остеопротегерин, применение его для изготовления фармацевтической композиции (варианты) и получения пищевого продукта (варианты) и корма для животных, пищевой продукт, корм для животных и фармацевтическая композиция для профилактики или лечения расстройств, связанных с костным ремоделированием, и/или иммунных расстройств

Формула изобретения

1. Остеопротегерин, который получают из женского или коровьего молока или молозива и который имеет профиль гликозилирования, дающий начало полипептиду с молекулярной массой приблизительно 80, 130 и 200 кДа, измеренной способом, описанным в настоящем изобретении.

2. Пищевой продукт, содержащий остеопротегерин по п.1.

3. Пищевой продукт по п.2, который выбирают из группы, состоящей из молока, йогурта, творога, сыра, кисломолочных продуктов, ферментированных продуктов на основе молока, мороженого, ферментированных продуктов на основе злаков, порошков на основе молока, детских смесей.

4. Корм для животных, содержащий остеопротегерин по п.1.

5. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения расстройств, связанных с костным ремоделированием, и/или иммунных расстройств, содержащая эффективное количество остеопротегерина по п.1, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, которую выбирают из группы, состоящей из растворов, сухой пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого питания в тубах или жидкого питания в тубах.

7. Применение остеопротегерина по п.1 для изготовления пищевого продукта по любому из пп.2 и 3.

8. Применение остеопротегерина по п.1 для изготовления корма для животных по п.4.

9. Применение остеопротегерина по п.1 для изготовления фармацевтической композиции по любому из пп.5 и 6.

10. Применение по п.9, где расстройство представляет собой остеопороз, болезнь Педжета, остеомиелит, инфекционные повреждения кости, ведущие к потере костной ткани, гиперкальциемию, остеопению, остеонекроз, потерю костной ткани вследствие остеоартрита или ревматоидного артрита, периодонтальную потерю кости и/или остеолитический метастаз.

11. Применение по п.9, где расстройство представляет собой аллергию, аутоиммунное заболевание, воспалительные болезни кишечника, системные аутоиммунные состояния, нарушение регуляции пролиферации и апоптоза клеток и иммунопатологические состояния кожи, ротовой полости, желудочно-кишечного и мочеполового тракта или дыхательных путей.

12. Применение по любому из пп.9-11, где расстройства связаны с преждевременными родами и/или низкой массой тела при рождении.

13. Применение остеопротегерина по п.1 для получения пищевого продукта для профилактики расстройств, связанных с костным ремоделированием.

14. Применение по п.13, где расстройство представляет собой остеопороз, болезнь Педжета, остеомиелит, инфекционные повреждения кости, ведущие к потере костной ткани, гиперкальциемию, остеопению, остеонекроз, потерю костной ткани вследствие остеоартрита или ревматоидного артрита, периодонтальную потерю кости и/или остеолитический метастаз.

15. Применение по любому из пп.12-13, где расстройства связаны с преждевременными родами и/или низкой массой тела при рождении.

16. Применение остеопротегерина по п.1 для получения пищевого продукта для профилактики иммунных расстройств.

17. Применение по п.16, где расстройство представляет собой аллергию, аутоиммунное заболевание, воспалительные болезни кишечника, системные аутоиммунные состояния, нарушение регуляции пролиферации и апоптоза клеток и иммунопатологические состояния кожи, ротовой полости, желудочно-кишечного и мочеполового тракта или дыхательных путей.

18. Применение по любому из пп.16 и 17, где расстройства связаны с преждевременными родами и/или низкой массой тела при рождении.

19. Применение остеопротегерина по п.1 для получения пищевого продукта для развития костного вещества и/или иммунной системы.

20. Применение остеопротегерина по п.1 для получения фармацевтической композиции для развития костного вещества и/или иммунной системы.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к остеопротегерину, который можно получить из молочных источников, в частности из женского и коровьего молока. Настоящее изобретение также относится к его применению для получения препарата, принимаемого внутрь, и/или фармацевтической композиции, в частности к применению такого препарата/композиции для предупреждения или лечения расстройств, связанных с метаболизмом в костях и иммунной функцией.

