бис-(гидроксиметил)-циклобутил-пурины или пиримидины и их фармацевтически приемлемые соли

Формула изобретения

Бис-(гидроксиметил-циклобутил-пурины или пиримидины общей формулы



где R₁ - группа формулы











и их фармацевтически приемлемые соли.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым пуриновым и пиримидиновым соединениям, проявляющим биологическую активность, а именно к соединениям, представленным формулой I, и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим, например, противовирусной активностью.

HOCH I

В формуле I и в описании символы имеют значения, определенные ниже.

R₁ представляет собой группу формулы

где R₃ представляет метил или группу



Предпочтительными соединениями формулы I являются соединения, в которых R₁ представляет группу формулы







Наиболее предпочтительными соединениями формулы I являются соединения, когда R<sub>1

.</sub>

Соединения формулы I и их фармацевтически приемлемые соли являются противовирусными агентами, которые могут применяться при лечении вирусных инфекций у млекопитающих, таких как домашние животные (например, собаки, кошки, лошади и т.п.) и люди, а также у домашней птицы (кур и индеек).

Соединения формулы I, где R₁ представляет группу





являются эффективными против одного или более из следующих вирусов: вирус герпеса 1 и 2, вирус ветряной оспы, вирус коровьей оспы, вирус мышиной лейкемии и вирус иммунодефицита человека. Они также считаются активными против разновидностей других ДНК и ретровирусов.

Примеры вирусов ДНК, кроме названных выше, включают другие вирусы (например, вирус Epstein-Barr, вирус псевдобешенства и подобные), другие покс-вирусы (например, monkey pox и миомы), papovaviruses (например, вирусы папиломы), вирус сывороточного гепатита и аденовирусы. Примеры ретровирусов, кроме названных выше, включают вирусы, воздействующие на человека, такие как Т-лимфоцит, лимфотропные вирусы (НТV), и воздействующие на животных, такие как кошачий вирус лейкоза и лошадиный вирус инфекционной анемии.

Соединение формулы I, где R₁

является активным против различных ДНК и ретровирусов, описанных выше, за исключением вирусов герпеса 1 и 2, вируса ветряной оспы и вируса цетомегалии.

Соединения данного изобретения могут применяться парентеpально (например, внутривенными, внутрибрюшинными и внутримышечными инъекциями), орально или локально в зависимости от того, применяется препарат для лечения внутренних или внешних вирусных инфекций.

При внутренних инфекциях соединения могут применяться орально или парентерально в количествах, достаточных для лечения инфекции. Доза зависит от тяжести заражения, но обычно доза составляет от 1,0 до 50 мг/гк веса тела. Желаемая доза может применяться несколько раз в день через соответствующие интервалы.

Для инфекций глаз или других внешних тканей, например рта или кожи, составы могут применяться локально на инфицированные части тела пациента в виде мази, пасты, аэрозоля, геля, порошка, лосьона, суспензии или раствора (например, в глазных каплях). Концентрация соединения в наполнителе будет зависеть от тяжести инфекции, но обычно находится в пределах от 0,1 до 7% от веса.

Соединение формулы I, где R<sub>1

,</sub> а R₇ и R₈ водород, может быть получено из промежуточного соединения формулы

, где Р защитная группа, такая как ацил, бензил, силил; а Х уходящая группа, такая как хлор, бром, иод или арил- или алкилсульфонат, хорошо известные в данной области (например, пара-толуолсульфонилокси или метансульфонилокси).

Термин "ацил" относится к R₉ С -группам, где R₉ низшая алкильная группа с разветвленной или прямой цепью с 1-6 атомами углерода или фенильная группа.

Термин "силил" относится к хорошо известным силилзащитным группам, например трет.бутилдиметилсилил, трет. бутилдифенилсилил (трифенилметил/диметилсилил, метилдиизопропилисилил или триизопропилсилил).

Реакция соединения формулы 2 с защищенной формой гуанина, например соединением формулы

в присутствии такого основания, как карбонат калия, гидрид натрия или гидрид калия, в апротонном полярном растворителе, таком как диметилформамид, диметилсульфоксид или сульфолан (тетраметиленсульфон), дает соответствующее соединение формулы



Реакция может не обязательно проводиться в присутствии образующегося с металлами хелатный комплекс катализатора, например 18-краун-6 (1,4,7,10,13,16-гексаоксациклооктадекана) или 15 краун-5 (1,4,7.10,13-пентаоксациклопентадекана). Удаление защитной группы из соединения формулы 4 дает соединение формулы I, где R<sub>1

.</sub>

Когда защитной группой Р в соединении формулы 4 является ацильная группа, то защитная группа Р может избирательно удаляться с использованием, например, каталитического метилата натрия в метаноле или метанольном аммиаке. Последующее удаление О-бензильной защитной группы на пуриновом фрагменте может достигаться обработкой водно-спиртовой минеральной кислотой (например, водно-метанольной хлористоводородной кислотой), натрием в жидком аммиаке или гидрогенолизом (например, с использованием гидрооксида палладия на угле в циклогексане или этаноле). Альтернативно может быть удалена сначала О-бензильная защитная группа пурина, а затем ацилзащищающие группы.

В случае, когда Р-группой в соединении формулы 4 является силильная защитная группа, ее удаление может быть осуществлено с использованием иона фтора (например, фторида тетрабутиламмония в тетрагидрофуране). В этом случае О-бензильная защитная группа пурина может быть удалена водно-спиртовой минеральной кислотой или гидрогенолизом. В случае, когда защитной группой Р в соединении формулы 4 является бензил, то удаление всех бензильных защитных групп осуществляется с помощью либо натрия в жидком аммиаке, либо гидрогенозилом (например, гидроксид палладия на угле в циклогексане или этаноле). Альтернативно все бензильные защитные группы могут быть удалены реакцией с трихлоридом бора в дихлорметане.

Реакция соединения формулы 2 с соединением формулы

в условиях, аналогичных используемым при получении соединения формулы 4, дает соединение формулы

^NH2

Селективное удаление защитной группы Р дает соединение формулы I, где R₁



Например, когда защитной группой Р в соединении формулы 6 является ацил, то Р-группа может избирательно удаляться с использованием, например, каталитического метоксида (метилата) натрия в метаноле. Когда защитной группой Р в соединении формулы 6 является силил, то защитная группа может избирательно удаляться реакцией с ионом фторида (например, фторидом тетрабутиламмония). Когда защитной группой Р в соединении формулы 6 является бензил, то удаление Р-группы может быть селективно осуществлено реакцией с трихлоридом бора.

Кислотный гидролиз (например, с использованием горячей водной хллористоводородной кислоты) хлорной группы соединения формулы I, где R₁-

дает соединение формулы I, в которой R₁ является группой



Соединение формулы 2 может быть получено следующим образом.

