фармацевтические композиции для лечения целлюлита

Формула изобретения

1. Применение ингибитора PDE3B, выбранного из группы, состоящей из: анагрелида, цилостазола, пимобендана, милринона, амринона, олпринона, эноксимона, цилостамида, веснаринона, трехинзина, 6-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-фенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-H-пиридазин-3-она; 3-{2-[4-(4,4-диметил-5-оксо-4,5-дигидро-1-H-пиразол-3-ил)-2,3-дифтор-фениламино]-6-оксо-циклогекс-1-енилметил}-бензонитрила; 5-{4-[2-(2,6-дихлорбензил)-3-оксо-циклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 5-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-фенил]-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 5-{4-[2-(3-нитробензил)-3-оксо-циклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 6-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-2-фторфенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-она для изготовления фармацевтической композиции для местного или мезотерапевтического лечения целлюлита.

2. Применение по п.1 милринона, цилостамида или трехинзина.

3. Применение по п.1, где местная фармацевтическая композиция представлена в форме геля, распыляемого геля, крема, нежирного крема, препарата типа "масло не в масле" (oil-non-oil), мази или лейкопластыря.

4. Применение по п.1, где местная фармацевтическая композиция представлена в форме, пригодной для локальной внутрикожной инъекции или мезотерапии.

5. Применение по п.4, где указанная композиция представлена в форме инъекционного раствора.

6. Применение по п.1, где количество ингибитора PDE3B составляет от 0,1 до 3% по массе.

7. Применение по п.6, где указанное количество составляет от 1 до 2% по массе.

8. Применение по п.6, где указанное количество составляет от 0,1 до 1% по массе.

9. Применение по п.1, где местная фармацевтическая композиция дополнительно содержит соединение, смесь соединений или экстракт, активные в отношении микроциркуляции.

10. Применение по п.9, где указанная композиция дополнительно содержит экстракт арники, Ginkgo biloba, ананаса, дудника китайского (dong quai, Angelica siniensis) или Centella asiatica.

11. Применение по п.9, где указанное соединение представляет собой сапонин или флавон.

12. Применение по п.11, где указанное соединение представляет собой эсцин.

13. Применение по любому из пп.9-12, где указанное соединение, смесь соединений или экстракт, активные в отношении микроциркуляции, присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 0,1 до 4% по массе.

14. Способ лечения целлюлита, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, местной фармацевтической композиции или композиции, пригодной для локальной внутрикожной инъекции или мезотерапии, содержащей в качестве активного ингредиента ингибитор PDE3B, выбранный из группы, состоящей из: анагрелида, цилостазола, пимобендана, милринона, амринона, олпринона, эноксимона, цилостамида, веснаринона, трехинзина, 6-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-фенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-она; 3-{2-[4-(4,4-диметил-5-оксо-4,5-дигидро-1-Н-пиразол-3-ил)-2,3-дифтор-фениламино]-6-оксо-циклогекс-1-енилметил}-бензонитрила; 5-{4-[2-(2,6-дихлорбензил)-3-оксо-циклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 5-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-фенил]-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 5-{4-[2-(3-нитробензил)-3-оксо-циклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-она; 6-[4-(2-бензил-3-оксо-циклогекс-1-ениламино)-2-фторфенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-она.

15. Способ по п.14, где ингибитор PDE3B выбран из группы, состоящей из милринона, цилостамида и трехинзина.

16. Способ по п.14, где местная композиция представлена в форме геля, распыляемого геля, крема, нежирного крема, препарата типа "масло не в масле", мази или лейкопластыря.

17. Способ по п.14, где местная фармацевтическая композиция содержит количество ингибитора PDE3B, составляющее от 1 до 2% по массе.

18. Способ по п.14, где композиция, пригодная для локальной внутрикожной инъекции или мезотерапии, содержит количество ингибитора PDE3B от 0,1 до 1% по массе.

