даже атом азота амидной группы, при некоторых обстоятельствах, может взаимодействовать как нуклеофил.

В ЕР 0768308 В1 описано получение смесей стереоизомеров производных пироглутаминовой кислоты.

Все попытки разделения смеси стереоизомеров, описанных в ЕР 0768308 В1, с выделением по существу чистых соединений оказались неудачными. Следуя экспериментальной части указанного изобретения, 5% соединения, идентифицированного в вышеуказанном европейском патенте как BLAS-236(Cl) (гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида)

BLAS-236(Cl)

было получено в виде смеси всех четырех возможных стереоизомеров.

Кроме того, его непосредственный предшественник BLAS-320(Ac) (ацетат 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния)

BLAS-320(Ac)

синтезировали с использованием различных методик. Соединение формулы BLAS-320(Ac) было получено в виде смеси стереоизомеров, которую невозможно очистить, главным образом из-за трудностей, связанных с растворимостью (соединение BLAS-320(Ac) растворялось только в воде и метаноле).

Более того, в соединении формулы BLAS-320(Ac) пробовали заменить противоион ацетат другими анионами, но неудачно. Кроме того, пытались преобразовать (или прямой синтез) и далее очистить соединение формулы BLAS-320(Ac) в его сложноэфирное производное. Во всех случаях полученные неочищенные смеси было невозможно очистить.

Ввиду вышеизложенных фактов было понято, что описание ЕР 0768308 В1 было недостаточным для получения требуемых по существу чистых стереоизомеров производных пироглутаминовой кислоты, описанных в указанном документе. Поэтому был разработан совершенно иной метод.

Синтез по существу чистых стереоизомеров соединения формулы I и их смесей

В одном из аспектов изобретение относится к способу, в дальнейшем называемому способ получения по существу чистого стереоизомера соединения формулы I:

в которой

R₁ выбран из -ОН, -ORa, где Ra выбран из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкенила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного аралкила или замещенного или незамещенного гетероциклила;

R₂, R₃ и R₄ независимо выбраны из водорода, защитной группы азота, которая гидролизуется в кислых условиях или фталамидом;

X представляет собой фармацевтически приемлемый анион; и

Y представляет собой органический остаток, выбранный из

(i) N-содержащей группы формулы VIa

в которой

пунктирная линия вместе с атомом азота образует замещенный или незамещенный гетероарил и

X определен выше; или

(ii) N-содержащей группы формулы VIb

в которой

X определен выше; и

Rа и Rb независимо выбраны из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного циклоалкенила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного аралкила или замещенного или незамещенного гетероциклила; или

Rа и Rb вместе с атомом азота, с которым они соединены, образуют замещенный или незамещенный гетероцикл;

или их смесей;

который включает

a) взаимодействие энантиомерно чистого соединения формулы IV

в которой R₁ и R₂ определены выше;

или их смесей;

с соединением формулы V

в которой R₄ определен выше;

с получением по существу чистого стереоизомера соединения формулы III,

в которой R₁, R₂ и R₄ определены выше;

или их смесей;

b) превращение указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смеси в по существу чистый стереоизомер соединения формулы II

в которой

R₁ , R₂ и R₄ определены выше;

R₅ выбран из отрицательного заряда или R₃ , где R₃ определен выше; и

Y представляет собой N-содержащий органический остаток, выбранный из

(i) когда R₅ является отрицательным зарядом, Y представляет собой N-содержащий органический остаток формулы VIIa

в которой

пунктирная линия вместе с атомом азота образует замещенный или незамещенный гетероарил; или

(ii) когда R₅ представляет собой R₃, Y представляет собой N-содержащий органический остаток, выбранный из

(ii.a) N-содержащей группы формулы VIIb

в которой Ra и Rb определены выше; или

(ii.b) N-содержащий органический остаток формулы VIIc

в которой

пунктирная линия вместе с атомом азота образует замещенный или незамещенный гетероарил; и

Z представляет собой фармацевтически приемлемый анион;

или их смесей; и

c) взаимодействие указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей с кислотными средами, включающими кислоту формулы HX, в которой X определен так же, как и выше, с получением указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы I или их смесей.

Роль защитных групп азота, которые гидролизуются в кислых условиях (R₂ , R₃ и/или R₄), состоит в защите функциональности азота до стадии c) (превращения соединений формулы II в соединения формулы I путем взаимодействия указанного соединения формулы II с соединением формулы HX). Любая защитная группа азота, которая может защитить атом азота до стадии c), подходит для настоящего изобретения. Предпочтительные защитные группы азота, которые гидролизуются в кислых условиях, включают группы, которые могут гидролизоваться в ходе стадии c) с одновременным образованием соли или двойной соли, в результате чего получают соединение формулы I. Таким образом, в ходе стадии c) с атомов азота в молекуле снимается защита, и соль или двойная соль образуется в одной стадии синтеза. Однако согласно настоящему изобретению образование соли или двойной соли одновременно со снятием защиты с атомов азота не является существенным. Поэтому согласно варианту осуществления изобретения образование соли или двойной соли и снятие защиты с атомов азота могут потребовать более одной стадии.

Согласно предпочтительному варианту осуществления группы защиты азота, которые гидролизуются в кислых условиях, выбраны из карбаматов формулы -(O=)C-O-Ra, в которой Ra имеет то же значение, как и выше, в которой Ra предпочтительно представляет собой бензил, -C(CH₃)₃ или -CH₂CH₃ ; или сульфонат формулы -(O=)S(=O)-Ra, в которой Ra имеет то же значение, как и выше, в которой предпочтительно Ra представляет собой -CH₃ или тозилат.

Другие защитные группы, которые гидролизуются в кислых условиях, известны квалифицированному специалисту; см. справочники, такие как Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.

Когда, по меньшей мере, один из R₂, R₃ и R₄ представляет собой фталамид, перед образованием соли или двойной соли необходимо провести дополнительную стадию (перед стадией c)), включающую восстановление или реакцию с гидразином (для более подробной информации по поводу удаления фталамидной группы см. Greene and Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999).

Исходное соединение формулы IV способа настоящего изобретения может находиться в форме энантиомерно чистого соединения (т.е. R или S) или в форме смеси энантиомеров (R и S), необязательно обогащенной одним из них. Используемое в настоящем описании понятие "смесь энантиомеров" включает любую смесь двух энантиомеров, в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, а также включает не только рацемические смеси указанных двух энантиомеров, но и смеси, обогащенные любым из указанных энантиомеров.

Когда соединение формулы IV находится в форме энантиомерно чистого соединения, вышеуказанная реакция может привести к получению двух продуктов (стереоизомеров), один из которых соответствует атаке с -плоскости, а другой соответствует атаке с -плоскости. В данном случае реакция показывает низкую стереоселективность, при этом из каждого энантиомера соединения формулы IV получают смесь двух возможных соединений (стереоизомеров).

Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления соединение формулы IV находится в форме энантиомерно чистого соединения. Если в качестве исходного вещества используется S-изомер соединения формулы IV, в реакции образуется в основном смесь соединения формулы IIIa:

в которой R₁, R₂ и R₄ определены выше; и

соединения формулы IIIb:

в которой R₁, R₂ и R₄ определены выше.

Итак, когда используемый изомер соединения формулы IV представляет собой S-стереоизомер, в итоге обычно будет образовываться соединение формулы III в форме смеси соответствующих стереоизомеров формулы IIIa и IIIb. В случае необходимости указанное соединение формулы III в форме указанной смеси стереоизомеров может быть выделено обычными способами (например, на силикагеле, путем перекристаллизации и т.д.) с получением смеси IIIa и IIIb в эквимолярном или неэквимолярном соотношении. В качестве альтернативы, если необходимо, указанную смесь стереоизомеров формулы IIIa и IIIb можно обработать с помощью стандартных методов (например, с помощью перекристаллизации, хроматографии и т.д.) с разделением каждого стереоизомера и получением стереоизомеров формулы IIIa и IIIb в виде энантиомерно чистых соединений.

Кроме того, если в качестве исходного вещества используется R-изомер соединения формулы IV, в реакции образуется в основном смесь соединения формулы IIIc:

в которой R₁, R₂ и R₄ определены выше;

и соединения формулы IIId:

в которой R₁, R₂ и R₄ определены выше.

Итак, когда используемый изомер соединения формулы IV представляет собой R-стереоизомер, в итоге обычно будет образовываться соединение формулы III в форме смеси соответствующих стереоизомеров формулы IIIc и IIId. Как упомянуто выше, в случае необходимости указанное соединение формулы III в форме указанной смеси стереоизомеров может быть выделено обычными способами с получением смеси IIIc и IIId в эквимолярном или неэквимолярном соотношении, или, в качестве альтернативы, указанную смесь стереоизомеров можно обработать с помощью стандартных методов с разделением каждого стереоизомера и получением стереоизомеров формулы IIIc и IIId в виде энантиомерно чистых соединений.

Хотя это и может показаться недостатком, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения в смеси, получаемой в итоге из реакции соединения формулы IV с соединением формулы V, могут быть легко разделены на соответствующие по существу чистые стереоизомеры соединения формулы III, т.е. IIIa, IIIb, IIIc или IIId. Это позволяет осуществить синтез по существу чистых стереоизомеров соединения формулы I, что является одним из аспектов настоящего изобретения.

Согласно другому конкретному варианту осуществления соединение формулы IV находится в форме смеси двух возможных энантиомеров (R или S), необязательно энантиомерно обогащенной одним из указанных энантиомеров. В таких случаях получаемое в результате соединение формулы III выбрано из смеси IIIa, IIIb, IIIc и IIId (в эквимолярном или неэквимолярном соотношении), смеси IIIa и IIIс в эквимолярном или неэквимолярном соотношении или смеси IIIb и IIId в эквимолярном или неэквимолярном соотношении.

Соединение формулы IV может быть получено способами, известными из уровня техники. Например, один из способов синтеза, используемый авторами настоящего изобретения, описан на схеме 1. Глутаминовая кислота 1 (в данном случае D-глутаминовая кислота) может быть превращена в соединение формулы 2, как описано у Silverman, R.B.; Levy, M.A., J. Org. Chem. 1980, 45, 815. Вторая стадия включает защиту азота амидной группы с использованием известного способа (Flyn, D.L., et al., J. Org. Chem., 1983, 48, 2424) с получением соединения формулы 3. Затем две следующих стадии включают вначале замещение 2-пирролидона в 3-м положении диметиламинометиловой группой, в результате чего образуется соединение 4 [которое фактически является смесью двух диастереомеров, так как хиральный центр в 3 положении в способе не контролируют], а также кватернизацию при помощи MeI с последующим отщеплением, что приводит к получению соединения формулы 5 (соединение формулы IV, в котором R₁ представляет собой -OEt, а R₂ представляет собой BOC), что уже было описано в работе Panday, S.K.; Griffart-Brunel, D.; Langlois, N.; Tetrahedron Lett., 1994, 35, 6673. В данном случае полученное соединение формулы IV имеет R-конфигурацию. Если требовалось получить S-конфигурацию, в качестве исходного вещества использовали L-глутаминовую кислоту (так как в соответствии с общим представлением соединение 5 имеет ту же конфигурацию, что и исходная глутаминовая кислота).

Схема 1

Первый вариант вышеуказанного способа синтеза соединения 5 включает превращение глутаминовой кислоты 1 (в данном случае D-глутаминовой кислоты) в пироглутаминовую кислоту формулы 1', как описано в работе Lennox, J.R.; Turner, S.C.; Rapoport, H. J. Org. Chem. 2001, 66, 7078-7083. Затем указанная пироглутаминовая кислота формулы 1' превращается в описанное выше соединение формулы 2 путем этерификации в присутствии этанола и SOCl₂ (см. схему 2).

Схема 2

Второй вариант вышеуказанного способа синтеза соединения 5 включает превращение соединения формулы 2 в соединение формулы 3 с помощью DMAP в качестве основания и ацетонитрила (MeCN) в качестве растворителя.

Третий вариант вышеуказанного способа синтеза соединения 5 включает превращение соединения формулы 3 в соединение формулы 4' посредством реакции с tBuOCH(NMe₂)₂ (реактив Бредерека). Указанное соединение формулы 4' превращается в соединение формулы 5 в двух последовательных стадиях. Сначала посредством реакции соединения формулы 4' с разбавленной HCl, затем реакции полученного соединения с водным раствором HCHO (37%) в присутствии неорганического основания, как описано в WO 2004039314 (см. схему 3).

Схема 3

Существует множество реагентов, позволяющих получить азиридиновое кольцо, известных квалифицированному специалисту. Однако выбор реагента для синтеза спиро-азиридинов из углерод-углеродных двойных связей довольно труден. Например, использование хлорамина-T в присутствии HBr/H₂О₂ (L.J. Suman; B. S. Sharma; S. Bir. Tetrahedron Letters, 2004, 45, 8731) приводило не к желательному азиридину, а хлорпроизводным следующей общей формулы:

После ряда экспериментов установили, что наиболее подходящим реагентом для реакции являлся бензилиодинан формулы V. Согласно конкретному варианту осуществления R ₄ выбран из -(O=)C-O-C(CH₃)₃, -(O=)C-O-CH ₂CH₃, -(O=)S(=O)-тозила или фталамида. В предпочтительном варианте осуществления соединение формулы V является N-тозилиминобензилиодинаном (Baron E.; O'Brien P.; Towers T.D. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 723), который можно синтезировать по методике, описанной у Gillepia, K., Synthetic Comunn. 2001, 123.

Взаимодействие энантиомерно чистого соединения формулы IV или их смесей с соединением формулы V, в результате которого образуется по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси, может быть проведено, в случае необходимости, в присутствии катализатора, предпочтительно катализатора на основе меди, более предпочтительно выбранного из Cu(ft)₂ или Cu(acac) ₂, где "ft" представляет собой фталоцианин, а "acac" - ацетоацетат. Более подробную информацию относительно катализаторов и условий см. у Baron, E.; O'Brien, P.; Towers, T.D. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 723, и S.L. Jain, B. Sain, Journal of molecular catalysis A: Chemical, 2003, 195, 283. Указанная реакция обычно выполняется в подходящем органическом растворителе при подходящей температуре, предпочтительно при температуре от 0 до 100°C. Хотя на практике в указанной реакции может использоваться любой подходящий органический растворитель (например, ацетонитрил, диметилформамид и т.д.), в конкретном варианте осуществления, когда соединение формулы IV представляет собой 1-трет-бутиловый 2-этиловый эфир 4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты, а соединение формулы V представляет собой N-тозилиминобензилиодинан (PhI=NTs) [Примеры 3.1 и 4.1], органическим растворителем является ацетонитрил, а реакцию проводят при температуре между 0°C и комнатной температурой (приблизительно 18-24°C).

Кроме того, по существу чистые стереоизомеры соединения формулы III или их смеси могут использоваться для получения по существу чистых стереоизомеров производных пироглутаминовой кислоты формулы I или их смесей, через по существу чистые стереоизомеры соединения формулы II или их смеси.

Таким образом, далее по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси превращаются в по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси посредством стратегии, которая зависит от природы R₅ и Y, таким образом:

(A) чтобы получить по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси, где R₅ представляет собой отрицательный заряд, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIa, по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси реагируют с азотсодержащим нуклеофилом формулы VIIIa:

в которой пунктирная линия вместе с атомом азота образует замещенный или незамещенный гетероарил, или

(B) чтобы получить по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси, где R₅ представляет собой R₃, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIb, по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси реагируют с азотсодержащим нуклеофилом формулы VIIIb:

в которой Ra и Rb определены выше;

и, в случае необходимости, в полученную смесь добавляют соединение формулы X:

R₃Z (X)

в которой R₃ и Z определены выше; или

(C) чтобы получить по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси, где R₅ представляет собой R₃, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIc, по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси реагируют с N-содержащим нуклеофилом формулы VIIIa, после чего в полученную смесь добавляют указанное соединение формулы X.

Вкратце, как было указано выше, синтез по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей включает реакцию по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смеси с

- соединением формулы VIIIa или, в альтернативном варианте, с

- соединением формулы VIIIb и, в случае необходимости, с соединением формулы X или, в альтернативном варианте, с

- соединением формулы VIIIa и с соединением формулы X.

Исходное соединение формулы III может находиться в виде по существу чистого стереоизомера [т.е. (3R,5R); (3S,5S); (3R,5S) или (3S,5R)] или в виде смеси указанных по существу чистых стереоизомеров, например в виде смеси диастереомеров и т.д., в тех же или в других соотношениях. Используемое в настоящем описании понятие "смесь стереоизомеров" включает любую смесь двух или более стереоизомеров соединения, в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях. В основном стереохимия исходного вещества (соединения формулы III) сохраняется в получаемом продукте (соединение формулы II).

Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления соединение формулы III находится в форме по существу чистого стереоизомера [т.е. (3R,5R); (3S,5S); (3R,5S) или (3S,5R)], при этом получают по существу чистое соединение формулы II, которое сохраняет стереохимию исходного соединения формулы III.

Согласно другому конкретному варианту осуществления соединение формулы III находится в форме смеси указанных стереоизомеров (т.е. смеси двух или более стереоизомеров, выбранных из соединений формулы IIIa, IIIb, IIIc и IIId) в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях. В данном случае получают смесь стереоизомеров соединения формулы II, сохраняющую стереохимию исходных стереоизомеров формулы III. Смесь стереоизомеров формулы II может быть разделена на соответствующие по существу чистые стереоизомеры с помощью стандартных методов, таких как хроматография на силикагеле или перекристаллизация.

В одном из вариантов осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси взаимодействуют с соединением формулы VIIIa с получением по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей, где R₅ представляет собой отрицательную связь, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIa [Опция (A)].

В указанном случае в одном из вариантов осуществления азотсодержащий нуклеофил VIIIa является пиридином формулы IX:

в которой

n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и

R₆ выбрано из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного циклоалкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероциклила, замещенного или незамещенного алкокси, замещенного или незамещенного арилокси, галогена, замещенного или незамещенного карбоксиэфира, замещенного или незамещенного амино, и/или пиридин образует одно или более замещенных или незамещенных конденсированных колец.