Уровень техники

У млекопитающих кости обеспечивают опору телу и состоят из минеральных веществ, матрикса из коллагеновых и неколлагеновых белков и клеточного компонента. Их рост и поддержание регулируются многими различными факторами, включая регуляцию и взаимодействие составляющих их клеточных типов, т.е. хондроцитов, образующих хрящ, остеобластов, синтезирующих и отлагающих костный матрикс, и остеокластов, ответственных за резорбцию костного вещества.

Хондроциты происходят от мезенхимных клеток и генерируют исходную хрящевую матрицу, требуемую для эндохондрального образования кости. Остеобласты, промотирующие образование костной ткани, происходят от мезенхимных преостеобластов и локализуются на поверхности костей, где они синтезируют, транспортируют и размещают белки матрикса С другой стороны, остеокласты, ответственные за резорбцию костей, происходят от предшественников гранулоцитов-моноцитов, присутствующих в гематопоэтическом костном мозгу. Действия остекластов и остеобластов тесно связаны, например, во время процесса резорбции, опосредуемой остеокластами, вырабатываемые белковые факторы действуют как сигнальные молекулы для инициации восстановления костей остеобластами Остеобласты, в свою очередь, могут влиять на функцию остеокластов через экспрессию растворимых или мембранно-связанных регуляторов. Поэтому нормальное ремоделирование костей зависит от определенного баланса между противоположными функциями образования костей и резорбции костей, осуществляемыми каждым из соответствующих типов клеток.

Факторы роста, такие как фактор роста фибробластов (FGF) и трансформирующий фактор роста (TGF- ), сохраняются в костном внеклеточном матриксе и при секреции стимулируют локальное высвобождение костных клеток-предшественников. Затем факторы, такие как костные морфогенные белки (BMP) и паратиреоидный гормон (РТН), влияют на развитие указанных предшественников в формирующие кости клетки - остеобласты, конечные дифференцировка и функция которых регулируются взаимодействием клетки с белками костного матрикса.

Во время старения индивидуум претерпевает постепенную потерю костной массы - явление, называемое разобщением, которое, как полагают, является результатом активности остеокластов, превосходящей таковую остеобластов. В случаях, когда такое разобщение сохраняется в течение длительного времени, все больше и больше костного вещества разрушается/рассасывается, и результатом является состояние, называемое остеопорозом.

Кроме явления, зависящего от возраста, потеря костной ткани также может быть вызвана кальциевым или гормональным дефицитом или состояниями, результатом которых являются различные заболевания, такие как остеопороз, гиперкальциемия, болезнь Педжета, потеря костной ткани вследствие остеоартрита или ревматоидного артрита или остеомиелита и т.п. Уменьшенная плотность костей, как правило, приводит к пониженной механической прочности и повышенной вероятности переломов.

Современные подходы к лечению остеопороза и/или родственных нарушений в костях включают применение кальция, вводимого пациентам, нуждающимся в этом. В последнее время средства, вовлекаемые в стимуляцию и/или ингибирование костных клеток, такие как гормоны, кальцитонин, инсулиноподобный фактор роста или остеопротегерин (OPG), также рассматриваются как могущие применяться при лечении вышеуказанных болезненных состояний. Указанные средства, как правило, получают рекомбинантными способами, и их следует вводить в состав/готовить в форме галеновых препаратов с тем, чтобы соответствующее вещество могло достигнуть мишени-кости в активной форме.

В WO 00/24771 описываются нуклеиновые кислоты, кодирующие остеопротегериноподобные белки, и их применение, например, при лечении остеопороза. Полипептид синтезируют рекомбинантными способами и затем вводят в состав так, чтобы он был совместим с предполагаемым способом введения. В качестве таких способов предлагаются внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное (например, путем ингаляции), трансдермальное (местное), через слизистую оболочку и ректальное введение.

Вообще, поиск подходящей галеновой формы для данного вещества является трудоемким и громоздким, так как ингредиенты, используемые для данной цели, должны быть совместимы с активным веществом и также должны обеспечивать достаточную защиту от различных условий в организме. Однако, так как средства, стимулирующие рост костей, синтезируются локально - в/на костной ткани - такое вещество трудно вводить. Обычно следует разрабатывать капсулы, которые помогают пройти веществу через желудочно-кишечный тракт без разрушения под влиянием неблагоприятных условий окружающей среды, существующих в нем. Однако такой способ введения также имеет некоторые недостатки, так как вещество должно пройти печень и транспортироваться жидкостями организма, прежде чем оно достигнет кости. Кроме того, это часто приводит к пониженному количеству активного биологического вещества, достигающего ткани-мишени.