Реакция диэтилфумарата и кетенди- этилацеталя в горячем трет. бутаноле дает соединение формулы 7 в виде рацемической смеси (см. К.С.Brannock, et al. J. Org. Chem, 29, 940 (1964)). Взаимодействие соединения формулы 7 с восстановителем, таким как гидрид метилалюминия в растворителе, например диэтиловом эфире или тетрагидрофуране, дает соединение формулы 8. Гидроксильные группы могут защищаться защитной группой Р известными в данной области способами, давая соединение формулы 9. Декетализация соединения формулы 9 с использованием, например, пара-толуолсульфоновой кислоты в ацетоне или водной серной кислоты в ацетонитриле дает соединение формулы 10, которое при обработке восстановителем (например, борогидридом натрия или цианоборогидридом натрия в спирте, таком как метанол, этанол или изопропанол) дает соединение формулы 11 в виде второстепенного продукта, а также изомерное соединение формулы 12 как основной продукт, который может быть отделен хроматографией. Альтернативно соединение формулы 10 может первоначально обрабатываться три-втор.-бутилборгидридом лития или трис-изо-амилборгидридом лития в тетрагидрофуране, а затем водной перекисью водорода и бикарбонатом натрия, давая соединение формулы 11 в качестве основного продукта и соединение формулы 12 (если оно присутствует) в качестве второстепенного вещества, которое может быть отделено (если необходимо) хроматографией. Соединение формулы 11 может быть преобразовано в соединении формулы 2 известными способами. Например, взаимодействие соединения формулы 11 с паратолуолсульфонилхлоридом или метан- сульфонилхлоридом в пиридине дает соединение формулы 2, где Х пара-толуолсульфонилокси или метансульфонилокси соответственно. Соединение формулы 2, где X пара-толуолсульфонилокси или метансульфонилокси, также может быть получено из изомерного соединения формулы 12 взаимодействием с пара-толуолсульфоновой кислотой или метансульфоновой кислотой соответственно в присутствии триэтиламина, трифенилфосфина и диэтил- или диизопропил азодикарбоксилата в растворителе, таком как толуол, эфир или диоксан.

Альтернативно обработка соединения формулы 12 галогенидом метилтрифеноксифосфония или галогенидом метилтрифенилфосфония (например, хлоридом, бромидом или иодидом) в растворителе, таком как диметилформамид, дает соединение формулы 2, где Х хлор, бром или иод. В виде еще одной альтернативы, соединение формулы 2, где Х хлор, бром или йод, может быть получено из соединения формулы 12, используя трифенилфосфин, диэтил (или диизопропил)азодикарбоксилат и источник галогенида, такой как метилиодид, метилбромид или дихлорметан, в соответствии с известным методом, См. например, H. Loibner et al. Helv. Chim. Acta. 59, 2100 (1976).

Вышесказанное показано ниже схематично:

_____

Реакция соединения формулы 2 с соединением формулы

методом, аналогичным использованному при получении соединения формулы 4, и последующее удаление защитных групп Р дает соответствующее соединение формулы I, где



Альтернативно это соединение формулы I может быть получено реакцией соединения формулы

с соединением формулы 2 методами, аналогичными используемому при приготовлении соединения формулы 2. Это дает соответствующее соединение формулы

(20) Обработка соединения формулы 20 горячим аммиаком в спирте, например метаноле или этаноле, и одновременное или последующее снятие защитных групп Р дает соответствующее соединение формулы I, где R₁



Соединение формулы

H-OCH где R₃ метил, может быть получено реакцией соответствующего соединения формулы

с соединением формулы 2 в присутствии основания, например карбоната калия, гидрида натрия или гидрида калия, в апротонном полярном растворителе (например, диметилформамиде, диметилсульфоксиде или сульфолане) при необязательном присутствии 18-краун-6 или 15-краун-5 и дает промежуточное соединение формулы



Удаление защитных групп Р дает соответствующее соединение формулы 22. Например, когда Р ацил, защитные группы могут быть удалены обработкой метилатом натрия в метаноле или метаноловом аммиаке, или, когда Р представляет силильную группу, снятие может быть осуществлено ионом фторида. Когда Р бензильная группа, снятие защиты может быть осуществлено гидрогенолизом (например, с использованием гидроокиси палладия на углероде в циклогексане и этаноле) или обработкой трихлоридом бора.

Соединение формулы

(27) где R₃ водород, получают из соответствующего соединения формулы 24 (где Р, например, защитная группа ацила) известными способами. Смотри, например, I.Wempner, et al. in "Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry", Vol. 1, W.W.Zorbach and R.S,Tipson, Eds. Interscience Publishers, N.Y. с.299, 1968, T.S. Lin et al. J. Med. Chem. 26, 1691 (1983), P. Herdewijn et. al. J. Med. Chem. 28, 550 (1985). Снятие защиты с использованием метанольного аммиака или метилана натрия дает соответствующее соединение формулы 27.

Альтернативно соединение формулы 27, где R₃ водород, может быть получено реакцией соответствующего соединения формулы

с соединением формулы 2 в присутствии основания. такого как карбонат калия, гидрид натрия или гидрид калия, в апротонном растворителе (например, диметилформамиде, диметилсульфоксиде или сульфолане) при необязательном присутствии 18-краун-6 или 15-краун-5 с последующим удалением защитных групп. Не обязательно амино (-NH₂)-группа в соединении формулы 28 может быть защищена, например, группой ацила. Удаление этой защитной группы может быть осуществлено использованием метоксида натрия в метаноле или метанольном аммиаке.

Соединения формулы 22, где R₃ иод, могут быть получены из соответствующих соединений формулы 22, где R₃ водород, известными способами. Смотри, например Basic Principals in Nucleic Acid Chemistry, том I, Р.О.Р. Ts"O, Ed. Academic Press. N. Y. с.146, 1974; P.K. Chang in "Nucleic Acid Chemistry", часть 3, L.B.Townsend and R.S.Tipson, Eds. John Wiley and Sons, N.Y. с.46, 1986.

Соединения формулы 22, где R₃ группа

CC и R₄ бром, могут быть получены из соответствующих соединений формул 22, где R₃ иод или HgCl, через палладий органические промежуточные соединения. Соединения формулы 22, где R₃ HgCl, могут быть получены из соответствующих соединений формулы 22, где R₃ водород, известными способами. Смотри, например, E.DeClercg et al. Pharmac. Ther. 26,1 (1984), M.E.Perlman, et al. J. Med. Chem. 28, 741 (1985), P. Herdewijn et al. J.Med. Chem. 28, 550 (1985), D.E.Berhstrom, et al. J. Med. Chem. 27, 279 (1984).

Стереохимия, показанная для соединений предлагаемого изобретения и промежуточных соединений, дающих соединения предлагаемого изобретения, относительна, а не абсолютна. Показано, что в соединениях предлагаемого изобретения основание, представленное R₁, является транс к ближайшему -СН₂ОН заместителю, а СН₂ОН заместители являются транс по отношению друг к другу.

Соединения формулы I, где R₁ представляет группу

^{, или} могут образовывать кислотно -аддитивные соли с органическими или неорганическими кислотами. Характерными являются галоиднитратные соли (например, гидрохлорид или гидробромид), алкилсульфонаты, сульфаты, фосфаты и карбоксилаты.

Соединения фоpмулы I, где R₁

или , могут образовывать основные соли с неорганическими и органическими основаниями. Характерными являются соли щелочных металлов (например натрия и калия), щелочноземельных металлов (например, кальция и магния), аммония и замещенного аммония.

П р и м е р 1. (1 ,2,3)-9-(203-бис)гидроксиметил(циулобутил)гуанин

А) Кетен Диэтил ацеталь.

Это соединение было получено, используя метод, описанный в "Organic Syntheses", Cokk. Vol. III, E.C.Jotning, Ed. John Wiley ans Sons, N.Y. с.506 (1955).