Кроме того, согласно конкретному варианту осуществления указанный пиридин формулы IX выбран из пиридина и одного из следующих соединений:

Согласно другому конкретному варианту осуществления азотсодержащий нуклеофил VIIIa является соединением формулы:

Обычно реакцию по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смеси с соединением формулы VIIIa проводят при нагревании. Более того, специалист, квалифицированный в данной области техники, осведомлен, что такие реакции, как превращение соединения формулы III в соединение формулы II, а именно размыкание азиридинового кольца в присутствии нуклеофила, обычно требуют нагрева. Если необходимо, могут использоваться микроволны. В конкретном варианте осуществления нагревание обеспечивается путем облучения реакционной смеси микроволнами, которые легко позволяют достичь требуемой температуры и поддерживать ее в течение необходимого периода времени. Согласно одному из вариантов осуществления реакцию проводят в присутствии катализатора, такого как монтмориллонит, пористый кислотный катализатор (например, примеры 3.2.1, 3.2.2, 4.2.1 и 4.2.2).

В другом варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смесь реагируют с соединением формулы VIIIb и, необязательно, с соединением формулы X с получением по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей, где R₅ представляет собой R₃, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIb [Опция (B)].

В указанном случае в одном из вариантов осуществления азотсодержащий нуклеофил VIIIb представляет собой соединение, выбранное из следующих соединений:

В Опции (B) фактически существует два возможных типа условий, зависящих от активных радикалов, которые атакуют азиридиновое кольцо. С одной стороны, возможно образование аниона соединения формулы VIIIb в результате взаимодействия указанного соединения формулы VIIIb с сильным основанием (т.е. бутиллитием и т.д.). При образовании аниона соединения формулы VIIIb может быть добавлено соединение формулы III, в результате чего азиридиновое кольцо атакуется анионом соединения формулы VIIIb. Реакцию можно продолжить посредством добавления соединения формулы X, например алкилирующего соединения, такого как метилиодид (R₃=алкил), и т.д. Условия, необходимые для образования аниона соединения формулы VIIIb, известны специалисту, квалифицированному в данной области техники. Некоторые из указанных радикалов даже являются коммерчески доступными. В качестве альтернативы можно остановить реакцию перед добавлением соединения формулы X, при этом в получаемом соединении формулы II R₃ будет являться водородом. С другой стороны, можно использовать непосредственно соединение формулы VIIIb. Указанные условия обычно требуют нагревания или микроволн и приводят к получению соединения формулы II, в которой R₃ представляет собой водород.

В еще одном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смесь взаимодействуют с соединением формулы VIIIa и с соединением формулы X, в результате чего получают по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси, где R₅ представляет собой R₃, а Y является N-содержащим органическим остатком формулы VIIc [Опция (C)]. Соединения формулы VIIIa и X были определены выше.

Специалист, квалифицированный в данной области техники, осведомлен, что такие реакции, как превращение соединения формулы III в соединение формулы II, а именно размыкание азиридинового кольца в присутствии нуклеофила, обычно требуют нагревания. Если необходимо, могут использоваться микроволны.

Соединение формулы II имеет два хиральных центра, следовательно, оно может находиться в виде любого из по существу чистых стереоизомеров или их смесей. В конкретном варианте осуществления соединение формулы II выбрано из группы, состоящей из

a) по существу чистого соединения формулы IIa,

в которой R₁, R₂ , R₄, R₅ и Y определены выше;

b) по существу чистого соединения формулы IIb,

в которой R₁, R₂ , R₄, R₅ и Y определены выше;

c) по существу чистого соединения формулы IIc,

в которой R₁, R₂ , R₄, R₅ и Y определены выше;

d) по существу чистого соединения формулы IId,

в которой R₁, R₂ , R₄, R₅ и Y определены выше, и

e) любой смеси указанных соединений формулы IIа, IIb, IIc и/или IId (в эквимолярном или неэквимолярном соотношении).

Предпочтительные соединения формулы II, включающие по существу чистые стереоизомеры, указаны ниже под соответствующим заголовком.

Получаемые соединения формулы II могут быть выделены или использованы непосредственно на следующей стадии без последующей очистки.

В случае если получают смесь стереоизомеров соединения формулы II, можно выделить требуемый стереоизомер с помощью стандартных методов, известных специалисту, квалифицированному в данной области техники. Таким образом, согласно настоящему изобретению по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси, непосредственный предшественник по существу чистого стереоизомера производного пироглутаминовой кислоты формулы I или их смеси, с требуемой стереохимией, могут быть получены путем очистки конечной смеси стереоизомеров соединения формулы III с последующим взаимодействием выделенных стереоизомеров с соответствующими реагентами или, в качестве альтернативы, путем очистки смеси, получаемой в результате реакции между указанным соединением формулы III и нуклеофилом формулы VIIIa или VIIIb и X (если необходимо).

Таким образом, согласно стадии c) способа настоящего изобретения по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси превращаются в по существу чистый стереоизомер производного пироглутаминовой кислоты формулы I или их смеси посредством взаимодействия указанного по существу чистого стереоизомера соединения формулы II или их смесей с кислотной средой, включающей кислоту формулы HX, в которой X определен выше.

Специалист, квалифицированный в данной области техники, осведомлен об органических или неорганических кислотах формулы HX, подходящих для проведения реакции с по существу чистым стереоизомером соединения формулы II или их смесями. В конкретном варианте осуществления указанная кислота HX представляет собой неорганическую кислоту, такую как HCl, HBr и т.д. Согласно предпочтительному варианту осуществления HX представляет собой HBr.

В зависимости от свойств соединений формулы I и II для реакции требуется 1 или 2 эквивалента HX. Квалифицированный специалист осведомлен об условиях, необходимых для образования соли. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси взаимодействуют с избытком кислоты формулы HX, где X определен выше. Согласно другому варианту осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси растворяют в водном растворе HBr и нагревают.

Согласно вышеприведенному описанию можно получить по существу чистый стереоизомер соединения формулы I или их смеси из по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смесей посредством проведения последовательности стадий. Однако также можно получить по существу чистый стереоизомер соединения формулы I или их смеси из соединения формулы III посредством методики проведения реакций в одном реакторе. Таким образом, дополнительным аспектом изобретения является способ синтеза в одном реакторе по существу чистого стереоизомера соединения формулы I или их смесей, включающий взаимодействие по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смесей с азотсодержащим нуклеофилом формулы VIIIa или VIIIb, с последующим взаимодействием соединения, получаемого в предыдущей стадии, с кислотой формулы HX.

Соединение формулы I имеет два хиральных центра, следовательно, оно может находиться в виде любого из своих по существу чистых стереоизомеров или в виде их смеси. Предпочтительные соединения формулы I, включающие свои по существу чистые стереоизомеры, указаны ниже под соответствующим заголовком.

Соединение формулы I

Соединение формулы I имеет два хиральных центра, следовательно, оно может находиться в виде любого из своих по существу чистых стереоизомеров или в виде их смеси. В конкретном варианте осуществления соединение формулы I выбрано из группы, состоящей из

a) по существу чистого стереоизомерного соединения формулы Ia:

в которой R₁, R₂ , R₃, R₄, X и Y определены выше;

b) по существу чистого стереоизомерного соединения формулы Ib:

в которой R₁, R₂ , R₃, R₄, X и Y определены выше;

c) по существу чистого стереоизомерного соединения формулы Ic:

в которой R₁, R₂ , R₃, R₄, X и Y определены выше;

d) по существу чистого стереоизомерного соединения формулы Id:

в которой R₁, R₂ , R₃, R₄, X и Y определены выше; и

e) любой смеси указанных по существу чистых соединений формулы Ia, Ib, Ic и/или Id, в эквимолярном или неэквимолярном соотношении, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений:

(i) гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида или

(ii) гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида.

Хотя некоторые соединения формулы I, а именно (i) гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида и (ii) гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида, были описаны как смеси всех четырех возможных стереоизомеров указанных соединений, до настоящего времени синтез по существу чистых стереоизомеров указанных соединений не был осуществлен.

В конкретном варианте осуществления в соединении формулы I R₁ представляет собой -OH или -ORa, где Ra определен выше и предпочтительно представляет собой -OH.

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I R₂ представляет собой водород, защитную группу азота, которая гидролизуется в кислых условиях, или фталамид, предпочтительно водород.

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I R₃ или R₄ независимо представляют собой водород, защитную группу азота, которая гидролизуется в кислых условиях, или фталамид, предпочтительно R₃ и R₄ одновременно являются водородом.

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I X представляет собой фармацевтически приемлемый анион, предпочтительно бромид или хлорид.

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I R ₁ представляет собой -OH или -ORa, предпочтительно -OH; R₂ представляет собой водород, защитную группу азота, которая гидролизуется в кислых условиях, или фталамид, предпочтительно водород; R₃ или R₄ независимо представляют собой водород, защитную группу азота, которая гидролизуется в кислых условиях, или фталамид, предпочтительно R₃ или R₄ одновременно являются водородом; и/или X представляет собой фармацевтически приемлемый анион, предпочтительно бромид или хлорид.

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I Y представляет собой органический остаток, выбранный из

В другом конкретном варианте осуществления в соединении формулы I Y представляет собой органический остаток, выбранный из

Согласно конкретному варианту осуществления соединение формулы I представляет собой по существу чистое соединение формулы I'a:

в которой R₁, R₂ , R₆ и n определены выше.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанное соединение формулы I представляет собой по существу чистое соединение формулы I'b:

в которой R₁, R₂ , R₆ и n определены выше.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанное соединение формулы I представляет собой по существу чистое соединение формулы I'c:

в которой R₁, R₂ , R₆ и n определены выше.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения указанное соединение формулы I представляет собой по существу чистое соединение формулы I'd:

в которой R₁, R₂ , R₆ и n определены выше.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения смесь, включающая два или более соединения формулы I'a, I'b, I'c и/или I'd, обеспечивается в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, например смесь, включающая соединения формулы I'a и I'b, или включающая соединения формулы I'a и I'c, или включающая соединения формулы I'a и I'd, или включающая соединения формулы I'b и I'c, или включающая соединения формулы I'b и I'd, или включающая соединения формулы I'c и I'd, или включающая соединения формулы I'a, I'b и I'c, или включающая соединения формулы I'a, I'b и I'd, или включающая соединения формулы I'b, I'c и I'd, или включающая соединения формулы I'a, I'b, I'c и I'd.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения соединение формулы I выбрано из группы, состоящей из

гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида;

гидробромида 3R,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида;

гидробромида 3R,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида; и

гидробромида 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида.

Изобретение дополнительно относится к композиции, включающей смесь указанных соединений формулы Ia, Ib, Ic и/или Id, в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений:

(i) гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида или

(ii) гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида.

Соединение формулы II

Хотя некоторые соединения формулы II, а именно ацетат 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния, ацетат 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)-пиридиния, ацетат 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния или гидрохлорид 1-(l-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния, были описаны как смеси всех четырех возможных стереоизомеров указанных соединений, до настоящего времени синтез по существу чистых стереоизомеров указанных соединений не был осуществлен.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к по существу чистому соединению формулы II или его смесям.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к по существу чистому соединению формулы IIа, IIb, IIc и IId. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к смеси указанных соединений формулы IIа, IIb, IIc и/или IId, в любом молярном соотношении, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений:

ацетат 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния;

ацетат 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния;

ацетат 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния или

гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния.

В другом конкретном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₁ представляет собой -ORa, в котором Ra предпочтительно является алкильной группой.

В другом конкретном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, предпочтительно BOC-группу.

В другом конкретном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₄ представляет собой -(O=)S(=O)-Ra, предпочтительно тозил.

В другом конкретном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₁ представляет собой -ORa, в котором Ra предпочтительно является алкильной группой; R₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, предпочтительно BOC-группу; и R₄ представляет собой -(O=)S(=O)-Ra, предпочтительно тозил.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₂, R₄ и R ₅ независимо представляют собой водород.

Согласно другому варианту осуществления изобретения по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R₁ представляет собой -OH.

Согласно другому варианту осуществления изобретения по существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси представляют собой соединение, в котором R ₅ представляет собой отрицательный заряд.

Изобретение также относится к композициям, включающим соединение, выбранное из группы, состоящей из указанных соединений формулы IIа, IIb, IIc, IId и их смесей, в любом молярном соотношении, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений:

ацетат 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния;

ацетат 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния;

ацетат 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния; или

гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-ацетиламино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридиния.

По существу чистый стереоизомер соединения формулы II или их смеси могут быть получены, как было указано выше, посредством способа, который включает реакцию по существу чистого стереоизомера соединения формулы III или их смесей с

- соединением формулы VIIIa или, в альтернативном варианте, с

- соединением формулы VIIIb и, в случае необходимости, с соединением формулы X или, в альтернативном варианте, с

- соединением формулы VIIIa и с соединением формулы X.

Указанный способ составляет следующий аспект настоящего изобретения и позволяет осуществить синтез по существу чистых стереоизомеров соединения формулы II или их смесей.

Соединение формулы III

В другом аспекте изобретение относится к по существу чистому стереоизомеру соединения формулы III или их смесям. Указанное соединение формулы III имеет два хиральных центра, следовательно, оно может находиться в виде любого из по существу чистых стереоизомеров или их смеси.

В конкретном варианте осуществления соединение формулы III выбрано из группы, состоящей из соединений формулы IIIa, IIIb, IIIc, IIId и любой смеси указанных соединений.

В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к смеси, включающей два или более соединений формулы IIIa, IIIb, IIIc и IIId. Иллюстративные неограничивающие примеры указанных смесей включают смеси двух из указанных соединений (например, смеси IIIa и IIIb, IIIa и IIIc, IIIa и IIId, IIIb и IIIc, IIIb и IIId или IIIc и IIId), или смеси трех из указанных соединений (например, смеси IIIa, IIIb и IIIc, IIIa, IIIb и IIId или IIIb, IIIc и IIId), или смеси четырех указанных соединений (например, смесь IIIa, IIIb, IIIc и IIId). Каждое конкретное соединение (IIIa-IIId) может присутствовать в указанной смеси в любой пропорции или соотношении, например в эквимолярных пропорциях или соотношениях или в различных пропорциях или соотношениях, где одно или более указанных соединений находится в избытке по отношению к другому (другим).

В другом конкретном варианте осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси представляют собой соединение, в котором R₁ представляет собой -ORa, в котором Ra предпочтительно является алкильной группой.

Согласно другому конкретному варианту осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси представляют собой соединение, в котором R₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, предпочтительно BOC-группу.

Согласно другому конкретному варианту осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси представляют собой соединение, в котором R ₄ представляет собой -(O=)S(=O)-Ra, предпочтительно тозил.

Согласно другому конкретному варианту осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси представляют собой соединение, в котором R₁ представляет собой -ORa, в котором Ra предпочтительно является алкильной группой; R₂ представляет собой -(O=)C-O-Ra, предпочтительно BOC-группу; и R₄ представляет собой -(O=)S(=O)-Ra, предпочтительно тозил.

Согласно другому конкретному варианту осуществления по существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси представляют собой соединение, в котором R₂, R₄ и R ₅ независимо представляют собой водород.

По существу чистый стереоизомер соединения формулы III или их смеси могут быть получены, как было указано выше, посредством способа, который включает взаимодействие соединения формулы IV в энантиомерно чистой форме или в форме смесей энантиомеров с соединением формулы V. Указанный способ составляет следующий аспект настоящего изобретения. Посредством указанного способа также можно получить по существу чистые стереоизомеры соединения формулы III или их смеси.

Применения соединения формулы I и

фармацевтических композиций

По существу чистые стереоизомеры соединения формулы I или их смеси могут применяться в качестве активных компонентов лекарственных средств для лечения и/или профилактики некоторых заболеваний у субъекта, например опухолей, иммунодефицитных состояний, инфекций и т.д.