Сущность изобретения

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечить средство введения активного вещества индивидууму, в результате которого вещество действует в организме индивидуума в специфической ткани-мишени.

Соответственно вышеуказанная проблема решается с помощью остеопротегерина, который можно получить из молока.

Перечень фигур

Фиг.1 показывает концентрацию остеопротегерина в женском грудном молоке во время разных стадий грудного кормления.

Фиг.2 показывает результаты анализа методом вестерн-блоттинга фракций женского молока в восстановительных условиях с использованием геля с 10% SDS. Полосы OPG обнаруживают с использованием биотинилированных поликлональных антител BAF805 против OPG от R&D Systems и конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (SAPP).

Фиг.3 показывает рестрикционную карту плазмиды, интегрированной в геномную ДНК трансформантов Yarrowia.

Фиг.4 показывает результаты анализа методом ОТ-ПЦР (RT-PCR) клеток женского грудного молока и эпителиальных клеток молочной железы человека MCF-7; дорожки 1 и 2: -актин (полоса ожидаемого размера 460 п.о.); дорожки 3 и 4: OPG (полоса ожидаемого размера 603 п.о.). 1. Клетки женского грудного молока; 2. MCF-7; 3. Клетки женского грудного молока; 4. MCF-7.

Фиг.5 показывает результаты эксперимента, в котором OPG настоящего изобретения ингибирует апоптоз клеток Jurcat, индуцированный TRAIL.

Фиг. 6 и 7 также поясняют предлагаемое изобретение.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Остеопротегерин (OPG), также известный как фактор, подавляющий остеокластогенез (OCIF), и подобная TNF-рецептору молекула 1 (TR1), является описанным недавно членом семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR). Он подавляет развитие остеокластов как in vitro, так и in vivo, и повышает плотность костей (остеопетроз). В здоровых мышиных эмбрионах OPG локализуется в хрящевых рудиментах развивающихся костей, а также в тонком кишечнике.

Однако в отличие от других членов семейства TNF-рецепторов OPG не обладает трансмембранным доменом. Более того, можно показать, что OPG также является рецептором для цитотоксического лиганда TRAIL (родственный TNF лиганд, вызывающий апоптоз) и идентичен рецептору-1, происходящему из фолликулярных дендритных клеток. Как таковой он, как предполагается, регулирует гибель клеток, а также играет важную роль в образовании лимфоидных тканей и регуляции иммунных реакций. Действительно, показано, что у животных, лишенных OPG, обнаруживаются недоразвитые лимфоидные ткани.

В исследованиях, ведущих к настоящему изобретению, теперь неожиданно обнаружилось, что кроме наличия остеопротегерина в, например, костных тканях, его также можно найти в женском грудном молоке. В результате, во время кормления грудью мать, очевидно, снабжает новорожденного указанным биологически активным веществом в форме, способной выживать в желудочно-кишечном тракте. Из указанного следует, что OPG, продуцируемый клетками молочной железы, очевидно отличается от OPG, выделенного из других источников, в смысле его стабильности и/или устойчивости к разложению.

Без намерения быть связанным какой-либо теорией, в настоящее время полагают, что специфический профиль гликозилирования, сообщаемый белку в клетках молочной железы, делает полипептид более устойчивым по отношению к кислой жидкости желудка и/или щелочной окружающей среде, встречающейся в кишечнике, так что после всасывания в кишечнике и переноса в костную ткань активный домен остается интактным и способен проявлять свою биологическую активность.

OPG настоящего изобретения, т.е., в форме, которую можно получить из молочных источников, имеет полипептидную последовательность, определяемую SEQ ID. NO.1, и обнаруживает размеры в примерно 80, 130 и 200 кДа соответственно, что отличается от размеров OPG, полученного рекомбинантными способами (55 кДа).

OPG настоящего изобретения можно включать в препарат, принимаемый внутрь, который может представлять собой пищевой продукт, такой как, например, молоко, йогурт, творог, сыр, кисломолочные продукты, ферментированные продукты на основе молока, мороженое, ферментированные продукты на основе злаков, порошки на основе молока, детские смеси, а также корм для животных. Подобным образом, OPG настоящего изобретения также можно включать в энтеральную или фармацевтическую композицию, например, выбранную из группы, состоящей из растворов, сухой пероральной добавки, жидкой пероральной добавки, сухого питания в тубах или жидкого питания в тубах.