К раствору трет. бутоксила калия (28,5 г, 0,254 моль) в сухом трет.бутаноле (150 мл, высушенном на ЗА молекулярном сите) при 50^оС добавили бромацетальдегид диэтилацеталь (38,5 мо, 0,254 моль). Колонку, заполненную стеклянными спиральными насадками (20х1,4 см) с частично съемной головкой для полного орошения, поместили на верх реакционной колбы. Температура масляной ванны постепенно поднималась до 100^оС. После орошения в течение 35 мин отогнали трет. бутанол за 16 ч со скоростью 4,5 капли в минуту при соотношении орошения в головке 22:4,5. Масляную ванну охладили до 20^оС и колонку, заполненную спиральными насадками, заменили на дистиллятор короткого прохождения. Дистилляция при 20-50^оС и 4 мм дала 26,96 г смеси, содержащей 23,31 г кетендиэтилацеталя и 3,66 г трет.бутанола, как было определено IН-ЯМР-интеграцией. В) (Транс)-3,3-диэтокси-1,3-циклобутандикарбоновая кислота, диэтиловый эфир.

Это соединение было получено модификацией способа K.C.Brannock et al. J. Org. Chem. 29, 840 (1964).

К раствору 25,27 г вышеупомянутой смеси, содержащей 21,63 г (0,186 моль) кетендиэтилацеталя в сухом трет. бутаноле (60 мл), добавили диэтилфумарат (28,28 мл, 0,173 моль). Все это нагревали при температуре 82^оС в течение 7 дней. Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток разделили на порции 3 г (А) и 39 г (В).

Порцию А хроматографировали на Мерк силикагеле-60 (1,5 х 30 см) в смеси гексан/этилацетат в соотношении 19:1. Фракции, содержащие продукт, объединили и концентрировали. Получили 567 мг.

Порцию В хроматографировали дважды на Мерк силикагеле-60 (35 х 5 см) в том же растворителе. Фракции, содержащие продукт, объединили и концентрировали. Получили 10,43 г, Общий выход желаемого вещества составил 10,99 г.

С) (Транс)-3,3-диэтокси-1,2-циклобутандиеметанол.

К суспензии гидрида метилалюминия (2,38 г, 0,0627 моль) в сухом тетрагидрофуране (50 мл) медленно добавили (транс)-3,3-ди-этокси-1,2-циклобутандикарбоновую кислоту, диэтиловый эфир (11,29 г, 0,0392 моль) в тетрагидрофуране (25 мл) при поддержании легкого орошения. Смесь нагревали при 55^оС в течение 4 ч, а затем разбавили эфиром (100мл). Понизили рН до 4 З М серной кислотой. Суспензию экстрагировали эфиром (4 х 100 мл), а затем хлороформом (3 х 100 мл). Эфирные экстракты объединили, высушили над сульфатом натрия, профильтровали и сконцентрировали. Получили 5,613 г желаемого вещества. Объединили экстракты хлороформа, высушили над сульфатом натрия, профильтровали и сконцентрировали. Получили 112 мг дополнительного желаемого вещества.

Д) (Транс)-3,3-диэтокси-1,2-циклобутандиметанол, эфир дибензоата.

К раствору (транс)-3,3-диэтокси-1,2-циклобутандиметанола (5,7 г, 0,028 моль) в сухом пиридине (40 мл) в атмосфере азота при 0^оС добавляли на протяжении 5 мин хлорид бензоила (9,73 мл, 0,0838 моль), Все это нагревали до комнатной температуры, после чего образовался осадок. Через 2 ч добавляли воду (20 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. В вакууме удаляли растворители. Остаток растворяли в диэтилацетате (400 мл) и промывали водой (2 х 150 мл), 1 н. хлористоводородной кислотой (2 х 150 мл) и насыщенным бикарбонатом натрия (3x150 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, что давало 10,97 г целевого вещества.

Е) (Транс)-2,3-бис[(тензоилокси(метил]циклобутанон.

К раствору дибензоатного эфира (транс)-3,3-диэтокси-1,2-циклобутандиме- танола (10,87 г, 0,0263 моль) в ацетоне (200 мл) добавляли п-толуолсульфоновую кислоту (250 мг, 0,00132 моль). Реакционная смесь нагревалась с обратным холодильником в течение 3 ч. Раствор концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (200 мл) и промывали насыщенным бикарбонатом натрия (2х200 мл). Водный слой снова экстрагировали этилацетатом (50 мл). Объединяли органические слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме, что давало 8,7 г нечистого продукта. Этот остаток очищали хроматографией на колонке на Мерк силикагель-60 (5 х 27 см) с использованием в качестве растворителя для элюирования гексан/этилацетата в соотношении 5:1.

Объединяли и концентрировали фракции, содержащие продукт. Получили 6,71 г целевого вещества.

Альтернативное получение (транс)-2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутанола.

К раствору дибензоатного эфира (транс)-3,3-диэтокси-1,2-циклобутандимета- нола (50 г, 0,12 моль) в 1,5 л ацетонитрила добавляли 570 мл 0,5 М серной кислоты в воде. Реакционную смесь перемешивали под действием аргона в течение 16 ч при 25^оС, а затем разбавили 5 л этилацетата. Смесь промывали водой (2х1 л) насыщенным бикарбонатом натрия (2х1 л), водой (2х1 л) и наконец 1 л рассола. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали до масла. Растирание в порошок с гексаном дало 34 г сырого продукта. Растирание этого сырого твердого вещества с 300 мл диэтилового эфира дало 10 г целевого вещества, т.пл. 76-78^оС. Охлаждение фильтрата при -30^оС в течение 4 ч дало второй сбор 12 г, т.пл. 76-78^оС такой же чистоты.

F) (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циулобутандиметанол, эфир 1,2-дибензоата и (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклоюутан- диметанол, эфир 1,2-дибензоата.

К раствору (транс)-2,3-бис[(бензоилокси)метил] циклобутанона (2,46 г, 7,28 моль) в безводном метаноле (40 мл) добавляли цианборгидрид натрия (1,01 г, 16 моль).

Бромкреозолевый зеленый (3 мг) добавляли в качестве рН-индикатора, Когда индикатор становился синим, добавляли 1 н. HCl в метаноле до тех пор, пока индикатор не становился желтым. Через 5 ч цвет уже не менялся, исходное вещество было израсходовано. Растворитель удаляли в вакууме, а остаток растворяли в этилацетате (100 мл) и промывали насыщенным хлоридом натрия (50 мл). Водный слой экстрагировался обратно этилацетатом (50 мл). Органические слои объединили, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на колонке Мерк силикагель-60 (5х55 см).

Элюирование гексаном/этилацетатом в соотношении 7:3 дало 521 мг (1 ,2, 3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата.

Элюирование гексаном/этилацетатом в соотношении 6:3 дало 1,78 г (1 ,2, 3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата.

Альтернативное получение (1, 2,3)- 3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата и (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутанди- метанола, эфира 1,2-дибензоата.