19. Способ по п.14, где местная фармацевтическая композиция дополнительно содержит соединение, смесь соединений или экстракт, активные в отношении микроциркуляции.

20. Способ по п.19, где указанная композиция содержит экстракт арники, Ginkgo biloba, ананаса, дудника китайского (dong quai, Angelica siniensis) или Centella asiatica.

21. Способ по п.19, где указанное соединение представляет собой сапонин или флавон.

22. Способ по п.21, где указанное соединение представляет собой эсцин.

23. Способ по п.19, где указанное соединение, смесь соединений или экстракт, активные в отношении микроциркуляции, присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 0,1 до 4% по массе.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам для местного или мезотерапевтического лечения целлюлита, которые содержат в качестве активного ингредиента ингибитор PDE3, возможно ассоциированный с другими соединениями, обладающими антицеллюлитной активностью.

Предшествующий уровень техники

Целлюлит, или "отечно-склеротическая панникулопатия", представляет собой расстройство, которое поражает гиподерму - ткань, расположенную ниже дермы, которая имеет в основном жировую природу. Целлюлит поражает почти исключительно женщин и им страдает приблизительно 80-85% женского населения постпубертатного возраста. Подкожная жировая ткань составляет 25% массы тела у женщин и осуществляет 3 основные функции: а) она обеспечивает физическую и механическую защиту; б) она высвобождает липидные и белковые вещества, вовлеченные в метаболизм липидов; и в) она осуществляет эндокринное и паракринное действие.

Статистически этот физический недостаток поражает большинство женщин белой расы. Эта проблема у женщин других рас встречается не так часто. Женщины, наиболее подверженные данному расстройству, относятся к "средиземноморскому" типу женщин вследствие того факта, что их гормональный фон богаче эстрогенами.

Даже у стройных женщин наблюдается тенденция к появлению выраженных жировых отложений на бедрах.

Несколько факторов оказывают неблагоприятное влияние, вызывая локальные изменения, которые воздействуют на микроциркуляцию жировой массы. Со временем это приводит к анатомической и функциональной деструкции сосудистой системы ткани, что порождает проблемы, влияющие на гиподерму и слой, находящийся непосредственно над ней, а именно дерму.

Целлюлит вызывается дегенерацией микроциркуляции жировой ткани с последующим изменением ее наиболее важных метаболических функций.

Видимым следствием этой дегенерации ткани является увеличение объема жировых клеток, задержка жидкости и застой жидкости в межклеточных пространствах.

Целлюлит может иметь генетические (наследственная предрасположенность), конституциональные, гормональные и сосудистые причины, часто усугубляемые малоподвижным образом жизни, стрессом, заболеванием печени, недостаточным питанием, кишечными расстройствами или расстройствами, характеризующимися выраженной задержкой жидкости.

Гормональный дисбаланс (влияющий на овариальные, гипофизарные гормон и тиреоидные гормоны) является причиной целлюлита; благодаря действию эстрогенов и их влиянию на микроциркуляцию женщины предрасположены к этому состоянию, особенно в период полового созревания, беременности и предменопаузальный период, когда активность овариальных гормонов является максимальной. Таким образом, предрасположенность к целлюлиту, главным образом, имеет гормональную основу, а не генетическую.

Существует четкий половой диморфизм в структурных характеристиках подкожной соединительной ткани, который предопределяет развитие у женщин нерегулярных выступов жировой ткани, характеризующих целлюлит в дерме. Предположили, что преобладание антилиполитической активности ( ₂-адренергическизависимый рецептор) у женщин, по сравнению с мужской подкожной жировой тканью, может способствовать увеличению отложений жира на бедрах и, следовательно, появлению целлюлита (Rosenbaum et al., Plastic and Reconstructive Surgery, 101(7): 1934-1939,1998).