Действительно, так как OPG по настоящему изобретению устойчив, нет необходимости переводить активное соединение в специфическую галеновую форму для защиты его от различных и потенциально неблагоприятных условий, существующих в желудочно-кишечном тракте и жидкостях организма.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к применению остеопротегерина из молока для получения препарата, принимаемого внутрь, такого как пищевой продукт, или энтеральная композиция, или фармацевтическая композиция.

Остеопротегерин настоящего изобретения и препарат, принимаемый внутрь, описанный выше, можно использовать для лечения и/или профилактики расстройств костного ремоделирования.

Наиболее обычным костным расстройством является остеопения - состояние, относящееся вообще к любому уменьшению костной массы до уровней ниже нормального. Такое состояние может возникнуть из-за снижения скорости синтеза костей, или возрастания скорости деструкции костей, или того и другого. Наиболее обычной формой остеопении является первичный остеопороз, также называемый постменопаузальным и возрастным остеопорозом. Такая форма остеопороза является следствием общей потери массы костной ткани с возрастом и, как правило, результатом повышения скорости резорбции костей при нормальной скорости образования костей. Другими формами остеопороза являются эндокринный остеопороз (гипертиреоз, гиперпаратиреоз, синдром Кушинга и акромегалия), наследственные и врожденные формы остеопороза (несовершенный остеогенез, гомоцистинурия, синдром Менкеса и синдром Райли-Дея) и остеопороз вследствие иммобилизации конечностей.

Совсем недавно признано, что остеопороз в популяции людей также связан с более высокой частотой артериальной кальцификации - компонента многих атеросклеротических повреждений.

Следовательно, пищевой продукт, описанный выше, можно с полным основанием использовать для предупреждения появления или облегчения симптомов и/или структурных изменений в костях, связанных с остеопенией или остеопорозом соответственно. Следует иметь в виду, что активное вещество будет включаться в пищевой продукт в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать желаемый биологический ответ. Так как обнаружено, что OPG сам является составляющей материнского молока, продукты на основе молока по своей сущности являются весьма подходящими для доставки вещества в организм индивидуума.

С другой стороны, для лечения тяжелых случаев остеопении или остеопороза соответственно, предпочтительной лечебной схемой может быть фармацевтическая композиция, содержащая остеопротегерин по настоящему изобретению в больших количествах, т.е. в количествах, достаточных для приостановки или даже реверсии болезненного процесса. Такие композиции могут содержать OPG настоящего изобретения в количестве единственного активного вещества. Преимуществом является то, что не предусматривается сколь либо серьезного подбора состава для вещества. Поэтому в рамках настоящего изобретения разумно просто прессовать таблетку, состоящую из "порошка OPG", при необходимости, с добавлением носителей или корригентов. Однако в случае, когда OPG настоящего изобретения следует вводить в композицию вместе с другими активными веществами, следует учитывать природу и склонность к разложению таких дополнительных веществ в желудочно-кишечном тракте. OPG настоящего изобретения, включенный в дозированные лекарственные формы, даст возможность лечащему врачу более точно контролировать суточную или недельную дозу активного соединения.

Остеопротегерин настоящего изобретения также можно использовать для предупреждения появления и/или лечения болезни Педжета, остеомиелита, инфекционных повреждений кости, которые приводят к потере костной ткани, гиперкальциемии, остеонекроза, потери костной ткани вследствие остеоартрита или ревматоидного артрита, периодонтальной потери кости и/или остеолитического метастаза.

Также обнаружено, что OPG является рецептором для лиганда, родственного фактору некроза опухоли (TRAIL), который индуцирует апоптоз после связывания с его рецепторами, содержащими домен смерть. Предполагается, что он регулирует гибель клеток, а также играет важную роль в образовании лимфоидных тканей и регуляции иммунных реакций. Кроме того, OPG является ложным рецептором для RANKL (лиганд для активатора рецептора NF- В), который описывают как продукт активированных Т-клеток. Связывание рецептора для RANKL на зрелых дендритных клетках увеличивает выживание дендритных клеток. Кроме того, вступление RANKL в контакт с его рецептором усиливает рост Т-клеток и функцию дендритных клеток.