К перемешанному раствору (транс)-2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутанона (12,0 г, 0,0355 моль) в безводном тетрагидрофуране при -78^оС в азоте добавляли 35,5 мл (0,0355 моль) 1М три-фторбутил-боргидрида лития в тетрагидрофуране на протяжении 3 мин. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, а затем добавляли насыщенный водный бикарбонат натрия (34 мл) с последующим добавлением по каплям 30%-ной перекиси водорода (13,0 мл, 0,127 моль) при поддержании температуры при 30^оС с помощью водной ледяной ванны. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 30 мин и разбавляли этилацетатом (400 мл) и водой (120 мл). Разделяли слои. Органический слой экстрагировали водой (100 мл). Образовалась эмульсия, после чего добавляли твердый хлорид натрия для разделения слоев. Два водных слоя объединяли и экстрагировали этилацетатом. Объединяли все этилацетатные слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме до остатка (12,5 г). Часть этого остатка (7 г) очищали с помощью препаративной жидкости хроматографии высокого давления на двух Waters Prep Pak 500 силикагельных колонках, используя в качестве растворителя для элюирования 30% этилацетат в гексане, со скоростью 250 мл/мин. (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутанди- метанол, эфир 1,2-дибензоата элюировали через 14-22 мин, а (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанол, эфир 1,2-дибензоата элюировали через 23-34 мин. Аналогичная хроматография оставшейся части 12,5 г остатка (в две стадии, одна с использованием 25% этилацетата в гексане, а вторая с использованием 35% этилацетата в гексане) давала всего 8,80 г (1,2, 1)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата и 2,6 г (1, 2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира дибензоата.

Альтернативное получение (1,2, 3)-3-гидрокси-1,2-циклобутанди- метанола, эфира 1,2-дибензоата.

К раствору (транс)-2,3-бис[(бензоилокси)метил] циклобутанона (13,55 г, 0,0389 моль) в тетрагидрофуране (180 мл) при -78^оС в азоте добавляли за 5 мин 38,9 мл (0,0389 моль) 1М триизоамилборгидрида лития в тетрагидрофуране. Реакционную смесь перемешивали 10 мин, а затем нагревали до комнатной температуры. Добавляли насыщенный бикарбонат натрия (36,9 мл), а затем медленно добавляли 30%-ную перекись водорода (14,19 мл, 0,138 моль), поддерживая температуру 30^оС с помощью ледяной ванны. Смесь разбавляли водой (120 мл) и экстрагировали этилацетатом (400 мл). Органический слой промывали водой (100 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме, получая 17,8 г сырого целевого продукта в виде остатка, не содержащего обнаруживаемого (1, 2, 3)- 3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата. Остаток очищали препаративной жидкостной хроматографией высокого давления на двух Waters Prep 500 силикагельных колонках, используя в качестве растворителя для элюирования 30% этилацетат в гексане, что давало 9,17 г (1,2,3)-3-гидрокси- 1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата.

Альтернативно сырой продукт (42г), полученный восстановлением 40,5 г (0,12 моль) (транс)-2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутанона 1М триизоамилборгидридом лития (как указано выше), растворяли в 100 мл смеси гексана и этилацетата (2/1) и наносили на сухую подушку 1,2 Мерксиликагеля-60. Подушку промывали 5 л того же растворителя, отбирая 500 мл фракции. Содержащие продукт фракции объединяли и выпаривали, что давало 39,8 г целевого вещества в виде бесцветной жидкости, достаточно чистой для применения в следующей стадии синтеза.

G) (1,2,3)-3-[(4-метилфенил)сульфонил]-окси-1,2-циклобутандиметанол, эфир дибензоата.

К раствору (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата (7,31 г, 0,0215 моль), предварительно высушенного концентрированием его из безводного пиридина (2х20 мл), в 36 мл безводного пиридина добавляли пара-толуол-сульфонилхлорид (6,56 г, 0,0344 моль). Смесь перемешивали в течение 16 ч при 60^оС в атмосфере азота и удаляли пиридин в вакууме. Оставшийся пиридин удаляли совместной перегонкой с толуолом (2х30 мл). Остаток растворяли в этилацетате (480 мл) и промывали насыщенным карбонатом калия. Сушили над сульфатом натрия органический слой, фильтровали и концентрировали в вакууме до остатка, который очищали хроматографией на колонке Мерк силикагель-60 (1500 мл). Колонка элюировалась 3000 мл этилацетата и гексана в соотношении 1: 5. Колонку затем элюировали смесью этилацетата и гексана в соотношении 1:3, собирая 50 мл фракции. Соответствующие фракции объединяли и концентрировали, что давало 7,00 г (1,2,3)-[[(4-метилфенил)сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиметанола, эфира дибензоата.

Альтернативно после нагревания (1,2,3)- 3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата (39,8 г, 117 ммоль) с пара-толуол-сульфонилхлоридом (24,65 г, 128,5 ммоль) в 60 мл пиридина при 60^оС в течение 22 ч температуру понижали до 40^оС и добавляли 2 мл воды. Через 2 ч удаляли летучие соединения и остаток распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой промывали 3% бикарбонатом натрия и сушили над сульфатом натрия. Полученный при концентрации растворителя сырой продукт растирали с пентаном, получая 39,4 г сырого вещества. Это вещество растворяли в 120 мл этилацетата при легком нагревании. Раствор охлаждали до комнатной температуры и разбавляли 120 мл пентана. Отстаивание в течение нескольких часов при +5^оС давало кристаллы, которые отфильтровывали, сушили, получая 32,6 г чистого целевого продукта.

Альтернативное приготовление (1,2,3)-3-[[(4-метилфенил)сульфонил] -окси]-1,2-циклобутандиметанола, эфира дибензоата.

К раствору (1,2,3)-3-гидрокси-1,2-циклобутандиметанола, эфира дибензоата (3,096 г, 9,10 моль) в безводном толуоле (25 мл) добавляли моногидрат пара-толуолсульфокислоты (2,08 г, 10,9 ммоль), триэтиламин (1,51 мл, 10,9 ммоль), трифенилфосфин (3,81 г, 14,6 ммоль) и диизопропилазодикарбоксилат (2,87 мл, 14,6 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 80^оС в атмосфере азота. Через 1 ч, а затем еще через 3 ч добавляли еще трифенилфосфин (1,90 г, 7,3 ммоль) и диизопропил азодикарбоксилат (1,43 мл, 7,3 ммоль). Еще через 3 ч нагревания добавляли дополнительное количество трифенилфосфина (0,95 г, 3,65 ммоль) и диизопропила азодикарбоксилата (0,717 мл. 3,65 ммоль). Реакционную смесь продолжали нагревать еще 1 ч, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Осадок промывали толуолом (20 мл), фильтрат и промывные воды объединяли и концентрировали в вакууме до остатка, который растворяли в этилацетате (100 мл). Раствор этилацетата промывали водой (2х30 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на Мерк силикагеле-60 (300 мл) с использованием смеси гексана и этилацетата в соотношении 5:1, и соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 20 мл. Этот концентрат разбавляли 30 мл гексана и оставляли на ночь при комнатной температуре. Фильтрацией собирали кристаллы, промывали гексаном и сушили, что давало 2,18 г (порция 1) чистого целевого продукта. Маточные растворы из порции 1 концентрировались до 40мл и оставлялись на ночь при комнатной температуре.

Фильтрацией собирали кристаллы (порция 2), сушили в вакууме и подвергали хроматографии на Мерк силикагеле-60 (300 мл) с использованием 2% этилацетата в толуоле, что давало 1,02 г (порция 3) целевого вещества с примесями. Маточные растворы из порции 2 подвергали хроматографии на Мерк силикагель-60 (300 мл) с использованием 2% этилацетата в толуоле, что дало 187 мг (порция 4) нечистого целевого продукта.