Иллюстративные, неограничивающие примеры заболеваний, поддающихся лечению по существу чистым стереоизомером соединения формулы I или их смесями, включают

A) заболевания, связанные с раком или с опухолями: включающие фактически все типы рака и опухолей, включая острый лимфобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз у взрослых, детский острый миелолейкоз, острый миелолейкоз у взрослых, аденокортикальную карциному, рак, связанный с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), рак анального канала, астроцитому, детскую церебеллярную астроцитому, базально-клеточную карциному, рак желчных путей, внепеченочный рак мочевого пузыря, рак мочевого пузыря, костный рак, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, глиому ствола головного мозга, опухоль головного мозга, злокачественную глиому, эпендимому, гранулобластому, супратенториальные нейроэктодермальные опухоли, глиому зрительных путей и гипоталамуса, рак молочной железы, парные бронхиальные аденомы/карциноиды, детскую лимфому Беркитта, карциноидную опухоль, желудочно-кишечную карциному неизвестной этиологии, лимфому центральной нервной системы, первичную церебеллярную астроцитому, астроцитому головного мозга/злокачественную глиому, рак шейки матки, детский рак, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, хронические миелопролиферативные заболевания, рак толстой кишки, колоректальный рак, кожную Т-клеточную лимфому, рак эндометрия, рак пищевода, детские опухоли Юинга, внечерепную герминому, внегонадную герминому, внепеченочный рак желчных путей, рак глаз, внутриглазную меланому, ретинобластому, рак желчного пузыря, гастральный рак (желудка), желудочно-кишечную карциноидную опухоль, герминому, гестационную трофобластную глиому яичников, глиому у взрослых, глиому ствола головного мозга, астроцитому глиому мозга, гистиоцитарный ретикулоэндотелиоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак (печени), гепатоцеллюлярный рак (печени) у взрослых (первичный), детскую лимфому Ходжкина (первичную), лимфому Ходжкина у взрослых, гипофарингеальный рак, внутриглазную меланому, карциному островковых клеток (поджелудочной железы), саркому Капоши, рак почек (клеток почечного эпителия), рак почек, рак гортани, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, рак полости рта, детский рак легких (первичный), немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточную лимфому, лимфому, связанную со СПИД, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина у взрослых, детскую лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому у взрослых, детскую неходжкинскую лимфому первичной центральной нервной системы, макроглобулинемию Вальденстрема, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости/остеосаркому, гранулобластому, меланому, внутриглазную (глазную) карциному клеток Меркеля, мезотелиому, злокачественную мезотелиому у взрослых, детский метастатический плоскоклеточный рак шеи неизвестной этиологии, синдром множественной эндокринной неоплазии, детскую множественную миелому/неоплазму плазматических клеток, грибовидную гранулему, миелодиспластический синдром, миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания, миелогенный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый миелолейкоз у взрослых, детскую острую миелому, множественные миелопролиферативные заболевания, хронический рак полости носа и околоносовых пазух, носоглоточный рак, детскую нейробластому, рак полости рта, детский рак полости рта, орофарингеальный рак, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак яичников, детскую эпителиому яичников, герминому яичников, пограничную опухоль яичников, рак поджелудочной железы, детский рак поджелудочной железы, рак островых клеток околоносовых пазух и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитома, пинеобластома и супратенториальные нейроэктодермальные опухоли, детскую опухоль гипофиза, неоплазму плазматических клеток/множественную миелому, плевролегочную бластому, первичную лимфому центральной нервной системы, рак простаты, рак прямой кишки, рак клеток почечного эпителия (почек), детский рак почечной лоханки и мочеточника, переходно-клеточный рак, ретинобластому, рабдомиосаркому, детский рак слюнных желез, рак слюнных желез, детскую саркому, опухоли Юинга, саркому, саркому Капоши, саркому мягких тканей у взрослых, детскую саркому мягких тканей, маточный синдром Сезари, рак кожи (не меланома), детский рак кожи (меланома), карциному кожи, рак клеток Меркеля, мелкоклеточный рак легких, рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, саркому мягких тканей у взрослых, детскую плоскоклеточную карциному, плоскоклеточный рак шеи неизвестной этиологии, метастатический рак желудка (гастральный), детские супратенториальные нейроэктодермальные опухоли, детскую Т-клеточную лимфому, рак яичка, тимому, детскую тимому и тимусную карциному, рак щитовидной железы, детский переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, трофобластную опухоль, гестационный переходно-клеточный рак неизвестной первичной локализации, рак уретры, рак матки, эндометриальную саркому матки, рак влагалища, глиому зрительных путей и гипоталамуса, детский рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса и т.д.;

B) инфекции: включающие фактически все типы инфекций, такие как инфекции бактериального, грибкового и вирусного генеза; или

C) аутоиммунные заболевания: включающие фактически все аутоиммунные заболевания, перечисленные на веб-сайте "Американской ассоциации аутоиммунных заболеваний" [http://www.aarda.org], включая рассеянный склероз (MS), болезнь Крона, ревматоидный артрит, сахарный диабет 1 типа, псориаз, волчанку, язвенный колит, витилиго, глютеновую энтеропатию, васкулит, дерматомиозит, полимиозит, тиреоидит (Хашимото, Грейвса), тяжелую псевдопаралитическую миастению, синдром Гийена-Барре, увеит, плоский лишай, темпоральный артериит, саркоидоз, сухой синдром (Шегрена), бронхиальную астму, пемфигус, анкилозирующий спондилит, склеродермию, фибромиалгию, острую ревматическую лихорадку и т.д.

Таким образом, согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в дальнейшем называемой фармацевтической композицией по изобретению, включающей соединение формулы I, его по существу чистые стереоизомеры Ia, Ib, Ic или Id, или их смеси в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений:

(i) гидрохлорид 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида или

(ii) гидрохлорид 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида;

а также фармацевтически приемлемый носитель.

В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция изобретения в качестве активного компонента включает, по меньшей мере, один по существу чистый стереоизомер соединения формулы I, т.е. Ia, Ib, Ic или Id, или их смеси в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера вышеуказанных соединений (i) или (ii), в терапевтически эффективном количестве. В значении, используемом в настоящем описании, понятие "терапевтически эффективное количество" относится к рассчитанному количеству активного компонента, обеспечивающему требуемый эффект, и обычно будет зависеть, среди других причин, от собственных свойств используемого активного компонента и требуемого терапевтического эффекта. В конкретном варианте осуществления доза активного компонента, вводимая субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике вышеуказанных заболеваний, находится в пределах диапазона от 10^-10 до 10¹⁰ мг/кг массы тела, обычно от 10^-3 до 10³ мг/кг массы тела.

Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или основе, с которыми вводят активный компонент. Такие фармацевтические носители могут являться стерильными жидкостями, такими как вода и масло, включая масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей предпочтительно используют водные солевые растворы, а также водные растворы декстрозы и глицерина, в особенности для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические носители описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin. Кроме того, понятие "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые являются физиологически допустимыми и обычно не вызывают аллергической или подобной нежелательной реакции, такой как расстройство желудка, головокружение и т.п., при введении человеку. Предпочтительно используемое в настоящем описании понятие "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального или государственного правительства или внесенный в реестр Фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных, а более конкретно на людях.

С целью введения субъекту, такому как млекопитающее, например человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтическую композицию изобретения можно вводить любым подходящим способом (путем), таким как оральный (например, оральный, сублингвальный и т.д.), парентеральный (например, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутримышечный и т.д.), влагалищный, ректальный, назальный, местный, глазной и т.д.

Фармацевтическую композицию изобретения, полученную путем смешивания активного компонента (компонентов) с подходящим фармацевтически приемлемым носителем (носителями), можно вводить в различных фармацевтических формах, например твердых, жидких и т.д. Иллюстративные неограничивающие примеры указанных фармацевтических форм для введения фармацевтической композиции изобретения включают капли для орального применения (раствор, суспензию, эмульсию и т.д.); композиции для орального применения (жидкость, раствор, суспензию, эмульсию, гель, пасту, порошок и т.д.); лиофилизат для орального применения; жевательную резинку; порошок для приготовления раствора или суспензии для орального применения; гранулы; гранулы, устойчивые в желудке; гранулы с пролонгированным высвобождением; гранулы с модифицированным высвобождением; гранулы для приготовления суспензии для орального применения; порошок и растворитель для приготовления раствора или суспензии для орального применения; сироп; порошок для приготовления сиропа; гранулы для приготовления сиропа; таблетки (например, растворимую таблетку, диспергируемую таблетку, таблетку с покрытием, таблетку с пленочным покрытием, шипучую таблетку, таблетку, диспергируемую во рту, таблетку, устойчивую в желудке, таблетку с пролонгированным высвобождением, таблетку с модифицированным высвобождением, таблетку для рассасывания, жевательную таблетку и т.д.); травяной чай; быстрорастворимый травяной чай; шипучий порошок или гранулы; саше, капсулу (например, твердую, мягкую, устойчивую в желудке твердую или мягкую капсулу, твердую или мягкую капсулу с пролонгированным высвобождением, твердую или мягкую капсулу с модифицированным высвобождением и т.д.); пилюли; внутрирубцовое устройство с непрерывным высвобождением; внутрирубцовое устройство с импульсным высвобождением; лизунец; премикс для приготовления кормовой смеси, содержащей лекарственное вещество; драже, раствор для полоскания; концентрат для приготовления раствора для полоскания; раствор для полоскания (порошок или приготовления раствора для полоскания); раствор для введения через слизистую ротовой полости, суспензию, капли, спрей, гель, пасту, капсулу и т.д.; сублингвальный спрей, таблетку и т.д.; жидкость для полоскания рта; раствор для десен, гель, пасту и т.д.; пастилку; спрессованную пастилку; пастилку; зубной гель, зубочистку, вставку, порошок, раствор, суспензию, эмульсию и т.д.; зубную пасту; крем; гель; мазь; пасту для нанесения на кожу, пену, спрей, раствор, суспензию, порошок, жидкость, раствор, концентрат для приготовления наносимого на кожу раствора, суспензии, эмульсии, палочки, губки и т.д.; пластырь; шампунь; раствор для ионтофореза; трансдермальный пластырь; примочку; раствор для окунания, суспензию, эмульсию, концентрат для приготовления раствора для окунания, суспензии или эмульсии; раствор для обливания, суспензию или эмульсию; раствор для локального нанесения; суспензию для локального нанесения; эмульсию для локального нанесения; раствор для обработки сосков; суспензию для обработки сосков; эмульсию для обработки сосков; спрей для обработки сосков; глазной крем; глазной гель; глазную мазь; глазные капли (раствор, суспензию, порошок и растворитель для приготовления раствора, порошок и растворитель для приготовления суспензии, растворитель для разбавления лосьона, растворитель для разбавления лосьона и т.д.); офтальмологическую вкладку; ушной крем; ушной гель; ушную мазь; ушные капли (раствор, суспензию, эмульсию, порошок и т.д.); ушной спрей (раствор, суспензию и т.д.); ушной лосьон (раствор, эмульсию и т.д.); ушной тампон; ушную палочку; назальный крем; назальный гель; назальную мазь; назальные капли (раствор, суспензию, эмульсию и т.д.); назальный порошок; назальный спрей (раствор, суспензию, эмульсию и т.д.); раствор для промывки носа, носовую палочку; вагинальный крем; вагинальный гель; вагинальную мазь; вагинальную пену; вагинальный раствор; вагинальную суспензию; вагинальную эмульсию; таблетку для приготовления вагинального раствора; твердую или мягкую вагинальную капсулу; вагинальную таблетку; шипучую вагинальную таблетку; вагинальную систему доставки; ректальный крем; ректальный гель; ректальную мазь; ректальную пену; ректальный раствор; ректальную суспензию; ректальную эмульсию; концентрат для приготовления ректального раствора; порошок для приготовления ректального раствора; порошок для приготовления ректальной суспензии; таблетку для приготовления ректальной суспензии; суппозиторий; ректальную капсулу; раствор для ректального тампона или небулайзера; суспензию для небулайзера; порошок для приготовления суспензии для небулайзера; порошок для приготовления раствора для небулайзера; эмульсию для небулайзера; средство для ингаляции под давлением (раствор, суспензию, эмульсию и т.д.); порошок для ингаляции; порошок для ингаляции (в твердой капсуле); дозированный порошок для ингаляции; пар для ингаляции (порошок, капсулу, раствор, таблетку, мазь, жидкость и т.д.); газ для ингаляции; гель для инъекции; раствор для инъекции; суспензию для инъекции; эмульсию для инъекции; порошок для приготовления раствора для инъекции; порошок для приготовления суспензии для инъекции; порошок и растворитель для приготовления раствора для инъекции; порошок и растворитель для приготовления суспензии для инъекции; концентрат для приготовления раствора для инъекции; раствор для инфузии; эмульсию для инфузии; порошок для приготовления раствора для инфузии; концентрат для приготовления раствора для инфузии; порошок и растворитель для приготовления раствора для инфузии; имплантируемую таблетку; раствор для перитонеального диализа; раствор для гемофильтрации; раствор для гемодиафильтрации; раствор для гемодиализа; концентрат для приготовления раствора для гемодиализа; раствор для внутрипузырного использования; раствор для промывания мочевого пузыря; порошок для приготовления раствора для промывания мочевого пузыря; уретральный гель; уретральную палочку; эндотрахеопульмонарную инстилляцию (раствор); эндотрахеопульмонарную инстилляцию (порошок для приготовления раствора); эндотрахеопульмонарную инстилляцию (суспензию); эндотрахеопульмонарную инстилляцию (порошок и растворитель для приготовления раствора); эндоцервикальный гель; порошок и растворитель для приготовления эндоцервикального геля; интрамаммарный раствор; интрамаммарную суспензию; интрамаммарную эмульсию; интрамаммарную мазь; палочку для соска; внутриматочную систему доставки; и т.д.

Носители и вспомогательные вещества, необходимые для приготовления требуемой фармацевтической формы для введения фармацевтической композиции изобретения, будут зависеть, среди других факторов, от выбранного способа введения фармацевтической формы. Указанные фармацевтические формы для введения фармацевтической композиции будут изготовлены согласно стандартным способам, известным специалисту, квалифицированному в данной области техники. Обзор различных способов введения активных компонентов, используемых наполнителей и способов их получения можно найти в "Tratado de Farmacia Galenica", C. Fauli i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению по существу чистого стереоизомера соединения формулы I, т.е. Ia, Ib, Ic или Id, или их смесей в эквимолярных или неэквимолярных соотношениях, где указанная смесь не содержит одновременно все четыре стереоизомера следующих соединений: (i) гидрохлорида 1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида или (ii) гидрохлорида 1-(1-ацетил-3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийхлорида, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для усиления иммунного ответа у субъекта, или для приготовления противоопухолевой фармацевтической композиции, или для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения инфекции бактериального, грибкового или вирусного происхождения, или для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения аутоиммунного заболевания.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение направлено на указанное применение для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение направлено на указанное применение для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака простаты, меланомы, мастоцитомы, рака легкого и рака почек.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение направлено на указанное применение для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики СПИД и связанных с ним заболеваний.

Иллюстративные неограничивающие примеры состояний, поддающихся лечению фармацевтической композицией, обеспечиваемой в соответствии с настоящим изобретением, включают состояния, перечисленные выше.

Следующие примеры могут использоваться для пояснения изобретения и ни в коем случае не должны ограничивать объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Общие методики. Все точки плавления были измерены в капиллярных трубках и неисправлены. ИК-спектры были определены на дисках KBr с использованием спектрометра Nicolet Impact 410. Спектры ¹Н-ЯМР были получены при 300-500 МГц на приборе VARIAN UNITY и UNITYPLUS. Химические сдвиги ( ) были определены с использованием ТМС в качестве внутреннего стандарта, а мультиплетность (s, синглет; d, дуплет; dd, двойной дуплет; t, триплет; q, квартет; m, мультиплет) указана для каждого сигнала. Анализы ВЭЖХ-МС были выполнены на приборе Agilent 1100. Использовали хроматографическую колонку Luna C18 (150×4,6 мм) 5 мкм Phenomenex, с подвижной фазой, сформированной тройным градиентом 4% водного раствора муравьиной кислоты (A), воды (B) и ацетонитрила (C). Градиент начинали с А 2,5%, B 93% и C 4,5%, а через 30 минут А достигал 2,5%, B 4,5% и С 93%. В масс-детекторе фрагментор работал при 70 эВ. Элементный анализ выполняли на приборе LECO CHNS-932. Все выходы соответствуют изолированным чистым соединениям.

Пример 1 относится к синтезу (1-трет-бутиловому 2-этиловому эфиру 2R-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты), исходному веществу способа по изобретению (соединение формулы IV).

Пример 2 относится к синтезу соединения формулы V, исходного вещества способа по изобретению.

Примеры 3 и 4 относятся к синтезу гидробромида (3R,5R), (3S,5S), (3R,5S) и (3S,5R)-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида, которые являются соединениями формулы I, с использованием однореакторного цикла.

Пример 5 относится к однореакторному синтезу гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида с использованием постадийного синтеза.

Пример 7 анализирует эффект различных изомеров соединения формулы I на рост опухолей (тестируемая опухоль: RENCA).

ПРИМЕР 1

Синтез соединения формулы IV: (1-трет-бутилового, 2-этилового эфира) (R)-5 (2R-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты)

Синтез соединения, соответствующего заголовку, показан на схеме 1.

1.1 Синтез соединения 2: этилового эфира 2S-5-оксопирролидин-2-карбоновой кислоты

Реактор емкостью 10 л загружали D-глутаминовой кислотой 1 (1 кг, 6,80 моль) в абсолютном этаноле (5,0 л), охлажденном до -10°С, затем через капельную воронку медленно, в течение 2 ч, добавляли тионилхлорид (2,0 кг, 14,9 моль). После того как добавление было окончено, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем нагревали до 80°С в течение еще одного часа. Полученный раствор сконцентрировали досуха (ВНИМАНИЕ: выделяются пары НСl и SO₂). Остаток растворяли в этаноле (2,5 л) и нейтрализовали до рН 7 путем добавления раствора гидроксида калия в этаноле (10% по весу, приблизительно 2,0 л). Образовавшееся твердое вещество удаляли фильтрацией, а раствор сконцентрировали, получая диэтиловый эфир 1 в виде сухого воскообразного вещества.

Затем остаток подвергали перегонке в вакууме (90°C, 3,1 мбар) в течение 2 ч, а оставшуюся смесь дополнительно нагревали до 150°C при 5,2 мбар в течение 2 ч. При комнатной температуре остаток затвердел. После перекристаллизации из смеси МТБЭ/гексана (2:1) целевой продукт 2 получали в виде сухого коричневатого вещества (960 г, 90%), т.пл. 49-51°C.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): 6,82 (ушир.с, 1H); 4,29-4,23 (м, 1H); 4,21 (кв, 2H, J=7,3 Гц); 2,48-2,17 (м, 4H); 1,28 (т, 3H, J=7,3 Гц) м.д.

1.2 Синтез соединения 3: 1-трет-бутилового 2-этилового эфира 2R-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты

В реактор к перемешиваемому раствору этилпироглутамата 2 (900 г, 5,73 моль) в дихлорметане (8,0 л) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (2,5 кг, 11,5 моль), триэтиламин (800 мл, 5,73 моль) и DMAP (700 г, 5,73 моль), после чего реакцию перемешивали в течение 2 ч. Красно-коричневый раствор концентрировали досуха, растворяли в этилацетате (10,0 л) и промывали водным раствором HCl 3н. (4×2,5 л). Объединенные органические слои промывали водой (6×2,5 л) и соляным раствором (1,0 л), а затем сушили над сульфатом натрия. Реакционную смесь концентрировали досуха, охлаждали на льду и растирали в МТБЭ и гексане (1:1), получая коричневое сухое вещество (390 г). В результате концентрирования маточных растворов было получено масло (600 г), из которого после хроматографии (SiО₂, гексан/этилацетат 3:1) получили бесцветное сухое вещество (386 г) 3. Полный выход 776 г, 54%. Т.пл. 48-49°C.