Более того, липолитический ответ на катехоламины в адипоцитах, происходящих из подкожной жировой ткани ягодиц, бедер или бедренной области, меньше, чем таковой в висцеральной жировой ткани (Lafontan and Berlan, TIPS, 24: 276-283, 2003), что вызывает предрасположенность к накоплению жировой ткани в этих областях.

В настоящее время целлюлит лечат с помощью:

- физиотерапевтических средств.

Способы, такие как электролиполиз и более современная лазерная терапия, ионофорез, ультразвуковая терапия и озоновая терапия, в настоящее время широко используются в дополнение к способам массажа; однако, ни один из этих способов не решает проблему по существу.

- пищевых добавок.

Многочисленные пищевые добавки имеются в продаже (минеральные соли, особенно калия, витамины, "сжигатели жиров" или экстракты из растений с диуретической активностью, регуляторы работы кишечника и биофлавоноиды), которые, как утверждают, усиливают метаболизм, улучшают циркуляцию, защищают от повреждения клеток и уменьшают всасывание жиров; однако какие-либо достоверные клинические испытания, которые подтверждают эффективность этих пищевых добавок для лечения целлюлита, не известны.

- фармакологически активных средств.

Согласно исследованию, опубликованному в European J. of Dermatology 10(8) 596-603, 2000, наиболее распространенным активным компонентом в 32 проанализированных целлюлитных средствах является кофеин, присутствующий в 14 лекарственных препаратах.

Другими широко используемыми соединениями являются:

а) Аминофиллин вследствие его способности увеличивать уровень цАМФ и липолиз; благоприятные и неблагоприятные данные о его антицеллюлитном действии были опубликованы.

б) Левотироксин, который использует способность тиреоидных гормонов усиливать метаболизм. Ввиду высокой дозы левотироксина может происходить системная абсорбция с последующими эффектами на кардиостимуляцию и влиянием на щитовидную железу, что особенно опасно для пациентов с гипертиреозом.

в) Эсцин, вследствие его вазопротективной гепариноидной способности.

- Мезотерапия.

Этот способ включает локальные подкожные инъекции лекарственных средств, обычно вводимых системным путем. Это позволяет инъецировать небольшое количество средства непосредственно в область целлюлита, поэтому данный способ является несистемным и не очень инвазивным. Долгосрочный терапевтический эффект может быть получен с помощью мезотерапии, так как абсорбция лекарственного средства на дермальном уровне является медленной. Соединения, используемые в настоящее время в мезотерапии для лечения целлюлита, представляют собой коэнзим А, фосфатидилхолин, аминофиллин, эсцин и гомеопатические средства.

Адипоцит представляет собой клетку, которая легко меняет свои размеры: при липогенезе ее объем увеличивается, а при липолизе ее объем уменьшается.

Липогенез происходит под действием LPL (липопротеинлипазы):

адипоциты, расположенные рядом с капиллярами, синтезируют и высвобождают LPL, которая гидролизует триглицериды (TG), присутствующие в липопротеинах очень низкой плотности (VLDL) и в хиломикронах. Глицерин и жирные кислоты высвобождаются, захватываются адипоцитами и этерифицируются в триглицериды.

Липолиз происходит под действием гормончувствительной липазы (HSL):

она гидролизует TG, присутствующие в адипоцитах, на жирные кислоты и глицерин. Активный фермент фосфорилируется цАМФ-зависимой протеинкиназой А.

Синтез цАМФ зависит от двух противоположных ферментных систем:

г) аденилатциклазы, которая превращает АТФ в цАМФ. Этот процесс отрицательно регулируется ₂-адренергическими рецепторами и положительно - -адренергическими рецепторами;

д) фосфодиэстеразы, которая разлагает цАМФ до АМФ, не активный в отношении HSL. Эта активность ингибируется кофеином, теофиллином и аминофиллином.

Кроме того, адипоциты секретируют многочисленные факторы, такие как лептин (фактор насыщения), ангиогенные факторы (агиотензиноген), простагландины PGE₂ (антилиполизные свойства) и PGI₂ (клеточная дифференцировка), лизофосфатидиловую кислоту (пролиферация клеток) и стероиды.