Объединяли порции 3 и 4, перекристаллизовывали из гексана/этилацетата, что давало дополнительно 770 мг чистого целевого продукта. Общий выход чистого целевого продукта составил 2,95 г.

Н) (1,2,3)-3-[2-амино-6-(фенилметокси)-9Н-пиридин-9-ил]-1,2-циклобутандимета нол,эфир 1,2-дибензоата.

К раствору (1,2,3)-3-[[(4-метилфенил)сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиме- танола, дибензоата (1,072 г, 2,17 ммоль) в диметилформамиде (20 мл) добавляли 2-амино-6-(фенилметокси)-9Н-пурин (784 мг, 3,25 ммоль), 18-краун-6 (573 мг, 2,17 ммоль) и карбонат калия (600 мг, 4,34 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота при 110^оС в течение 24 ч. В вакууме удаляли растворители и остаток хроматографировали на Мерк силикагеле-60 (205х30 см) с использованием смеси этилацетата в соотношении 3:1, что давало 400 мг чистого целевого продукта. Другие фракции, содержащие целевой продукт с примесями, объединялись и еще раз хроматографировались на Мерк силикагеле-60 (1,5 х 30 см) с использованием смеси этилацетата и гексана в соотношении 2:1, что давало дополнительно 52 мг целевого продукта, а общий выход составил 452 мг.

I) (1, 2,3)-3-[2-амино-6-(фенилметокси)-9Н-пурин-9-ил]-1,2-циклобутандиме- танол.

К раствору (1,2,3)-3-[2-амин-6-(фенилметокси)-9Н-пурин-9-ил]-1,2-цикло- бутандиметанола, эфира 1,2-дибензоата (452 мг, 0,803 ммоль) в безводном метаноле (12 мл) добавляли 25%-ный раствор метоксида натрия в метаноле (109 мл, 0,482 мл). Реакционную смесь перемешивали в токе азота 1 ч при 40^оС. В вакууме удаляли растворитель и добавляли воду (10 мл). С помощью 1н. НСl понижали рН до 7. Удаляли в вакууме растворители, а остаток растирали с эфиром (2х20 мл) и сушили, что давало 358 мг сырого целевого продукта, который затем использовали на следующей стадии.

J) (1,2,3)-9-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]гуанин.

К суспензии (1,2,3)-3-[2-амин-6-(фенилметокси)-9Н-пурин-9-ил]-1,2-цикло- бутандиметанола (358 мг, 1,0 ммоль) в метаноле (5 мл) добавляли 3н. НСl (2,5 мл). Смесь перемешивали 4 ч при 45^оС. В вакууме удаляли растворители и остаток растворяли в воде (20 мл). С помощью 1 н. КОН повышали рН до 7. Отбирали 10% пробы и удаляли растворители в вакууме. Остаток концентрировали из метанола (3х4 мл) и этилацетата (2х4 мл). Остаток растворяли в воде (4 мл) при нагревании и помещали в колонку с СНР-20Р смолой (1,1х20 см), Мицубиси Кемикал Индастриз Лтд. (75-150 мкм). Элюирование водой, смесью 2% ацетонитрил/вода и 4% ацетонитрил/вода давало 11 мг целевого продукта.

Оставшиеся 90% смеси концентрировали в вакууме, а затем концентрировали из метанола (3х20 мл) и этилацетата (2х2 мл). Остаток растворяли в воде (30 мл) при нагревании и помещали в колонку с СНР-20Р смолой (2,5х15 см). Элюирование водой, смесями 2% ацетонитрил/вода, 4% ацетонитрил/вода и 10% ацетонитрил/вода давало дополнительно 111 мг (1,2,3)- 9-[2,3-бис(гидроксиметил)цик- лобутил]гуанина с температурой плавления > 220 ^оС.

Вычислено: для С₁₁Н₁₅N₅O₃ 1,43 3H₂O:

C 45,40; H 6,18; N 24,08; H₂O 8,83.

Найдено: C 45,66; H 5,95; N 23,82; H₂O 8,83.

П р и м е р 2. (1,2,3)-3-(6-амин-9Н-пурин-9-ил)-1,2-циклобутандиметанола

A) (1, 2, 3)-3-[6-амин-9Н-пурин-9-ил] -1,2-циклобутандиметанол, эфир дибензоата.

К раствору (1, 2,3)-3-[[(4-метилфенил)сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиме- танола, эфир дибензоата (988 мг, 2 ммоль) в безводном диметилформамиде (20 мл) в токе азота добавляли аденин (405 мг, 33 ммоль), 18-краун-6 (538 мг, 2 ммоль) и карбонат калия (276 мг, 2 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 110^оС 16 ч, а затем в вакууме удаляли растворитель, что давало остаток, который очищали хроматографией на колонке Мерк силикагель-60 (400 мл). Элюирование 0,1, 0,5, 5 и 10%-ным метанолом в этилацетате давало 522 мг целевого продукта с примесями. Хроматография на колонке этого вещества на Мерк силикагель-60 (400 мл) с использованием смеси дихлорметан/метанол в соотношении 20: 1 давала 400 мг чистого (1,2,3)-3-(6-амин-9Н-пурин-9-ил)-1,2-циклобутандиме- танола, эфира дибензоата.

В) (1,2,3)-3-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)-1,2-циклобутандиметанол.

К суспензии (1,2,3)-3-(6-амин-9Н-пурин-9-ил)-1,2-циклобутандиметанола, эфира дибензоата (400 мг, 0,899 ммоль) в безводном метаноле (20 мл) добавляли 25%-ный раствор метоксида натрия в метаноле (123 мл, 0,539 ммоль). Смесь перемешивали 45 мин при 40^оС, а затем удаляли в вакууме растворитель.

Остаток суспендировали в воде (20 мл) с помощью 1 н. НСl рН доводили до 7,0 и удаляли летучие вещества. Остаток очищали хроматографией на колонке СНР-20Р смола. Элюирование водой, градиентом от 0 до 20% метанола в воде, а затем 20% и 30% метанола в воде давало 128 мг (1,2,3)-3-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)-1,2-циклобутан- диметанола в качестве твердого вещества с температурой плавления 181-183^оС.

Вычислено для C₁₁Н₁₅N₂O₅ 0,1 H₂O:

C 52,63; H 6,10; N 27,90

Найдено: С 52,64; H 6,10; N 28,00.

П р и м е р 3. (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-5-метил-2,4-(1Н, 3Н)-пиримидиндион.

А) (1,2,3)-1-[2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутил]-5 -метил-2,4(1Н, 3Н)-пиримидиндион.

Смесь (1,2,3)-3-[[(4-метилфенил)-сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиметано- ла, эфира дибензоата (1,245 г, 2,52 ммоль), тимина (625 мг, 4,96 ммоль), карбоната калия (1,39 г, 10,1 ммоль) в безводном диметилформамиде (12,5 мл) в аргоне при перемешивании нагревали 16 ч при 105^оС, а затем 1 ч при 125^оС. Добавляли еще тимин (310 мг, 2,2 ммоль) и карбонат калия (354 мг, 2,6 ммоль) и продолжали нагревание при 125^оС еще 2 ч. Реагирующую смесь охлаждали и фильтровали, нерастворимые вещества промывали диметилформамидом. Фильтраты диметилформамида объединяли и выпаривали до остатка, который растирали с этилацетатом. Твердые вещества удаляли фильтрацией, фильтрат выпаривали до остатка. Этот остаток растворяли в небольшом количестве этилацетата гексана (1:1) и помещали в колонку Мерк силикагель-60 (5х11,5 см) в гексане. Элюирование этилацетатом и гексаном (4:1), а затем этилацетатом давало 219 мг частично очищенного целевого продукта. Хроматография этого вещества на колонке Мерк силикагель-60 (в дихлорэтане) при элюировании 10, 20, 30 и 50%-ным этилацетатом в дихлорметане давала 166 мг чистого (1,2, 3)-1-[2,2-бис[бензоилокси/метил] -циклобутил]-5-метил-2,4(1Н,3Н)-пири мидив виде белого твердого вещества.