¹H-ЯМР (CDCl ₃, 300 МГц): 4,57 (дд, 1Н, J=9,5 Гц, J=3,3 Гц); 4,20 (кв, 2H, J=7,3 Гц); 2,72-1,77 (м, 4H); 1,46 (с, 9H); 1,26 (т, 3H, J=7,3 Гц) м.д.

1.3 Синтез соединения 4: смесь 1-трет-бутилового 2-этилового эфира цис- и транс- 2R-4-диметиламино-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты

К перемешиваемому раствору LiHMDS в ТГФ (1M, 0,24 л, 0,24 моль) при -78°C медленно добавляли раствор 3 (30 г, 0,12 моль) в сухом ТГФ (1,0 л). После перемешивания в течение 40 минут при -78°C добавляли соль Эшенмозера (45,5 г, 0,24 моль), после чего перемешивание продолжали еще 20 мин. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 16 часов. Смесь концентрировали, а остаток разделяли между этилацетатом (300 мл) и водой (300 мл). Водный слой снова экстрагировали этилацетатом (2×300 мл). Объединенный органический экстракт промывали водным раствором HCl 1M (3×150 мл). Кислый слой сразу нейтрализовывали бикарбонатом натрия и экстрагировали этилацетатом (3×300 мл). Органическую фазу промывали водой (300 мл), соляным раствором (50 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха, получая требуемый продукт 4 в виде бледно-коричневого масла (26,9 г, 72%), которое использовали непосредственно на следующей стадии.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): 4,62 (дд, 1Н, J=9,4 Гц, J=3,3 Гц); 4,21 (кв, 2H, J=7,3 Гц); 4,18-4,07 (м, 1Н); 2,57-2,20 (м, 3H); 2,22 (с, 3H); 2,17 (с, 3H); 1,47 (с, 9H); 1,24 (т, 3H, J=7,3 Гц) м.д.

1.4 Синтез соединения (R)-5: 1-трет-бутилового 2-этилового эфира 2R-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты

В автоклав (4 л) загружали раствор 4 (244,9 г, 0,74 моль) в MeOH (2,5 л) и йодметан (138,2 мл, 2,22 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Растворитель удаляли, после чего остаток делили между этилацетатом (2 л) и 10% NaHCO₃ (1 л). Водную фазу снова экстрагировали этилацетатом (3×500 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали досуха. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии (гексан/этилацетат 4:1 этилацетат), получая (R)-5 в виде бесцветного масла (55,1 г, 27%).

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): 6,23 (т, 1Н, J=2,7 Гц); 5,51 (т, 1Н, J=2,2 Гц); 4,61 (дд, 1Н, J=10,3 Гц, J=3,3 Гц); 4,22 (кв, 2 H, J=7,1 Гц); 3,17-3,05 (м, 1Н); 2,75-2,64 (м, 1Н); 1,47 (с, 9H); 1,23 (т, 3H, J=7,1 Гц) м.д.

ПРИМЕР 2

Синтез соединения формулы IV: (1-трет-бутилового 2-этилового эфира) (R)-5 (2R-4-метилен-5-оксопирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты)

Синтез соединения, соответствующего заголовку, показан на схеме 4 ниже и включает три варианта синтеза соединения формулы 5, раскрытые в описании.

Схема 4

2.1 Синтез (2R)-пироглутаминовой кислоты (2')

Методика описана у Lennox, J.R.; Turner, S.C.; Rapoport, H. J. Org. Chem. 2001, 66, 7078-7083.

D-глутаминовую кислоту (1) (100 г, 679,7 ммоль) в воде (400 мл) нагревали с дефлегмацией при перемешивании в течение 72 часов. Полученный прозрачный раствор пропускали через колонку Dowex 50wX8 (с ионообменной смолой в кислой форме, 135 г) и промывали водой, пока элюат не становился нейтральным. Объединенные водные элюаты концентрировали при 50°C, пока не собирали 300 мл дистиллята. Затем добавляли метанол (500 мл), чтобы способствовать удалению остаточной воды и предотвращать слипание твердого вещества. Полученное твердое вещество сушили в вакууме, получая соединение 2' в виде белого твердого вещества (74,63 г, 85%). Т.пл. 157°C, [ ]_D ²²+10,5° (c 2,0, H₂O).

2.2 Синтез этил-(2R)-пироглутамата (2)

К перемешиваемой суспензии (2R)-пироглутаминовой кислоты 2' (1 экв., 2,017 г, 15,62 ммоль) в EtOH (2 мл/ммоль, 8 мл) добавляли SOCl₂ (0,1 экв., 115 мкл, 1,56 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем реакционную смесь нейтрализовывали водным раствором NaHCO ₃ (1M). Растворитель концентрировали в вакууме, а остаток экстрагировали AcOEt (3×25 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Соединение 2 было получено в виде бесцветного масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (79%).

2.3 Синтез этил-(2R)-N-(трет-бутоксикарбонил)пироглутамата (3)

К холодному (5-10°C) перемешиваемому раствору сложного эфира 2 (1 экв., 78,6 г, 0,50 моль) и 4-диметиламинопиридина (DMAP) (0,1 экв., 6,10 г, 50 ммоль) в MeCN (0,3 мл/ммоль, 180 мл) частями добавляли трет-бутилдикарбонат (BOC)₂O (1,2 экв., 131 г, 0,60 моль) (30 минут). Полученный красный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем смесь концентрировали в вакууме, а остаток очищали с помощью флеш-хроматографии (EtOAc:CH₂Cl₂, 1:4), получая 3 в виде желтоватого сухого вещества (95%). Т.пл. 48-49°C.

2.4 Синтез енаминона (4')

Методика описана у Dieterich, P.; Young, D.W. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1492-1496.

К раствору пироглутамата 3 (1 экв., 83,1 г, 0,32 моль) в 1,2-диметоксиэтане (2,3 мл/ммоль, 736 мл) добавляли ^tBuOCH(NMe₂)₂ (реактив Бредерека, 1,5 экв., 100 мл, 0,48 моль), после чего полученную смесь нагревали при 85°C в течение 15 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выпаривали в вакууме. Полученное неочищенное масло растирали в минимальном количестве МТБЭ, после чего полученное твердое вещество фильтровали. Соединение 4' было получено в виде оранжевого твердого вещества (59,48 г, 59%). Маточные растворы концентрировали в вакууме и после нескольких перекристаллизаций полный выход составил 84% (84,26 г).

2.5 Синтез алкена (5)

Методика описана в WO 2004039314.

К раствору 4' (59,48 г, 0,19 моль) в ТГФ (1,56 мл/ммоль, 300 мл) добавляли водный раствор 1М HCl (1,1 экв., 210 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Водный и органический слои разделяли, водную фазу отбрасывали, после чего к органическому слою добавляли K₂CO ₃ (1,4 экв., 37 г, 0,27 моль) и водный раствор HCHO (37%) (1 мл/ммоль, 190 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут. Образовавшиеся две фазы разделяли, а органический слой собирали и концентрировали в вакууме. Полученный неочищенный продукт растворяли в метил-трет-бутиловом эфире (МТБЭ) (400 мл), промывали водой (200 мл), Na₂SO₃ (20% водный р-р, 200 мл) и водой (200 мл). Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и выпаривали в вакууме. Соединение 5 было получено после короткой очистки с помощью флеш-хроматографии в виде бесцветного масла (20,8 г, 40%).

¹H-ЯМР (CDCl₃ , 300 МГц): 6,23 (т, 1Н, J=2,7 Гц); 5,51 (т, 1Н, J=2,2 Гц); 4,61 (дд, 1Н, J=10,3 Гц, J=3,3 Гц); 4,22 (кв, 2H, J=7,1 Гц); 3,17-3,05 (м, 1Н); 2,75-2,64 (м, 1Н); 1,47 (с, 9H); 1,23 (т, 3H, J=7,1 Гц) м.д.

ПРИМЕР 3

3.1 Синтез соединения формулы V: N-тозилиминобензилиодинана

Синтез соединения, соответствующего заголовку, показан на схеме 5.

Схема 5

п-Толуолсульфонамид (5,13 г), гидроксид калия (4,20 г) и метанол (120 мл) перемешивали в конической колбе в ледяной ванне, что позволяло поддерживать температуру реакционной смеси ниже 10°C. К перемешиваемой смеси добавляли йодбензолдиацетат (9,60 г), после чего полученный раствор желтого цвета перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов. Затем реакционную смесь вливали в большой избыток ледяной воды и перемешивали в течение 1 часа. За ночь из раствора выпало твердое вещество желтого цвета. Твердое светло-желтое вещество выделяли фильтрацией и сушили потоком воздуха, пропускаемым через воронку Бюхнера. Несколько порций эфира, в котором продукт нерастворим, использовали, чтобы смыть остаточный йодбензол. Желтое твердое вещество растворяли в минимально возможном количестве кипящего метанола. Раствор на ночь поместили в морозилку, после чего желтовато-белое твердое вещество получили с помощью фильтрации (5,1 г, 46%).

3.2 Синтез соединения формулы V: N-тозилиминобензилиодинана

KOH (2,5 экв., 393 г, 7,00 моль) добавляли к раствору п-толуолсульфонамида (1 экв., 480 г, 2,80 моль) в MeOH (11 л), после чего смесь перемешивали при комнатной температуре до полного растворения. Затем смесь охлаждали до 0°C, добавляли йодбензолдиацетат (1 экв., 903 г, 2,80 моль) и перемешивали при 0°C в течение 40 минут. Температуру реакции медленно повышали до 22°C и оставляли на ночь при перемешивании. Образовавшееся твердое вещество фильтровали, промывали Et₂O (250 мл) и сушили в вакууме при комнатной температуре (285 г). Дополнительные фракции получали охладив маточные растворы до 0°C и медленно добавляя смесь H₂O/лед (5 л). Полученную смесь оставляли на ночь при 5°C. Затем осадок фильтровали, промывали Et ₂O (250 мл) и сушили в вакууме при комнатной температуре (479 г, общий выход 73%).

ПРИМЕР 4

Синтез гидробромида (3R,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида) 9c и гидробромида (3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида) 9d

Синтез указанных в заголовке соединений (9c и 9d) показан на схеме 6.

Схема 6

4.1.1 Синтез 5-трет-бутилового 6-этилового эфира 3R,6R-4-оксо-1-(4-толуолсульфонил)-1,5-диазаспиро[2,4]гептан-5,6-дикарбоновой кислоты 7c и 5-трет-бутилового 6-этилового эфира 3S,6R-4-оксо-1-(4-толуолсульфонил)-1,5-диазаспиро[2,4]гептан-5,6-дикарбоновой кислоты 7d

К холодному раствору (0°C, ледяная баня) (R)-5 (3,02 г, 11,21 ммоль) в сухом ацетонитриле (12 мл) в один прием добавляли PhI=NTs (см. пример 2) (6,27 г, 16,8 ммоль), а затем Cu(acac)₂ (293 мг, 1,12 ммоль). Полученную гетерогенную смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и оставляли на ночь при перемешивании. К полученной смеси добавляли 1M NaOH (50 мл), после чего смесь экстрагировали EtOAc (3×25 мл). Затем органические слои промывали соляным раствором (25 мл), сушили над безводным Na₂SO₄ и выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью флеш-хроматографии (SiO₂, гексаны/EtOAc: 2/1), получая азиридин 7c (730 мг) и 7d (287 мг) в виде белых сухих веществ (общий выход: 23%).

7c

Т.пл.: 94-95°C.

[ ]_D ^25°C=+42° (0,032, CHCl₃ ).

ИК (KBr, см^-1): 2977, 2928, 1808, 1746, 1352, 1298, 1251, 1192, 1161 988, 690.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 500 МГц) (7c): 7,82 (д, 2H, J=7,3 Гц); 7,31 (д, 2H, J=7,7 Гц); 4,74 (дд, 1Н, J=9,7 Гц, J=2,02 Гц); 4,25-4,22 (м, 2H); 3,28 (дд, 1Н, J=14,4 Гц, J=9,7 Гц); 2,78 (с, 1Н); 2,57 (с, 1Н); 2,53 (дд, 1Н, J=14,4 Гц, J=2,02 Гц); 2,42 (с, 3H); 1,49 (с, 9H); 1,29 (т, 3H, J=7,0 Гц) м.д.

¹³C (CDCl₃, 125 МГц) (7c): 170,5, 166,9, 148,7, 145,1, 135,2, 129,6, 127,9, 84,5, 62,0, 55,5, 47,1, 38,3, 27,7, 25,3, 21,5, 14,0 м.д.

MS (ESI+): m/z: 339 (M+1-Boc).

7d

Т.пл.: 55-56°C.

[ ]_D ^25°C=+11° (0,036, CHCl₃ ).

ИК (KBr, см^-1): 2981, 2936, 1799, 1749, 1371, 1330, 1253, 1203, 1156, 1094, 989, 687.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 500 МГц) (7d): 7,79 (д, 2H, J-8,0 Гц); 7,30 (д, 2H, J=7,7 Гц); 4,70 (дд, 1Н, J=9,4 Гц, J=4,3 Гц); 4,30-4,22 (м, 2H); 3,06 (дд, 1Н, J=15,1 Гц, J=4,3 Гц); 2,92 (дд, 1Н, J=15,4 Гц, J=9,4 Гц); 2,82 (с, 1Н); 2,63 (с, 1Н); 2,41 (с, 3H); 1,49 (с, 9H); 1,28 (т, 3H, J=7,0 Гц) м.д.

¹³C (CDCl₃, 125 МГц) (7d): 169,5, 167,1, 148,9, 145,0, 135,7, 129,6, 127,9, 84,5, 62,1, 56,1, 47,0, 37,1, 27,8, 24,5, 21,6, 14,0 м.д.

MS (ESI+): m/z: 339 (M+1-Boc).

4.1.2 Синтез 5-трет-бутилового 6-этилового эфира 3S,6R-4-оксо-1-(4-толуолсульфонил)-1,5-диазаспиро[2.4]гептан-5,6-дикарбоновой кислоты 7d с улучшенным выделением продукта

К холодному раствору (0°C, ледяная баня) (R)-5 (1,84 г, 6,82 ммоль) в сухом ацетонитриле (7 мл) в один прием добавляли PhI=NTs (3,82 г, 10,2 ммоль), а затем Cu(acac)₂ (178 мг, 0,682 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и оставляли на ночь при перемешивании. Полученную смесь выпаривали в вакууме. Неочищенное масло очищали с помощью флеш-хроматографии (SiO₂, CH₂Cl₂/EtOAc: 9/1) с получением смеси азиридинов без примеси п-TsNH₂ (по данным ВЭЖХ-МС). Затем смесь снова подвергали хроматографической очистке (SiO₂, гексан/EtOAc: 2/1) с получением цис-азиридина 7d в виде чисто белой пены (8%).

4.2.1 Синтез гидробромида 3R,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9c в одном реакторе

Смесь азиридина 7c (200 мг, 0,46 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 40 мг) и пиридина (37 мкл, 0,46 ммоль) облучали микроволнами (300 Вт) при 100°C в течение 10 минут. Неочищенную смесь растворяли в этилацетате [EtOAc] (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Бетаин 8c использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (чистота по данным ВЭЖХ 93%). Неочищенное коричневое масло растворяли в водном растворе (48%) HBr (20 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли водой и промывали EtOAc (3×10 мл), а водную фазу выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью хроматографии с использованием порошка целлюлозы : SiО₂ : порошка целлюлозы : активированного древесного угля (1 см : 0,5 см : 0,5 см : 2 см) в качестве неподвижной фазы, получая 9c в виде сухого вещества (51 мг, 28%). Т.пл.: >200°C.

[ ]_D ^25°C=+40° (0,041, CH₃OH).

ИК (KBr, см^-1): 3434, 3051, 1725, 1633, 1488, 1420, 1384, 1280, 1188, 1145, 1083, 683.

¹H-ЯМР (D₂O, 500 МГц): 8,82 (д, 2H, J=5,3 Гц); 8,59 (т, 1Н, J=7,8 Гц); 8,09 (т, 2H, J=6,8 Гц); 5,21 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,93 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,24 (т, 1Н, J=9,2 Гц); 3,01 (дд, 1Н, J=13,9 Гц, J=9,3 Гц); 2,11 (т, 1Н, J=7,8 Гц) м.д.

¹³C (D₂O, 125 МГц): 173,2, 173,1, 147,1, 145,6, 128,6, 64,4, 64,2, 49,3, 33,0 м.д.

MS (ESI+): m/z: 236 (М+1-2Br).

4.2.2 Синтез гидробромида 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9d в одном реакторе

Смесь азиридина 7d (200 мг, 0,46 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 40 мг) и пиридина (37 мкл, 0,46 ммоль) облучали микроволнами (300 Вт) при 100°C в течение 10 минут. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Бетаин 8d использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (чистота по данным ВЭЖХ 93%). Неочищенное коричневое масло растворяли в водном растворе 48% HBr (20 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли водой и промывали EtOAc (3×10 мл), а водную фазу выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью хроматографии с использованием порошка целлюлозы : SiO₂ : порошка целлюлозы : активированного древесного угля (1 см : 0,5 см : 0,5 см : 2 см) в качестве неподвижной фазы, получая 9d в виде сухого вещества (52 мг, 28%). Т.пл. >200°C.

[ ]_D ^25°C=+40° (0,038, CH₃OH).

ИК (KBr, см^-1): 3435, 3051, 1721, 1631, 1509, 1475, 1422, 1384, 1280, 1190, 1144, 683.

¹H-ЯМР (D₂O, 500 МГц): 8,76 (д, 2H, J=5,3 Гц); 8,59 (т, 1Н, J=7,8 Гц); 8,07 (т, 2H, J=6,8 Гц); 5,19 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,78 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,33 (т, 1Н, J=9,2 Гц); 2,90 (дд, 1Н, J=13,9 Гц, J=9,3 Гц); 2,46 (т, 1Н, J=7,8 Гц) м.д.