Соответственно настоящее изобретение относится к применению остеопротегерина, который можно получить из женского и/или коровьего молока, для производства препарата, принимаемого внутрь, такого как, например, пищевая композиция или энтеральная композиция, или для производства лекарственного средства соответственно с целью содействия нормальному развитию иммунных тканей, с целью содействия нормальной иммунной функции и даже для предупреждения и/или лечения расстройств иммунной системы.

Расстройства иммунной системы, рассматриваемые в настоящем изобретении, включают аллергию, аутоиммунные реакции, сепсис, рак, воспалительные болезни кишечника, системные аутоиммунные состояния, сердечно-сосудистые заболевания и иммунопатологические состояния кожи, ротовой полости, желудочно-кишечного и мочеполового тракта и дыхательных путей.

Кроме того, остеопротегерин настоящего изобретения также можно использовать для регуляции пролиферации и апоптоза клеток, для стимуляции оральной переносимости, модуляции инфекционных процессов и бактериальной колонизации новорожденного. В частности, у новорожденных указанные выше расстройства, в общем, могут ассоциироваться с преждевременными родами и/или низкой массой тела при рождении, так что в таких случаях остеопротегерин настоящего изобретения можно просто вводить младенцу через продукты детского питания.

Следует иметь в виду, что индивидуумом, которого лечат, может являться индивидуум любого возраста, хотя маленькие дети и престарелые являются основными субъектами, которых приходится рассматривать из-за свойственной им потребности в экзогенном остеопротегерине. Некоторым индивидуумам, например новорожденным, остеопротегерин требуется для развития костного вещества и/или иммунной системы, так что в таких случаях может оказаться выгодным введение соединения, и/или пищевого продукта, и/или фармацевтической композиции настоящего изобретения.

Однако следует иметь в виду, что настоящее изобретение также можно применить ко взрослым людям для предупреждения появления какого-либо из вышеуказанных расстройств. Также следует иметь в виду, что, кроме людей, индивидуумами, которых лечат, могут являться животные, например домашние животные, для которых OPG настоящего изобретения включают в корм.

OPG настоящего изобретения можно получить из молочного источника, полученного от млекопитающего, в частности из женского или коровьего молока или молозива. OPG женского молока имеет аминокислотную последовательность из 380 ак и обнаруживает молекулярную массу приблизительно в 80, 130 и 200 кДа при сравнении с белковыми маркерами, которые используют в качестве эталонов молекулярной массы (BioRad). Он показывает 4 сайта для N-гликозилирования и может присутствовать в мономерной форме и димерной форме за счет образования связи S-S через Cys³⁷⁹.

OPG настоящего изобретения можно выделить из молочных источников, таких как женское или коровье молоко. Однако следует иметь в виду, что OPG настоящего изобретения можно получить рекомбинантными способами в соответствующих клетках, дающих профиль гликозилирования, какой наблюдают в "OPG из молока". Предпочтительными клетками для экспрессии являются клетки молочной железы, так как можно ожидать, что такие клетки дадут идентичный или по существу идентичный профиль гликозилирования.

Подходящие клетки для экспрессии OPG настоящего изобретения можно получить путем иммортализации подходящим средством, таким как вектор SV40 или ген теломеразы, и трансформации экспрессирующим вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид OPG. Представляющий интерес полипептид можно получить, выделяя его из супернатанта в случае, когда полипептид секретируется, или собирая клетки и выделяя полипептид из самих клеток. В случае непрерывного получения предпочтительным будет выделение из супернатанта.

Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.

Примеры

Образцы женского молока и человеческой сыворотки

Образцы грудного женского молока (10-60 мл) берут у здоровых матерей в период до 17 дней после родов в стерильных условиях путем сцеживания с помощью молокоотсоса или иногда ручным сцеживанием. Молоко сцеживают в стерильные 50-мл центрифужные пробирки и обрабатывают в течение 2 час после взятия. После центрифугирования (200×g, 10 мин) клеточный осадок сразу же отделяют и обрабатывают для экстрагирования РНК. Оставшееся молоко замораживают при -20°С. Образцы человеческой сыворотки получают от здоровых доноров и хранят при -20°С.