В) (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-5-метил-2,4(1Н,3Н)-пири- мидиндион.

25% -ный раствор метоксида натрия в метаноле (44,7 мл, 0,196 ммоль) добавляли к перемешиваемой суспензии (1,2,3)-1-[2,3,-бис[(бензолокси/метил)циклобутил] 5-метил-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндиола (146 мг, 0,326 ммоль) в безводном метаноле (4,9 мл) в аргоне при 40^оС. Через 4 ч прозрачный раствор охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме до остатка, который брали в воду. Величину рН доводили до 7, используя разбавленную хлористоводородную кислоту, и раствор помещали в колонку (1,5х21 см) СНР-20Р смола в воде. Элюирование водой, 2, 4 и 10%-ным ацетонитрилом в воде давало после выпарирования и последующей лиофилизации из воды 58 мг (1, 2, 3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)цик- лобутил]-5-метил-2,4 (1Н, 3Н)-пиримидиндион в виде расплывающего твердого вещества.

Протонный ЯМР (270 мГц, CD₃--CD₃, тетраметилсилан) 11, 11, (широкий синглет, 1Н), 7,64 (дублет, I 1,1 Гц, 1Н), 4,56 (мультиплет, 2Н), 4,47 (мультиплет, 2Н), 4,47 (мультиплет, 1Н), 3,44 (мультиплет, 4Н) 2,5 (мультиплет, CD₃--CD₃ растворитель +1Н), 1,85 (мультиплет, 1Н), 1,84 (мультиплет, 1Н), 1,79 (дублет, I 1,1 Гц, 3Н).

П р и м е р 4. (1,2,3)-4-амино-1-[2,3-бис(гидроксиметил)-циклобутил] -2(1Н)- пиримидинон

А) (1,2,3)-4-амино-1-[2,3-бис(бензоилокси)метил/циклобутил]-2(1Н)-пирими- динон.

Смесь (1, 2,3)-3-[[(4-метилфенил)сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиме- танола, эфира дибензоата (1,51 г 3,05 ммоль), цитозина (6,78 мг, 6,10 ммоль), карбоната калия (1,69 г 12,2 ммоль) и 18-краун-6 (804 мг, 3,04 ммоль) в 12,5 безводного диметилсульфоксида перемешивали в аргоне при 112^оС в течение 4,5 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали добавлением ледяной уксусной кислоты (0,7 мл, 12,2 ммоль). Растворитель удаляли в вакууме, остаток брали в этилацетате. Твердое вещество удаляли фильтрацией, осадок на фильтр промывали этилацетатом. Этилацетатный фильтрат концентрировали до остатка, который растворяли в толуоле и помещали в колонку Мерк силикагель-60 в толуоле. Элюирование изопропанолом в толуоле давало 156 мг целевого вещества.

В) (1,2,3)-4-амино-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-2(1Н)-пиримиди- нон.

25% -ный раствор метоксида натрия в метаноле (48 мл, 0,209 ммоль) добавляли к раствору (1,2,3)-4-амино-1-[2,3-бис[(безоилокси)метил]циклобутил]-2(1Н)-пиримидино на (151,3 мг, 0,349 ммоль) в 5,25 мл безводного метанола. Реакционную смесь перемешивали 75 мин при 40^оС и охлаждали до комнатной температуры. В вакууме удаляли растворитель, остаток растворяли в воде. С помощью 1 н. НСl доводили рН до 7. Водный раствор пропускали через колонку СНР-20Р смола в воде, колонку промывали 50 мл воды и элюировали градиентом 0-50% ацетонитрила в воде. Комбинирование соответствующих фракций и удаление растворителя в вакууме давало целевой продукт в виде прозрачного стекла (52 мг).

Протонный ЯМР (270 мГц, CD₃--CD₃, тетраметилсилан) : 7,69 (дублет, I 7 Гц, 1Н), 6,98 (широкий синглет, 2Н), 5,71 (дублет, I 7,6 Гц, 1Н), 4,65 (широкий мультиплет, 2Н), 4,37 (мультиплет, 1H), 3,43 (мультиплет, 4Н), 2,43 (мультиплет, 1Н), 2,31 (мультиплет, 1Н), 2,20 (мультиплет, 1Н), 1,77 (мультиплет, 1Н).

П р и м е р 5. [1 (Е), ,2,3-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил] -5-(2-бромэтенил)-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион.

А) (1,2,3)-1-[2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пирими- диндион.

К раствору урацила (1,26 г, 11,23 ммоль), высушенного в течение 16 ч при 50^оС, и 18-краун-6 (1,98 г, 7,49 ммоль) в диметилсульфоксиде (9 мл) при 50^оС добавляли карбонат калия (2,07 г, 14,98 ммоль) и (1,2,3)-3-[[(4-метилфенил)сульфонил] окси]-1,2-циклобутандиметанол, эфир дибензоат (3,7 г, 7,49 ммоль), При нагревании при 100^оС в азоте образовалась эмульсия. Добавляли еще диметилсульфоксид (3 мл), и смесь перемешивали при 100^оС в течение 24 ч. В вакууме удаляли растворители и получали остаток, который очищали хроматографией на Мерк силикагеле-60 (700 мл), используя градиент толуола до 3% изопропилового спирта в толуоле. Объединяли соответствующие фракции и получали 850 мл чистого целевого продукта. Фракции, содержащие целевой продукт с примесями, объединялись и концентрировались до остатка, который растворяли в толуоле (1 мл). Собирали полученные кристаллы, сушили и получали 35 мг дополнительного чистого целевого продукта.

В) (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион.

К суспензии (1, 2,3)-1-[2,3-бис[(бензоилокси)метил]циклобутил]-2,4- (1Н, 3Н)-пиримидиндиона (885 мг, 2,04 ммоль) в безводном метаноле (25 мл) добавляли 25%-ный раствор метоксида натрия в метаноле (264 мл, 1,22 ммоль). Смесь нагревали 3 ч при 40^оС в токе азота. Растворители удаляли в вакууме, а остаток растворяли в воде (5 мл). Понижали рН до 7 с помощью 1 н. НСl, и раствор оставляли на ночь при 0^оС. Полученный осадок и всплывающее вещество очищали на колонке с СНР-20Р смолой (200 мл), используя ступенчатый градиент воды, смесь 2% ацетонитрил/вода и 4% ацетонитрил/вода, и получали 423 мг целевого продукта.

С) (1 ,2,3)-1-[2,3-бис[(гидроксиметил)циклобутил]-5-иод-2,4(1Н,3Н)-пирими- диндион.