¹³C (D₂O, 125 МГц): 173,3, 172,4, 147,0, 145,1, 128,5, 65,6, 64,7, 49,3, 33,9 м.д.

MS (ESI+): m/z: 236 (M+1-2Br).

4.2.3 Однореакторный синтез гидробромида 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9d с улучшенной кристаллизацией

Смесь азиридина 7d (100 мг, 0,23 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 20 мг) и пиридина (18 мкл, 0,23 ммоль) нагревали при 90°C в течение 3 часов. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (3 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме. Остаток растирали в Et ₂O и фильтровали с получением бетаина 8d в виде твердого вещества коричневого цвета. Полученное соединение (8d) растворяли в 48% водном растворе HBr (10 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18-72 часов. Реакцию контролировали анализом ВЭЖХ-МС. Неочищенное масло растирали в ацетоне с получением коричневого твердого вещества. Полученное твердое вещество растворяли в минимальном количестве MeOH (1 мл), после чего добавляли Et₂O или ацетон, пока не происходило осаждение. Затем твердое вещество фильтровали и сушили в вакууме (ВНИМАНИЕ: продукт является высокогигроскопичным). Процесс повторяли дважды, после чего чистоту продукта определяли с помощью анализа ВЭЖХ (выход 80%).

ПРИМЕР 5

Синтез (гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида) 9a и (гидробромид 3R,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида) 9b

Синтез указанных в заголовке соединений (9a и 9b) показан на схеме 7.

Схема 7

5.1 Синтез 5-трет-бутилового 6-этилового эфира 3S,6S-4-оксо-1-(4-толуолсульфонил)-1,5-диазаспиро[2,4]гептан-5,6-дикарбоновой кислоты 7a и 5-трет-бутилового 6-этилового эфира 3R,6S-4-оксо-1-(4-толуолсульфонил)-1,5-диазаспиро[2,4]гептан-5,6-дикарбоновой кислоты 7b

К холодному раствору (0°C, ледяная баня) (S)-5 (1,84 г, 6,82 ммоль) в сухом ацетонитриле (7 мл) в один прием добавляли PhI=NTs (см. пример 2) (3,82 г, 10,2 ммоль), а затем Cu(acac)₂ (178 мг, 0,682 ммоль). Полученную гетерогенную смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и оставляли на ночь при перемешивании. К полученной смеси добавляли 1M NaOH (20 мл), после чего смесь экстрагировали EtOAc (3×25 мл). Затем органические слои промывали соляным раствором (25 мл), сушили над безводным Na₂SO₄ и выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью флеш-хроматографии (SiO₂, гексаны/EtOAc: 2/1) с получением азиридина 7a (641 мг) и 7b (478 мг) в виде белых твердых веществ (общий выход: 37%).

7a

Т.пл.: 95-96°C.

[ ]_D ^25°C=-57° (0,029, CHCl₃ ).

ИК (KBr, см^-1): 2977, 2928, 1808, 1746, 1352, 1298, 1251, 1192, 1161, 988, 690.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 500 МГц) (7a): 7,77 (д, 2H, J=7,3 Гц); 7,27 (д, 2H, J=7,7 Гц); 4,70 (дд, 1Н, J=9,7 Гц, J=2,02 Гц); 4,21-4,17 (м, 2H); 3,22 (дд, 1Н, J=14,4 Гц, J=9,7 Гц); 2,75 (с, 1Н); 2,51 (с, 1Н); 2,49 (дд, 1Н, J=14,4 Гц, J=2,02 Гц); 2,37 (с, 3H); 1,45 (с, 9H); 1,27 (т, 3H, J=7,0 Гц) м.д.

¹³C (CDCl₃, 125 МГц) (7a): 170,5, 166,9, 148,7, 145,1, 135,2, 129,6, 127,9, 84,5, 62,0, 55,5, 47,1, 38,3, 27,7, 25,3, 21,5, 14,0 м.д.

MS (ESI+): m/z: 339 (M+1-Boc).

7b

Т.пл.: 57-58°C.

[ ]_D ^25°C=-13° (0,068, CHCl₃ ).

ИК (KBr, см^-1): 2982, 2936, 1799, 1749, 1371, 1330, 1252, 1203, 1154, 1093, 989, 687.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 500 МГц) (7b): 7,78 (д, 2H, J=8,0 Гц); 7,29 (д, 2H, J=7,7 Гц); 4,70 (дд, 1Н, J=9,4 Гц, J=4,3 Гц); 4,29-4,20 (м, 2H); 3,04 (дд, 1Н, J=15,1 Гц, J=4,3 Гц); 2,91 (дд, 1Н, J=15,4 Гц, J=9,4 Гц); 2,82 (с, 1Н); 2,63 (с, 1Н); 2,40 (с, 3H); 1,48 (с, 9H); 1,29 (т, 3H, J=7,0 Гц) м.д.

¹³C (CDCl₃, 125 МГц) (7b): 169,5, 167,1, 148,9, 145,0, 135,7, 129,6, 127,9, 84,5, 62,1, 56,1, 47,0, 37,1, 27,8, 24,5, 21,6, 14,0 м.д.

MS (ESI+): m/z: 339 (M+1-Boc).

5.2.1 Однореакторный синтез гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9a

Смесь азиридина 7a (311 мг, 0,71 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 60 мг) и пиридина (58 мкл, 0,71 ммоль) облучали микроволнами (300 Вт) при 100°C в течение 10 минут. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Бетаин 8a использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (чистота по данным ВЭЖХ 93%). Неочищенное коричневое масло растворяли в 48% водном растворе HBr (30 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли водой и промывали EtOAc (3×10 мл), после чего водную фазу выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью хроматографии с использованием порошка целлюлозы : SiO₂ : порошка целлюлозы : активированного древесного угля (1 см : 0,5 см : 0,5 см : 2 см) в качестве неподвижной фазы, получая 9a в виде твердого вещества (110 мг, 40%).

Т.пл.: >200°C.

[ ]_D ^25°C=-49° (0,069, CH₃OH).

ИК (KBr, см^-1): 3433, 3051, 1724, 1633, 1488, 1420, 1384, 1281, 1188, 1144, 1083, 683.

¹H-ЯМР (D₂O, 500 МГц): 8,82 (д, 2H, J=5,3 Гц); 8,59 (т, 1Н, J=7,8 Гц); 8,08 (т, 2H, J=6,8 Гц); 5,23 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,97 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,28 (т, 1Н, J=9,2 Гц); 3,06 (дд, 1Н, J=13,9 Гц, J=9,3 Гц); 2,13 (т, 1Н, J=7,8 Гц) м.д.

¹³C (D₂O, 125 МГц): 173,1, 172,6, 147,2, 145,6, 128,6, 63,9, 63,7, 49,2, 32,7 м.д.

MS (ESI+): m/z: 236 (M+1-2Br).

5.2.2 Однореакторный синтез гидробромида 3R,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9b

Смесь азиридина 7b (200 мг, 0,46 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 40 мг) и пиридина (37 мкл, 0,46 ммоль) облучали микроволнами (300 Вт) при 100°C в течение 10 минут. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Бетаин 8b использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (чистота по данным ВЭЖХ 93%). Неочищенное коричневое масло растворяли в 48% водном растворе HBr (20 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли водой и промывали EtOAc (2×10 мл), после чего водную фазу выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью хроматографии с использованием порошка целлюлозы : SiO₂ : порошка целлюлозы : активированного древесного угля (1 см : 0,5 см : 0,5 см : 2 см) в качестве неподвижной фазы, получая 9b в виде сухого вещества (44 мг, 24%).

Т.пл.: >200°C.

[ ]_D ^25°C=-09° (0,12, CH₃OH).

ИК (KBr, см^-1): 3435, 3049, 1724, 1631, 1513, 1475, 1420, 1384, 1280, 1190, 1144, 683.

¹H-ЯМР (D₂O, 500 МГц): 8,82 (д, 2H, J=5,3 Гц); 8,59 (т, 1Н, J=7,8 Гц); 8,08 (т, 2H, J=6,8 Гц); 5,23 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,97 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,28 (т, 1Н, J=9,2 Гц); 3,06 (дд, 1Н, J=13,9 Гц, J=9,3 Гц); 2,13 (т, 1Н, J=7,8 Гц) м.д.

¹³C (D₂O, 125 МГц): 173,4, 172,4, 147,0, 145,0, 128,5, 65,7, 64,8, 49,3, 33,9 м.д.

MS (ESI+): m/z: 236 (M+1-2Br).

ПРИМЕР 6

Постадийный синтез гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида

6.1 Синтез бетаина 8a

Следуя той же методике, как и в примере 5, смесь азиридина 7a (311 мг, 0,71 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 60 мг) и пиридина (58 мкл, 0,71 ммоль) облучали микроволнами (300 Вт) при 100°C в течение 10 минут. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Бетаин 8a, очищенный с помощью обработки диэтиловым эфиром, выделяли в виде белого твердого вещества.

Т.пл.: 127-128°C.

ИК (KBr, см^-1): 3434, 2980, 1786, 1746, 1489, 1370, 1311, 1287, 1199, 1153, 1121, 555.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): 9,2 (д, 2H, J=5,6 Гц); 8,3 (т, 1Н, J=7,7 Гц); 7,89 (т, 2H, J=6,9 Гц); 7,69 (д, 2H, J=8,0 Гц); 7,10 (д, 2H, J=8,0 Гц); 5,07 (д, 1Н, J=13,0 Гц); 4,89 (д, 1Н, J=12,6 Гц); 4,27 (т, 2H, J=7,1 Гц); 4,20-4,13 (м, 2H); 2,81 (дд, 1Н, J=12,8 Гц, J=7,1 Гц); 2,31 (с, 3H); 2,04-1,98 (м, 1Н); 1,38 (с, 9H); 1,25 (т, 3H, J=7,1 Гц) м.д.

MS (ESI+): m/z : 518 (M+1).

Альтернативно бетаин 8a получали нагревая ту же реакционную смесь (азиридина 7a (311 мг, 0,71 ммоль), монтмориллонита MK10 (20% по весу, 60 мг) и пиридина (58 мкл, 0,71 ммоль)) при 90°C в течение 7 часов. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc (10 мл), фильтровали и выпаривали в вакууме, пока анализ ВЭЖХ не показывал отсутствие остаточного пиридина. Полученный выход был подобен выходу, полученному с использованием микроволн.

6.2 Синтез гидробромида 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида 9a

Чистый бетаин 8a, полученный на предыдущей стадии, растворяли в 48% водном растворе HBr (30 мл) и нагревали с дефлегмацией в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли водой и промывали EtOAc (3×10 мл), после чего водную фазу выпаривали досуха. Неочищенное масло очищали с помощью хроматографии с использованием порошка целлюлозы : SiO₂ : порошка целлюлозы : активированного древесного угля (1 см : 0,5 см : 0,5 см : 2 см) в качестве неподвижной фазы, получая 9a в виде твердого вещества (110 мг, 40%).

Т.пл.: >2000°C.

[ ]_D ^25°C=-49° (0,069, CH₃OH).

ИК (KBr, см^-1): 3433, 3051, 1724, 1633, 1488, 1420, 1384, 1281, 1188, 1144, 1083, 683.

¹H-ЯМР (D₂O, 500 МГц): 8,82 (д, 2H, J=5,3 Гц); 8,59 (т, 1Н, J=7,8 Гц); 8,08 (т, 2H, J=6,8 Гц); 5,23 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,97 (д, 1Н, J=14,3 Гц); 4,28 (т, 1Н, J=9,2 Гц); 3,06 (дд, 1Н, J=13,9 Гц, J=9,3 Гц); 2,13 (т, 1Н, J=7,8 Гц) м.д.

¹³C (D₂O, 125 МГц): 173,1, 172,6, 147,2, 145,6, 128,6, 63,9, 63,7, 49,2, 32,7 м.д.

MS (ESI+): m/z: 236 (М+1-2Br).

ПРИМЕР 7

Влияние различных изомеров (9a, 9b, 9c и 9d) на рост опухоли. Тестируемая опухоль: Renca

Данный анализ был проведен с целью исследования влияния каждого стереоизомера на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели клетки Renca. Влияние каждого стереоизомера сравнивали с плацебо. Исследованы следующие стереоизомеры:

Изомер 1: гидробромид 3R,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида (9b)

Изомер 2: гидробромид 3R,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида (9c)

Изомер 3: гидробромид 3S,5S-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида (9a)

Изомер 4: гидробромид 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида (9d)

Указанные изомеры могут быть получены согласно способу, описанному в примерах 4, 5 и 6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

Renca является почечно-клеточной карциномой, полученной в линии мышей Balb/c и поэтому являющейся изогенной в мышах с генетическим окружением Balb/c (Melder R.J. et al., Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54: 535-547; Felluga B. et al., 1969, J. Natl. Cancer Inst. 43: 319-333). Renca считают умеренно иммуногенной опухолью и используют в качестве подходящей модели для тестирования иммунологических методов (Salup R.R., et al., 1992, The Journal of Urology, 147: 1120-1123).

Клетки Renca (CLS, Eppelheim, Германия) культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10 ⁶ клеток в 75-см² культуральные флаконы. Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур после трипсинизации (Sigma, St. Louis, MO, USA), использовали в качестве источника клеток Renca для исследований, описанных ниже.

Лекарственные вещества в исследовании

Активный компонент

Изомер 1 (9b) в концентрации 2,815 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 2 (9c) в концентрации 2,520 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 3 (9a) в концентрации 2,080 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 4 (9d) в концентрации 3,040 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Плацебо

Физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain).

Мыши

Животное	Balb/c AnNHsd
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с Renca
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 181 самца
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Число животных в выборке

Согласно предыдущим данным число животных в выборке, необходимое для достижения значимости, составляло 26 животных на группу. Указанное число животных в выборке вычисляли используя программу Epi-info v6.0 (Fleiss. Statistical Methods for rates and Proportions. 2nd Ed, Wiley, 1981: 38-45) и оценивали для статистической мощности 0,8 с уровнем доверительной вероятности 0,95 для двойного уменьшения площади опухоли, при отношении случай-контроль 1-1.

Оборудование

Ламинар, ванна, инвертационный микроскоп, счетная камера, CO₂ инкубатор, центрифуга, штангенциркуль, весы, регулируемые пипетки, баллон с азотом, холодильник/морозильник и клетки для иммунодефицитных мышей.

Реактивы

Трипановый синий (Sigma, St. Louis, MO, USA), стерильный фосфатно-солевой буфер (Sigma, St. Louis, MO, USA), физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain).

Доза, среда, путь и объем введения

Доза

Каждый изомер тестировали при уровне доз 260 нг, которые вводили в дни 6, 7 и 14 после введения опухоли.

Среда

Среда, которой разбавляли изомеры, представляла собой физиологический раствор.

Путь введения и объем

Введение осуществляли внутрибрюшинным путем (в/б). Введенный объем составлял 0,2 мл/животное. Указанный путь был выбран, поскольку являлся одним из описанных в оригинальной методике (Pérez S., et al., 2003, Clinical Cancer Research. 9: 5776-5785).

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам (Balb/c) вводили 0,2 мл, содержащих 10 ⁵ живых клеток Renca. День подкожной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мыши Balb/c, которым ввели клетки Renca, были распределены в 5 экспериментальных групп:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) BALB/C	31	Самец	Плацебо (P.S.)		6, 7, 14	в/б
(C1) BALB/C	30	Самец	изомер 1	260 нг	6, 7, 14	в/б
(C2) BALB/C	30	Самец	изомер 2	260 нг	6, 7, 14	в/б
(C3) BALB/C	30	Самец	изомер 3	260 нг	6, 7, 14	в/б
(C4) BALB/C	30	Самец	изомер 4	260 нг	6, 7, 14	в/б
* Дневная доза одной мыши

За мышами вели ежедневное наблюдение, при этом размер опухоли регистрировали два раза в неделю. Регистрацию выполняли измеряя два перпендикулярных диаметра (Д/Ш) штангенциркулем. Указанные измерения использовали, чтобы получить значение площади и объема опухоли:

Площадь опухоли = Д×Ш (мм²)

Объем опухоли = Д×Ш ²×1/2 (мм³)

Результаты выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. или срединное значение от каждой экспериментальной группы.

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между введением изомеров и введением плацебо. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах с помощью теста Колмогорова, Смирнова - p<0,05. Непараметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, оказывали ли изомеры ингибирующее воздействие на рост опухолей. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Из-за высокой дисперсии данных выпадающие значения (животные с площадями опухолей ниже 25 или выше 75% в день 25) были исключены из исследования.

Использовали статистическое программное обеспечение SPSSv12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирующее воздействие изомеров

на рост клеток опухоли Renca

Запланировали исследование тридцати мышей в группе (тридцать одна из группы плацебо). Две мыши из группы, в которой вводили изомер 2, умерли по неизвестным причинам на второй неделе после введения опухоли и были исключены.