Стратегии лечения

Развитие фармакологических основ лечения целлюлита прошло через несколько этапов. В восьмидесятые годы использовали ингибирование фосфодиэстеразы (PDE) ксантином (кофеином). В девяностые годы решение проблемы искали путем улучшения венолимфатической недостаточности с помощью растительных экстрактов, обладающих дренирующей и противоотечной активностью (флавоноиды и сапонисиды). Совсем недавно была предпринята попытка реструктурировать соединительную ткань компонентами внеклеточного матрикса и ферментами расщепления.

Однако наиболее многообещающим терапевтическим подходом, по-видимому, является тот, который направлен на увеличение метаболизма адипоцитов и липолиза.

Липолиз может быть индуцирован: а) стимуляцией -адренергических рецепторов; б) ингибированием аденозиновых или ₂-адренергических рецепторов; в) ингибированием фосфодиэстеразы.

В серии клинических испытаний были определены эффекты локального применения -адренергического стимулятора (изопреналина), ₂-адренергического антагониста (йохимбина) и ингибитора фосфодиэстеразы (аминофиллина). Результаты показали, что уменьшение локализованного жира может быть получено фармакологически, без диет или физических упражнений (Greenway et al., Obes res,3:561S-568S, 1995).

Стимуляция -адренергического рецептора увеличивает концентрацию цАМФ в жировых клетках, стимулируя таким образом липолиз. Другой путь увеличения цАМФ состоит в том, чтобы предупреждать ее расщепление путем ингибирования фермента фосфодиэстеразы.

Наиболее распространенные ингибиторы PDE (кофеин, теофиллин и аминофиллин) являются неудовлетворительными вследствие их низкой специфичности и невысокой способности к местному всасыванию. PDE3, и особенно PDE3B, присутствуют в адипоцитах человека, поэтому представляется необходимым селективно ингибировать эти подтипы ферментов для получения эффекта, ограниченного жировой тканью.

Патенты, поданные по данной теме:

ЕР 692250 на применение флавонов для улучшения микроциркуляции. GB 1588501, FR 2797765, ЕР 1261310 и ЕР 1259221, относящиеся к косметическому применению ксантина для активации липазы.

Из приведенной выше информации очевидно, что липолитическая активность является существенной, но недостаточной для лечения целлюлита. Способы лечения, которые применяли до настоящего времени, часто использующие ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ксантин, не оказались полностью удовлетворительными, поэтому существует настоятельная потребность в новых эффективных способах лечения этого многофакторного морфологического изменения подкожного жира.

Группа арилдигидропиридазонов и арилдиметилпиразолонов в качестве селективных ингибиторов PDE3B, потенциально полезных в лечении ожирения, описана в Bioorganic & Medical Chemistry Letters, (2003), 13, 3983-3987.

Описание изобретения

В настоящие время обнаружено, что ингибиторы PDE3 (фосфодиэстераза-3) и, в частности, ингибиторы изоформы PDE3B, которая в основном экспрессируется в жировой ткани человека, являются неожиданно эффективными против целлюлита.

Соответственно, в настоящем изобретении предложено применение ингибитора PDE3, предпочтительно PDE3B, для изготовления фармацевтической композиции для местного или мезотерапевтического лечения целлюлита.

Среди ингибиторов PDE3 предпочтительными являются анагрелид, цилостазол, пимобендан, милринон, амринон, олпринон, эноксимон, цилостамид, веснаринон, трехинзин и их фармацевтически приемлемые соли. Особенно предпочтительными являются милринон, трехинзин и цилостамид.