К суспензии (1, 2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-2,4,(1Н, 3Н)-пиримидиндиона (3423 мг, 1,87 ммоль) в диоксане (38 мл), очищенном на основной окиси алюминия, добавляли йод (950 мг, 3,75 ммоль) и 0,8 М азотной кислоты (2,5 мл, 2 ммоль). Этот раствор перемешивали 90 мин при 95^оС, а затем охлаждали до комнатной температуры. Добавляли раствор насыщенного водного тиосульфата натрия до тех пор, пока не попадал красный цвет. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и получали слегка желтоватый остаток. Это вещество очищали хроматографией на СНР-20Р смоле (150 мл), используя градиент воды, до 50% ацетонитрила в воде, что давало 557 мг целевого продукта.

D) [1 (Е), 2,3]-3-[1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-1,2,3,4-тетрагидро-2,4- диоксо-5-пиримидинил]-2-пропеновая кислота, метиловый эфир.

Суспензию ацетата палладия (II) (17,5 мг, 0,078 ммоль), трифенилфосфина (40,9 мг, 0,15 ммоль) и триэтиламина (290 мл, 2,08 ммоль) в диоксане (320 мл), очищенном на основной окиси алюминия, нагревали в течение 15 мин при 85^оС в атмосфере азота, а затем добавляли раствор (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил] -5-иод- 2,4(1Н,ДН)-пиримидиндиона (457 мг, 1,3 ммоль) и метилакрилата (468 мл, 5,2 ммоль) в диоксане (310 мл). Реакционную смесь нагревали при 85^оС в токе азота. Через 4 ч добавляли еще метилакрилат (234 мл, 2,7 ммоль). После дополнительного нагревания в течение 2 ч реакция все еще не была полной. Добавляли целит (300 мг) и теплую реакционную смесь фильтровали. В вакууме удаляли растворители. Остаток сушили концентрацией из безводного диоксана (2х10 мл) и остаток подвергали следующим условиям реакции.

Реакцию повторяли, но на этот раз удаляли кислород из диоксана, пропуская пузырьки аргона через растворитель. После нагревания суспензии ацетата палладия (II) (17,5 мг, 0,078 ммоль), трифенилфосфина (40,9 мг, 0,15 ммоль) и триэтиламина (290 мл, 2,08 ммоль) в диоксане (20 мл) в течение 15 мин при 85^оС в азот добавляли раствор вышеупомянутого остатка и метилакрилата (468 мл, 5,2 ммоль) в диоксане (10 мл). Смесь нагревали 3 ч при 85^оС. Добавляли целит (300 мг), теплую реакционную смесь фильтровали, охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме. Остаток помещали в колонку Мерк силикагель-60 (150 мл в хлороформе) и очищали, используя стадийный градиент хлороформа до 5; 7,5; 10% метанол/хлороформ. Объединяли соответствующие фракции и концентрировали, что давало 310 мг целевого вещества, загрязненного солями триэтиламмония. Смесь растворяли в воде (5 мл) и этилацетате (50 мл). Разделяли слои, слой воды экстрагировали этилацетатом (4х30 мл). Слои этилацетата объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, что давало 230 мг целевого вещества.

Е) [1(E), 2,3]-3-[1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-1,2,3,4-тетрагидро- 2,4-диокси- 5-пиримидинил]-2-пропеновая кислота.

Раствор метилового эфира [1(E), 2, 3] -3-[1-[2,3-бис(гидроксиме- тил)циклобутил] -1,2,3,4-тетрагидро-2,4-ди- оксо-5-пиримидинил]-2-пропеновой кислоты (230 мг, 0,742 ммоль) в 2М гидроксиде натрия (3,7 мл, 7,42 ммоль) перемешивали 1,5 ч при комнатной температуре, смесь охлаждали до 4^оС. Понижали рН до 2 с помощью 2 н. НСl и оставляли на 1 ч при 4 ^оС. Фильтрацией собирали осадок, промывали водой и сушили над Р₂О₅ в вакууме в течение 16 ч, что давало 120 мг целевого вещества. Маточные растворы и промывные воды концентрировали до 3 мл и оставляли на 16 ч при 4^oС. Собирали кристаллы, промывали водой, сушили над Р₂О₅ в вакууме в течение 4 ч и получали 7 г дополнительного целевого вещества.

F) [1(E),2,3]-3-[1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-5-(2-бромэтенил)-2,4- (1Н,3Н)- пиримидиндион.

К раствору [1(E), 2, 3] -3-[1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-1,2,3,4-тет- рагидро-2,4-диоксо-5-пиримидинил] -2-про- пеновой кислоты (127 мг, 0,429 ммоль, высушенной выпариванием диметилформамида, 2х3 мл) в диметилформамиде (2 мл) добавляли бикарбонат калия (129 мг, 1,29 ммоль). Добавляли раствор N-бромсукцинимида (76 мг, 0,429 ммоль) в диметилформамиде (1 мл), смесь перемешивали 2,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток концентрировали из воды (2х5 мл) и хроматографировали на СНР-20Р смоле (110 мл) с использованием градиента воды до 30% ацетонитрила в воде, что давало после концентрации в вакууме 99 мг [1(E),2,3]-1-[2,3-бис(гидроксиметил-циклобутил]-5- (2-бромэтенил)-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндиона с температурой плавления 155-157^оС.

Вычислено для С₁₂Н₁₅N₂O₄Br 0,31 H₂O:

C 42,79; H 4,69; N 8,32.

Найдено: C 42,85; H 4,69; N 8,26.

П р и м е р 6. (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-5-иод-2,4- (1Н,3Н)-пиримидиндион.

А) (1,2,3)-1-[2,3-бис(бензоилокси)метилциклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пирими- диндион.

Смесь (1, 2,3)-3-[[(4-метилфенил)- сульфонил]окси]-1,2-циклобутандиметано- ла, эфира дибензоата (1,25 г, 5,07 ммоль), урацила (0,567 г, 5,07 ммоль), карбоната калия (1,40 г, 1,12 ммоль) и 18-краун-6 (670 мг, 2,54 ммоль) в безводном диметилсульфоксиде (12,5 мл) нагревали 4,5 ч при 110^оС. В вакууме удаляли растворитель и полученное полутвердое вещество дважды растирали с этилацетатом. Объединенные этилацетатные плавающие сверху слои концентрировались до небольшого объема, разбавлялись равным объемом гексана и наносились на колонку Мерк силикагель-60 (2,5 х 25 см) в гексане. Колонку элюировали смесью этилацетата и гексана в соотношении 1:4 и 1:1, а затем этилацетатом, и получали частично очищенный целевой продукт (250 мг). Хроматография этого вещества на силикагельной колонке (1,5х24,5 см) в метиленхлориде с использованием в качестве элюента смеси этилацетата и метиленхлорида в соотношении 1:4 и 1:1, а затем этилацетате не обеспечивала удаление примесей. Последующая хроматография на силикагельной колонке (1,5х25 см) в толуоле и элюирование смесью изопропанола и толуола в соотношении 4:96 давали целевой чистый продукт (56,5 мг), а также целевой продукт с примесями. Перекристаллизация из толуола целевого продукта с примесями дала дополнительное целевое вещество (86,3 мг, общий выход 143 мг).

В) (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пиримидин- дион.