В таблицах 1 и 2 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения. В указанные таблицы сведены срединные значения площади (таблица 1) или объема (таблица 2) в группах мышей, которым вводили изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 1 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза нг/мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	11	14	18	21	25
P.S.	-	А1	31	0	0	9	36	64	132
Изомер 1	260	C1	30	0	0	12,5	36	81	160,5
Изомер 2	260	C2	28	0	0	9	42	77	140
Изомер 3	260	C3	30	0	0	4	18	45,5	90
Изомер 4	260	C4	30	0	0	0	9	25	63,5

Таблица 2 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза нг/мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	11	14	18	21	25
P.S.	-	А1	31	0	0	10	108	256	726
Изомер 1	260	C1	30	0	0	22,75	108	329,25	907,5
Изомер 2	260	C2	28	0	0	13,5	126	278,75	613,25
Изомер 3	260	C3	30	0	0	4	36	148,75	405
Изомер 4	260	C4	30	0	0	0	13,5	62,5	238,25

В таблицах 3 и 4 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения. В данные таблицы сведены средние значения площади (таблица 3) или объема (таблица 4) в группах мышей, которым вводили изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 3 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обработка	Доза нг/мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	11	14	18	21	25
P.S.	-	А1	31	0	0,19	10,52	33,16	68,45	134,9
Изомер 1	260	C1	30	0	1,2	14,1	44,07	86,6	149,97
Изомер 2	260	C2	28	0	1,6	14,46	55,14	96,86	156,53
Изомер 3	260	C3	30	0	0,3	7,5	31	64,57	106,17
Изомер 4	260	C4	30	0	0	2,87	15,47	37,37	81,3

Таблица 4 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обработка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	11	14	18	21	25
P.S.	-	А1	31	0	0,16	24,52	106,71	312,58	816,93
Изомер 1	260	C1	30	0	1,73	36,88	174,37	429,07	895,58
Изомер 2	260	C2	28	0	2,34	32,05	217,43	453,89	938,48
Изомер 3	260	C3	30	0	0,28	14,55	101,4	278,15	557,18
Изомер 4	260	C4	30	0	0	4,73	40,67	126,42	372,82

Наблюдали различия в скорости роста опухолей Renca у мышей, получавших изомер 3, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) в день 18 и 25 развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухолей Renca у мышей, получавших изомер 4, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,01) во все дни, оцениваемые после 14 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

На фиг. 1 представлен график срединных значений площадей опухолей (Группы А1, С1, C2, C3, C4), а на фиг. 2 представлен график срединных значений объемов опухолей (Группы А1, С1, C2, C3, C4). Как может быть видно из указанных фигур, различия в скорости роста опухолей Renca наблюдались у мышей, получавших изомер 3 и изомер 4, по сравнению с мышами, получавшими плацебо.

На фиг. 3 представлен график средних значений площадей опухолей (Группы А1, С1, C2, C3, C4), а на фиг. 4 представлен график средних значений объемов опухолей (Группы А1, С1, C2, C3, C4). Как может быть видно из указанных фигур, различия в скорости роста опухолей Renca наблюдались у мышей, получавших изомер 3 и изомер 4, по сравнению с мышами, получавшими плацебо.

Результаты показывают, что изомер 3 и изомер 4 ингибируют рост почечно-клеточной карциномы (Renca) in vivo, при этом изомер 4 оказывал наиболее сильное ингибирующее воздействие на рост опухолей Renca.

ПРИМЕР 8

Сравнение влияния на рост опухолей, оказываемого различными изомерами (9a, 9b, 9c и 9d) и смесью BLAS

Тестируемая опухоль: ASB XIV

Данный анализ был проведен с целью сравнения влияния каждого стереоизомера на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели опухоли ASB XIV, с влиянием смеси всех указанных стереоизомеров. Анализируемые стереоизомеры являлись теми же, что и в примере 7 выше, плюс использовали смесь из всех них (BLAS). Оборудование (в случае необходимости), реактивы, доза, среда, путь и объем введения являлись теми же, как и в примере 7.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

ASB XIV является легочной плоскоклеточной карциномой, полученной в линии мышей Balb/c и поэтому являющейся изогенной в мышах с генетическим окружением Balb/c.

Клетки ASB XIV (CLS, Eppelheim, Германия) культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10⁶ клеток в 75-см ² культуральные флаконы. Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур после трипсинизации (Sigma, St. Louis, MO, USA), использовали в качестве источника клеток ASB XIV в настоящем примере.

Лекарственное вещество в исследовании

Активный компонент

BLAS (смесь изомеров 1, 2, 3 и 4) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 1 (9b) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 2 (9c) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 3 (9a) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Изомер 4 (9d) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Плацебо

Физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain).

Мыши

Животное	Balb/c AnNHsd
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с клетками ASB XIV
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 187 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Число животных в выборке

Согласно предыдущим данным число животных в выборке, необходимое для достижения значимости, составляло 26 животных на группу. Указанное число животных в выборке вычисляли используя программу Epi-info v6.0 и оценивали для статистической мощности 0,8 с уровнем доверительной вероятности 0,95 для двойного уменьшения площади опухоли, при отношении случай-контроль 1-1.

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам (Balb/c) вводили 0,2 мл, содержащих 2×10 ⁵ живых клеток ASB XIV. День подкожной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мыши Balb/c, которым ввели клетки ASB XIV, были распределены в 6 экспериментальных групп:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) BALB/C	32	Самец	Плацебо (P.S.)		6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(В1) BALB/C	31	Самец	BLAS	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C1) BALB/C	31	Самец	изомер 1	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C2) BALB/C	31	Самец	изомер 2	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C3) BALB/C	31	Самец	изомер 3	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C4) BALB/C	31	Самец	изомер 4	260 нг	6, 7 и 14	в/б
* Дневная доза одной мыши

За мышами вели ежедневное наблюдение, при этом размер опухоли регистрировали два раза в неделю. Регистрацию выполняли измеряя два перпендикулярных диаметра (d1/d2) штангенциркулем. Указанные измерения использовали, чтобы получить значение площади и объема опухоли:

Площадь опухоли = d1×d2 (мм²)

Объем опухоли = d1×d2 ²×1/2 (мм³)

Результаты выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. или срединное значение от каждой экспериментальной группы.

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между BLAS или каждым отдельным изомером и введением плацебо. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах с помощью теста Колмогорова, Смирнова - p<0,05. Непараметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, оказывал ли BLAS ингибирующее воздействие на рост опухолей. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Из-за высокой дисперсии данных выпадающие значения (животные с площадями опухолей ниже 10 или выше 90% в день 33) были исключены из исследования.

Использовали статистическое программное обеспечение SPSSv12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирующее воздействие BLAS или каждого изомера

на рост клеток опухоли ASB XIV

Исследовали тридцать одну мышь в группе (тридцать две из группы плацебо). Две мыши из группы, в которой вводили изомер 4 (9d), умерли по неизвестным причинам в первую неделю после введения опухоли и были исключены.

В таблицах 5 и 6 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения. В указанные таблицы сведены срединные значения площади или объема в группах мышей, которым вводили BLAS, изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 5 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	8	12	15	19	22	26	29	33
P.S.	-	А1	32	0	0	0	0	16	39	81	120,5	161
BLAS	260	В1	31	0	0	0	0	9	30	64	81	120
Изомер 1	260	C1	31	0	0	0	0	16	36	72	110	154
Изомер 2	260	C2	31	0	0	0	0	25	56	110	144	210
Изомер 3	260	C3	31	0	0	0	0	9	25	64	99	140
Изомер 4	260	C4	29	0	0	0	0	9	25	49	81	110

Таблица 6 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	8	12	15	19	22	26	29	33
P.S.	-	А1	32	0	0	0	0	32	117	364,5	632,75	936
BLAS	260	В1	31	0	0	0	0	13,5	75	245	364,5	600
Изомер 1	260	C1	31	0	0	0	0	32	108	288	550	864
Изомер 2	260	C2	31	0	0	0	0	62,5	196	550	864	1436,5
Изомер 3	260	C3	31	0	0	0	0	13,5	62,5	256	445,5	700
Изомер 4	260	C4	19	0	0	0	0	13,5	62,5	171,5	364,5	550

В таблицах 7 и 8 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения. В данных таблицах приведены средние значения площади или объема в группах мышей, которым вводили BLAS, изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 7 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обработка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	8	12	15	19	22	26	29	33
P.S.	-	А1	32	0	0	0,5	3,84	22,72	47,69	92,41	126,34	169,25
BLAS	260	В1	31	0	0	0,19	2,45	13,81	34,19	68,84	96,52	131,42
Изомер 1	260	C1	31	0	0	0,32	3,45	19,65	46,81	92,52	125,16	165,65
Изомер 2	260	C2	31	0	0	0,71	6,19	29,84	63,55	105,97	142,45	188,87
Изомер 3	260	C3	31	0	0	0,29	2,81	15,16	33,16	68,67	94,61	131,35
Изомер 4	260	C4	29	0	0	0,17	2,79	14,59	34,52	65,86	90,28	123,45

Таблица 8 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	8	12	15	19	22	26	29	33
P.S.	-	А1	32	0	0	0,69	7,52	69,89	197,25	492,77	751,27	1165,34
BLAS	260	В1	31	0	0	0,19	4,26	34,29	116,52	322,06	511,90	806,10
Изомер 1	260	C1	31	0	0	0,45	5,34	53,37	179,79	474,10	733,26	1114,37
Изомер 2	260	C2	31	0	0	1	12,68	102,44	292,39	603,66	913,90	1377,02
Изомер 3	260	C3	31	0	0	0,44	6,31	44,13	116,65	337,18	529,37	848,87
Изомер 4	260	C4	29	0	0	0,16	5,29	36,5	118,19	297,83	451,55	700,66

Наблюдали различия в скорости роста опухолей ASB XIV у мышей, получавших BLAS, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 26 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухолей ASB XIV у мышей, получавших изомер 3, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 26 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухолей ASB XIV у мышей, получавших изомер 4, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 26 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

BLAS, изомер 3 и изомер 4 ингибируют рост карциномы легких ASB XIV. Между ингибирующим воздействием BLAS, изомера 3 и изомера 4 на рост опухоли ASBЕ XIV различий не наблюдали.

ПРИМЕР 9

Сравнение влияния на рост опухолей, оказываемого различными изомерами (9a, 9b, 9c и 9d) и смесью BLAS

Тестируемая опухоль: опухоль Эрлиха

Данный анализ был проведен с целью сравнения влияния каждого стереоизомера на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели опухоли Эрлиха, с влиянием смеси всех указанных стереоизомеров. Использовали те же продукты, оборудование, реактивы, дозы, среды и путь введения, как и в примере 8.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

Мышам вводили клетки опухоли Эрлиха. Она была описана как аденокарцинома молочной железы мышей. Опухоль Эрлиха является карциномой молочной железы мышей, изначально выращенной в аутбредных мышах и принадлежащей, таким образом, к так называемым неспецифическим опухолям (Subiza J.L., Vinuela J.E., Rodriguez R., Gil J., Figueredo M.A., de la Concha. EG. Development of splenic natural suppressor (NS) cells in Ehrlich tumor bearing mice. Int. J. Cancer, 44: 307 315; 1989). Указанные опухоли могут расти через барьеры гистосовместимости и поэтому не являются специфическими по отношению к конкретной линии мышей (Carry P.J., Prescott D.M., Ogilvie G.K. Resistance to Ehrlich ascites tumor in a strain of dystrophic mice. Cancer Res., 39: 2139-2140; 1979).

Клетки Эрлиха культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10⁶ клеток в 75-см² культуральные флаконы. Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур, использовали в качестве источника клеток в исследованиях, описанных ниже.

Мыши

Животное	Balb/c AnNHsd
Основание для выбора	Инбредная линия иммунокомпетентных мышей
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 96 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам (Balb/c) вводили 0,2 мл, содержащих 2×10⁵ живых клеток Эрлиха. День подкожной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мыши Balb/c, которым ввели клетки ASB XIV, были распределены в 6 экспериментальных групп:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) BALB/C	16	Самец	Плацебо (P.S.)		6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(В1) BALB/C	16	Самец	BLAS	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C1) BALB/C	16	Самец	изомер 1	260 нг	6, 7 и 14	в/б
6, 7 и 14	в/б
(C2) BALB/C	16	Самец	изомер 2	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C3) BALB/C	16	Самец	изомер 3	260 нг	6, 7 и 14 6, 7 и 14	в/б в/б
(C4) BALB/C	16	Самец	изомер 4	260 нг	6, 7 и 14	в/б
* Дневная доза одной мыши

За мышами вели ежедневное наблюдение, при этом размер опухоли регистрировали два раза в неделю. Регистрацию выполняли измеряя два перпендикулярных диаметра (Д/Ш) штангенциркулем. Указанные измерения использовали, чтобы получить значение площади и объема опухоли:

Площадь опухоли = Д×Ш (мм²)

Объем опухоли = Д×Ш ²×1/2 (мм³)

Результаты выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. или срединное значение от каждой экспериментальной группы.

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между BLAS или каждым отдельным изомером и введением плацебо. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах с помощью теста Колмогорова, Смирнова - p<0,05. Непараметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, оказывал ли BLAS ингибирующее воздействие на рост опухолей. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Использовали статистическое программное обеспечение SPSSv12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирующее воздействие BLAS на рост клеток опухоли Эрлиха

Запланировали исследование шестнадцати мышей в группе.

В таблицах 9 и 10 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения (n (первый день) во всех случаях равно 16, а доза составляет 260 нг/мышь). В указанные таблицы сведены срединные значения площади или объема в группах мышей, которым вводили BLAS, изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 9 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обработка	Группа	Дни после введения опухоли
0	8	13	16	20	23	29	31	35	38
P.S.	А1	0	10,5	25	49	64	84	103	119	138	148,5
BLAS	В1	0	6,5	18	27,5	39	49	49	52,5	56	64
Изомер 1	C1	0	2	16	20,5	27,5	39,5	39,5	46,5	52,5	53
Изомер 2	C2	0	4	16	20	27,5	33	42	45	51	71
Изомер 3	C3	0	0	9	16	20	25	27,5	36	43	49,5
Изомер 4	C4	0	0	12,5	18	27,5	39	45	48,5	52,5	68

Таблица 10 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обработка	Группа	Дни после введения опухоли
0	8	13	16	20	23	29	31	35	38
P.S.	А1	0	15,75	62,5	171,5	256	336	455,25	575	675	815
BLAS	В1	0	8,75	36	68,75	117	171,5	171,5	183,75	198	232
Изомер 1	C1	0	2	32	47,25	68,75	123,25	123,25	147,75	173,25	191
Изомер 2	C2	0	4	32	40	68,75	91,5	126	135	153	266,5
Изомер 3	C3	0	0	13,5	32	40	62,5	68,75	100,5	135,5	164,25
Изомер 4	C4	0	0	22,75	36	68,75	117	135	157,75	183,75	272

В таблицах 11 и 12 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения (n (первый день) во всех случаях равно 16, а доза составляет 260 нг/мышь). В данных таблицах приведены средние значения площади или объема в группах мышей, которым вводили BLAS, изомеры или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 11 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обработка	Группа	Дни после введения опухоли
0	8	13	16	20	23	29	31	35	38
P.S.	А1	0	9,19	27,5	44	64,19	80,31	98,25	111,5	125,87	147,62
BLAS	В1	0	6,81	19,81	30,31	41,75	51,5	59,87	65	74,19	87,81
Изомер 1	C1	0	5,69	13,69	20,875	32,37	42,12	50	57	68,87	78,81
Изомер 2	C2	0	6,69	14,81	20,37	28,37	35,75	46,12	50,06	60,25	75,37
Изомер 3	C3	0	3,62	10,94	16,5	24,12	32,25	42,94	53,37	66	79,37
Изомер 4	C4	0	3,37	12,44	20,19	31,31	43,06	52,94	63,12	76,31	91,56

Таблица 12 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обработка	Группа	Дни после введения опухоли
0	8	13	16	20	23	29	31	35	38
P.S.	А1	0	17,34	73,56	149,75	263,09	356,34	470,81	571,25	691,75	899,12
BLAS	В1	0	11,91	46,22	86,53	140,81	191,94	237,31	274,87	339,66	437,41
Изомер 1	C1	0	9,91	31,34	53,12	105,19	160,5	202,19	249,06	342,94	425,91
Изомер 2	C2	0	10,97	32,16	51,87	81,81	113,75	167	191,91	258,06	372,5
Изомер 3	C3	0	6	23,53	37,12	65,12	100,44	156,34	213,31	293,87	387,69
Изомер 4	C4	0	5,9	26,91	50,34	95,59	156,53	214,91	274,94	379,72	504,22

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших BLAS, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 16 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни. В день 35 и 38 наблюдали тенденцию в отношении площади (p=0,056 и p=0,08 соответственно). В день 13, 16, 20 и 38 наблюдали тенденцию в отношении объема (p=0,08, p=0,056, p=0,051 и p=0,067 соответственно).

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших изомер 1, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 13 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших изомер 2, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 13 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших изомер 3, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 8 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших изомер 4, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 8 дня развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни. Тенденцию наблюдали в день 35 и 38 либо в отношении площади, либо объема (p=0,061 и p=0,08 соответственно; p=0,102 у обоих).

Наблюдали различия в скорости роста опухоли Эрлиха у мышей, получавших BLAS, и мышей, получавших изомер 3. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) в день 13, 16, 20 и 23 развития опухоли, как было вычислено из U-теста Манна-Уитни.

BLAS, изомер 1, изомер 2, изомер 3 и изомер 4 ингибируют рост клеток опухоли Эрлиха in vivo. Изомер 3 показал наиболее сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли Эрлиха.

ПРИМЕР 10

Влияние изомера 4 (9d) на рост различных опухолей

Следующий анализ был проведен с целью исследования влияния изомера 4 (9d) на различные опухоли в соответствии с методами и материалами, аналогичными используемым в примерах 8 и 9. Во всех случаях в качестве плацебо использовали стерильный физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain). Изомер 4 (9d) тестировали на уровнях доз, указанных в таблице 13, в дни 6, 7 и 14 после введения опухоли. Во всех случаях среда являлась физиологическим раствором, а лекарственные средства вводили внутрибрюшинным путем. Вводимый объем составлял 0,2 мл/животное. Результаты приведены в таблице 13.