Фракционирование женского грудного молока

Отделяют сливки от цельного молока высокоскоростным центрифугированием. Верхний слой сливок извлекают, промывают водой и воды от промывки сливок замораживают при -20°С и хранят до применения. Разделения сыворотки и казеина достигают обработкой сычужным ферментом или химическим подкислением (HCl) снятого молока, вызывающим свертывание казеина. Затем центрифугированием обработанного молока отделяют сладкую сыворотку от нерастворимого сычужного казеина и кислую сыворотку от кислотного казеина соответственно. Наконец, с использованием ультрацентрифугирования получают растворимые молочные белки (ультрацентрифугированная сыворотка) и нерастворимый мицеллярный казеин. Все фракции казеина и сыворотки замораживают при -20°С и хранят до применения.

Линия клеток молочной железы человека

Клеточная линия клеток молочной железы MCF-7 (American Type Culture Center (ATCC), Manassas, VA., HTB-22), полученная из плеврального выпота рака молочной железы, сохраняет некоторые характеристики дифференцированного эпителия молочной железы. Клетки культивируют в DMEM (Amimed Bioconcept, Allschwill, Швейцария) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS, Amimed Bioconcept) и культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Культуральную среду заменяют 2-3 раза в неделю. По достижении конфлюэнтности клетки отделяют с использованием трипсина/ЭДТА (GibcoBRL) при 37°С. Затем клетки готовят для экстрагирования РНК.

Анализ методом вестерн-блоттинга

Образцы молока разбавляют 1/25 восстанавливающим буфером Лэммли и кипятят в течение 5 мин. Белки разделяют методом SDS-PAGE (10%) и переносят на нитроцеллюлозные мембраны (BioRad). Блоты гибридизуют с биотинилированными поликлональными антителами против человеческого OPG (BAF805 при 0,2 мкг/мл; R&D Systems) и комплексом стрептавидин-щелочная фосфатаза (Pierce). Иммунореактивность визуализируют с помощью субстрата щелочной фосфатазой BCIP/NBT (Zymed Laboratories). В качестве эталонов молекулярной массы используют предварительно окрашенные белковые маркеры (BioRad). Рекомбинантный человеческий OPG (R&D Systems), служащий в качестве положительного контроля, наносят в количестве 25 нг на дорожку.

Экспрессия OPG клетками женского грудного молока и эпителиальными клетками молочной железы человека

Обратную транскрипцию с последующей ПЦР используют для амплификации транскриптов OPG в популяции клеток цельного женского грудного молока от одной матери через 18 дней после родов и в линии эпителиальных клеток молочной железы MCF-7. Полную РНК экстрагируют из клеток с использованием способа с Trizol (GibcoBRL). Коротко, Trizol (1 мл на 5-10×10 ⁶ клеток) добавляют к клеточному осадку, смесь несколько раз засасывают в пипетку и выдувают и переносят в Эппендорфовскую пробирку. Добавляют хлороформ (0,2 мл на 1 мл Trizol), и пробирки инкубируют в течение 5 мин перед центрифугированием при 12000×g в течение 15 мин, 4°С. РНК осаждают равным объемом изопропанола и центрифугируют при 12000×g в течение 10 мин. Осадки промывают 70% этанолом и затем ресуспендируют в стерильной деионизованной воде. РНК хранят при -20°С до применения.

Образцы РНК обрабатывают ДНКазой I, не содержащей РНКазы, для удаления загрязнения геномной ДНК. РНК определяют количественно по поглощению при 260 нм и 280 нм на спектрофотометре при соответствующем разведении (100-200 крат). Концентрацию РНК (в мкг/мл) вычисляют следующим образом: (поглощение А₂₆₀)×(фактор разведения)×40 мкг/мл. Образец тотальной РНК, по существу, не содержащий белков, должен иметь отношение А ₂₆₀/А₂₈₀ 1,8-2,2.