Другая группа предпочтительных ингибиторов PDE3 по настоящему изобретению представляет собой соединения, описанные в Bioorganic & Medical Chemistry Letters, (2003), 13, 3983-3987; в частности соединения:

1) 6-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1 -ениламино)фенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-H-пиридазин-3-он (соединение 8а);

2) 3-{2-[4-(4,4-диметил-5-оксо-4,5-дигидро-1-Н-пиразол-3-ил)-2,3-дифторфениламино]-6-оксоциклогекс-1-енилметил}-бензонитрил (соединение 18n);

3) 5-{4-[2-(2,6-дихлорбензил)-3-оксоциклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он (соединение 18h);

4) 5-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1-ениламино)фенил]-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он (соединение 18а);

5) 5-{4-[2-(3-нитробензил)-3-оксоциклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он (соединение 18f);

6) 6-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1-ениламино)-2-фторфенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-он (соединение 14I).

Как использовано в данном документе, термин "местный" означает предназначенный для локального применения и действия или включающий таковое. Местные композиции представлены предпочтительно в форме крема, нежирного крема, мази, препаратов типа "масло не в масле" (oil-non-oil), геля, распыляемого геля и пластыря. Для применения в мезотерапии эти композиции должны быть представлены в форме, подходящей для локальной внутрикожной инъекции, предпочтительно в форме инъекционных растворов.

Активный ингредиент присутствует в концентрациях, находящихся в диапазоне от 0,1 до 3%, предпочтительно от 1 до 2%, на основе общей массы композиции для местных форм и от 0,1 до 1% по массе для инъекционных форм для применения в мезотерапии. В дополнение к ингибиторам PDE3 композиции по изобретению могут содержать соединение, смесь соединений или экстракт, активный в отношении микроциркуляции, предпочтительно сапонин или флавон, или экстракты, содержащие их. Наиболее предпочтительными являются экстракты Ginkgo biloba, арники, ананаса, дудника китайский (dong quai, Angelica siniensis), Centella asiatica и сапонин эсцин.

Соединение, экстракт или смесь соединений, активных в отношении микроциркуляции, содержатся в композиции в концентрации от 0,1 до 4%.

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как адъюванты, в частности вода или спирты (этанол), витамины, в частности токоферол, декспантенол или ретинола пальмитат, загустители, консерванты, защитные коллоиды, увлажнители, ароматизаторы, электролиты, гелеобразующие агенты, агенты, увеличивающие проницаемость кожи, полимеры или сополимеры, эмульгаторы, агенты, стабилизирующие эмульсию, и другие фармацевтически приемлемые эксципиенты.

Предпочтительные консерванты представляют собой вещества с низкой аллергенностью, такие как этиловый спирт и бензиловый спирт.

Местные препараты могут содержать ненасыщенные производные олеиновой кислоты, такие как 10 транс-12цис-линоленовая кислота.

Особенно подходящими гелеобразующими агентами являются карбомер, более предпочтительно карбомер 940, полиакриламид изопарафин-лаурет-7, ксантановая смола, каррагенин, аравийская камедь, гуаровая смола, агаровый гель, альгинаты и метилгидроксицеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилцеллюлоза, полиакрилаты, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, коллоидный кремнезем. Мочевина и пантенол являются примерами увлажнителей по настоящему изобретению.

Способы получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению известны специалистам в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, XVIII Ed. Mack Publishing Co.

Фармацевтические препараты, содержащие ингибитор PDE3, как описано выше, удобно использовать для местного лечения целлюлита у человека, предпочтительно у женщин.

Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение более подробно. ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Нежирный крем (% по массе)

Активный ингредиент:

Амринон 1

Эсцин 2

Эксципиенты:

Глицерилмоностеарат 8

Макрогола цетостеариловый эфир 2,5

Жидкий вазелин 2

Белый вазелин 2

Изопропилмиристат 4

Миристиловый спирт 3

Сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты 0,3

Очищенная вода, q.s. до 100 г

q.s. - достаточное количество

ПРИМЕР 1.2

Активный ингредиент:

Милринон 1

Эксципиенты:

Цетостеариловый спирт 1

Глицерилмоностеарат 4,5

Жидкий вазелин 2

Белый вазелин 2

Диметикон 0,30

Изопропилмиристат 1

Миристиловый спирт 3

Эфирные масла q.s.