Таблица 13
Опухоль	Мыши (кол-во в выборке)	Доза (нг/мышь)	Ингибирование роста опухоли?
CT26.wt (высокая доза карциномы легких)	Balbc/cByl (около 40 самцов)	250	ДА
CT26.CL25 (низкая доза карциномы легких)	Balbc/cByl (около 40 самцов)	250	ДА
Mm5MT (опухоль груди)	C3H/HeN (42 самца)	250	ДА
KLN205 (высокая доза карциномы легких)	DBA/2NCrl (около 62 самцов)	260	ДА
ASBX1V (высокая доза карциномы легких)	Balb/cAnNCrl (61 самец)	260	ДА
ASBX1V (низкая доза карциномы легких)	Balb/cAnNCrl (62 самца)	260	ДА
Льюис (низкая доза карциномы легких)	C57BL/6NCrl (62 самца)	260	ДА
P-815 (мастоцитома)	DBA/2NCrl (42 самца)	250	ДА

ПРИМЕРЫ 11, 12 и 13

Влияние изомера 4 (9d) по сравнению с плацебо

и комбинациями 9d + цисплатин

Тестируемые опухоли: KLN 205 и клетки карциномы легких Льюиса

Данный анализ был проведен с целью сравнения влияния каждого изомера 4 (9d) на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели клетки опухоли KLN 205 и карциномы легких Льюиса, с влиянием смеси изомера 4 (9d) + цисплатин. Использовали те же продукты, оборудование, реактивы, среды, путь и объем введения, как и в примере 7.

Лекарственные вещества в исследовании

В примерах 11, 12 и 13 в исследовании использовали следующие лекарственные вещества.

Активный компонент

Цисплатин (Sigma, St. Louis, MO, USA) в стерильном физиологическом растворе.

Изомер (9d) (гидробромид 3S,5R-1-(3-амино-5-карбокси-2-оксопирролидин-3-илметил)пиридинийбромида) в стерильном физиологическом растворе.

Плацебо

Физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain).

В примерах 11, 12 и 13 за мышами вели ежедневное наблюдение, при этом размер опухоли регистрировали два раза в неделю. Регистрацию выполняли измеряя два перпендикулярных диаметра (d1/d2) штангенциркулем. Указанные измерения использовали, чтобы получить значение площади и объема опухоли:

Площадь опухоли = d1×d2 (мм²)

Объем опухоли = d1×d2²×1/2 (мм³ )

Результаты выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. или срединное значение от каждой экспериментальной группы.

ПРИМЕР 11

Влияние 9d в комбинации с цисплатином на рост опухоли

Тестируемая опухоль: KLN 205

Данный анализ был проведен с целью исследования влияния 9d на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели клетки KLN 205. Их влияние сравнивали с комбинацией цисплатина и 9d и/или плацебо.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

KLN 205 представляет собой плоскоклеточную карциному легких, полученную в линии мышей DBA/2 и поэтому являющуюся изогенной в мышах с генетическим окружением DBA/2 (Kaneko T. and LePage G.A. Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo. Cancer Res. 38: 2084-2090; 1978).

Клетки KLN 205 (CLS, Eppelheim, Германия) культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10⁶ клеток в 75-см² культуральные флаконы.

Пассажные культуры были получены путем сбора отделившихся клеток после обработки трипсином с EDTA (Sigma, St. Louis, MO, USA). Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур, использовали в качестве источника клеток KLN 205 в исследованиях, описанных ниже.

Мыши

Животное	DBA/2NCrl
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с клетками KLN 205
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 62 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Доза

Цисплатин тестировали на уровнях доз 65 мкг, которые вводили два раза в неделю в течение трех недель после введения опухоли.

Изомер 4 (9d) тестировали на уровнях доз 250 нг, которые вводили два раза в неделю в течение трех недель после введения опухоли.

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам (DBA/2) вводили 0,2 мл, содержащих 2×10⁵ живых клеток KLN 205. День подкожной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мыши DBA/2, которым ввели клетки KLN 205, были распределены в 6 экспериментальных групп:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) DBA/2	16	Самец	Плацебо (P.S.)	-	3, 6, 10, 13, 17, 20	в/б
(В1) DBA/2	16	Самец	9d	250 нг
(C1) DBA/2	15	Самец	Цисплатин	65 мкг
(D1) DBA/2	15	Самец	9d Цисплатин	250 нг 65 мкг
* Дневная доза одной мыши

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между плацебо, 9d, цисплатином или 9d + цисплатин. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах с помощью теста Колмогорова, Смирнова - p<0,05. Параметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, обладал ли 9d и/или цисплатин синергическим эффектом в отношении роста опухолей. t-Тест был выбран, поскольку является одним из наиболее известных параметрических тестов.

Использовали статистическое программное обеспечение SPSSv12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирующее воздействие 9d и/или цисплатина на рост опухолевых клеток KLN 205

Запланировали исследование шестнадцати или пятнадцати мышей в группе.

В таблицах 14 и 15 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения. В указанные таблицы сведены срединные значения площади или объема в группах мышей, которым вводили 9d, цисплатин, 9d + цисплатин или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 14 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	16	0	0,5	12,5	30,5	49	80,5	114,5	174	210	270,5
9d	250 нг	В1	16	0	4	16	25	36	64	105,5	132,5	170,5	227,5
Циспла-тин	65 мкг	C1	15	0	4	16	20	36	72	99	120	150	198
9d + цисплатин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	4	9	16	25	42	63	81	100	132

Таблица 15 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	16	0	0,25	22,75	85,25	171,5	342,25	582,75	1044	1477,5	2007
9d	250 нг	В1	16	0	4	32	62,5	108	256	446,75	628,75	937,75	1478,8
Циспла-тин	65 мкг	C1	15	0	4	32	40	108	288	445,5	600	800	1089
9d + цисплатин	250 нг + 65мкг	D1	15	0	4	13,5	32	62,5	126	220,5	364,5	500	700

В таблицах 16 и 17 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения. В данных таблицах приведены средние значения площади или объема в группах мышей, которым вводили 9d, цисплатин, 9d + цисплатин или P.S., оцениваемые ежедневно.

Таблица 16 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	16	0	3,63	17,44	40,81	70,56	104,69	141,75	187,25	221,69	275,31
9d	250 нг	В1	16	0	5,38	17,25	29,88	57,06	81,38	113,5	135,31	168,81	214,44
Циспла-тин	65 мкг	C1	15	0	4,07	14,87	23,93	39,07	72,2	97,07	124,67	147,93	185,33
9d + цисплатин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	3,2	10,6	18,47	31,07	47,2	65,8	85,73	105,73	136,87

Таблица 17 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	16	0	7,12	48,41	151,16	324,47	539,84	813,44	1213,9	1584,0	2166,8
9d	250 нг	В1	16	0	8,81	43,38	94,56	246,03	393,25	611,75	777,53	1068,3	1504,7
Циспла-тин	65 мкг	C1	15	0	5,1	31,77	59,1	119,07	285,43	445,8	637,07	809,03	1129,9
9d + цисплатин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	3,73	19,77	42,17	93,4	170,07	267,57	377,67	514	740,3

Наблюдали различия в скорости роста опухоли KLN 205 у мышей, получавших 9d + цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 17 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью t-теста.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли KLN 205 у мышей, получавших цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 20 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью t-теста.

В скорости роста опухоли KLN 205 у мышей, получавших 9d, и мышей, получавших плацебо, различий не наблюдали. Наблюдали существенную тенденцию во все дни, оцениваемые после 31 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью t-теста.

Таким образом, цисплатин и 9d или цисплатин ингибируют рост клеток KLN 205 in vivo. 9d и цисплатин обладают синергическим эффектом.

ПРИМЕР 12

Влияние изомера (9d) в комбинации с цисплатином на рост

опухоли, введенной подкожно, внутрикожно или внутримышечно

Тестируемая опухоль: KLN 205

Данный анализ был проведен с целью исследования влияния на рост опухолей in vivo у мышей, которым ввели клетки KLN 205. Опухоли индуцировали с помощью подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения.

Влияние комбинации цисплатина и/или изомера (9d) сравнивали с плацебо у мышей, которым ввели опухоль внутрикожно. Кроме того, влияние 9d на рост опухолей in vivo у мышей, которым опухоль ввели внутримышечно или подкожно, также сравнивали с плацебо.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

KLN 205 представляет собой плоскоклеточную карциному легких, полученную в линии мышей DBA/2 и поэтому являющуюся изогенной в мышах с генетическим окружением DBA/2 (Kaneko T. and LePage G.A. Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo. Cancer Res. 38: 2084-2090; 1978).

Клетки KLN 205 (CLS, Eppelheim, Германия) культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10⁶ клеток в 75-см² культуральные флаконы. Пассажные культуры были получены путем сбора отделившихся клеток после обработки трипсином с EDTA (Sigma, St. Louis, MO, USA). Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур, использовали в качестве источника клеток KLN 205 в исследованиях, описанных ниже.

Мыши

Животное	DBA/2NCrl
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с клетками KLN 205
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 80 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Доза

Цисплатин тестировали на уровнях доз 65 мкг, которые вводили в дни 7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28 после введения опухоли.

Изомер (9d) тестировали на уровнях доз 250 нг, которые вводили в дни 7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28 после введения опухоли.

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам (DBA/2) вводили 0,05 мл, содержащих 2×10⁵ живых клеток KLN 205. День подкожной, внутрикожной и внутримышечной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мыши DBA/2, которым ввели клетки KLN 205, были распределены в 8 экспериментальных групп:

Группа	n	Пол	Способ введения	Обработка	Доза*	Дни**	Путь
(A1) DBA/2	10	Самец	подкожно	Плацебо (P.S.)	-	7, 11, 14, 18, 21, 25 и 28	в/б
(A2) DBA/2	10	Самец	подкожно	9d	250 нг
(В1) DBA/2	10	Самец	внутрикожно	Плацебо (P.S.)	-
(В2) DBA/2	10	Самец	внутрикожно	9d	250 нг
(В3) DBA/2	10	Самец	внутрикожно	Цисплатин	65 мкг
(В4) DBA/2	10	Самец	внутрикожно	9d Цисплатин	250 нг 65 мкг
(C1) DBA/2	10	Самец	внутримышечно	Плацебо (P.S.)	-
(C2) DBA/2	10	Самец	внутримышечно	9d	250 нг
* Дневная доза одной мыши ** При внутримышечном введении, помимо указанных дней, мышей обрабатывали в дни 32 и 35.

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между плацебо, 9d, цисплатином или 9d + цисплатин. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах (тест Колмогорова, Смирнова - p<0,05). Непараметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, оказывал ли 9d, цисплатин или 9d + цисплатин ингибирующее воздействие на рост опухолей. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Весь статистический анализ выполняли с помощью с SPSS (Статистического Пакета для Социальных Наук) v13.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирующее воздействие изомера 4 (9d)

на рост опухолевых клеток KLN 205

Запланировали исследование десяти мышей в группе.

В таблицах 18 и 19 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения. В указанные таблицы сведены срединные значения площади или объема в каждый день оценки.

Таблица 18 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обра-ботка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	10	0	18	32,5	61,5	100	156,5	206,5	268
9d	250 нг	А2	10	0	12,5	30	45	70	118,5	159	186
P.S.	-	В1	10	0	12,5	25	54	89,5	142	186	221
9d	250 нг	В2	10	0	12,5	25	42	63,5	95	128	162,5
Цис-платин	65 мкг	В3	10	0	6,5	20	33	56	96	129	155
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	В4	10	0	6,5	18	30	56	88	120	143
P.S.	-	С1	10	0	0	0,23	0,4	0,63	2,8	6,5	12,25	19,89	34,68
9d	250 нг	С2	10	0	0,03	0,17	0,315	0,93	1,83	6,94	12,26	24,34	37,56

Таблица 19 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обра-ботка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	10	0	36	81,25	208,25	400	793,25	1217	1860,5
9d	250 нг	А2	10	0	22,75	75	135	245	506,25	800	1058,75
P.S.	-	В1	10	0	22,75	62,5	166,75	336	748,5	1116	1436,5
9d	250 нг	В2	10	0	22,75	62,5	126	232,75	425,25	608,5	885,75
Цис-платин	65 мкг	В3	10	0	8,75	40	91,5	196	384	646,5	775
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	В4	10	0	8,75	36	75	196	352	600	786,5

В таблицах 20 и 21 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения. В данных таблицах приведены средние значения площади или объема в каждый день оценки.

Таблица 20 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31	34	38
P.S.	-	А1	10	0	17,8	33,3	67,9	112,5	163,9	214	270,7
9d	250 нг	А2	10	0	11,4	27,4	49	74,4	117,4	149,3	179,2
P.S.	-	В1	10	0	13,9	30,6	63,4	97,9	141,9	185,3	231,6
9d	250 нг	В2	10	0	14,3	27,9	46,3	71,2	107,8	141,7	177,1
Цис-платин	65 мкг	В3	10	0	7,3	20	38,3	62,2	93,7	124,1	151,3
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	В4	10	0	6,8	17	31,3	54,6	82,6	115	143,6
P.S.	-	С1	10	0	0,04	0,25	0,36	0,69	2,64	6,81	12,48	20,78	34,38
9d	250 нг	С2	10	0	0,06	0,18	0,37	0,89	2,48	6,7	13,61	29,17	41,53

Таблица 21 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза нг/ мышь	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	10	0	41,3	93,05	257,35	534,45	887,35	1315	1879,85
9d	250 нг	А2	10	0	22	75,5	171,6	304,2	554,9	765,05	1020
P.S.	-	В1	10	0	27,65	85,5	229,1	447,75	777,15	1155,45	1595,8
9d	250 нг	В2	10	0	28,85	74,95	150,05	280,6	496,8	744,75	1029,35
Цис-платин	65 мкг	В3	10	0	11,05	43,6	115,95	233,5	408,05	642,55	848,95
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	В4	10	0	10,3	37,7	91,15	201,6	350,8	592,9	835,8

Наблюдали различия в скорости роста опухоли KLN 205 у мышей, получавших 9d, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 20 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

В скорости роста опухоли KLN 205, индуцированной внутрикожным введением, у мышей, получавших 9d, и мышей, получавших плацебо, различий не наблюдали. Наблюдали существенную тенденцию либо в отношении площади, либо объема все дни, оцениваемые после 17 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли KLN 205, индуцированной внутрикожным введением, у мышей, получавших цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) в 17, 20 и 31 дни развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли KLN 205, индуцированной внутрикожным введением, у мышей, получавших 9d + цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 13 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

В скорости роста опухоли KLN 205, индуцированной внутримышечным введением, у мышей, получавших 9d, и мышей, получавших плацебо, различий не наблюдали, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

Изомер 4 (9d) ингибирует рост клеток опухоли KLN 205 in vivo, индуцированной подкожным введением. 9d + цисплатин или цисплатин ингибируют рост клеток опухоли KLN 205 in vivo, индуцированной внутрикожным введением.

ПРИМЕР 13

Влияние 9d в комбинации с цисплатином на рост опухоли

Тестируемая опухоль: опухоль Льюиса

Данный анализ проводили с целью исследования воздействия на рост опухоли in vivo у мышей, которым ввели клетки карциномы легких Льюиса. Их эффект сравнивается с комбинацией химиотерапевтических агентов плюс 9d и/или плацебо.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опухоль

Карцинома легких Льюиса представляет собой карциному клеток легких, полученную в линии мышей C57BL/6J и поэтому являющуюся изогенной в мышах с генетическим окружением C57BL/6J (Rodrigo Garz n M., Tirapu Fernández de la Cuesta I, Arina Iraeta A., Noel Centelles Llorente M. and Zulueta Francés J. Use of Gene Therapy in a Subcutaneous Murine Model of Lung Cancer. Arch Bronconeumology. 42: 526-532; 2006).

Клетки карциномы легких Льюиса (CLS, Eppelheim, Германия) культивировали in vitro серийными пассажами каждые 3-4 дня. Культуры выращивали с использованием среды RPMI (RPMI, 10% эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамин 2 мМ, неосновные аминокислоты, пируват натрия 1 мМ, HEPES 20 мМ, гентамицин 80 мкг/мл; все реактивы получены от Sigma, St. Louis, MO, USA) с посевом 5×10 ⁶ клеток в 75-см² культуральные флаконы. Пассажные культуры были получены путем сбора отделившихся клеток после обработки трипсином с EDTA (Sigma, St. Louis, MO, USA). Опухолевые клетки, полученные из 48-часовых культур, использовали в качестве источника клеток карциномы легких Льюиса в исследованиях, описанных ниже.

Мыши

Животное	C57BL/6NCrl
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с клетками карциномы легких Льюиса
Поставщик	Charles River Laboratories
Число животных в исследовании	около 60 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	8-10 недель 20-25 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Цисплатин тестировали на уровнях доз 65 мкг, которые вводили в дни 7, 11, 14, 18, 21, 24 и 27 после введения опухоли.

Изомер 4 (9d) тестировали на уровнях доз 250 нг, которые вводили в дни 7, 11, 14, 18, 21, 24 и 27 после введения опухоли.

Схема исследования

Опухоли индуцировали путем подкожного введения в тазовую часть правого бока. Мышам вводили 0,2 мл, содержащих 2×10⁵ живых клеток. День подкожной инъекции обозначали как День 0 теста.

Мышей распределили в 4 экспериментальных группы:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) C57BL/6J	15	Самец	Плацебо (P.S.)	-	7, 11, 14, 18, 21, 25, 28	в/б
(B1) C57BL/6J	15	Самец	9d	250 нг
(C1) C57BL/6J	15	Самец	Цисплатин	65 мкг
(D1) C57BL/6J	15	Самец	9d цисплатин	250 нг 65 мкг
* Дневная доза одной мыши

За мышами вели ежедневное наблюдение, при этом размер опухоли регистрировали два раза в неделю. Регистрацию выполняли измеряя два перпендикулярных диаметра (d1/d2) штангенциркулем. Указанные измерения использовали, чтобы получить значение площади и объема опухоли:

Площадь опухоли = d1×d2 (мм²)

Объем опухоли = d1×d2 ²×1/2 (мм³)

Результаты выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. или срединное значение от каждой экспериментальной группы.

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между плацебо, 9d, цисплатином или 9d + цисплатин. Полученные данные (площадь и объем опухоли) проанализировали на нормальное распределение в группах (тест Колмогорова, Смирнова - p<0,05). Непараметрический критерий проверки гипотезы для непарных проб выполняли для сравнения, оказывал ли 9d, цисплатин или 9d + цисплатин ингибирующее воздействие на рост опухолей. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Авторы настоящего изобретения исключили из исследования животных, у которых опухоль не обнаруживалась или не поддавалась оценке на 31 день после введения опухоли. Из-за высокой дисперсии данных выпадающие значения были исключены из исследования.