РНК подвергают обратной транскрипции обратной транскриптазой вируса мышиного лейкоза Молони (Perkin-Elmer). Образцы РНК (0,5 мкг тотальной РНК), 0,5 единицы ингибитора РНКазы, 1 мМ каждого dNTP, 0,5 нмоль/мл специфического 3'-праймера, 5 мМ MgCl₂ и 1,25 единицы обратной транскриптазы инкубируют в общем объеме реакционной смеси 10 мкл, содержащей буфер для фермента, поставляемый изготовителем. Реакционную смесь инкубируют в течение 30 мин при 42°С и затем нагревают в течение 5 мин при 95°С. Затем продукты обратной транскрипции амплифицируют с Gold-ДНК-полимеразой (Perkin-Elmer) в термоциклере (Biolabo, Scientific Instruments, Chatel St Denis, Швейцария). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляют в общем объеме 50 мкл с использованием 10 мкл продуктов обратной транскрипции в буфере для ПЦР, 2 мМ MgCl ₂, 5 мкМ каждого dNTP, 0,2 нмоль/мл обоих OPG-специфических праймеров - антисмыслового ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG и смыслового GGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTG и 1,25 единицы ДНК-полимеразы. После начальной стадии денатурации в течение 10 мин при 95°С образцы амплифицируют в 35 циклах денатурации при 94°С в течение 45 с, отжига при 60°С в течение 1 мин и наращивания при 72°С в течение 1 мин 30 с, с последующей 7-мин стадией наращивания при 72°С. Все образцы подвергают ОТ-ПЦР, используя -актин в качестве положительного контроля. Образцы продуктов ОТ-ПЦР вносят в 1,2% агарозные гели (содержащие бромид этидия) в буфере 1×ТАЕ и разделяют электрофорезом при 150 В в течение 1 часа. Продукты ОТ-ПЦР визуализируют в УФ-свете. Точный размер полос определяют путем сравнения с маркерами размеров ДНК (Boehringer Mannheim).

ELISA-анализ человеческого OPG (иммуноферментный сэндвич-анализ)

Концентрацию OPG, присутствующего в грудном молоке и различных фракциях молока, измеряют методом ELISA. С этой целью моноклональные антитела против OPG (МАВ805, 1 мкг/мл; R&D Systems, UK) наносят на 96-луночные планшеты (Nunc) путем инкубации в течение ночи при 4°С. Затем планшеты дважды промывают 0,05% раствором твина-20 в PBS. Неспецифическое связывание блокируют инкубацией планшетов с 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS еще в течение 2 час при комнатной температуре. Образцы или рекомбинантный OPG в стандартных концентрациях (0,119-121,5 нг/мл; R&D Systems) инкубируют в PBS-BSA в течение 3 час при комнатной температуре. Затем планшеты четыре раза промывают PBS-твином перед добавлением меченных биотином поликлональных антител против OPG (BAF805, 0,5 мкг/мл; R&D Systems) еще в течение одного часа при комнатной температуре. После дополнительных четырех промывок добавляют стрептавидин-пероксидазу (SAAP, 0,5 мкг/мл, Kirkegaard % Perry KPL) и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывают четыре раза и добавляют субстрат пероксидазы ТМВ (KPL). Планшеты накрывают и инкубируют в темноте в течение пяти минут. Ферментативную реакцию останавливают, добавляя 1 N HCl. Определяют поглощение при 450 нм при помощи считывающего устройства для ELISA (Dynex Technologies). Предел чувствительности составляет приблизительно 30 пг/мл.

Биологическая активность OPG из женского молока

OPG является рецептором для лиганда, родственного фактору некроза опухоли (TRAIL), который индуцирует апоптоз после связывания с его содержащими домен смерти рецепторами DR4 и DR5. Разрабатывают биологический анализ, в котором OPG грудного женского молока можно проверить на его способность блокировать вызываемый TRAIL апоптоз таких клеток.

С этой целью клетки Jurkat, клон Е6-1 (АТСС) культивируют в среде RPMI 1640 в модификации поставщика АТСС, содержащей 10% FCS (37°С и 5% СО₂ ). Клетки высевают при плотности 5×10⁶ клеток/лунку в 96-луночные планшеты (Nunc). В каждую лунку добавляют различные концентрации растворимого рекомбинантного человеческого TRAIL (0-20 нг/мл) в присутствии 2 мкг/мл белка-усилителя - антител, взаимодействующих с растворимым рекомбинантным человеческим TRAIL и посредством этого повышающих его активность (Alexis, Läufelfingen, CH). Некоторые лунки также содержат 50 нг/мл рекомбинантного человеческого OPG (R&D Systems), образцы женского грудного молока (НМ; конечное разведение 1/80; собраны в 1-й или 9-й день после родов) и/или 20 мкг/мл моноклональных антител против OPG (MAB805, R&D Systems). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 16 час. Жизнеспособность клеток определяют, добавляя ³H-тимидин (1 мкКи/лунку) во время последних 6 часов культивирования.