Очищенная вода, q.s. до 100 г

ПРИМЕР 1.3

Активный ингредиент:

Трехинзин 2

Эксципиенты:

Олеиновая кислота 5,0

Макрогола стеарат 40 9,0

Цетостеариловый спирт 6,0

Бутилгидроксианизол 0,02

Трометамол 0,1

Диметикон 0,3

Карбопол 980 0,3

Пропиленгликоль 20,0

Сульфит натрия 0,1

Эфирные масла q.s.

Очищенная вода, q.s. до 100 г

ПРИМЕР 2. Гидроспиртовой гель (% по массе)

Активный ингредиент:

Милринон 2

Эксципиенты:

Карбомер 1,5

Этиловый спирт 96° ЕР 40 мл

Эфирные масла q.s.

Триэтаноламин, q.s. для подведения рН

Очищенная вода, q.s. до 100 г

ПРИМЕР 3. Липофильный крем (% по массе)

Активный ингредиент:

Амринон 1

Эксципиенты:

Полиглицерил-3-диизостеарат 4

Глицерилолеат 2

Пчелиный воск 7

Дикаприловый эфир 10

Гексилдеканол/гексилдециллаурат 10

Глицерин 85% 5

Сульфат магния 7Н₂О 1

Сложные эфиры ла/загидроксибензойной кислоты 0,1

Эфирные масла q.s.

Очищенная вода, q.s. до 100 г

ПРИМЕР 4. Нежирный крем (% по массе)

Активный ингредиент:

3-{2-[4-(4,4-Диметил-5-оксо-4,5-дигидро-1-Н-пиразол-3-ил)-2,3-дифтор-фениламино]-6-оксоциклогекс-1-енилметил}-бензонитрил: 1

Эксципиенты:

Олеиновая кислота 5,0

Макрогола стеарат 40 9,0

Цетостеариловый спирт 6,0

Бутилгидроксианизол 0,02

Трометамол 0,1

Диметикон 0,3

Карбопол 980 0,3

Пропиленгликоль 20,0

Сульфит натрия 0,1

Очищенная вода, q.s. до 100 г

Следующие активные ингредиенты могут быть использованы для приготовления нежирных кремов согласно Примеру 4:

6-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1-ениламино)фенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-он;

5-{4-[2-(2,6-дихлорбензил)-3-оксоциклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он;

5-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1-ениламино)фенил]-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он;

5-{4-[2-(3-нитробензил)-3-оксоциклогекс-1-ениламино]-2-фторфенил}-4,4-диметил-2,4-дигидропиразол-3-он;

6-[4-(2-бензил-3-оксоциклогекс-1-ениламино)-2-фторфенил]-5-метил-4,5-дигидро-2-Н-пиридазин-3-он.

ПРИМЕР 5: Инъекционный раствор для мезотерапии (ампула 5 мл) (количество выражено в мг/мл);

Активный ингредиент:

Милринон 5

Эксципиенты:

Метабисульфит натрия, молочная кислота 0,2-0,5

Очищенная вода, q.s. до 5 мл

ПРИМЕР 6: Тест на эффективность

Целлюлит является проблемой с многофакторной этиологией, в которой липогенез играет критическую роль. Поэтому определение in vitro липолитической активности является существенным фактором в первоначальном скрининге потенциальных антицеллюлитных лекарственных средств, хотя и совершенно недостаточным для идентификации конечного кандидата. Поэтому тестирование in vitro липолитической активности должно быть связано с тестированием, которое оценивает эффективность in vivo.

Тесты in vitro.

- Определение внеклеточного глицерина, продуцируемого в результате липолиза триглицеридов в адипоцитах.