Весь статистический анализ был выполнен с использованием SPSS (Статистического Пакета для Социальных наук) v13.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние изомера 4 (9d) на рост клеток опухоли легких Льюиса

Запланировали исследование пятнадцати мышей в группе. Одна мышь из группы плацебо умерла по неизвестным причинам на второй неделе после введения опухоли и была исключена.

В таблицах 22 и 23 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как срединные значения. В указанные таблицы сведены срединные значения площади или объема в группах мышей, которым вводили P.S., 9d, цисплатин или 9d + цисплатин, оцениваемые каждый день.

Таблица 22 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	15	0	4	16	36	61,5	104	154,5	217
9d	250 нг	В1	15	0	0	4	24	36	80	88	130
Цисплатин	65 мкг	С1	15	0	0	4	25	49	90	120	169
9d + цисплатин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	1	9	25	49	90	130	165

Таблица 23 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (срединные)
Обработка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	15	0	4	32	108	208,25	493	885,75	1519
9d	250 нг	В1	15	0	0	4	48	108	320	364,5	665,5
Цисплатин	65 мкг	С1	15	0	0	4	56	171,5	405	600	1080
9d + цисплатин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	0,5	13,5	62,5	162	384	650	936

В таблицах 24 и 25 приведены результаты каждой экспериментальной группы, выраженные как средние значения. В данных таблицах приведены средние значения площади или объема в группах мышей, которым вводили P.S., 9d, цисплатин или 9d + цисплатин, оцениваемые каждый день.

Таблица 24 ПЛОЩАДЬ (мм2) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	15	0	4,53	13,87	33,6	56,5	97,79	151,86	223,93
9d	250 нг	В1	15	0	2	6,47	20,13	34,33	60,6	104,8	141,8
Цис-платин	65 мкг	С1	15	0	2,4	6,73	20,73	58,33	106,07	160,07	204,93
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	2,47	9	21,87	46,67	85,8	132,27	176,53

Таблица 25 ОБЪЕМ (мм3) Общие значения (средние)
Обра-ботка	Доза	Группа	n (первый день)	Дни после введения опухоли
0	10	13	17	20	24	27	31
P.S.	-	А1	15	0	6,47	31,27	99,07	214,11	477,04	902,71	1630,89
9d	250 нг	В1	15	0	2,27	12,5	52,73	112,3	253,77	557,13	887,17
Цис-платин	65 мкг	С1	15	0	3,27	11,23	49,97	269,1	619,43	1076,9	1530,4
9d + цис-платин	250 нг + 65 мкг	D1	15	0	2,97	15,83	52,67	159,47	383,37	718,87	1112,53

Наблюдали различия в скорости роста опухоли легких Льюиса у мышей, получавших 9d, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 13 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли легких Льюиса у мышей, получавших цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) в 10, 13 и 17 день развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

Наблюдали различия в скорости роста опухоли легких Льюиса у мышей, получавших 9d + цисплатин, и мышей, получавших плацебо. Указанные различия в площади или объеме являлись статистически значимыми (p<0,05) во все дни, оцениваемые после 17 дня развития опухоли, как было вычислено с помощью U-теста Манна-Уитни.

9d, цисплатин и 9d + цисплатин ингибируют рост опухоли легких Льюиса in vivo у инбредных мышей.

ПРИМЕР 14

ТОКСИЧНОСТЬ

Данный анализ был проведен с целью исследования переносимости (смертность/токсичность) терапии BLAS и IL-2 у мышый.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лекарственные вещества в исследовании

BLAS (эквимолярная смесь изомера 1, 2, 3 и 4) 1,25 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Рекомбинантный IL-2 человека, в концентрации 18×10⁶ МЕ/мл (Proleukin; Chiron Iberia, Madrid, Spain).

Мыши

Животное	Balb/c AnNHsd
Основание для выбора	Инбредная линия мышей
Поставщик	Harlan Iberica
Число животных в исследовании	около 50 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	12 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Доза, среда, путь и объем введения

Доза

Группа	Продукт	Испытанная доза*	Контрольная доза	Дни
А1	BLAS	1 мкг	260 нг	0, 1, 4 и 5
A2	25 мкг
A3	250 мкг
В1	IL-2	900000 МЕ	300000 МЕ
B2	1800000 МЕ
* Дневная доза одной мыши при использовании постоянного объема 0,2 мл

Среда

Среда, которой разбавляли BLAS и IL-2, представляла собой стерильный физиологический раствор для инъекций (Grifols, Barcelona, Spain) и стерильную дистиллированную воду для инъекций (Grifols, Barcelona, Spain).

Путь введения

Препараты вводили в/б.

Схема исследования

За каждой мышью вели ежедневное наблюдение в течение 30 дней.

Проводили измерение двух показателей:

1. Смертность. Указанный показатель выражали как процент выживших животных.

2. Токсичность. Указанный показатель проверяли на живых мышах с учетом следующих параметров и критериев оценки:

Параметр		Баллы
Общий аспект
	Норма	0
	Затронут наружный покров	1
	Затронут наружный покров плюс выделения из глаз/носа	2
	Атипичное положение	3
Атипичное поведение
	Отсутствует	0
	Присутствует	3

РЕЗУЛЬТАТЫ

Смертность и токсичность, связанные с терапией BLAS и IL-2

В таблице 26 показана смертность, наблюдаемая при любой терапии. Результаты выражены как процент выживших животных. Как можно увидеть из данной таблицы, две мыши из Группы B2, получавшие наиболее высокую дозу IL-2, умерли в 6 и 7 день после введения первой дозы. Больше ни в какой другой группе мышей, которым вводили либо IL-2 (в более низкой дозе), либо BLAS в какой-либо используемой дозе, смертей не наблюдали.

Таблица 26 СМЕРТНОСТЬ
Обработка	Доза (мышь)	Группа	Дни с начала обработки
0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	30	31
BLAS	1 мкг	А1	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
BLAS	25 мкг	A2	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
BLAS	250 мкг	A3	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
IL-2	9×l05 МЕ	В1	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
IL-2	1,8×l06 МЕ	B2	100	100	100	100	100	100	90	80	80	80	80	80

В таблице 27 показана токсичность, наблюдаемая у мышей при любой обработке, оцениваемая в соответствии с критериями, описанными выше. Результаты выражены в баллах токсичности, накопленных в группе обработки.

Таблица 27 ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ
Обработка	Доза (мышь)	Группа	Дни с начала обработки
0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	30	31
BLAS	1 мкг	А1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
BLAS	25 мкг	A2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
BLAS	250 мкг	A3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
IL-2	9×105 МЕ	В1	0	0	1	1	4	10	10	10	9	9	5	1	1	0	0	0	0	0	0
IL-2	1,8×106 МЕ	B2	0	0	1	7	25	45	35	32	32	26	24	26	18	18	10	3	0	0	0

Как можно увидеть из данной таблицы, токсичность наблюдали только у мышей, которым вводили IL-2 (Группы B1 и B2), при этом в Группе B2 (наибольшая доза IL-2) наблюдали более заметные побочные эффекты, впрочем, мыши в Группе B1 (более низкая доза) также были затронуты, хотя и в меньшей степени. Побочные эффекты наблюдали во время и после терапии IL2 (со 2 до 15 дня). Как можно было ожидать, позже указанные эффекты исчезли, так как введение IL-2 закончили через шесть дней после введения первой дозы. Следует отметить, что BLAS, по-видимому, вообще не был токсичен, поэтому ни одна мышь не могла бы впоследствии получить каких-либо баллов. Это замечательно, поскольку доза, используемая в данном исследовании, в 1000 раз превышала терапевтическую дозу, используемую в большинстве примеров выше.

BLAS в отличие от IL-2 хорошо переносится мышами даже в таких дозах, которые сильно превышают его терапевтический диапазон.

ПРИМЕР 15

ТОКСИЧНОСТЬ ИЗОМЕРА 4 (9d)

Данный анализ проводили с целью выполнения предварительного исследования токсического эффекта изомера 4 (9d), применяемого в высокой дозе на здоровых мышах. Его потенциальную токсичность сравнивали с плацебо.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лекарственное вещество в исследовании

Активное вещество

Изомер 4 (9d) в концентрации 0,7 мг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Плацебо

Стерильный физиологический раствор для инъекций (Grifols, Barcelona, Spain).

Мыши

Животное	C57BL/6NCrI
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 10 самцов
Возраст Вес	в начале обработки	24 недели 23-29 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Животное	Swiss
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 10 самок
Возраст Вес	в начале обработки	24 недели 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Доза, среда, путь и объем введения

Доза

Группа	Продукт	Тестируемая доза*	Контрольная доза	Линия мышей	День введения
А1	Изомер 4	1,25 мг (в/б)	260 нг	C57BL/6NCrI	0
В1	Плацебо	-	-
C1	Изомер 4	140 мкг (п/к)	260 нг	Swiss
D1	Плацебо	-	-
* Дневная доза одной мыши при использовании постоянного объема 1,8 мл (А1, В1) или 0,2 мл (C1, D1)

Среда

Среда, которой разбавляли изомер 4, представляла собой стерильный физиологический раствор для инъекций (Grifols, Barcelona, Spain) и стерильную дистиллированную воду для инъекций (Grifols, Barcelona, Spain).

Путь введения

Препараты вводили в/б или п/к.

Схема исследования

За каждой мышью вели ежедневное наблюдение в течение 10 дней.

Измеряли три показателя:

3. Вес. Указанный показатель измеряли и выражали в граммах.

4. Смертность. Указанный показатель выражали как процент от выживших животных.

5. Токсичность. Указанный показатель проверяли на живых мышах с учетом следующих параметров и критериев оценки:

Параметр	Системная токсичность	Баллы
Общий аспект
	Норма	0
	Затронут наружный покров	1
	Затронут наружный покров плюс выделения из глаз/носа	2
	Атипичное положение	3
	Атипичное положение плюс неподвижность	4
Атипичное поведение
	Отсутствует	0
	Присутствует	3

Параметр	Местная токсичность	Баллы
	Норма	0
	Эритема на участке введения	1
	Эритема плюс раздражение/папула	2
	Эритема плюс раздражение/папула плюс затронут наружный покров	3
	Некроз на участке введения	4

Статистические данные

Исследование методом случай-контроль выполняли с обработанными и контрольными мышами, чтобы определить, присутствовали ли различия между изомером 4 и введением плацебо. U-тест Манна-Уитни был выбран, поскольку является одним из наиболее известных непараметрических тестов, так или иначе, результаты данного теста эквивалентны результатам суммы рангов Уилкоксона и теста Крускал-Валлиса с двумя группами.

Использовали статистическое программное обеспечение SPSSvl2.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Смертность и токсичность, связанные с терапией изомером 4

В таблицах 28 и 29 показан вес каждой мыши C57BL/6, оцениваемый ежедневно, наряду со средним значением, стандартным отклонением и срединным значением. Различий в весе между группами не наблюдали, как было определено с помощью U-теста Манна-Уитни (p>0,05).

Таблица 28 ПОТЕРЯ ВЕСА Группа А1 (Изомер 4)
Животное	Дни после начала обработки
n°	код	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	1	23	22	22	22	21	20	20	20	20	20	19
2	2	29	28	28	29	29	27	28	28	28	28	28
3	3	27	26	26	26	26	26	26	26	26	26	25
4	4	27	26	26	27	27	26	26	26	26	26	26
5	5	26	25	25	26	26	25	25	25	26	25	26
Среднее значение	26,4	25,4	25,4	26	25,8	24,8	25	25	25,2	25	24,8
Ст. откл.	2,19	2,19	2,19	2,55	2,95	2,77	3	3	3,03	3	3,420526
Срединное значение	27	26	26	26	26	26	26	26	26	26	26
n	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

Таблица 29 ПОТЕРЯ ВЕСА Группа В1 (Плацебо)
Животное	Дни после начала обработки
n°	код	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	1	27	27	26	27	27	27	27	27	27	27	27
2	2	26	26	25	25	26	26	26	25	26	26	26
3	3	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25
4	4	27	27	26	26	26	25	25	26	26	26	26
5	5	28	28	27	27	27	27	27	26	27	27	28
Среднее значение	26,6	26,6	25,8	26	26,2	26	26	25,8	26,2	26,2	26,4
Ст. откл.	1,14	1,14	0,84	1	0,84	1	1	0,84	0,84	0,84	1,140175
Срединное значение	27	27	26	26	26	26	26	26	26	26	26
n	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

Ни в одной группе мышей, которым вводили изомер 4 (Группа А1) или физиологический раствор (Группа В1), не наблюдали смертельных случаев или токсичности. Это следует отметить, так как доза, используемая для системной токсичности, в 50000 раз превышала общее количество терапевтической дозы.

Местную токсичность не наблюдали ни у мышей, которым вводили изомер 4 (Группа С1), ни у мышей, которым вводили плацебо (Группа D1). Это следует подчеркнуть, так как доза, используемая для местной токсичности в данном исследовании, в 500 раз превышала нормальную концентрацию терапевтической дозы.

Таким образом, изомер 4 хорошо переносится мышами даже в дозах, которые сильно превышают его терапевтический диапазон. Местную токсичность на участке введения не наблюдали ни у одной мыши, которой вводили изомер 4.

ПРИМЕР 16

АНАЛИЗ ФЕНОТИПА ЛЕЙКОЦИТОВ

Данный пример выполняли с целью оценки возможных различий в процентном соотношении лейкоцитов в популяции среди обрабатываемых мышей с помощью проточной цитометрии. Подсчет выполняли с помощью проточной цитометрии после мечения мембранных белков (CD11B и Ly6G) специфичными антителами к указанным белкам. Маркер CD11B (также известный как Mac-1) экспрессируется в популяциях моноцитов, тогда как Ly6G (также известный как GR-1) экспрессируется в популяциях гранулоцитов. Оба маркера (11b и Ly6G) экспрессируются в популяциях нейтрофилов. Данный анализ показывает, что анализируемое соединение увеличивает популяцию лейкоцитов, в особенности из линии миелоидных клеток, что является важным в случаях, когда требуется усиление иммунного ответа у субъекта, а именно, например, у пациентов, страдающих СПИД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лекарственное вещество в исследовании

Изомер 4 (соединение 9d) в концентрации 65 мкг/мл в стерильном физиологическом растворе.

Плацебо

Физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain).

Мыши

Животное	Balb/cByJ
Основание для выбора	Инбредная линия мышей, изогенная с опухолевыми клетками Renca
Поставщик	CRIFFA - Charles River
Число животных в исследовании	около 10 самцов
Возраст в начале обработки Вес	10-12 недель 25-30 г
Идентификация	Посредством методики прокола уха

Оборудование

Ламинар, проточный цитометр, регулируемые пипетки, стерильные шприцы, стерильные иглы, стерильные пробирки EDTA, пластиковые пробирки.

РЕАКТИВЫ

Анестезирующий раствор

Стерильный PBS (Sigma, St. Louis, MO, USA)

Физиологический раствор (Grifols, Barcelona, Spain)

Антитела крысы против CD11b-PE мыши (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)

Антитела крысы против Ly6G-FITC мыши (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)

Optylise C (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)

Доза, среда, маршрут и объем введения

Доза

Изомер 4 (состав 9d) тестировали на уровнях доз 250 нг, которые вводили в дни 0 и 7.

Среда

Среда, которой разбавляли изомер 4, представляла собой физиологический раствор.

Путь и объем введения

Препараты вводили внутрибрюшинным путем. Вводимый объем составлял 200 мкл/животное.

Проект исследования

Мыши Balb/c были распределены в 2 экспериментальных группы:

Группа	n	Пол	Обработка	Доза*	Дни	Путь
(A1) BALB/C	5	Самец	Плацебо (P.S.)
					0 и 7	в/б
(В1) BALB/C	5	Самец	Изомер 4	250 нг
* Дневная доза одной мыши

Через три дня после введения последней дозы выделяли кровь мышей. Кровь получали непосредственно путем внутрисердечной пункции. Предварительно мышам внутримышечно ввели обезболивающее средство.

Кровь смешивали с моноклональными антителами, описанными выше.

Через 20 минут инкубации в пробы добавляли раствор Optylise C с целью лизиса популяции эритоцитов.

Наконец, пробы разбавляли ½ стерильным 1×PBS и анализировали с помощью проточной цитометрии.

Процентное соотношение в каждой проанализированной популяции выражали как отдельные значения и/или как среднее ± ст. откл. от каждой экспериментальной группы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Скрининг посредством проточной цитометрии

PBL (Периферическая кровь)

	ID	Контроль (n=5), %	Состав 9d (n=4), %
CD11b+	1	21,6	44
	2	22,4	35,4
	3	18,4	-
	4	11,2	32,9
	5	9,74	35,5
	Среда	16 668	36,95
	Стандартное отклонение	5,875297439	4,851460261

	ID	Контроль (n=5), %	Состав 9d (n=4), %
Ly6G+	1	16,9	27
	2	22,1	37,6
	3	28,9	-
	4	23,7	33,3
	5	10,7	41,2
	Среда	20,46	34 775
	Стандартное отклонение	6,934551175	6,107031467

	ID	Контроль (n=5), %	Состав 9d (n=4), %
CD11b+Ly6G+	1	16,1	29,7
	2	20,4	32,3
	3	13,7	-
	4	7,78	28,5
	5	8,02	33,7
	Среда	13,2	31,05
	Стандартное отклонение	5,401592358	2,37416652

Согласно приведенным результатам мыши (Balb/C), которым вводили две дозы (раз в неделю) соединения 9d, показывали прирост CD11b, Ly6G и CD11b+Ly6G положительных клеток в периферической крови по сравнению с контрольными мышами (физиологический раствор). Указанные клетки проверяли с помощью проточной цитометрии через три дня после введения последней дозы.