Смесь (1, 2,3)-1-[2,3-бис(бензоилокси)метилциклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пири- мидиндиона (142,9 мг, 0,329 ммоль), 45 мл 25%-ного раствора метоксида натрия в метаноле и 4,9 мл безводного метанола перемешивали при 40^оС в аргоне в течение 8,5 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и удаляли в вакууме растворитель. Липкий остаток частично растворяли в нескольких миллиметрах воды и доводили рН до 7 разбавленной хлористоводородной кислотой и бикарбонатом натрия. Раствор (7-8 мл) наносили на колонку из СН-20Р смолы (1,5х23,5 см) в воде. После элюирования водой ( 50 мл) колонку элюировали водным ацетонитрилом (2% 4% и 10%) и получали 55,8 мг целевого вещества в виде твердого вещества.

С) (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-5-иод-2,4(1Н,3Н)-пирими- диндион.

Раствор (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]-2,4(1Н,3Н)-пирими- диндиона (54,7 мг, 0,242 ммоль), иода (123 мг, 0,484 ммоль) и водной азотной кислоты (0,8 н. 0,256 ммоль) в 5 мл диоксана перемешивали при 105^оС 85 мин.После охлаждения до комнатной температуры смесь обесцвечивали водным тиосульфатом натрия и концентрировали в вакууме до твердого вещества. Твердое вещество брали в воду и концентрировали в вакууме (3 раза). Полученное твердое вещество частично растворяли в воде и наносили на колонку из СНР-20Р смолы (1,5х20 см) в воде. После элюирования водой (50 мл) колонку элюировали непрерывным градиентом воды 50%-ный ацетонитрил в воде и получали 67,3 мг (1,2,3)-1-[2,3-бис(гидроксиметил)цик- лобутил]-5-иод-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндиона в виде твердого вещества с температурой плавления 170-171^оС.

Вычислено для С₁₀Н_13IN₂O₄ 0,27 H₂O:

C 33,65; H 3,82; N 7,85.

Найдено: C 33,68; H 3,77; N 7,82.

П р и м е р 7. Лечение вирусных инфекций в культуре клеток.

Проводились анализы в системах культуры клеток для определения концентраций, которые эффективны для предотвращения нескольких видов вирусных инфекций. Анализы описываются ниже, а результаты приводятся в табл.1.

Сокращения:

HSV-1 (вирус герпеса, тип 1);

HSV-2 (вирус герпеса, тип 2);

VZV (вирус ветряной оспы);

HCMV (человеческий цитомегаловирус);

MuLV (вирус мышиного лейкоза).

Анализы культуры клеток.

Вирус (герпеса 1, герпеса 2, цитомегаловирус, ветряной оспы) адсорбировался в WI-38 однослойных культурах клеток в чашках с культурой с 6 ячейками (Costar, Cambridge, MA) в течение 1 ч перед тем, как добавляли питательную среду, содержащую двухкратные разбавления испытуемого соединения. Торможение развития бляшек оценивалось на неподвижных и окрашенных монослоях после 4-дневного инкубирования при 37^оС для HSV-1 и HSV-2 и через 6-7 дней инкубирования при 37^оС для HCMV и VZV.

ID₅₀ величины определялись по концентрации лекарства, которая обеспечивала по крайней мере 50%-ное уменьшение бляшек по сравнению с контрольными вирусами.

Противовирусные анализы MuLV проводились с некоторыми модификациями, как описано Rowe et al. and Shannon et al. SC-1 клетки помещались в количестве приблизительно 2х10⁵ клеток на ячейку в чашку с 6 ячейками. После инкубирования в течение ночи при 37^оС культуру клеток сенсибилизировали в течение 1 ч при 37^оС с помощью DEAE-Декстрана, промывали и инокулировали MuLV. В культуру вновь добавляли среду для роста, содержащую различные концентрации опытного соединения. Через 3 дня при 37^оС в культуру вновь добавляли свежую среду и опытные соединения и инкубировали при 37^оС еще 3 дня. Культуру затем промывали для удаления среды, облучали ультрафиолетовым светом и помещали в среде для роста клеток, содержащей соответствующую концентрацию опытного соединения, в количестве приблизительно 5х10⁵ ХС клеток на ячейку. Затем культуру инкубировали еще 4 дня с добавлением на второй день среды роста, содержащей опытное соединение, с последующим наложением ХС клеток. Затем культуры прополаскивали, окрашивали и подсчитывали бляшки.

К продукту примера 1 (100 мг, 0,358 ммоль) добавляли 20 мл дистиллированной из пара воды (дегазированной в вакууме в течение 20 мин), а затем 0,1 н. гидроксид натрия (3,6 мл). Полученную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 5 мин, добавляли дополнительное количество воды (5 мл) и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Нерастворимую часть удаляли, а полученный прозрачный раствор лиофилизировали до получения 79 мг гранулированной мононатриевой соли (1, 2, 3)- 9-[2,3-бис(гидроксиметил)циклобутил]гу- анина; т.пл 155-165^оС.

Элементный анализ для: C₁H₁₄N₅O₃Na 2H₂O

Рассчитано: C 40,87; H 5,61; N 21,66.

Найдено: C 41,21; H 5,46; N 21,61.

Сравнительные испытания.

Антивирусная активность и активность по ингибированию роста клеток определялась следующим образом.

Антивирусный опыт в культуре клеток.

Вирус Herpes Simplex типа 1(HSV-1) штамм Schooler, штамм HSV-2-186 приготавливались в виде экстрактов из культур клеток, инфицированных vero. Штамм AD169 циматогаловируса человека (HCMV) и штамм Ellen вируса варицелле зостер (VZV) приготавливались в виде суспензии клеток, инфицированных WI-38. Клетки WI-38 выращивались в минимально неотъемлемой среде Eagles с солью Eagles (EMEM) с добавкой 2 мкМ -глютамина, 100 ед./мл пенициллина, 11 мкг/мл стрептомицина и 10% зародышевой бычьей сыворотки (Джибко Лабораториз, Гранд Айлэнд, НЙ).

Вирусы анализировались на монослоях клеток WI-38. Вирусы абсорбировались на клеточные монослои на 6-ячеистых пластинах для культуры (Костар, Кембридж, МА) в течение 1-2 ч перед добавлением среды для поддержания жизнедеятельности (EMEM плюс добавки, 1% карбоксиметилцеллюлоза, 2,5% зародышевая (внутриутробная) бычья сыворотка лекарство), содержащей двукратные разбавления испытуемого соединения. Спустя 4-6 дней после инкубации при 37^оС оценивалось ингибирование развития бляшек (тромбоцитов). Величины ID₅₀ определялись по концентрации лекарства, которая обеспечивала 50%-ное снижение количества бляшек в сравнении с вирусными контролями. Все титрования производились в двух повторениях и выражались в виде интервала в повторных анализах.

Данные приведены в табл.2-4.

Ингибирование роста клеток.

Клетки WI-38 наносились в количестве 1х10⁵ клеток/мл на 12-ячеистые пластины для культуры клеток Костар. Через 24 ч в культуры клеток повторно добавлялась среда для роста, содержащая антивирусное соединение с рядом разбавлений. С интервалами 24 ч культуры клеток в каждой концентрации с четырехкратным повторением повторно суспендировались с помощью трипсинизации, производился подсчет жизнеспособных и мертвых клеток с использованием критерия исключения (эксклюзии) трипана синего. Контрольные культуры оценивались аналогичным образом и на протяжении 96-часового периода увеличивались в 3-5 раз. Показатель ID₅₀ для каждого соединения вычислялся в виде концентрации, которая ингибировала рост на 50% по отношению к контрольным культурам клеток.