Тест на липолиз in vitro проводили на адипоцитах человека, полученных из первичных культур их предшественников: преадипоцитов (клеток-предшественников), путем индукции дифференцировки. Фактическую дифференцировку адипоцитов устанавливали путем анализа глицерин-3-фосфатдегидрогеназы (фермента, экспрессирующегося в зрелых адипоцитах, но не в преадипоцитах) и липидов, накапливающихся на межклеточном уровне, с помощью Oil Red О (Sigma).

Ингибиторы PDE3 предварительно инкубировали с адипоцитами при различных концентрациях в течение 15 мин; затем добавляли 10 нМ изопреналина, способного индуцировать слабую стимуляцию липолиза (25% максимального ответа, полученного с 1 мкМ изопреналином). Через 4 ч культуральную среду удаляли и количество внутриклеточных липидов, накопленных в каждой лунке, определяли с помощью Oil Red О.

Липолитическую активность оценивали путем определения глицерина, высвобожденного во внеклеточную среду после гидролиза триглицеридов.

В данном тесте препараты с ингибиторами PDE3, включая селективные ингибиторы PDE3B по настоящему изобретению, оказались сравнимы или более эффективны, чем аналогичные препараты, содержащие неселективные ингибиторы PDE (кофеин, теофиллин).

Действие некоторых ингибиторов PDE на высвобождение глицерина, стимулированное 10 нМ изопреналина, в культивируемых адипоцитах человека

% УВЕЛИЧЕНИЕ ПРИ ЛИПОЛИЗЕ 10 мкМ
Амринон	20±6
Анагрелид	114±11
Цилостазол	31±9
Эноксимон	65±4
Милринон	151±16
Пимобендан	159±22
Трехинзин	276±59
Теофиллин	5±4
Кофеин	10±5

*Определение продукции цАМФ в адипоцитах

цАМФ является внутриклеточным мессенжером, уровень которого зависит от его синтеза (аденилатциклазная активность) и распада (фосфодиэстеразная активность). Адипоциты переносили в физиологический раствор, в который добавляли липолитические агенты (активаторы аденилатциклазы), антилиполитические агенты (активаторы фосфодиэстеразы) и ингибиторы PDE3. После соответствующего периода инкубации процесс прерывали и цАМФ, образовавшийся в клетках, экстрагировали. Клеточный экстракт лиофилизировали, затем извлекали и анализировали с помощью специфического, коммерчески доступного колориметрического ферментативного иммуноанализа (Е1А) (Amersham, Cayman). Уровни цАМФ определяли в соответствии с инструкциями поставщика. В данном тесте препараты с антагонистами PDE3 по настоящему изобретению оказались более эффективными, чем похожие препараты, содержащие неселективные ингибиторы PDE3 (кофеин, аминофиллин).

Тесты in vivo

В эксперименте участвовали 10 здоровых взрослых женщин, у которых наблюдались явные признаки целлюлита в верхней наружной части бедер.

Каждая пациентка выступала в качестве своего собственного контроля при оценке эффективности и безопасности. Крем, содержащий активный компонент (1% милринона), наносили на верхнюю часть одного бедра, в то время как основу крема (без активного компонента) наносили на такую же часть другого бедра произвольным образом.

Обработку с помощью приблизительно 2-3 см крема, сопровождающуюся массирующими движениями в течение 2-3 минут до тех пор пока не впитается, повторяли два раза в день каждый день в течение 2 месяцев.

Во время теста пациентки не придерживались комплекса физических упражнений и не подвергались каким-либо ограничениям в питании.

Длину окружности каждого бедра измеряли периодически на расстоянии двух третей между коленом и большим вертелом бедренной кости до окончания курса лечения. Уменьшение длины окружности бедра, которое подвергали фармакологической обработке, по сравнению с контрольным бедром составило 2,9±0,7 см и колебалось в пределах 1,3-4,7 см.

В конце периода наблюдения при определении PDE3 в крови не обнаружено присутствия данного соединения.