В контрольной среде ингибирование пролиферации клеток, вызванное TRAIL, очевидно при концентрациях свыше 5 нг/мл. Однако образцы НМ предотвращают такое ингибирование. Этот эффект имеет место явно из-за присутствия OPG, так как моноклональные антитела против OPG обращают указанный эффект.

Результаты показаны на фигуре 5.

Анализ методом вестерн-блоттинга

OPG синтезируют в клетках в виде мономера в 55 кДа, но при внеклеточной секреции он превращается в связанный дисульфидной связью димер приблизительно в 100 кДа. В молоке полосы детектируются в области приблизительно 80, 130 и 200 кДа.

Концентрации OPG в женском грудном молоке

Содержание OPG в образцах грудного молока, взятых у 10 кормящих матерей в разное время в первые 17 дней лактации, проверяют методом ELISA. Концентрации достигают максимальных значений в первые 1-3 дня лактации и затем снижаются. Концентрации в молоке колеблются от 50 нг/мл до почти 2 мкг/мл (фиг.1).

Клеточный источник OPG молока

Анализ методом ОТ-ПЦР показывает, что OPG настоящего изобретения можно обнаружить в клетках женского грудного молока и эпителиальных клетках молочной железы. Конститутивная экспрессия мРНК для OPG выражена в обоих типах необработанных клеток (фигура 4).

Клонирование OPG женского молока в дрожжах

Выделяют клетки из женского грудного молока (18 дней после родов) центрифугированием (200×g, 10 мин). Из клеточного осадка экстрагируют тотальную РНК с использованием Trizol® (Life Technologies, Basel, Швейцария), обрабатывают ДНКазой I и затем очищают на центрифужных колонках RNeasy (Qiagen, Basel) согласно рекомендациям изготовителей. Продукт ПЦР, кодирующий зрелую форму OPG, амплифицируют из такой тотальной РНК с использованием системы ОТ-ПЦР Titan One tube согласно протоколу, предоставляемому изготовителем (Roche Diagnostics, Rotkreuz).

С OPG-специфическим антисмысловым праймером

CCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGA GAAACGTTTCCTCCAAAGTACC

и смысловым праймером

ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG

из данной кДНК амплифицируют фрагмент ПЦР в 1174 п.о. Продукт ПЦР расщепляют SfiI-SpeI, очищают в геле и полученный фрагмент в 1156 п.о. лигируют с расщепленной SfiI-XbaI и SAP-обработанной pINA1267, получая pNFF270. Затем данную плазмиду вводят в дрожжи Yarrowia lipolytica путем трансформации. Фигура 3 изображает рестрикционную карту плазмиды, которую интегрируют в геномную ДНК трансформантов Yarrowia и SEQ ID. NO. 1-белок, кодируемый такой плазмидой OPG.

Последовательность клона pGEM-T OPG показана на фигуре 6. Зрелый OPG представлен черным шрифтом и дан в транслированном виде. В опубликованной последовательности OPG/OCIF аминокислотный остаток 242 зрелого OPG представлен остатком Ala (А), в то время как все анализированные клоны pGEM-T OPG в указанной позиции кодируют остаток Asp (D). SfiI-SpeI фрагмент OPG данного клона переносят в pINA1267, расщепленную SfiI-XbaI. Полученная плазмида имеет рестрикционную карту, изображенную на фигуре 3. Единичную копию такой плазмиды интегрируют в геномную ДНК трансформантов Yarrowia. Белок, кодированный такой плазмидой, показан на фигуре 4. Зрелый OPG показан жирным шрифтом. Плазмиду pNFF270 вводят в Yarrowia lipolytica путем трансформации. Полученные трансформанты секретируют белок, перекрестно реагирующий с OPG-специфическими антителами, в культуральную среду, в то время как трансформанты Y.lipolytica, несущие не содержащий вставки экспрессионный вектор, не секретируют такой белок.